專利名稱：在真細(xì)菌宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)正交翻譯組分的系統(tǒng)的制作方法
相關(guān)申請的交叉引用
本申請要求以下申請的優(yōu)先權(quán)2006年3月9日提交的美國臨時專利申請序列號60/780,973；2006年3月17日提交的美國臨時專利申請序列號60/783,497；和2006年10月29日提交的美國臨時專利申請序列號60/855,336，各份申請通過引用全文納入本文。
聯(lián)邦資助研發(fā)下所作發(fā)明的權(quán)利的聲明
本發(fā)明在美國政府的能源部合同號ER46051的支持下作出。美國政府對本發(fā)明享有一定權(quán)利。
發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)化學(xué)領(lǐng)域，例如翻譯生物化學(xué)。本發(fā)明涉及體內(nèi)產(chǎn)生含有一個或多個非天然氨基酸的多肽的組合物和方法。

背景技術(shù)：
在歷史上，對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究依賴于利用天然產(chǎn)生的氨基酸的R-基團(tuán)的可用反應(yīng)特性。不幸的是，從細(xì)菌到人類的每種已知生物編碼相同的二十種常見氨基酸(罕見的例外是硒代半胱氨酸(參見，例如，A.Bock等，(1991)，Molecular Microbiology 5515-20)和吡咯賴氨酸(參見，例如，G.Srinivasan等，(2002)，Science 2961459-62)。R-基團(tuán)的這種有限選擇性約束了對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究，即天然產(chǎn)生的氨基酸的化學(xué)特性限制了這些研究。
現(xiàn)已開發(fā)了在原核和真核生物內(nèi)將具有新穎理化和生物特性的化學(xué)上有差異的非天然氨基酸體內(nèi)位點特異性地?fù)饺氲鞍踪|(zhì)的通用方法(Wang等，Science 292，498-500(2001)；Chin等，Science 301，964-967(2003)；Wang和Schultz，Angew.Chem.Int.Ed.44，34-66(2005))。該方法依賴于獨特的密碼子-tRNA配對和在蛋白質(zhì)翻譯中有效起作用，但不與宿主生物中任何內(nèi)源性tRNA、RS、氨基酸或密碼子相互反應(yīng)(即，其必須是正交的)的各非天然氨基酸的相應(yīng)氨?；?tRNA合成酶(aaRS，或簡稱為RS)。利用這種正交tRNA-RS配對能遺傳學(xué)編碼大量結(jié)構(gòu)上有差異的氨基酸，包括具有獨特化學(xué)(Wang等，Proc.Natl.Sci Acad.USA.100，56-61(2003))和光化學(xué)反應(yīng)性(Chin等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 99，11020-11024(2002)；Wu等，J.Am.Chem.Soc，126，14306-14307(2004))的那些氨基酸以及糖基化的(Zhang等，Science303，371-373(2004))、熒光的(Wang和Schultz，Angew.Chem.Int.Ed.4434-66(2005))、金屬結(jié)合的(Wang和Schultz，Angew.Chem.Int.Ed.4434-66(2005))和氧化還原活性氨基酸(Alfonta等，J.Am.Chem.Soc.12514662-14663(2003))。一種具體的突變體MjtRNA-Tyr(CUA)-MjTyrRS配對尤其可用于在大腸桿菌(E.coli)中編碼新的氨基酸(Wang和Schultz，Chem.Biol.8883-890(2001))。
然而，盡管該技術(shù)成功地在體內(nèi)摻入了各種不同的非天然氨基酸，但產(chǎn)生含非天然氨基酸的突變型蛋白的表達(dá)系統(tǒng)的效率尚未優(yōu)化，正交系統(tǒng)克服選擇者密碼子(selector codon)的抑制效率不佳。本領(lǐng)域需要開發(fā)試劑以提高正交翻譯系統(tǒng)的抑制效率。閱讀下文可明白本文所述的發(fā)明滿足了這些及其它需求。
發(fā)明概述 本發(fā)明提供可用于有效細(xì)菌表達(dá)突變型蛋白的改進(jìn)表達(dá)載體系統(tǒng)，所述蛋白在特定位點含有由選擇者密碼子(例如琥珀無義密碼子)遺傳編碼的一個或多個非天然氨基酸。在真細(xì)菌中(例如大腸桿菌)，這些系統(tǒng)將非天然氨基酸摻入蛋白質(zhì)的效率明顯提高。本發(fā)明的新表達(dá)載體特征與各種大腸桿菌表達(dá)載體骨架和大腸桿菌廣泛相容，除了表達(dá)正交氨?；鵷RNA合成酶或正交抑制型tRNA外，還不難適用于表達(dá)感興趣的其它蛋白質(zhì)或tRNA。
本領(lǐng)域已知本發(fā)明采用的這些正交翻譯技術(shù)。然而，本發(fā)明不限于所用具體正交翻譯組分的任何方面(即，具體正交氨?；?tRNA合成酶或具體正交抑制型tRNA)。實際上，本發(fā)明提供可廣泛用于細(xì)菌表達(dá)載體系統(tǒng)的改進(jìn)組合物和方法，所述系統(tǒng)不限于表達(dá)正交氨?；?tRNA合成酶或抑制型tRNA。
在一些方面，本發(fā)明提供各種核酸構(gòu)建物。這些實施方式包括，例如 構(gòu)建物A具有衍生自大腸桿菌脯氨酸t(yī)RNA基因的啟動子和終止子核苷酸序列和可表達(dá)核苷酸序列的構(gòu)建物，其中啟動子和終止子序列均操作性連接于可表達(dá)核苷酸序列，并且其中所述可表達(dá)核苷酸序列是所述啟動子和終止子核苷酸序列的異源序列。
構(gòu)建物B具有啟動子核苷酸序列和可表達(dá)核苷酸序列的構(gòu)建物，所述啟動子核苷酸序列是具有SEQ ID NO13所示核苷酸序列的經(jīng)修飾大腸桿菌glnS啟動子，其中所述經(jīng)修飾大腸桿菌glnS啟動子核苷酸序列操作性連接于所述可表達(dá)核苷酸序列。
在一些方面，構(gòu)建物A和B的元件用于同一載體中，其中可表達(dá)核苷酸序列不同。
構(gòu)建物C具有編碼正交tRNA(O-tRNA)的核苷酸序列和編碼正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)的構(gòu)建物，其中所述O-RS用非天然氨基酸優(yōu)先氨?；疧-tRNA。
構(gòu)建物D具有多順反子操縱子的構(gòu)建物，所述操縱子包含多條tRNA基因核苷酸序列，其中至少一個tRNA基因通過異源多核苷酸接頭與至少一個毗鄰tRNA基因相隔開，所述異源多核苷酸接頭衍生自天然tRNA操縱子的天然多核苷酸接頭。
在一些實施方式中，如果同時使用構(gòu)建物A、B和C，A中的可表達(dá)核苷酸序列編碼O-tRNA，而B中的可表達(dá)核苷酸序列編碼O-RS。
在這些構(gòu)建物的一些實施方式中，大腸桿菌脯氨酸t(yī)RNA基因選自大腸桿菌proK、proL和pro MtRNA基因。在一些實施方式中，大腸桿菌tRNA啟動子和終止子序列分別衍生自SEQ ID NO32(啟動子)和33(終止子)所示大腸桿菌proK的啟動子和終止子序列。在一些實施方式中，構(gòu)建物A的可表達(dá)核苷酸序列是包含一條或多條核苷酸序列中多條的多順反子操縱子。在一些實施方式中，構(gòu)建物A中的可表達(dá)核苷酸序列編碼tRNA，例如，所述tRNA衍生自一種或多種古菌tRNA或tRNA由SEQ ID NO1(MjtRNA-Tyr(CUA))所示核苷酸序列編碼的情況。在一些實施方式中，所述可表達(dá)核苷酸序列是包含多條SEQ ID NO1(MjtRNA-Tyr(CUA))所示核苷酸序列的多順反子操縱子。在一些方面，所述可表達(dá)核苷酸序列是多個多順反子操縱子。
如果利用構(gòu)建物B，所述可表達(dá)核苷酸序列能編碼多肽，例如氨?；?tRNA合成酶。在一些方面，構(gòu)建物B的可表達(dá)核苷酸序列編碼正交氨?；?tRNA合成酶(O-RS)，其中所述O-RS用非天然氨基酸優(yōu)先氨?；鄳?yīng)的O-tRNA。在一些方面，所述O-RS衍生自詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)氨酰基-tRNA合成酶，例如詹氏甲烷球菌酪氨酰-tRNA合成酶。在這些方面，與SEQID NO2(野生型Mj-tRNA-Tyr RS)所示野生型詹氏甲烷球菌酪氨酰-tRNA合成酶的氨基酸序列相比，O-RS任選在氨基酸286位或類似于286位的位置具有天冬氨酸到精氨酸的取代。
本發(fā)明的這些構(gòu)建物可用于宿主細(xì)胞中，例如真細(xì)菌宿主細(xì)胞，如大腸桿菌細(xì)胞中。
如果利用構(gòu)建物D，所述多順反子操縱子可包含多個相同的異源多核苷酸接頭。在一些情況中，所述異源多核苷酸接頭中至少兩個不同。D的這種多順反子操縱子可包含多個異源多核苷酸接頭。在一些實施方式中，D的異源多核苷酸接頭可包含5’末端胸苷核苷酸、3’末端腺苷核苷酸，或同時包含5’末端胸苷核苷酸和3’末端腺苷核苷酸。所述異源多核苷酸接頭可衍生自位于選自以下的內(nèi)源性大腸桿菌tRNA基因之間的天然多核苷酸接頭valU和valX；ileT和alaT；serV和argV；valV和valW；glyT和thrT；metT和leuW；glnW和metU；hisR和leuT；glnU和glnW；leuP和leuV；glnV和glnX；alaW和alaX；ileU和alaU；ileV和alaV；metU和glnV；glyW和cysT；argX和hisR；以及argY和argZ。在一些方面，D的異源多核苷酸接頭衍生自SEQ IDNO14(valU/valX接頭)或15(ileT/alaT接頭)所示的核苷酸序列。
在其它方面，本發(fā)明提供表達(dá)在特定位置含有至少一個非天然氨基酸的感興趣多肽的翻譯系統(tǒng)。本發(fā)明的這些系統(tǒng)包含 (a)非天然氨基酸； (b)核酸構(gòu)建物，該構(gòu)建物包含編碼正交tRNA(O-tRNA)的核苷酸序列和編碼正交氨?；?RNA合成酶(O-RS)的核苷酸序列，其中所述O-RS用非天然氨基酸優(yōu)先氨?；鯫-tRNA；和 (c)編碼感興趣多肽的多核苷酸，所述多核苷酸包含所述O-tRNA識別的至少一個選擇者密碼子，其中多核苷酸表達(dá)產(chǎn)生多肽后，所述多核苷酸中選擇者密碼子的位置控制感興趣多肽中非天然氨基酸的位置。
在本發(fā)明的這些系統(tǒng)中，核酸構(gòu)建物可包含下述任何一個或多個元件 (1)衍生自大腸桿菌脯氨酸t(yī)RNA基因的啟動子和終止子核苷酸序列，其中所述啟動子和終止子序列均操作性連接于包含或編碼O-tRNA的核苷酸序列，并且其中所述O-tRNA是所述啟動子和終止子核苷酸序列的異源序列； (2)對應(yīng)于具有SEQ ID NO13所示核苷酸序列的經(jīng)修飾大腸桿菌glnS啟動子的核苷酸序列，其中所述經(jīng)修飾大腸桿菌glnS核苷酸序列操作性連接于編碼O-RS的核苷酸序列；或 (3)包含多個O-tRNA基因核苷酸序列的多順反子操縱子，其中至少一個O-tRNA基因通過異源多核苷酸接頭與至少一個毗鄰O-tRNA基因相隔開，所述異源多核苷酸接頭衍生自天然tRNA操縱子的天然多核苷酸接頭。
在這些系統(tǒng)中，大腸桿菌脯氨酸t(yī)RNA基因可選自大腸桿菌proK、proL和proM tRNA基因。所述大腸桿菌脯氨酸t(yī)RNA啟動子和終止子序列可分別衍生自SEQ ID NO32(啟動子)和33(終止子)所示大腸桿菌proK的啟動子和終止子序列。多順反子操縱子可包含多個相同的異源多核苷酸接頭，例如其中所述異源多核苷酸接頭中至少兩個不同。在這些系統(tǒng)中，所述異源多核苷酸接頭可包含5’末端胸苷核苷酸、3’末端腺苷核苷酸，或同時包含5’末端胸苷核苷酸和3’末端腺苷核苷酸。所述異源多核苷酸接頭可衍生自位于選自以下的內(nèi)源性大腸桿菌tRNA基因之間的天然多核苷酸接頭valU和valX；ileT和alaT；serV和argV；valV和valW；glyT和thrT；metT和leuW；glnW和metU；hisR和leuT；glnU和glnW；leuP和leuV；glnV和glnX；alaW和alaX；ileU和alaU；ileV和alaV；metU和glnV；glyW和cysT；argX和hisR；以及argY和argZ。在一些方面，所述異源多核苷酸接頭衍生自SEQ IDNO14(valU/valX接頭)或15(ileT/alaT接頭)所示的核苷酸序列。
在這些系統(tǒng)中，O-tRNA可衍生自一種或多種古菌tRNA。在該系統(tǒng)的一些方面，編碼O-tRNA的核苷酸序列是包含多條編碼O-tRNA的核苷酸序列的多順反子操縱子。在一些方面，編碼O-tRNA的核苷酸序列包含SEQ IDNO1(MjtRNA-Tyr(CUA))所示核苷酸序列。在該系統(tǒng)的其它方面，編碼O-tRNA的核苷酸序列是包含多條SEQ ID NO1(MjtRNA-Tyr(CUA))所示核苷酸序列的多順反子操縱子。
在其它方面，翻譯系統(tǒng)可利用衍生自詹氏甲烷球菌氨?；?tRNA合成酶，例如詹氏甲烷球菌酪氨酰-tRNA合成酶的O-RS。在一些方面，與SEQ ID NO2(野生型Mj-tRNA-Tyr RS)所示野生型詹氏甲烷球菌酪氨酰-tRNA合成酶的氨基酸序列相比，該O-RS在氨基酸286位或類似于286位的位置具有天冬氨酸到精氨酸的取代。
在該系統(tǒng)的一些方面，各組分包含在宿主細(xì)胞，例如真細(xì)菌宿主細(xì)胞，如大腸桿菌細(xì)胞中。
在其它方面，本發(fā)明提供在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生在特定位置含有非天然氨基酸的感興趣多肽的方法。這些方法具有以下步驟 (a)提供(i)非天然氨基酸；(ii)包含編碼正交tRNA(O-tRNA)的核苷酸序列和編碼正交氨?；?tRNA合成酶(O-RS)的核苷酸序列的核酸構(gòu)建物，其中所述O-RS用非天然氨基酸優(yōu)先氨?；鯫-tRNA；和(iii)編碼感興趣多肽的多核苷酸，所述多核苷酸包含所述O-tRNA識別的至少一個選擇者密碼子，其中所述選擇者密碼子的位置與感興趣多肽中非天然氨基酸的位置相關(guān)；(iv)包含(i)、(ii)和(iii)的宿主細(xì)胞；和 (b)培養(yǎng)該宿主細(xì)胞；和 (c)在宿主細(xì)胞的多肽翻譯期間將非天然氨基酸摻入該多肽的特定位置，從而產(chǎn)生在特定位置含有非天然氨基酸的感興趣多肽。
在這些方法中，所述O-tRNA可衍生自一個或多個古菌tRNA。用于這些方法的構(gòu)建物可利用包含編碼一種或多種O-tRNA的多條核苷酸序列的多順反子操縱子。所用的O-tRNA可包含SEQ ID NO1(MjtRNA-Tyr(CUA))所示核苷酸序列，或者包含SEQ ID NO1(MjtRNA-Tyr(CUA))所示核苷酸序列的多順反子操縱子。在該方法的一些方面，O-RS可衍生自詹氏甲烷球菌氨?；?tRNA合成酶，例如詹氏甲烷球菌酪氨酰-tRNA合成酶。在一些方面，與SEQID NO2(野生型Mj-tRNA-Tyr RS)所示野生型詹氏甲烷球菌酪氨酰-tRNA合成酶的氨基酸序列相比，該O-RS在氨基酸286位或類似于286位的位置具有天冬氨酸到精氨酸的取代。
產(chǎn)生多肽的這些方法可利用各種核酸構(gòu)建物，其中所述構(gòu)建物可利用以下任何序列 (I)衍生自大腸桿菌脯氨酸t(yī)RNA基因的啟動子和終止子核苷酸序列，其中所述啟動子和終止子序列均操作性連接于編碼O-tRNA的核苷酸序列，并且其中編碼O-tRNA的核苷酸序列是所述啟動子和終止子序列的異源序列； (II)對應(yīng)于具有SEQ ID NO13所示核苷酸序列的經(jīng)修飾大腸桿菌glnS啟動子的核苷酸序列，其中所述經(jīng)修飾大腸桿菌glnS核苷酸序列操作性連接于編碼O-RS的核苷酸序列；和 (III)包含多個O-tRNA基因核苷酸序列的多順反子操縱子，其中至少一個O-tRNA基因通過異源多核苷酸接頭與至少一個毗鄰O-tRNA基因相隔開，所述異源多核苷酸接頭衍生自天然tRNA操縱子的天然多核苷酸接頭。
如果利用(I)，大腸桿菌脯氨酸t(yī)RNA可選自大腸桿菌proK、proL和proMtRNA。利用大腸桿菌proK時，可利用SEQ ID NO32(啟動子)和33(終止子)。
如果利用(III)所述多順反子操縱子，可利用多個相同的異源多核苷酸接頭，或者所述異源多核苷酸接頭中至少兩個不同。在一些方面，(III)所述多順反子操縱子利用5’末端胸苷核苷酸、3’末端腺苷核苷酸，或同時利用5’末端胸苷核苷酸和3’末端腺苷核苷酸。此外，所述異源多核苷酸接頭可衍生自位于選自以下的內(nèi)源性大腸桿菌tRNA基因之間的天然多核苷酸接頭valU和valX；ileT和alaT；serV和argV；valV和valW；glyT和thrT；metT和leuW；glnW和metU；hisR和leuT；glnU和glnW；leuP和leuV；glnV和glnX；alaW和alaX；ileU和alaU；ileV和alaV；metU和glnV；glyW和cysT；argX和hisR；以及argY和argZ。具體地說，可利用SEQ ID NO14(valU/valX接頭)或15(ileT/alaT接頭)所示核苷酸序列。在一些方面，所述宿主細(xì)胞是真細(xì)菌宿主細(xì)胞，例如大腸桿菌宿主細(xì)胞。
在其它方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生具有非天然氨基酸的蛋白質(zhì)的方法。這些方法利用本發(fā)明的新載體系統(tǒng)，從而能產(chǎn)生含有非天然氨基酸的蛋白質(zhì)。這些產(chǎn)生含非天然氨基酸的感興趣多肽的方法在宿主細(xì)胞中實施，其中該方法的步驟包括(a)提供 (i)非天然氨基酸； (ii)包含編碼正交tRNA(O-tRNA)的核苷酸序列的核酸構(gòu)建物； (iii)編碼正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)的核苷酸序列的核酸構(gòu)建物，其中所述O-RS用非天然氨基酸優(yōu)先氨?；鯫-tRNA； (iv)編碼感興趣多肽的多核苷酸，所述多核苷酸包含所述O-tRNA識別的至少一個選擇者密碼子，其中所述選擇者密碼子的位置與感興趣多肽中非天然氨基酸的位置相關(guān)；和 (v)包含(i)、(ii)、(iii)和(iv)的宿主細(xì)胞。
這些方法要求(ii)和(iii)所示核酸構(gòu)建物共同含有以下三種元件中的至少一個 (I)衍生自大腸桿菌脯氨酸t(yī)RNA基因的啟動子和終止子核苷酸序列，其中所述啟動子和終止子序列均操作性連接于編碼O-tRNA的核苷酸序列，并且其中編碼O-tRNA的核苷酸序列是所述啟動子和終止子序列的異源序列； (II)對應(yīng)于具有SEQ ID NO13所示核苷酸序列的經(jīng)修飾大腸桿菌glnS啟動子的核苷酸序列，其中所述經(jīng)修飾大腸桿菌glnS核苷酸序列操作性連接于編碼O-RS的核苷酸序列；和 (III)包含多個O-tRNA基因核苷酸序列的多順反子操縱子，其中至少一個O-tRNA基因通過異源多核苷酸接頭與至少一個毗鄰O-tRNA基因相隔開，所述異源多核苷酸接頭衍生自天然tRNA操縱子的天然多核苷酸接頭。
所述方法通過(b)培養(yǎng)該宿主細(xì)胞；和(c)在宿主細(xì)胞的多肽翻譯期間將非天然氨基酸摻入多肽特定位置，從而產(chǎn)生在特定位置包含非天然氨基酸的感興趣多肽得以實施。
編碼O-tRNA的核苷酸序列任選衍生自一種或多種古菌tRNA。可以在包含多個編碼一種或多種O-tRNA的多條核苷酸序列的多順反子操縱子中提供O-tRNA。在一些方面，編碼O-tRNA的核苷酸序列包含SEQ ID NO1(MjtRNA-Tyr(CUA))所示核苷酸序列。多順反子操縱子可任選利用多條SEQID NO1(MjtRNA-Tyr(CUA))所示核苷酸序列。
在其它方面，O-RS衍生自詹氏甲烷球菌氨?；?tRNA合成酶，例如詹氏甲烷球菌酪氨酰-tRNA合成酶。與SEQ ID NO2(野生型Mj-tRNA-Tyr RS)所示野生型詹氏甲烷球菌酪氨酰-tRNA合成酶的氨基酸序列相比，該O-RS在氨基酸286位或類似于286位的位置具有天冬氨酸到精氨酸的取代。
在這些方法的其它實施方式中，(I)的核酸構(gòu)建物包含選自大腸桿菌proK、proL和proM tRNA的大腸桿菌脯氨酸t(yī)RNA。此外，(I)的構(gòu)建物可分別利用SEQ ID NO32(啟動子)和33(終止子)所示大腸桿菌proK的啟動子和終止子序列。
在其它方法實施方式中，(III)的核酸構(gòu)建物利用多個相同的異源多核苷酸接頭。所述異源多核苷酸接頭中至少兩個任選不同。
這些方法中，(III)的多順反子操縱子任選利用5’末端胸苷核苷酸、3’末端腺苷核苷酸，或同時利用5’末端胸苷核苷酸和3’末端腺苷核苷酸。本文所用的異源多核苷酸接頭可衍生自位于選自以下的內(nèi)源性大腸桿菌tRNA基因之間的天然多核苷酸接頭valU和valX；ileT和alaT；serV和argV；valV和valW；glyT和thrT；metT和leuW；glnW和metU；hisR和leuT；glnU和glnW；leuP和leuV；glnV和glnX；alaW和alaX；ileU和alaU；ileV和alaV；metU和glnV；glyW和cysT；argX和hisR；以及argY和argZ。例如，所述異源多核苷酸接頭可衍生自SEQ ID NO14(valU/valX接頭)或15(ileT/alaT接頭)所示核苷酸序列。這些方法任選在真細(xì)菌宿主細(xì)胞，例如大腸桿菌中實施。
在其它方面，本發(fā)明還提供表達(dá)在特定位置具有至少一個非天然氨基酸的感興趣多肽的翻譯系統(tǒng)。這些系統(tǒng)基本上包括 (a)非天然氨基酸； (b)核酸構(gòu)建物，該構(gòu)建物包含編碼正交tRNA(O-tRNA)的核苷酸序列和編碼正交氨?；?tRNA合成酶(O-RS)的核苷酸序列，其中所述O-RS用非天然氨基酸優(yōu)先氨酰化所述O-tRNA；和 (c)編碼感興趣多肽的多核苷酸，所述多核苷酸包含所述O-tRNA識別的至少一個選擇者密碼子，其中多核苷酸表達(dá)產(chǎn)生多肽后，所述多核苷酸中選擇者密碼子的位置控制感興趣多肽中非天然氨基酸的位置。
這些系統(tǒng)組分任選整合在宿主細(xì)胞中。
在還有其它實施方式中，本發(fā)明提供產(chǎn)生在特定位置具有非天然氨基酸的感興趣多肽的方法。這些方法基本上采用以下步驟 (a)提供翻譯系統(tǒng)，所述翻譯系統(tǒng)包含 (i)非天然氨基酸； (ii)包含編碼正交tRNA(O-tRNA)的核苷酸序列和編碼正交氨?；?tRNA合成酶(O-RS)的核苷酸序列的核酸構(gòu)建物，其中所述O-RS用非天然氨基酸優(yōu)先氨?；鯫-tRNA；和 (iii)編碼感興趣多肽的多核苷酸，所述多核苷酸包含所述O-tRNA識別的至少一個選擇者密碼子，其中所述選擇者密碼子的位置與感興趣多肽中非天然氨基酸的位置相關(guān)； (iv)包含(i)、(ii)和(iii)的宿主細(xì)胞。
這些方法還要求(b)培養(yǎng)該宿主細(xì)胞；和(c)在宿主細(xì)胞的多肽翻譯期間將非天然氨基酸摻入該多肽的特定位置，從而產(chǎn)生在特定位置含有非天然氨基酸的感興趣多肽。
定義 在詳細(xì)描述本發(fā)明前，應(yīng)該知道本發(fā)明不局限于具體的生物系統(tǒng)，本發(fā)明當(dāng)然可以有各種變化。還應(yīng)知道本文所用的術(shù)語只是為了描述具體的實施方式，而非限制性的。除非另有明確指出，本說明書和隨附的權(quán)利要求書中使用的單數(shù)形式“一個”、“一種”和“該”也包括復(fù)數(shù)對象。因此，例如述及“一個細(xì)胞”包括兩個或多個細(xì)胞的組合；述及“一個多核苷酸”實際上包括該多核苷酸的多份拷貝。
除了此處和以下說明書的其余部分所定義的，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員常規(guī)理解的意義相同。在對本發(fā)明的描述和主張，按照下述定義使用以下術(shù)語。
正交本文所用的術(shù)語“正交”指與某細(xì)胞或翻譯系統(tǒng)的內(nèi)源性相應(yīng)分子相比，某分子(例如，正交tRNA(O-tRNA)和/或正交氨酰tRNA合成酶(O-RS))與該細(xì)胞內(nèi)源性組分起作用的效率降低，或不能與該細(xì)胞的內(nèi)源性組分起作用。就tRNA和氨酰-tRNA合成酶而言，正交指與和內(nèi)源性tRNA合成酶起作用的內(nèi)源性tRNA相比，正交tRNA與內(nèi)源性tRNA合成酶不起作用或起作用的效率降低；或者與和內(nèi)源性tRNA起作用的內(nèi)源性tRNA合成酶相比，正交氨酰tRNA合成酶與內(nèi)源性tRNA不起作用或起作用的效率降低，所述效率降低例如，小于20％的效率，小于10％的效率，小于5％的效率，或小于1％的效率。正交分子缺乏細(xì)胞中功能正常的內(nèi)源性互補分子。例如，與內(nèi)源性RS氨酰化內(nèi)源性tRNA相比，細(xì)胞的任何內(nèi)源性RS氨?；?xì)胞中正交tRNA的效率降低或者甚至降為0。在另一例子中，與內(nèi)源性RS氨?；瘍?nèi)源性tRNA相比，正交RS氨?；信d趣細(xì)胞中任何內(nèi)源性tRNA的效率降低或者降為0?？蓪⒛芘c第一正交分子起作用的第二正交分子引入細(xì)胞。例如，正交tRNA/RS配對包括引入的互補組份，與對照，例如相應(yīng)的tRNA/RS內(nèi)源性配對或活性正交配對(如酪氨酰正交tRNA/RS配對)相比，它們在細(xì)胞中共同起作用的效率是，例如45％效率、50％效率、60％效率、70％效率、75％效率、80％效率、90％效率、95％效率或99％效率，或更高。
正交酪氨酰-tRNA本文所用的術(shù)語正交酪氨酰-tRNA(酪氨酰-O-tRNA)是感興趣翻譯系統(tǒng)的正交tRNA，其中所述tRNA是(1)與天然酪氨酰-tRNA相同或基本類似；(2)通過天然或人工誘變衍生自天然酪氨酰tRNA；(3)由考慮了(1)或(2)的野生型或突變型酪氨酰tRNA序列的方法所產(chǎn)生；(4)與野生型或突變型酪氨酰tRNA同源；(5)指定為酪氨酰tRNA合成酶，例如SEQ ID NO2、4、6、8或10所示合成酶的底物的任何示例性tRNA同源；(6)與指定為酪氨酰tRNA合成酶底物的任何示例性tRNA，例如SEQID NO1所示O-tRNA的保守變體。酪氨酰tRNA可攜帶氨基酸，或處于非負(fù)載狀態(tài)。還應(yīng)知道“酪氨酰-O-tRNA”任選被關(guān)聯(lián)的合成酶分別加載(氨?；?除酪氨酸或亮氨酸以外的氨基酸，例如非天然氨基酸。應(yīng)該知道，實際上本發(fā)明酪氨酰-O-tRNA優(yōu)選用于在翻譯期間對選擇者密碼子起反應(yīng)而基本上可將任何氨基酸(無論天然或人工的)摻入延伸的多肽內(nèi)。
正交酪氨酰氨基酸合成酶本文所用的正交酪氨酰氨基酸合成酶(酪氨酰-O-RS)是在感興趣翻譯系統(tǒng)內(nèi)用氨基酸優(yōu)先氨?；野滨?O-tRNA的合成酶。酪氨酰-O-RS加載到酪氨酰-O-tRNA上的氨基酸可以是任何氨基酸，無論是天然的還是人工的，并且不限于本文所述的。該合成酶任選與天然酪氨酰氨基酸合成酶相同或同源，或者與指定為例如SEQ ID NO4、6、8或10所示O-RS的合成酶相同或同源。例如，所述O-RS可以是例如SEQ IDNO4、6、8或10所示酪氨酰-O-RS的保守變體，和/或與例如SEQ ID NO4、6、8或10所示O-RS的序列至少有50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或以上相同。
關(guān)聯(lián)的(cognate)術(shù)語“關(guān)聯(lián)的”指共同起作用的組分，例如正交tRNA和正交氨酰-tRNA合成酶。這些組分也可稱為“互補的”。
優(yōu)先氨酰化在本文中用于述及正交翻譯系統(tǒng)，當(dāng)某表達(dá)系統(tǒng)中O-RS使O-tRNA帶上氨基酸的效率高于其使任何內(nèi)源性tRNA帶上氨基酸的效率時，該O-RS“優(yōu)先氨?；标P(guān)聯(lián)O-tRNA。即，當(dāng)翻譯系統(tǒng)中存在摩爾比大致相等的O-tRNA與任何給定的內(nèi)源性tRNA時，O-RS使O-tRNA帶上氨基酸的頻率高于它使內(nèi)源性tRNA帶上氨基酸的頻率。當(dāng)翻譯系統(tǒng)中存在等摩爾濃度的O-tRNA與內(nèi)源性tRNA時，通過O-RS帶上氨基酸的O-tRNA與通過O-RS帶上氨基酸的內(nèi)源性tRNA的相對比例優(yōu)選較高，最好導(dǎo)致O-RS僅使或幾乎僅使O-tRNA帶上氨基酸。當(dāng)存在等摩爾濃度的O-tRNA與O-RS時，通過O-RS帶上氨基酸的O-tRNA與通過O-RS帶上氨基酸的內(nèi)源性tRNA的相對比例大于1:1，優(yōu)選至少約2:1，更優(yōu)選5:1，更優(yōu)選10:1，更優(yōu)選20:1，更優(yōu)選50:1，更優(yōu)選75:1，更優(yōu)選95:1、98:1、99:1、100:1、500:1、1,000:1、5,000:1或更高。
當(dāng)(a)與內(nèi)源性tRNA相比，O-RS優(yōu)先氨酰化O-tRNA，和(b)與O-RS用任何天然氨基酸氨酰化O-tRNA相比，氨酰化對非天然氨基酸特異時，O-RS“用非天然氨基酸優(yōu)先氨?；疧-tRNA”。即，當(dāng)包含O-RS和O-tRNA的翻譯系統(tǒng)中存在等摩爾量的非天然和天然氨基酸時，O-RS將非天然氨基酸加載到O-tRNA上的頻率高于加載天然氨基酸的頻率。帶有非天然氨基酸的O-tRNA與帶有天然氨基酸的O-tRNA的相對比例優(yōu)選較高。O-RS更優(yōu)選使O-tRNA僅僅，或者幾乎僅僅帶上非天然氨基酸。當(dāng)翻譯系統(tǒng)中存在等摩爾濃度的天然和非天然氨基酸時，使O-tRNA帶上非天然氨基酸與使O-tRNA帶上天然氨基酸的相對比例大于1:1，優(yōu)選至少約2:1，更優(yōu)選5:1，更優(yōu)選10:1，更優(yōu)選20:1，更優(yōu)選50:1，更優(yōu)選75:1，更優(yōu)選95:1、98:1、99:1、100:1、500:1、1,000:1、5,000:1或更高。
選擇者密碼子術(shù)語“選擇者密碼子”指翻譯過程中為O-tRNA所識別而不為內(nèi)源性tRNA所識別的密碼子。O-tRNA反密碼子環(huán)識別mRNA上的選擇者密碼子并在多肽的此位置摻入其氨基酸，例如非天然氨基酸。選擇者密碼子可包括，例如無義密碼子，如終止密碼子(如，琥珀、赭石和乳白密碼子)；四堿基或四堿基以上密碼子；罕用密碼子；衍生自天然或非天然堿基對的密碼子，等等。
抑制型tRNA抑制型tRNA是例如通過提供對選擇者密碼子起反應(yīng)而將氨基酸摻入多肽鏈的機(jī)制來改變給定翻譯系統(tǒng)中信使RNA(mRNA)閱讀的tRNA。例如，抑制型tRNA可讀通如終止密碼子(如，琥珀、赭石和乳白密碼子)、四堿基密碼子、罕用密碼子等。
抑制活性本文所用的術(shù)語“抑制活性”總體上指tRNA(例如，抑制型tRNA)能翻譯讀通在其它情況中可導(dǎo)致翻譯終止或錯譯(例如，移碼)的密碼子(例如，作為選擇者密碼子的琥珀密碼子或四個或以上堿基的密碼子)的能力。抑制型tRNA的抑制活性可表達(dá)為與第二抑制型tRNA，或與對照系統(tǒng)，例如缺乏O-RS的對照系統(tǒng)相比，觀察到的翻譯讀通活性的百分比。
本發(fā)明提供了能定量測定抑制活性的各種方法。具體O-tRNA和O-RS對感興趣的選擇者密碼子(例如，琥珀密碼子)的抑制百分比是指，與陽性對照構(gòu)建物相比，在包含O-RS和O-tRNA的感興趣翻譯系統(tǒng)中，在編碼表達(dá)測試標(biāo)記的核酸中含有選擇者密碼子的給定表達(dá)測試標(biāo)記(例如，LacZ)的活性的百分比，所述陽性對照缺乏O-tRNA、O-RS和選擇者密碼子。因此，例如，如果在給定翻譯系統(tǒng)中觀察到缺乏選擇者密碼子的活性陽性對照標(biāo)記構(gòu)建物的活性為X(其單位與具體的標(biāo)記試驗相關(guān))，則含有選擇者密碼子的測試構(gòu)建物的抑制百分比是在與陽性對照標(biāo)記的表達(dá)基本相同的環(huán)境條件下(除了測試標(biāo)記構(gòu)建物在也含有O-tRNA和O-RS的翻譯系統(tǒng)中表達(dá)外)，該測試標(biāo)記構(gòu)建物顯示的X百分比。表達(dá)該測試標(biāo)記的翻譯系統(tǒng)一般還包含被O-RS和O-tRNA所識別的氨基酸?？扇芜x通過將測試標(biāo)記與“背景”或“陰性”對照標(biāo)記構(gòu)建物比較來校正抑制百分比的測量值，所述“背景”或“陰性”對照標(biāo)記構(gòu)建物含有與測試標(biāo)記相同的選擇者密碼子，但其所在的系統(tǒng)不含O-tRNA、O-RS和/或被O-tRNA和/或O-RS所識別的相關(guān)氨基酸。該陰性對照可用于標(biāo)準(zhǔn)化抑制百分比測量值以消除感興趣翻譯系統(tǒng)中標(biāo)記的背景信號影響。
可通過本領(lǐng)域已知的許多試驗來測定抑制效率。例如，可采用β-半乳糖苷酶報道試驗，如可將衍生的lacZ質(zhì)粒(該構(gòu)建物在lacZ核酸序列中含有選擇者密碼子)連同含本發(fā)明O-tRNA的質(zhì)粒引入合適生物(例如，可利用正交組分的生物)的細(xì)胞。還可引入關(guān)聯(lián)合成酶(其為多肽或表達(dá)時能編碼該關(guān)聯(lián)合成酶的多核苷酸)。細(xì)胞在培養(yǎng)基中生長至所需密度，例如至OD600約為0.5，利用例如貝塔弗魯爾(BetaFluorTM)β-半乳糖苷酶試驗試劑盒(諾維金公司(Novagen))進(jìn)行β-半乳糖苷酶試驗?？蓪⒁种瓢俜直扔嬎銥榕c可比較對照，例如衍生的lacZ構(gòu)建物的觀察值相比，樣品的活性百分比，其中該衍生的lacZ構(gòu)建物在所需位置具有相應(yīng)的有義密碼子而非選擇者密碼子。
翻譯系統(tǒng)術(shù)語“翻譯系統(tǒng)”指將氨基酸摻入延伸中的多肽鏈(蛋白質(zhì))的各組分。翻譯系統(tǒng)的組分可包括，例如核糖體、tRNA、合成酶、mRNA等。本發(fā)明的O-tRNA和/或O-RS可加入體外或體內(nèi)翻譯系統(tǒng)或是其一部分，例如存在于非真核細(xì)胞，如細(xì)菌(如大腸桿菌)中，或存在于真核細(xì)胞中，如酵母菌細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞、植物細(xì)胞、藻類細(xì)胞、真菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞等。
非天然氨基酸本文所用的術(shù)語“非天然氨基酸”指不在20種常見天然氨基酸或硒代半胱氨酸或吡咯賴氨酸之列的任何氨基酸，修飾的氨基酸和/或氨基酸類似物。例如，本發(fā)明可利用非天然氨基酸對-苯甲?；?L-苯丙氨酸(Bpa)、對-乙?；?L-苯丙氨酸(pAcPhe)、對-疊氮基-L-苯丙氨酸(pAzPhe)和對-碘代-L-苯丙氨酸(pIPhe)。
起反應(yīng)本文所用的術(shù)語“起反應(yīng)”指本發(fā)明的O-tRNA識別選擇者密碼子并介導(dǎo)與該tRNA偶聯(lián)的非天然氨基酸摻入延伸中的多肽鏈的過程。
多肽“多肽”是任何長度的任何氨基酸寡聚物(天然或非天然的，或它們的組合)，其通常(但不限于)由共價肽鍵相連。多肽可以是任何來源，例如天然多肽、重組分子遺傳學(xué)技術(shù)產(chǎn)生的多肽、細(xì)胞或翻譯系統(tǒng)的多肽、或通過不含細(xì)胞的合成方法產(chǎn)生的多肽。多肽以其氨基酸序列表征，例如其組成氨基酸的一級結(jié)構(gòu)。本文所用的“多肽的氨基酸序列”不限于全長序列，而可以是部分或完整的序列。此外，不通過具有或不具有任何具體的生物學(xué)活性來限定多肽。本文所用的術(shù)語“蛋白質(zhì)”是多肽的同義詞。術(shù)語“肽”指小的多肽，例如但不限于長度為2-25個氨基酸。
保守性變體就翻譯組分而言，本文所用的術(shù)語“保守性變體”指在功能上類似于和該保守性變體相似的基本組分，例如O-tRNA或O-RS，但與參比O-tRNA或O-RS相比，序列中有變異的某翻譯組份，例如保守性變體O-tRNA或保守性變體O-RS。例如，O-RS或該O-RS的保守性變體可用非天然氨基酸如含有N-乙酰半乳糖胺部分的氨基酸氨?；P(guān)聯(lián)O-tRNA。在該例子中，所述O-RS及保守性變體O-RS的氨基酸序列不相同。所述保守性變體在序列中可具有例如一處變異、兩處變異、三處變異、四處變異或五處或更多處變異，只要該保守性變體仍與相應(yīng)的O-tRNA或O-RS互補。
在一些實施方式中，保守性變體O-RS與衍生其的O-RS相比，含有一個或多個保守性氨基酸取代。在一些實施方式中，保守性變體O-RS與衍生其的O-RS相比，含有一個或多個保守性氨基酸取代，此外還保留了O-RS的生物學(xué)活性；例如，保守性變體O-RS保留了衍生其的親本O-RS分子至少10％，或者至少20％，至少30％，或至少40％的生物學(xué)活性。在一些優(yōu)選的實施方式中，所述保守性變體O-RS保留了衍生其的親本O-RS分子至少50％的生物學(xué)活性。保守性變體O-RS的保守性氨基酸取代可出現(xiàn)在該O-RS的任何結(jié)構(gòu)域內(nèi)，包括氨基酸結(jié)合袋。
多核苷酸或核酸本文所用術(shù)語“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“寡核苷酸”、“多核苷酸”或“核酸分子”或類似的術(shù)語指通常經(jīng)由糖-磷酸骨架相連的堿基寡聚物，例如寡核苷酸或多核苷酸，及其各片段或部分，還指基因組或合成來源的DNA或RNA，可以是單鏈或雙鏈并代表有義鏈或反義鏈。術(shù)語“核酸”、“多核苷酸”和“核苷酸”還特別包括除五種生物學(xué)上存在的堿基(即，腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)以外的堿基堿基組成的核酸，還包括具有非天然骨架結(jié)構(gòu)的核酸，例如PNA分子。
據(jù)信核酸分子(例如，DNA或RNA)具有“5’端”和“3’端”是因為單核苷酸反應(yīng)以形成寡核苷酸或多核苷酸的方式使得一個單核苷酸戊糖環(huán)上的5’磷酸通過磷酸二酯鍵在一個方向上與其毗鄰的3’氧相連。因此，多核苷酸通常具有一個包含5’磷酸的“5’端”和一個包含3’氧的“3’端”。據(jù)信，多核苷酸序列(即使處于較大核酸的內(nèi)部)還可具有5’和3’方向性。在線形或環(huán)狀DNA分子中，不連續(xù)的元件稱為“下游”或3’元件的“上游”或5’。該術(shù)語反映出轉(zhuǎn)錄沿著DNA鏈以5’到3’的方式進(jìn)行這一事實。
基因本文所用的術(shù)語“基因”最常見是指多核苷酸元件的組合，當(dāng)這些元件以天然或重組方式操作性相連時能提供一些產(chǎn)物或功能。術(shù)語“基因”應(yīng)作廣泛解釋，包括基因的mRNA、cDNA、cRNA和基因組DNA形式。在一些情況中，基因是可遺傳的。在一些方面，基因包含產(chǎn)生多肽所需的編碼序列(例如，“開放讀框”或“編碼區(qū)”)，而在其它方面，基因不編碼多肽。不編碼多肽的基因的例子包括核糖體RNA基因(rRNA)和轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)基因。
術(shù)語“基因”可任選包括位于基因座的非編碼調(diào)節(jié)序列。例如，除了核酸的編碼區(qū)，術(shù)語“基因”還包括毗鄰編碼區(qū)的5’和3’端的全長mRNA的轉(zhuǎn)錄核苷酸序列。這些非編碼區(qū)的大小可變，一般同時在編碼區(qū)的5’和3’端上延伸。位于編碼區(qū)的5’和3’并包含在mRNA上的序列稱為5’和3’非翻譯序列(5’UT和3’UT)。5’和3’UT可起到調(diào)節(jié)作用，包括翻譯起始、翻譯后切割和聚腺苷酸化。術(shù)語“基因”包括基因的mRNA、cDNA和基因組形式。
在一些方面，基因的基因形式或基因組克隆包括轉(zhuǎn)錄mRNA的序列以及位于轉(zhuǎn)錄物以外的其它非轉(zhuǎn)錄序列。有時將位于mRNA轉(zhuǎn)錄物以外的調(diào)節(jié)區(qū)稱為“5’或3’側(cè)翼序列”?；虻墓δ芑蚪M形式通常包含調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄所需的調(diào)節(jié)元件。例如，通常利用術(shù)語“啟動子”描述足以賦予精確轉(zhuǎn)錄起始的DNA區(qū)域，通常(但不絕對)是轉(zhuǎn)錄起始位點的5’。在一些實施方式中，啟動子是組成型活性的，而在其它實施方式中，啟動子是條件活性的(例如，只在某些生理條件下啟動轉(zhuǎn)錄)。在原核生物中，可通過毗鄰的“操縱”序列調(diào)節(jié)啟動子的活性。在一些實施方式中，3’側(cè)翼區(qū)含有調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄終止的其它序列，有時稱為“終止子”序列。術(shù)語“調(diào)節(jié)元件”通常指控制核酸序列表達(dá)一些方面的任何遺傳學(xué)元件。
可表達(dá)核苷酸序列本文所用的“可表達(dá)核苷酸序列”指能轉(zhuǎn)錄(例如，由DNA-依賴性RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄)從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄物的任何核苷酸序列。轉(zhuǎn)錄物序列沒有限制，可以是編碼蛋白質(zhì)的(例如，能編碼氨?；?tRNA合成酶)或者可以是不編碼蛋白質(zhì)的(例如，能編碼tRNA分子)。
操作性連接當(dāng)本文所用的術(shù)語“可操作的組合”、“可操作的順序”、“操作性連接”、“操作性結(jié)合”以及類似的短語用于述及核酸時，這些術(shù)語指將核酸序列的連接置于使彼此有功能關(guān)系。例如，操作性連接的啟動子序列、開放讀框和終止子序列導(dǎo)致精確產(chǎn)生RNA分子。在一些方面，操作性連接的核酸元件導(dǎo)致開放讀框轉(zhuǎn)錄，最終產(chǎn)生多肽(即，表達(dá)開放讀框)。
操縱子本文所用的術(shù)語“操縱子”指在原核生物中控制基因表達(dá)的遺傳單位(例如，染色體區(qū)域)。操縱子通常包含編碼一種或多種多肽或RNA的一個或多個基因和控制基因轉(zhuǎn)錄的毗鄰調(diào)節(jié)區(qū)(或多個調(diào)節(jié)區(qū))。調(diào)節(jié)區(qū)通常包含啟動子和操縱基因(operator)。在歷史上，原核生物基因的編碼區(qū)稱為“順反子”。含有多個順反子的操縱子稱為“多順反子”。多順反子操縱子中的基因通常在功能上相關(guān)，一般作為一個單位共同轉(zhuǎn)錄進(jìn)而以協(xié)同方式表達(dá)。
構(gòu)建物本文所用的術(shù)語“構(gòu)建物”用于述及可將一個或多個核酸區(qū)段轉(zhuǎn)移入細(xì)胞中的任何多核苷酸序列或其它分子。術(shù)語“載體”或“運載體”有時可與“載體”互換使用。載體任選包含能介導(dǎo)載體增殖和操作的諸部分(例如，復(fù)制所需的序列、賦予藥物或抗生素抗性的基因、多克隆位點、能表達(dá)所克隆基因的操作性連接的啟動子/增強(qiáng)子元件，等等)。載體常衍生自質(zhì)粒、細(xì)菌噬菌體或植物或動物病毒?！翱寺≥d體”或“穿梭載體”或“亞克隆載體”含有有助于亞克隆步驟的操作性連接的諸部分(例如，含有多個限制性內(nèi)切酶位點的多克隆位點)。
表達(dá)載體本文所用的“表達(dá)載體”指包含有助于編碼序列在特定宿主生物中表達(dá)的操作性連接多核苷酸序列的重組載體(例如，細(xì)菌表達(dá)載體)。有助于在原核生物中表達(dá)的多核苷酸序列包括，例如啟動子，轉(zhuǎn)錄終止子序列，即終止子序列，操縱基因(任選的)和核糖體結(jié)合位點，還常有其它序列。
編碼本文所用的術(shù)語“編碼”指用多聚大分子或序列鏈中的信息來指導(dǎo)不同于該第一分子或序列鏈的第二種分子或序列鏈產(chǎn)生的任何過程。本文所用的該術(shù)語應(yīng)用廣泛，可用于各種領(lǐng)域。在一些方面，術(shù)語“編碼”描述了半保留DNA復(fù)制的過程，其中雙鏈DNA分子的一條鏈用作模板，通過依賴DNA的DNA合成酶來編碼新合成的互補姊妹鏈。
在另一方面，術(shù)語“編碼”指用一種分子的信息來指導(dǎo)產(chǎn)生化學(xué)性質(zhì)不同于該第一分子的第二種分子的任何過程。例如，DNA分子可編碼RNA分子(例如，通過依賴DNA的RNA聚合酶參與的轉(zhuǎn)錄過程)。RNA分子也可編碼多肽，例如翻譯過程。當(dāng)術(shù)語“編碼”用于描述翻譯過程時，其含義也延伸至編碼氨基酸的三聯(lián)密碼子。在一些方面，RNA分子可編碼DNA分子，例如通過依賴RNA的DNA合成酶參與的逆轉(zhuǎn)錄過程。在另一方面，DNA分子可編碼多肽，應(yīng)該知道該情況用“編碼”同時包括轉(zhuǎn)錄和翻譯過程。
異源本文所用的術(shù)語“異源”或“外源性”在應(yīng)用于多核苷酸或多肽時指經(jīng)重排或人工供應(yīng)生物學(xué)系統(tǒng)并處于非天然構(gòu)型(例如，就諸部分的序列、基因組位置或配置而言)或就特定生物學(xué)系統(tǒng)而言非天然的分子。該術(shù)語表明相關(guān)物質(zhì)源自除天然來源以外的來源，或指具有非天然構(gòu)型、遺傳位置或配置的諸部分的分子。有時術(shù)語“外源性”和“異源”可與“重組”互換使用。
重組術(shù)語“重組”述及核酸或多肽時表明該物質(zhì)(例如，重組核酸、基因、多核苷酸序列、多肽等)被人工干預(yù)所改變。重組分子諸部分的配置通常不是天然構(gòu)型，或者重組多核苷酸或多肽的一級序列在一定程度上被操作過?？蓪⑺鑫镔|(zhì)在其天然環(huán)境或狀態(tài)中或從其天然環(huán)境或狀態(tài)中取出以實施改變從而產(chǎn)生重組物質(zhì)。例如，如果借助人為干預(yù)在天然核酸的來源細(xì)胞內(nèi)改變該天然核酸，或使其從經(jīng)改變的DNA轉(zhuǎn)錄，該天然核酸轉(zhuǎn)變成重組核酸。如果將核苷酸序列從其天然環(huán)境中取出并克隆入任何類型的人工核酸載體中，基因序列開放讀框是重組體。術(shù)語“重組體”還指含有重組物質(zhì)的生物。產(chǎn)生重組分子，特別是重組核酸的方法和試劑是本領(lǐng)域普通且慣常的(參見，例如Maniatis等(編)，《分子克隆實驗室手冊》(Molecular CloningA LaboratoryManual)，冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，紐約，[1982]；Sambrook等(編)，《分子克隆實驗室手冊》，第二版，第1-3卷，冷泉港實驗室出版社，紐約，[1989]；和Ausubel等(編)，《分子生物學(xué)最新方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，第1-4卷，約翰威利父子公司(John Wiley & Sons，Inc.)，紐約，[1994])。
天然或內(nèi)源性與異源或外源性分子相反，“天然”或“內(nèi)源性”分子對于所研究的生物學(xué)系統(tǒng)、種類或染色體是天然的?！疤烊弧被颉皟?nèi)源性”基因是不含除自然界中正常發(fā)現(xiàn)的染色體外的來源編碼的核酸元件的基因。內(nèi)源性基因、轉(zhuǎn)錄物或多肽由其天然染色體基因座編碼，而非人工供應(yīng)給細(xì)胞的。
宿主細(xì)胞術(shù)語“宿主細(xì)胞”通常指含有異源核酸，例如載體并支持該核酸復(fù)制和/或表達(dá)的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，例如大腸桿菌或真核細(xì)胞，例如酵母菌、昆蟲、兩棲動物或哺乳動物細(xì)胞。宿主細(xì)胞優(yōu)選植物細(xì)胞。在本發(fā)明中，一種特別優(yōu)選的宿主細(xì)胞是大豆宿主細(xì)胞。
真核生物本文所用的術(shù)語“真核生物”指屬于真核生物界(KingdomEucarya)的生物。真核生物通常因其以下特征而區(qū)別于原核生物典型的多細(xì)胞組織(但不都是多細(xì)胞，例如酵母)，存在以膜分界的核與其它以膜分界的細(xì)胞器，線形遺傳物質(zhì)(即，線性染色體)，不存在操縱子，存在內(nèi)含子、信使(RNA)加帽和poly-A mRNA，以及其它生物化學(xué)特征，如不同的核糖體結(jié)構(gòu)。真核生物包括，例如動物(如哺乳動物、昆蟲、爬行動物、鳥等)，纖毛蟲，植物(如單子葉植物、雙子葉植物、藻類等)、真菌、酵母菌、鞭毛蟲類、微孢子蟲、原生動物等。
原核生物本文所用的術(shù)語“原核生物”指屬于原核生物界(也稱為原核生物(Procarya))的生物。原核生物通常因其以下特征而區(qū)別于真核生物單細(xì)胞組織，通過出芽或分裂的無性生殖，缺乏以膜分界的核與其它以膜分界的細(xì)胞器，環(huán)狀染色體，存在操縱子，不存在內(nèi)含子、信使(RNA)加帽和poly-AmRNA，以及其它生物化學(xué)特征，如核糖體結(jié)構(gòu)不同。原核生物包括真細(xì)菌和古菌(有時稱為“古細(xì)菌”)亞界。在原核生物界有時將藍(lán)細(xì)菌(藍(lán)綠藻)與支原體分為不同類別。
細(xì)菌本文所用的術(shù)語“細(xì)菌”和“真細(xì)菌”指不同于古菌的原核生物。類似地，古菌指不同于真細(xì)菌的原核生物?？筛鶕?jù)許多形態(tài)和生物化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)區(qū)分真細(xì)菌和古菌。例如，可采用核糖體RNA序列、RNA聚合酶結(jié)構(gòu)的差異，存在或不存在內(nèi)含子，抗生素敏感性，存在或不存在細(xì)胞壁肽聚糖和其它細(xì)胞壁組分，膜脂質(zhì)的分枝與不分枝結(jié)構(gòu)，存在/不存在組蛋白和組蛋白樣蛋白而將某生物指定為真細(xì)菌或古菌。
真細(xì)菌的例子包括大腸桿菌(Escherichia coli)、嗜熱棲熱菌(Thermusthermophilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)等)。古菌的例子包括詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)(Mj)、梅氏甲烷八疊球菌(Methanosarcina mazei)(Mm)、嗜熱堿甲烷桿菌(Methanobacteriurnthermoautotrophicum)(Mt)、海沼甲烷球菌(Methanococcus maripaludis)、甲烷嗜熱菌(Methanopyrus kandleri)、鹽細(xì)菌(Halobacterium)(例如沃氏富鹽菌(Haloferax volcanii)和鹽細(xì)菌種NRC-1)、閃爍古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)(Af)、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)(Pf)、極端嗜熱古菌(Pyrococcus horikoshii)(Ph)、好氧火球菌(Pyrobaculum aerophilum)、Pyrococcus abyssi、硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobus solfataricus)(Ss)、Sulfolobus tokodaii、嗜熱泉生古細(xì)菌(Aeuropyrum pernix)(Ap)、嗜酸熱原體(Thermoplasma acidophilum)和火山熱原體(Thermoplasna volcanium)。
衍生自本文所用的術(shù)語“衍生自”指分離自特定分子或生物，或是用特定分子或生物的信息制得的某組份。例如，衍生自第二多肽的多肽含有與該第二多肽的氨基酸序列相同或基本上類似的氨基酸序列。以多肽為例，可通過，例如天然產(chǎn)生的誘變、人工定向誘變或人工隨機(jī)誘變獲得衍生的種類。用于衍生多肽的誘變可以是有意定向或有意隨機(jī)的，或各方法的結(jié)合。誘變多肽以產(chǎn)生衍生自第一(多肽)的不同多肽可以是隨機(jī)的(例如，聚合酶失真所致)，而鑒定衍生的多肽可通過例如本文所述的合適篩選方法進(jìn)行。誘變多肽通常需要操作編碼該多肽的多核苷酸。
類似地，術(shù)語“衍生自”可應(yīng)用于多核苷酸序列。衍生自某來源多核苷酸序列的多肽可包括與該來源核苷酸序列相同或基本上類似的核苷酸序列。以多核苷酸為例，可通過例如，天然誘變、人工定向誘變或人工隨機(jī)誘變獲得衍生種類。用于衍生多核苷酸的誘變可以是有意定向或有意隨機(jī)的，或各方法的結(jié)合。在一些方面，通過將來源多核苷酸置于異源環(huán)境中(即不同于其天然或內(nèi)源性環(huán)境的環(huán)境)來產(chǎn)生衍生的多核苷酸。例如，可通過除去內(nèi)源性啟動子結(jié)構(gòu)域并將其置于與通常不相連的不同核苷酸序列操作性組合從而自內(nèi)源性基因啟動子衍生基因啟動子。
陽性選擇或篩選標(biāo)記本文所用的術(shù)語“陽性選擇或篩選標(biāo)記”指當(dāng)存在該標(biāo)記時(例如被表達(dá)或激活等)，可區(qū)分具有特征的細(xì)胞，例如具有陽性選擇標(biāo)記的細(xì)胞和不具有該特征的細(xì)胞。
陰性選擇或篩選標(biāo)記本文所用的術(shù)語“陰性選擇或篩選標(biāo)記”指當(dāng)存在該標(biāo)記時(例如被表達(dá)或激活等)可鑒定不含有所選特性或特征的細(xì)胞(例如，與確實具有該特性或特征的細(xì)胞相比)。
選擇或篩選試劑本文所用的術(shù)語“選擇或篩選試劑”指當(dāng)其存在時可從某群體中選擇/篩選某些組分的試劑。例如，選擇或篩選試劑可以是但不限于，如營養(yǎng)物、抗生素、某波長的光、抗體、表達(dá)的多核苷酸等。選擇試劑可根據(jù)例如濃度、強(qiáng)度等而不同。
報道分子(reporter)在總的意義上，本文所用的術(shù)語“報道分子”或其等價術(shù)語指在所研究的系統(tǒng)中不難檢測(報道分子的檢測與一些其它分子或特性的存在或不存在有關(guān))或可用于鑒定、選擇和/或篩選感興趣系統(tǒng)的靶標(biāo)的任何組分。最適用于特定應(yīng)用的報道分子的選擇取決于所需應(yīng)用和熟悉該領(lǐng)域之人已知的其它變量。在一些方面，報道分子是報道基因。
本領(lǐng)域已知各種報道分子和基因。各報道分子可具有檢測該報道分子的特定試驗。一些報道分子檢測試驗可以是酶試驗，而其它試驗的性質(zhì)可以是例如，免疫學(xué)試驗(例如，ELISA或免疫組化分析)或比色試驗。報道分子還可以包括蛋白質(zhì)，如能賦予抗生素抗性或敏感性的酶(如β-內(nèi)酰胺酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)等)、熒光篩選標(biāo)記(如綠色熒光蛋白(如GFP)、YFP、EGFP、RFP等)、冷光標(biāo)記(如螢火蟲螢光素酶蛋白)、親和力篩選標(biāo)記，酶活性，如lacZ(β-半乳糖苷酶)、或其它正或負(fù)可選擇標(biāo)記基因如、ADH(乙醇脫氫酶)、his3、ura3、leu2、lys2等。
附圖簡述

圖1提供了提供了四種非天然氨基酸的結(jié)構(gòu)和相應(yīng)的名稱即對-苯甲?；?L-苯丙氨酸(Bpa)、對-乙酰基-L-苯丙氨酸(pAcPhe)、對-疊氮基-L-苯丙氨酸(pAzPhe)和對-碘-L-苯丙氨酸(pIPhe)。
圖2提供了顯示含MjtRNA-Tyr(CUA)基因的proK啟動子和終止子、在BpaS基因中有D286R突變、BpaRS基因的突變形式glnS啟動子和/或多拷貝tRNA基因的質(zhì)粒的抑制效率直方圖。誤差棒表明標(biāo)準(zhǔn)偏差和n＝3。
圖3提供了所列抑制型質(zhì)粒表達(dá)的琥珀抑制型MjtRNA-Tyr(CUA)的Northern印跡分析化學(xué)發(fā)光圖像。
圖4提供了在野生型glnS啟動子和突變形式的glnS啟動子控制下表達(dá)BpaRS的蛋白質(zhì)進(jìn)行印跡分析后的化學(xué)發(fā)光圖像。該印跡利用抗-His(C-末端)抗體-HRP偶聯(lián)物(英杰公司(Invitrogen))。
圖5顯示了pSup-BpaRS-6TRN的質(zhì)粒圖譜。將其它合成酶基因從其相應(yīng)的pBK質(zhì)?？寺∪朐撡|(zhì)粒的NdeI/PstI位點。
圖6顯示了新系統(tǒng)對Bpa、pAcPhe、pAzPhe和Iphe摻入的抑制效率。誤差棒表明標(biāo)準(zhǔn)偏差和n＝3。
圖7提供了在沒有或有Bpa存在下表達(dá)的含有Bpa代替Ser-4的突變型肌紅蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡后的化學(xué)發(fā)光圖像。該印跡利用抗-His(C-末端)抗體-HRP偶聯(lián)物(英杰公司)。
圖8提供了本發(fā)明所用的各種多核苷酸和多肽序列。
發(fā)明詳述 本發(fā)明提供可用于有效地細(xì)菌表達(dá)在特定位點含一個或多個由選擇者密碼子(例如，琥珀無義密碼子)遺傳編碼的非天然氨基酸的突變型蛋白質(zhì)的改進(jìn)表達(dá)載體系統(tǒng)。這些系統(tǒng)利用本領(lǐng)域已知的正交翻譯技術(shù)體內(nèi)摻入非天然氨基酸。本發(fā)明不限于所用具體正交翻譯組分(即，具體正交氨?；?tRNA合成酶或具體正交抑制型tRNA)的任何方面。此外，在一些實施方式中，本發(fā)明提供可廣泛用于細(xì)菌表達(dá)載體系統(tǒng)中的改進(jìn)組合物和方法，所述系統(tǒng)不限于正交氨酰基-tRNA合成酶或抑制型tRNA。
本發(fā)明提供的新型表達(dá)載體元件能明顯提高真細(xì)菌(例如大腸桿菌)中非天然氨基酸摻入蛋白質(zhì)的效率并以高產(chǎn)率表達(dá)在特定位點含有選擇者密碼子遺傳指定的該非天然氨基酸的突變型蛋白。非天然氨基酸摻入感興趣蛋白質(zhì)的效率提高估計是因為(至少部分因為)正交氨?；?tRNA合成酶和抑制型tRNA的表達(dá)提高，雖然作出或利用本發(fā)明無需了解效率提高的機(jī)制。
除了表達(dá)正交氨?；?tRNA合成酶或正交抑制型tRNA外，本發(fā)明的新型表達(dá)載體元件與各種大腸桿菌表達(dá)載體骨架和大腸桿菌菌株相容，還不難改造用于表達(dá)感興趣的其它蛋白質(zhì)或tRNA。
在一些方面，本發(fā)明提供的新型表達(dá)載體元件可獨立用于不同質(zhì)粒上。在其它方面，可在多個質(zhì)粒中采用一種新型元件或元件組合。在其它實施方式中，同一質(zhì)粒上可聯(lián)用多個這些元件。本發(fā)明對細(xì)菌表達(dá)載體系統(tǒng)作出多種改進(jìn)，從而可用于提高包含一個或多個非天然氨基酸的突變型蛋白質(zhì)的表達(dá)，在一些情況中，本發(fā)明可更廣泛地應(yīng)用于提高感興趣的任何具體多肽或tRNA的表達(dá)。
例如，本發(fā)明可對細(xì)菌表達(dá)載體系統(tǒng)作出以下改進(jìn)。
(A)本發(fā)明提供正交氨?；?tRNA合成酶基因和正交抑制型tRNA基因攜帶在同一質(zhì)粒上的表達(dá)載體。這些簡化了這些正交組分的表達(dá)，而在以前不同的質(zhì)粒各自攜帶這二組分； (B)本發(fā)明提供衍生自大腸桿菌脯氨酸t(yī)RNA操縱子的改進(jìn)啟動子和終止子序列以表達(dá)異源tRNA序列，例如正交MjtRNA-Tyr(CUA)基因或任何其它正交tRNA基因。用于遞送啟動子和終止子序列的脯氨酸t(yī)RNA基因可以是大腸桿菌proK、proL或proM tRNA基因。
(C)本發(fā)明提供用于表達(dá)tRNA基因的改進(jìn)的重組多順反子操縱子，其中該操縱子中任何兩個tRNA基因被衍生自天然tRNA多順反子操縱子的接頭，例如天然存在于大腸桿菌valU和valX基因之間，或者例如ileT和alaT基因之間的接頭的異源接頭序列隔開。
(D)本發(fā)明提供衍生自大腸桿菌glnS啟動子的新型啟動子序列，從而能提高開放讀框，例如編碼正交氨?；?tRNA合成酶的開放讀框的表達(dá)。
用于共同表達(dá)O-tRNA和O-RS基因的載體系統(tǒng) 在一些方面，本發(fā)明提供正交氨酰基-tRNA合成酶基因和正交抑制型tRNA基因攜帶在同一質(zhì)粒上的表達(dá)載體。該元件是對現(xiàn)有技術(shù)的改進(jìn)，而以前需要用獨立攜帶O-tRNA和O-RS基因的兩個不同表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
如實施例所述，構(gòu)建了適用于共同表達(dá)O-tRNA和O-RS種類的一系列相關(guān)表達(dá)載體。這些質(zhì)粒包括 pYR-BpaRS1 pYR-BpaRS5 pYR-BpaRS5(D286R) pYR-BpaRS-TRN pYR-BpaRS-TRN(D286R) pYR-BpaRS-3TRN(D286R) pYR-BpaRS-6TRN(D286R) pSup-BpaRS-6TRN(D286R) pSup-pAcPheRS-6TRN pSup-pAzPheRS-6TRN pSup-pIPheRS-6TRN 這些質(zhì)粒各自是本發(fā)明的元件。然而，本發(fā)明不限于這些質(zhì)粒，技術(shù)人員應(yīng)知道構(gòu)建這些質(zhì)粒的變體也屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
例如，本發(fā)明的任何質(zhì)粒不應(yīng)限于表達(dá)任何具體O-tRNA和O-RS種類，從而能產(chǎn)生包含任何具體非天然氨基酸的蛋白質(zhì)。本文提供的例子描述了對對-苯甲?；?L-苯丙氨酸(Bpa)、對-乙酰基-L-苯丙氨酸(pAcPhe)、對-疊氮基-L-苯丙氨酸(pAzPhe)和對-碘-L-苯丙氨酸(pIPhe)具有tRNA負(fù)載特異性的MjtRNA-Tyr(CUA)(SEQ ED NO1)和四種不同O-RS種類的成功應(yīng)用(參見圖1和圖8，SEQ ID NO4、6、8和10)。
以上這些應(yīng)用例子只是描述本發(fā)明應(yīng)用其它O-tRNA和O-RS種類的更廣泛適用性。實際上，本發(fā)明可用于表達(dá)感興趣的任何O-tRNA或任何O-RS，特別是在真細(xì)菌細(xì)胞中優(yōu)化操作的正交翻譯組分。在一些方面，本發(fā)明特別可利用衍生自天然古菌(例如，詹氏甲烷球菌)氨酰基-tRNA合成酶的O-RS種類，或衍生自古菌tRNA的O-tRNA種類。許多來源描述了本領(lǐng)域已知可用于本發(fā)明的各種O-tRNA和O-RS種類。參見，例如國際
發(fā)明者柳榮夏, P·G·舒爾茨 申請人:斯克利普斯研究院