專利名稱：：突變基因的檢測方法
背景技術(shù)：
：例如人，易患病、藥物易見效、易出副作用等個體間不同的原因之一有時與基因的突變(基因的堿基多態(tài)性)有關(guān)。因此著眼于這樣的基因序列的差異，正在探討適合體質(zhì)的治療法的研究。另外，基因的堿基多態(tài)性也可成為很多疾病的遺傳標(biāo)志。因此這些堿基多態(tài)性的闡明在臨床上很重要，期待確立能夠檢測各種各樣的突變型基因的核酸序列分析法以及這些堿基多態(tài)性的鑒定法。另外，在感染癥的診斷領(lǐng)域中，有時感染起因菌通過基因突變而獲得耐藥性。因此為了判定自患者檢出的菌是否獲得了對該藥物的耐性，對從患者檢出的菌的基因突變進行檢測，這在診斷法上以及選擇治療法上特別重要。例如，已闡明人型結(jié)核菌(結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis))的利福平耐性的獲得與編碼分枝桿菌(Mycobacterium)屬的RNA聚合酶B亞基的rpoB基因(RNApolymeraseBsubunit)的突變有關(guān)，在約95%利福平耐性結(jié)核菌中觀察到rpoB基因中的突變。因此如果檢測該基因并判定有無基因突變，就可以判斷該結(jié)核菌是否有利福平耐性。另外，對于與結(jié)核菌的利福平耐性相關(guān)的rpoB基因上的突變，已報告了多個模式(VIVEKKAPUR等人，J.Clin.Microbiol.,1994,pl095-1098))。因此如果能夠同時檢測多個突變基因，預(yù)期可以提高診斷的準(zhǔn)確度和通量(在一定期間能夠處理的信息的量)。對于結(jié)核菌還研究了其它的與耐藥性有關(guān)的基因的突變，各種各樣的突變的樣式正變得明朗。作為有效檢測突變的其它例子，如MRSA的檢測。即，由于二甲氧基苯青霉素耐性葡萄球菌(MRSA)帶有mec基因，所以如果檢測mec基因，就了解了它的耐性(能夠檢測MRSA)。然而為了檢測點突變或單堿基多態(tài)性等突變基因的存在，由于必須要檢測龐大的基因組堿基序列中僅有的一個堿基的差別，所以要求非常高的特異性。作為現(xiàn)有的一般性的核酸序列分析技術(shù)，已知例如核酸序列確定法(測序法)、TaqManTM探針法(GenomeRes.，笫6巻，第986頁，1996)、RFLP(限制酶酶切片段長度多態(tài)性)法(J.Clin.Invest.,第72巻，第1262頁，1983)、ASP(等位基因特異的引物)法(WO01/42498號)、ASO(等位基因特異的寡探針(oligoprobe))法(Nature,第324巻，第163頁，1986)、單堿基延伸法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,第94巻，第10756頁，1997)、焦磷酸測序法(AnalyticalBiochemistry,第244巻,第367頁，1997)、Invader法(NatureBiotech.,第17巻，第292頁，1999)等。這些方法中，核酸序列確定法、TaqManTM探針法、RFLP法、ASO法、單堿基延伸法、焦磷酸測序法等是預(yù)先要利用聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReaction,PCR)等核酸擴增技術(shù)對含有突變或多態(tài)性的區(qū)域擴增之后進行檢測的方法。因此，首先獲得特異的擴增產(chǎn)物對于降低背景、獲得鮮明的信號非常重要。另外，Invader法從原理上講是即使不進行擴增反應(yīng)也能檢測突變或多態(tài)性的方法。然而，即使不進行擴增反應(yīng)進行檢測，往往是靈敏度不夠，實際上與別的方法同樣，預(yù)先對要檢測的測定對象的核苷酸進行特異的擴增是重要的。進一步地，ASP法是4吏用由約20堿基組成的對突變DNA特異的寡核苷酸和成為模板的DNA進行PCR，對突變等位基因進行特異擴增后，進行凝膠電泳，檢測突變等位基因帶存在的方法。該方法是適于有效檢查多個檢體的方法。然而，包括ASP法在內(nèi)的上述那樣的現(xiàn)有利用PCR的方法中，即使在引物中存在錯配，有時也可得到引物延伸產(chǎn)物，由于難于得到特異的擴增產(chǎn)物，所以存在著檢測的嚴(yán)密性問題。另夕卜，基于在自3，末端開始的第2位具有SNP部位的多態(tài)性特異引物可正確區(qū)分多態(tài)性的見解而對ASP法進行了改變的方法中，有使用自3，末端開始的第2位帶有并不與對象基因互補的堿基的核苷酸，在3，末端設(shè)定希望檢測的多態(tài)性部分的引物的方法。據(jù)報告，該方法與使用自3，末端開始的第2位帶有與對象基因互補的堿基的核苷酸的引物的情況相比，可改善3，末端存在的多態(tài)性部位的檢測(非專利文獻1)。然而在使用該方法的場合，即使在引物的3，末端存在錯配，有時也可得到引物延伸產(chǎn)物，所以存在著檢測準(zhǔn)確度的問題。進一步地，將寡核苷酸的核苷酸序列的3'末端配置為多態(tài)性部位，作為從3，末端開始的第3位核苷酸使用2，-0，4，-C-亞乙基核苷酸單元的寡核苷酸作為引物使用的方法也有報道(專利文獻l)。在該文獻中，使用從3'末端開始的第3位核苷酸是2，-0，4，-C-亞乙基核苷酸單元的與野生型序列互補的引物(專利文獻1的實施例1)、和同樣從3，末端開始的第3位核苷酸是2，-0，4，-C-亞乙基核苷酸單元的與突變型序列互補的引物(專利文獻1的實施例2)，以野生型樣品為才莫板進行PCR(專利文獻l的試驗例l)。此時對于使用與來自野生型DNA序列互補的引物的情況，確認(rèn)了基因被擴增，而對于使用與突變型序列互補的引物的情況，不能確認(rèn)基因被擴增。由此可以說根據(jù)該文獻，通過該方法可以選擇性地擴增基因。然而，僅就上述那樣的結(jié)果來說，還不能斷定與野生型序列互補的該引物對野生型的檢測是特異的。即，使用與野生型序列互補的引物，以來自野生型的DNA樣品作為模板進行PCR時，可得到引物延伸產(chǎn)物，而使用同樣的引物，以來自突變型的DNA樣品為模板進行PCR時不能得到引物延伸產(chǎn)物，如果不是這一結(jié)果，則不能證明該引物能夠特異地檢測野生型。實際上，在該方法中使用"擴增突變型的引物"對野生型基因的樣品進行PCR時，存在著可得到引物延伸產(chǎn)物(假陽性的出現(xiàn))的問題。即，使用該引物對于是野生型還是突變型不明的樣品進行PCR，即使得到引物延伸產(chǎn)物，也存在著不能判定該樣品是野生型還是突變型的問題。出現(xiàn)上述問題的原因認(rèn)為出自以下的理由。即，PCR中使用的耐熱性DNA聚合酶既具有5，—3'聚合酶活性，又具有3，—5'外切核酸酶活性。因此當(dāng)擴增突變型的引物與含有野生型基因的樣品結(jié)合時，與配置在引物的3，末端的突變核苷酸基因相同或與它互補的核苷酸堿基在PCR階段被耐熱性DNA聚合酶所具有的3，—5'外切核酸酶活性切斷了。因此，這個引物的3，末端完全識別本來不應(yīng)當(dāng)識別的野生型樣品的基因序列，由于DNA聚合酶的作用開始進行從引物序列開始的延伸反應(yīng)。其結(jié)果是，盡管的確使用了擴增突變型的引物，但由于以含有野生型基因的樣品作為才莫板進行了PCR、得到了引物延伸產(chǎn)物這樣的可以認(rèn)為是產(chǎn)生非特異擴增的原因。另外，一般所謂的特異性-f皮定義為將陰性判定為陰性的能力。因此，作為在利用核酸擴增反應(yīng)的突變或多態(tài)性的解析中使特異性提高的方法，可考慮抑制非特異的擴增(假陽性出現(xiàn))的方法。作為用于此目的的手段，可考慮擴增條件(提高退火溫度、減少循環(huán)數(shù)、減少酶量、變更酶的種類、減少dNTP濃度、減少Mg濃度、減少模板DNA濃度等)的最適化、引物設(shè)計的變更、利用抗體或適配子的熱啟動法的利用、作為特異性提高的修飾寡核苷酸(PNA和LNA等)的利用等。然而這些手段雖然有時對非特異擴增的抑制有效，但存在著效果不明顯，往往連特異的擴增都被抑制等各種各樣的缺點。由以上事實可看到現(xiàn)在處于希望確立排除假陽性的特異性高的檢測核酸序列突變的方法的現(xiàn)狀。專利文獻1特開2005-323583號7>凈艮專利文獻2特開平5-271224號/>才艮非專利文獻1Bloorganic&MedicalChemistrv，2003年，第11巻，p.2211畫222非專利文獻2VIVEKKAPUR等人，J.Clin.Microbiol.，第32巻，第4期，1994，pl095-1098非專利文獻3KojiMorita等人，Bioorganic&MedicinalChemistryLetters,第12巻，2002,p.73畫
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明要解決的課題本發(fā)明以提供特異性提高的基因序列中的突變的檢測方法和基因多態(tài)性檢測用試劑盒為課題。用于解決課題的手段本發(fā)明正是以解決上述課題為目的而做成的，包含下述(I)和(II)的組成。(I)核酸序列突變的檢測方法，其特征在于，以使用下述(a)~(d)中任一項所述的寡核苷酸或其鹽作為引物，以樣品中的核酸作為才莫板進行核酸擴增反應(yīng)，檢測反應(yīng)產(chǎn)物，(a)i)在3，末端部位具有與對象基因的突變核苷酸相同的核苷酸，ii)3，末端部位以外的部位與對象基因的核普酸序列相同，具有與可能存在上述突變核苷酸的上述對象基因上的位置5，側(cè)的對象基因的核苷#列相同的序列，iii)并且從3，末端開始的第2位核苷酸帶有能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾的寡核苷酸或其鹽，(b)i)在3，末端部位具有與對象基因的突變核苷酸互補的核苷酸，ii)3，末端部位以外的部位與對象基因的核苷酸序列互補，具有與可能存在上述突變核苦酸的上述對象基因上的位置3，側(cè)的對象基因的核苷^列互補的序列，iii)并且從3，末端開始的第2位核苷酸帶有能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾的寡核苷酸或其鹽，(c)i)在3，末端部位具有與對象基因的基準(zhǔn)核苷酸相同的核苷酸，ii)3'末端部位以外的部位與對象基因的核苷酸序列相同，具有與上述基準(zhǔn)核苷酸在上述對象基因上的位置5'側(cè)的對象基因的核苷^列相同的序列，iii)并且從3，末端開始的第2位核苷酸帶有能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾的寡核苷酸或其鹽，(d)i)在3，末端部位具有與對象基因的基準(zhǔn)核苷酸互補的核苷酸，ii)3，末端部位以外的部位與對象基因的核苷酸序列互補，具有與上述基準(zhǔn)核苷酸在上述對象基因上的位置3，側(cè)的對象基因的核苷酸序列互補的序列，iii)并且從3，末端開始的第2位核苷酸帶有能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾的寡核苷酸或其鹽。(II)核酸序列突變的檢測用試劑盒，其包含下述(a)~(d)中任一項所述的寡核苷酸或其鹽作為引物(a)i)在3，末端部位具有與對象基因的突變核苷酸相同的核苷酸，ii)3，末端部位以外的部位與對象基因的核苷酸序列相同，具有與可能存在上述突變核苷酸的上述對象基因上的位置5，側(cè)的對象基因的核苷,列相同的序列，iii)并且從3，末端開始的笫2位核苷酸帶有能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾的寡核苷酸或其鹽，(b)i)在3，末端部位具有與對象基因的突變核苷酸互補的核苷酸，ii)3'末端部位以外的部位與對象基因的核普酸序列互補，具有與可能存在上述突變核苷酸的上述對象基因上的位置3，側(cè)的對象基因的核苷^列互補的序列，iii)并且從3，末端開始的第2位核苷酸帶有能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾的寡核苷酸或其鹽，(c)i)在3，末端部位具有與對象基因的基準(zhǔn)核苷酸相同的核苷酸，ii)3，末端部位以外的部位與對象基因的核苷酸序列相同，具有與上述基準(zhǔn)核苷酸在上述對象基因上的位置5，側(cè)的對象基因的核苷^列相同的序列，iii)并且從3，末端開始的第2位核苷酸帶有能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾的寡核苷酸或其鹽、(d)i)在3，末端部位具有與對象基因的基準(zhǔn)核苷酸互補的核苷酸，ii)3'末端部位以外的部位與對象基因的核苷酸序列互補，具有與上述基準(zhǔn)核苷酸在上述對象基因上的位置3'側(cè)的對象基因的核苷酸序列互補的序列，iii)并且從3，末端開始的第2位核苷酸帶有能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾的寡核苷酸或其鹽。本發(fā)明者進行了有關(guān)基因突變的檢測方法的要解決如上述那樣的現(xiàn)有問題的研究。研究結(jié)果表明通過在3，末端設(shè)計基因突變位點，再于自3，末端開始的第2位設(shè)計配置了帶有能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾的核苷酸(有時也稱為核苷酸類似物)的寡核苷酸。然后當(dāng)使用該寡核苷酸作為PCR引物時，可以完全解決如上所述的例如由于PCR使用的DNA聚合酶的3，—5，外切核酸酶活性引起的1堿基缺失發(fā)生時導(dǎo)致模板的誤讀等問題，抑制成為假陽性的引物延伸產(chǎn)物的出現(xiàn)，使得高準(zhǔn)確度的基因突變檢測成為可能，從而完成了本發(fā)明。發(fā)明的效果本發(fā)明的檢測方法可以在例如結(jié)核癥診斷(治療)中認(rèn)為必須進行的菌的耐性研究的藥物感受性試驗中利用。特別是通過利用在線(in-Line)(芯片上(Onchip)PCR系統(tǒng))的分離檢測法，在l個試管(l個系統(tǒng))內(nèi)作為基因診斷項目可以同時進行結(jié)核菌和非結(jié)核性抗酸菌癥的基因診斷與耐藥性判定方面有^f艮大的效果。特別是在結(jié)核菌中，卯~95%的利福平耐性菌中存在rpoB的突變。因此如果實施本發(fā)明的檢測方法，可以在短時間內(nèi)檢測出患者結(jié)核菌的突變。如果那樣操作的話，對于患者是否感染利福平耐性菌可以迅速進行判定、處理。另外通過本發(fā)明可以一次對利福平耐性菌中rpoB基因上的多個突變的可能性進行檢測、判定。附圖的簡單說明圖1是實施例1得到的使用引物rpoB_2、以含有突變型rpoB基因序列一2的質(zhì)粒DNA作為模板通過使用嵌入劑法進行的實時PCR的結(jié)果為!^出得到的熔解曲線分析的結(jié)果。圖2是實施例1得到的使用引物rpoB—2、以含有野生型rpoB基因序列的質(zhì)粒DNA作為模板通過使用嵌入劑法進行的實時PCR的結(jié)果為基礎(chǔ)得到的熔解曲線分析的結(jié)果。圖3是比較例1得到的使用引物rpoB—2—n3、以含有突變型rpoB基因序列_2的質(zhì)粒DNA作為模板通過使用嵌入劑法進行的實時PCR的結(jié)果為基礎(chǔ)得到的熔解曲線分析的結(jié)果。圖4是比較例1得到的使用引物rpoB—2—n3、以含有野生型rpoB基因序列的質(zhì)粒DNA作為模板通過4吏用嵌入劑法進行的實時PCR的結(jié)果為基礎(chǔ)得到的熔解曲線分析的結(jié)果。圖5是實施例2得到的使用引物rpoB一6、以含有突變型rpoB基因序列一6的質(zhì)粒DNA作為模板通過使用嵌入劑法進行的實時PCR的結(jié)果為基礎(chǔ)得到的熔解曲線分析的結(jié)果。圖6是實施例2得到的使用引物rpoB一6、以含有野生型rpoB基因序列的質(zhì)粒DNA作為模板通過使用嵌入劑法進行的實時PCR的結(jié)果為基礎(chǔ)得到的熔解曲線分析的結(jié)果。圖7談實施例3得到的使用引物rpoB_2、引物rpoB一3和引物rpoB—4的混合引物、以含有突變型rpoB基因序列—2的質(zhì)粒DNA作為模板通過使用嵌入劑法進^f于的實時PCR的結(jié)果為基礎(chǔ)得到的熔解曲線分析的結(jié)果。圖8M實施例3得到的使用引物rpoB一2、引物rpoB一3和引物rpoB_4的混合引物、以含有突變型^08基因序列_3的質(zhì)粒DNA作為模板通過使圖9是實施例3得到的使用引物rpoB一2、引物rpoB—3和引物rpoB一4的混合引物、以含有突變型^08基因序列_4的質(zhì)粒DNA作為模板通過使圖10是比較例2得到的使用引物rpoB_2、引物rpoB一3和引物rpoB_4的混合引物、以含有野生型rpoB基因序列的質(zhì)粒DNA作為模板通過使用嵌入劑法進行的實時PCR的結(jié)果為基礎(chǔ)得到的熔解曲線分析的結(jié)果。用于實施發(fā)明的最佳方式本發(fā)明所涉及的核酸序列突變的檢測方法是這樣的核酸序列突變的檢測方法，其特征在于，以使用下述U)~(d)中任一項所述的寡核苷酸或其鹽作為引物，以樣品中的核酸作為模板進行核酸擴增反應(yīng)，檢測反應(yīng)產(chǎn)物，(a)i)在3，末端部位具有與對象基因的突變核苷酸相同的核苦酸，ii)3'末端部位以外的部位與對象基因的核苷酸序列相同，具有與可能存在上述突變核苷酸的上迷對象基因上的位置5'側(cè)的對象基因的核苷^列相同的序列，iii)并且從3，末端開始的第2位核苷酸帶有能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾的寡核普酸或其鹽，(b)i)在3，末端部位具有與對象基因的突變核苷酸互補的核苷酸，ii)3，末端部位以外的部位與對象基因的核苷酸序列互補，具有與可能存在上述突變核苷酸的上述對象基因上的位置3，側(cè)的對象基因的核苷#列互補的序列，iii)并且從3，末端開始的第2位核苷酸帶有能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾的寡核苷酸或其鹽，(c)i)在3，末端部位具有與對象基因的基準(zhǔn)核苷酸相同的核苷酸，ii)3，末端部位以外的部位與對象基因的核苷,列相同，具有與上述基準(zhǔn)核苷酸在上述對象基因上的位置5，側(cè)的對象基因的核苷酸序列相同的序列，iii)并且從3，末端開始的第2位核苷酸帶有能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾的寡核苷酸或其鹽、(d)i)在3，末端部位具有與對象基因的基準(zhǔn)核苷酸互補的核苷酸，ii)3，末端部位以外的部位與對象基因的核苷酸序列互補，具有與上述基準(zhǔn)核苷酸在上述對象基因上的位置3，側(cè)的對象基因的核苷酸序列互補的序列，iii)并且從3，末端開始的第2位核苷酸帶有能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾的寡核苷酸或其鹽。本發(fā)明中，作為"核^列突變"可列舉例如"基因多態(tài)性"。所謂"基因多態(tài)性"，以該領(lǐng)域中所使用的通常的意義使用，也稱為SNP(單核脊酸多態(tài)性singlenucleotidepolymorphism)。具體來說，例如在某個基因中，可以列舉其中的1個堿基置換為其它堿基的單堿基置換、1個堿基缺失的單堿基缺失、1個堿基插入的單堿基插入等。另外，在本發(fā)明中，所謂突變和堿基多態(tài)性指的是具有與野生型不同的核酸序列。一般將頻率不到1%的稱為突變、1%以上的稱為多態(tài)性，這里并不試圖嚴(yán)格區(qū)分使用。作為本發(fā)明所涉及的"對象基因"，是成為檢測核酸序列突變的對象的基因，可以列舉其核苷酸序列中的至少一部分已知，而且存在其核苷酸序列的突變的基因。具體來說，可以列舉例如人型結(jié)核菌的rpoB基因(非專利文獻2)、細(xì)胞色素P4501A2、細(xì)胞色素P4502A6、細(xì)胞色素P4502C9、細(xì)胞色素P4502C19、細(xì)胞色素P4502D6、細(xì)胞色素P4502E1、硫代嘌呤轉(zhuǎn)甲基酶、N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、UDP-葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶、HLA、TCRcx、APOE4、多巴胺D3受體、色氨酸羥化酶、血管緊張肽前體、血液凝固因子VII、瘦蛋白(leptin)等基因。另外，對基因中的突變數(shù)沒有特別限定。在本發(fā)明中，將沒引起突變(置換)、缺失、插入等本發(fā)明中的"核酸序列突變"的核苷酸序列(例如，野生型菌的基因的核苷酸序列等)稱為"基準(zhǔn)序列"。而該基準(zhǔn)序列中的可能引起突變的部位的核苷酸稱為"基準(zhǔn)核苷酸"。而所謂"突變核苷酸"指的是相對于基準(zhǔn)序列引起了突變的序列中突變部分的核苷酸。本發(fā)明中所謂"互補的核苷酸"以通常在該領(lǐng)域中使用的意思來使用。即，指的是構(gòu)成該核苷酸的核酸堿基與成為對象的核苷酸的堿基互補的核苷酸。另外，在本發(fā)明中有時將構(gòu)成核苷酸的核酸堿基以在本發(fā)明的領(lǐng)域中通常使用的縮略號表示(腺嘌呤表示為"A"、鳥噪呤表示為"G"、胞嘧#示為"C"、胸腺嘧噴束示為"T，，)。作為本發(fā)明所涉及的"寡核苷酸或其鹽，，中的"鹽"，例如與鈉、鉀、鋰等堿金屬形成的鹽；與釣、鎂等堿土類金屬形成的鹽；與鋁、鐵、鋅、銅、鎳、鈷等金屬形成的鹽；銨鹽等無機鹽；與叔辛胺、二芐胺、嗎啉、乙二胺、N-甲基葡糖胺、胍、二乙胺、三乙胺、二環(huán)己胺、N，N，-二千基乙二胺、氯代普魯卡因、普魯卡因、二乙醇胺、N-節(jié)基-苯乙胺、哌溱、四曱基銨、三羥甲基氨基甲烷等胺形成的鹽等有機酸鹽；以及與甘氨酸、賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、谷氨酸、天冬氨酸等氨基酸形成的鹽等。在本發(fā)明中涉及的"帶有能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾的核苷酸，，中，所謂"帶有能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾"指的是例如代替構(gòu)成核苷酸的通常的2-脫氧-D-核糖，而使用"能夠阻止核酸合成反應(yīng)的，，構(gòu)造的例如核糖衍生物或氧雜環(huán)丁烷衍生物。并且，當(dāng)使用3，末端結(jié)合有這樣的修飾的核苷酸或其鹽的寡核苷酸作為引物，進行下面的核酸擴增反應(yīng)時，所述修飾的核苷酸或其鹽能夠阻止核酸合成反應(yīng)，從而不能得到復(fù)制物(擴增產(chǎn)物)。作為本發(fā)明所涉及的"帶有能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾的核苷酸"的具體例子，可以列舉例如用下式[I(式中，B表示核酸堿基，R表示氧原子、-NH-基或低級亞烷基，R:表示氫原子或低級亞烷基。)或下式[II<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>(式中，B代表核酸堿基，R3代表氧原子、氮原子、-NH-基、或低級亞烷基。)表示的核苷酸衍生物。在上述式II和式[II中，作為以R!、R2和R3表示的低級亞烷基，可以列舉亞甲基、亞乙基、亞丙基、亞丁基、亞戊基、亞己基(可以是直鏈狀、分支狀或環(huán)狀中的任一種)。本發(fā)明所涉及的以式[I表示的帶有能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾的核苷酸的具體例子如下述表1所示。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>另外，本發(fā)明所涉及的以式[II1表示的帶有能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾的核苷酸的具體例子如下述表2所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>本發(fā)明所涉及的以式[I]表示的"帶有能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾的核脊酸，，可以根據(jù)例如KojiMorita等人，Bioorganic&MedicinalChemistryLetters,第12巻，2002，p.73-76(非專利文獻3)所述的合成方法，使用適當(dāng)?shù)牟牧线M行合成。另外，2'-0，4，-C-亞乙基橋接的核酸(ENA)還有市售品，也可以使用市售品。另外本發(fā)明所涉及的以式[II表示的"帶有能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾的核苷酸"可以才艮據(jù)例如特開平5-271224號^^艮(專利文獻2)所述的含有氧雜環(huán)丁烷環(huán)的核苷酸衍生物的合成方法，用適當(dāng)?shù)牟牧虾铣伞Ａ硗?，本發(fā)明所涉及的"帶有能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾的核苦酸"只要是具有上述那樣性質(zhì)的核苷酸，無論那種都可以使用，并不限定于上述表1和表2表示的核苷酸。作為本發(fā)明所涉及的引物，可以列舉(a)i)在3，末端部位具有與對象基因的突變核苷酸相同的核苷酸，ii)3，末端部位以外的部位與對象基因的核苷酸序列相同，具有與可能存在上述突變核苷酸的上述對象基因上的位置5，側(cè)的對象基因的核苷^列相同的序列，iii)并且從3，末端開始的第2位核苷酸帶有能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾的寡核苷酸或其鹽(以下有時稱為"引物a"。)，(b)O在3，末端部位具有與對象基因的突變核苷酸互補的核苷酸，ii)3，末端部位以外的部位與對象基因的核苷酸序列互補，具有與可能存在上述突變核苷酸的上述對象基因上的位置3，側(cè)的對象基因的核苷^列互補的序列，iii)并且從3，末端開始的第2位核苷酸帶有能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾的寡核苷酸或其鹽(以下有時稱為"引物b，，。)，(c)i)在3，末端部位具有與對象基因的基準(zhǔn)核苷酸相同的核苷酸，ii)3，末端部位以外的部位與對象基因的核苷^列相同，具有與上述基準(zhǔn)核苷酸在上述對象基因上的位置5，側(cè)的對象基因的核苷酸序列相同的序列，iii)并且從3，末端開始的第2位核苷酸帶有能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾的寡核苷酸或其鹽(以下有時稱為"引物c，，。)，或(d)i)在3，末端部位具有與對象基因的基準(zhǔn)核苷酸互補的核苷酸，ii)3，末端部位以外的部位與對象基因的核苷酸序列互補，具有與上述基準(zhǔn)核苷酸的上述對象基因上的位置3，側(cè)的對象基因的核苷*列互補的序列，iii)并且從3，末端開始的第2位核苷酸帶有能夠阻止核酸合成反應(yīng)的Jl"飾的寡核苷酸或其鹽(以下有時稱為"引物d"。)。本發(fā)明所涉及的引物，例如如果以設(shè)計引物a的情況為例，可以設(shè)計除了使與檢測對象的基因突變(例如基因多態(tài)性)有關(guān)的突變核苷酸配置在3，末端，作為從3，末端開始的第2位核苷酸配置如上所述的帶有能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾的核苷酸以外，寡核苷酸包含與檢測對象的突變核苷酸存在的上述對象基因上的位置5，側(cè)的上述對象基因的核苷*列相同的核酸序列的部分或全部，在考慮了解離溫度(Tm值)等之后，設(shè)計適當(dāng)區(qū)域的適當(dāng)長度的序列。當(dāng)設(shè)計引物b時，與檢測對象的基因(例如基因多態(tài)性)的突變核苷酸互補的核苦酸配置在3，末端，除此以外的寡核苷酸部分是含有與檢測對象的突變核苷酸可能存在的上述對象基因上的位置3'側(cè)的上述對象基因的核苷酸序列互補的核酸序列的部分或全部的寡核苷酸，其從3，末端開始的第2位核苷酸為如上所述帶有能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾的核苷酸的該寡核苷酸中，在考慮到解離溫度(Tm值)等因素之后，設(shè)計適當(dāng)區(qū)域的適當(dāng)長度的核苷^列。另外當(dāng)設(shè)計引物c時，使與"對象基因上的可引起突變的部位的基準(zhǔn)核苷酸"相同的核苷酸配置在3'末端部位，3'末端部位以外的部位作為與對象基因的核苷酸序列(基準(zhǔn)序列)相同的序列，具有與上述對象基因上的基準(zhǔn)核苷酸的某個位置5'側(cè)的對象基因的核苷,列相同的序列，并且從3，末端開始的笫2位核苷酸是帶有能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾的寡核苷酸中，在考慮了解離溫度(Tm值)等之后，設(shè)計適當(dāng)區(qū)域的適當(dāng)長度的核苷酸序列。另外，當(dāng)設(shè)計引物d時，使與"對象基因上的可引起突變的部位的基準(zhǔn)核苷酸"互補的核苷酸配置在3'末端部位，3'末端部位以外的部位與對象基因的核苷酸序列(基準(zhǔn)序列)互補，具有與上述基準(zhǔn)核苷酸在上述對象基因上的位置3，側(cè)的對象基因的核苷酸序列互補的序列，并且從3，末端開始的第2位核苷酸為帶有能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾的寡核苷酸中，在考慮了解離溫度(Tm值)等之后，設(shè)計適當(dāng)區(qū)域的適當(dāng)長度的核苷酸序列。作為本發(fā)明所涉及的引物的長度，考慮到用于維持作為引物序列的特異性必需的堿基數(shù)，優(yōu)選具有10堿基以上、更優(yōu)選具有20堿基以上長度的引物序列。例如包含15~30堿基的引物序列。為了獲得本發(fā)明所涉及的引物，有望通過使用用上述方法得到的本發(fā)明所涉及的帶有能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾的核苷酸和通常的核苷酸，運用本身公知的化學(xué)合成法進行制備。通過該方法可以容易、大量而且低成本地獲得恒定品質(zhì)的寡核苷酸。例如，通過4吏用在DNA的合成中通常應(yīng)用的DNA合成儀、運用通常的亞磷酰胺法合成寡核苷酸，按照使用陰離子交換柱層析的常規(guī)方法進行純化，可以得到目的的本發(fā)明寡核苷酸。另外，帶有本發(fā)明所涉及的"帶有能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾的核苷酸"的寡核苷酸可以利用專門從事核酸合成的賣主的客戶服務(wù)獲得。以下對本發(fā)明所涉及的核酸序列突變的檢測方法的原理進行說明。<原理1>當(dāng)使用本發(fā)明所涉及的引物a或引物b時例如當(dāng)希望檢測單堿基突變的核,列突變時，使上述引物a或引物b、以及與該引物配對，能夠在核酸擴增反應(yīng)中擴增目的序列部分的寡核苷酸引物，在反應(yīng)液中與樣品(含有要檢測的核酸序列突變的核苷酸序列的核酸)發(fā)生核酸擴增反應(yīng)。這樣一來，當(dāng)引物a或引物b的3，末端一致(堿基是互補的)時，即當(dāng)存在單堿基突變時，發(fā)生核酸擴增反應(yīng)。然而當(dāng)3，末端不一致(堿基不互補)時，即當(dāng)不存在單堿基置換時，就不發(fā)生核酸擴增反應(yīng)。<原理2>當(dāng)使用本發(fā)明所涉及的引物c或引物d時例如當(dāng)希望檢測單堿基突變的核,列突變時，使上述引物c或引物d、以及與該引物配對，能夠在核酸擴增反應(yīng)中擴增目的序列部分的寡核苷酸引物在反應(yīng)液中與樣品(含有要檢測的核酸序列突變的核苷酸序列的核酸)發(fā)生核酸擴增反應(yīng)。這樣一來，當(dāng)引物c或引物d的3，末端一致(堿基互補)時，即，當(dāng)是與檢測對象的基準(zhǔn)核苷酸相同的堿基時，發(fā)生核酸擴增反應(yīng)。然而當(dāng)3，末端不一致(堿基不互補)時，即存在單堿基突變時，就不發(fā)生核酸擴增反應(yīng).例如作為要檢測的基因多態(tài)性，當(dāng)著眼于人型結(jié)核菌的rpoB基因的突變時，根據(jù)上述〈原理1>進行檢測時使用的引物a可以像以下那樣設(shè)定。即，對于要檢測的rpoB基因突變，(i)與帶有突變的堿基的突變核苷酸相同的核苷酸出現(xiàn)在引物的3，末端，并且(ii)引物的3，末端部位以外的部位具有與上述突變核苷酸存在的上述rpoB基因上的位置5，側(cè)的rpoB基因的核苷*列相同的序列，而且(iii)從引物的3，末端開始的第2位核苷酸為帶有能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾的寡核苷酸或其鹽那樣進行設(shè)計。另外，作為例如要檢測的基因多態(tài)性，當(dāng)著眼于人型結(jié)核菌的rpoB基因的突變，根據(jù)上述〈原理2>進行檢測時的引物c可以像以下那樣設(shè)定。即，按照(i)在3，末端部位具有與rpoB基因的基準(zhǔn)核苷酸相同的核苷酸，(ii)引物的3'末端部位以外的部位與rpoB基因的核苷酸序列相同，具有與上述基準(zhǔn)核苷酸在上述rpoB基因上的位置5，側(cè)的rpoB基因的核苷酸序列相同的序列，而且(iii)從引物的3，末端開始的第2位核苷酸為帶有能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾的寡核苷酸或其鹽那樣進行設(shè)計。作為設(shè)計本發(fā)明所涉及的引物的方法，以下對用于用例如〈原理1>的方法檢測rpoB基因的突變的引物a進行設(shè)計的具體例子進行說明。人型結(jié)核菌rpoB基因及其利福平耐性(RFP耐性)的突變的種類和其基因上的位置由于VIVEKKAPUR等人，J.Clin.Microbiol.,第32巻，4期，1994，pl095-1098(非專利文獻2)的圖1有報道，所以參考該圖1所述，首先設(shè)定含有單堿基突變的序列。例如，就野生型的人型結(jié)核菌的rpoB基因來說，有時在編碼第511~533位的氮基酸的69堿基對的寡核苷酸部分中存在突變。野生型的人型結(jié)核菌中的69堿基對的寡核苷酸序列(作為"野生型的rpoB基因高突變區(qū)的序列")如下所示。5,畫CTGAGCCAATTCATGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTCGGCGCTGGGG-3，(序列號1)而作為這部分的突變之一，在野生型的rpoB基因高突變區(qū)序列中存在著從上述序列號1的序列的5'末端開始的第46位的堿基"C，，(胞嘧咬)變?yōu)?T"(胸腺嘧啶)的突變。因此可以設(shè)計成該突變出現(xiàn)在3，末端(即3'末端變成"T"那樣)，而其它部位的序列與野生型的rpoB基因高突變區(qū)的序列上的上述第46位堿基5，側(cè)的野生型的rpoB基因的核苷酸序列相同，而且作為引物發(fā)揮功能的長度的以下序列的寡核苷酸。畫出下劃線的堿基對應(yīng)于突變的堿基。5，畫GCTGTCGGGGTTGACCI誦3，(序列號7)然后將從上述序列的3，末端開始的第2位的堿基"C"設(shè)計成為帶有"本發(fā)明所涉及的能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾"的"C，，。以下將該經(jīng)修飾的引物定為"引物rpoB一2"。如果使用該引物進行核酸擴增反應(yīng)(PCR)，可以檢測野生型的rpoB基因高突變區(qū)的序列的第46位堿基有無"C"—"T"的突變。另外，作為另一個突變的例子，對于序列號l的寡核苷酸，在野生型的rpoB基因中存在著從該基因的5'末端開始的第68位的堿基"T"變?yōu)?C"的突變。因此可以設(shè)計成該突變出現(xiàn)在3，末端(即3，末端變成"C"那樣)、而其它部位的序列與野生型的rpoB基因高突變區(qū)的序列上的上述第68位堿基5，側(cè)的野生型的rpoB基因的核苷酸序列相同，而且作為引物發(fā)揮功能的長度的以下序列的寡核苷酸。畫出下劃線的堿基對應(yīng)于突變的堿基。5，-CCGACTGTCGGCGC￡-3，(序列號8)然后將從上述序列的3，末端開始的第2位的堿基"C"設(shè)計成為帶有"本發(fā)明所涉及的能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾"的"C"。以下將該經(jīng)修飾的引物定為"引物rpoB一6"。如果使用該引物進行核酸擴增反應(yīng)(PCR),可以檢測野生型的rpoB基因高突變區(qū)的序列的第68位堿基有無"T"—"C"的突變。另外作為另一個突變的例子，對于序列號l的寡核苷酸，在野生型的rpoB基因高突變區(qū)的序列中存在著從該基因的5，末端開始的第46位的堿基"C"變?yōu)?G"(鳥嘌呤)的突變。因此可以，沒計成該突變出現(xiàn)在3，末端(即3，末端變成"G"那樣)、而其它部位的序列與野生型的rpoB基因高突變區(qū)的序列上的上述笫46位堿基5，側(cè)的野生型的rpoB基因的核苷^列相同，而且作為引物發(fā)揮功能的長度的以下序列的寡核苷酸。畫出下劃線的堿基對應(yīng)于突變的堿基。5，漏GCTGTCGGGGTTGACCg-3，(序列號9)然后將從上述序列的3，末端開始的第2位的堿基"C"設(shè)計成為帶有"本發(fā)明所涉及的能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾，，的"C，，。以下將該經(jīng)修飾的引物定為"引物rpoB一3"。如果使用該引物進行核酸擴增反應(yīng)(PCR)，可以檢測野生型的rpoB基因高突變區(qū)的序列的第46位堿基有無"C"—"G"的突變。另外作為另一個突變的例子，對于序列號l的寡核苷酸，在野生型的rpoB基因高突變區(qū)的序列中存在著從該基因的5，末端開始的第47位的堿基"A"(腺噤呤)變?yōu)?T"的突變。因此可以設(shè)計成該突變出現(xiàn)在3，末端(即3，末端變成"T"那樣)、而其它部位的序列與野生型的rpoB基因高突變區(qū)的序列上的上述第47位堿基5，側(cè)的野生型的rpoB基因的核苷,列相同，而且作為引物發(fā)揮功能的長度的下列序列的寡核苷酸。畫出下劃線的堿基對應(yīng)于突變的堿基。5，陽CTGTCGGGGTTGACCCI-3，(序列號10)然后將從上述序列的3，末端開始的第2位的堿基"C"設(shè)計成為帶有"本發(fā)明所涉及的能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾"的"C"。以下將該經(jīng)修飾的引物定為"引物rpoB一4"。如果使用該引物進行核酸擴增反應(yīng)(PCR)，可以檢測野生型的rpoB基因高突變區(qū)的序列的第47位堿基有無"A"—"T"的突變。上述不過是設(shè)計本發(fā)明所涉及的引物的方法的一個例子，在檢測其它的突變時，也可以設(shè)計如上所述結(jié)構(gòu)的本發(fā)明所涉及的(a)(d)的寡核苷酸或其鹽。另外，本發(fā)明所涉及的引物也可以用標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記。作為用于用標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記本發(fā)明所涉及的引物的標(biāo)記物質(zhì)，只要是放射性同位素或酶、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、生物素等公知標(biāo)記物質(zhì)，可以使用任一種。例如，作為方文射性同位素如"P、33P、"S等，作為酶如堿性磷酸酶、西洋辣;f艮過氧化物酶等，作為熒光物質(zhì)如花菁染料(CyanineDye)體系的Cy3、Cy5(AmershamBioscience有限公司)、熒光素等，作為發(fā)光物質(zhì)如含有吖啶酯的化學(xué)發(fā)光試劑等。當(dāng)用放射性同位素對本發(fā)明所涉及的引物進行標(biāo)記，在合成引物時，如通過整合入凈iU文射性同位素標(biāo)記的核苷酸來標(biāo)記引物的方法、和合成引物后用放射性同位素進行標(biāo)記的方法等。具體來說，如一般常用的隨機引物法、切口平移法、通過T4多核苷酸激酶進行的5，-末端標(biāo)記法、使用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的3，-末端標(biāo)記法、RNA標(biāo)記法等。當(dāng)用酶標(biāo)記本發(fā)明所涉及的引物時可以使用使堿性磷酸酶、西洋辣根方法的直接標(biāo)i己法。當(dāng)用熒光物質(zhì)對本發(fā)明所涉及的引物進行標(biāo)記時可以通過該領(lǐng)域中的常規(guī)方法的標(biāo)記手法使例如熒光素標(biāo)記的核苷酸整合到引物中。另外，也可以用將帶有連接臂的核苷酸作為序列的寡核苷酸中的一員進行置換的方法(參照例如NucleicAcidsRes.，1986年，第14巻，p.6115)用熒光物質(zhì)對核苷酸進行標(biāo)記。此時通過特開昭60-50017號公報公開的合成法由脫氧尿苷化學(xué)合成在5位帶有連接臂的尿苷，在上迷寡核苷酸鏈中導(dǎo)入熒光物質(zhì)的方法。用發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記本發(fā)明所涉及的引物的方法以及用生物素標(biāo)記的方法進行。與上述那樣的本發(fā)明所涉及的引物配對，并通過核酸擴增反應(yīng)能夠?qū)δ康男蛄胁糠謹(jǐn)U增的寡核苷酸引物是能夠擴增可能含有檢測對象的公知基因序列中的目的突變序列部分的序列(目的序列部分)的適當(dāng)?shù)墓押塑账帷Ρ景l(fā)明所涉及的"使用本發(fā)明所涉及的寡核苷酸作為引物進行核酸擴增反應(yīng)時，與該寡核苷酸引物配對，通過核酸擴增反應(yīng)能夠?qū)δ康男蛄胁糠謹(jǐn)U增的寡核苷酸引物"進行設(shè)計的方法、以及作為獲得該引物的方法，有例3口利用Primer3(WhiteheadInstituteforBiomedicalResearch)等引物預(yù)測軟件，設(shè)法防止與本發(fā)明所涉及的引物發(fā)生干涉反應(yīng)而進行設(shè)計的方法。另外，在可使用的情況下，可以使用上述具有"使用本發(fā)明所涉及的寡核苷酸作為引物進行核酸擴增反應(yīng)時，與該寡核苷酸引物配對，通過核酸擴增反應(yīng)能夠?qū)δ康男蛄胁糠謹(jǐn)U增的"性質(zhì)的寡核苷酸引物和通常在該領(lǐng)域使用的引物。各種引物由于有銷售(例如M13正向引物，Takara-Bio公司制等)，也可以使用這些引物。作為本發(fā)明的"特征為使用引物，以樣品中的核酸作為才莫板進行核酸擴增反應(yīng)，檢測反應(yīng)產(chǎn)物的核酸序列突變的檢測方法"涉及到的"核酸擴增反應(yīng)"，如在該領(lǐng)域中通常進行的，例如使用本發(fā)明所涉及的引物，使引物與樣品中的核酸雜交,利用DNA聚合酶等進行核酸擴增[例如PCR(特開昭60-281號)、LAMP(環(huán)介導(dǎo)的等溫擴增)法(TsugunoriNotomi等人，NucleicAcidRes.，28，e63，2000)、ICAN(等溫的和嵌合引物起始的核酸擴增)法(臨床病理，51(11)，1061-1067，2003年11月)、LCR(連接膝漣反應(yīng))法(特開平4-211399號)、SDA(鏈置換擴增)法(特開平8-19394號)]使引物延伸的常規(guī)方法。包括PCR在內(nèi)的核酸擴增反應(yīng)的條件、操作法等可以依據(jù)該領(lǐng)域通常的常規(guī)方法進行。作為本發(fā)明所涉及的"對通過核酸擴增反應(yīng)得到的反應(yīng)產(chǎn)物進行檢測的方法"，例如嵌入劑法、TaqManTM實時PCR法(參照例如美國專利第5538848號所述)、MGBEclipse探針系統(tǒng)法(參照例如美國專利第5,801,155號所述)、分子信標(biāo)探4十才支術(shù)(MolecularBeaconsProbeTechnology)法(參照例如美國專利第5925517號所述)、LUX熒光引物(FluorogenicPrimer)法(InvitrogenCorporation)、摔滅探針PCR(Quenchingprobe-PCR;QP)法(參照例如美國專利第6,492,121號所述)，進行核酸擴增反應(yīng)后，對得到的引物延伸產(chǎn)物進行電泳，根據(jù)其結(jié)果進行檢測的方法，對使用標(biāo)記《1物進行核酸擴增反應(yīng)得到的引物延伸產(chǎn)物的標(biāo)記進行測定的方法等各種各樣的檢測法。有關(guān)對通過核酸擴增反應(yīng)得到的擴增產(chǎn)物(引物延伸產(chǎn)物)進行測定的方法，以以下4種方法為例，就各個方法進行說明，不用說并不限定于這些例子。(1)嵌入劑法、(2)TaqManTM實時PCR法、(3)進行核酸擴增反應(yīng)后，對得到的引物延伸產(chǎn)物進行電泳，根據(jù)其結(jié)果進行檢測的方法、(4)對使用標(biāo)記引物進行核酸擴增反應(yīng)得到的引物延伸產(chǎn)物的標(biāo)記進4亍測定的方法。(1)嵌入劑法可以利用使用公知嵌入劑進行實時PCR的通常的嵌入劑法。例如，使用本發(fā)明所涉及的引物以及與該引物配對的通過核酸擴增反應(yīng)能夠擴增目的序列部分的寡核苷酸引物和嵌入劑，利用通常的嵌入劑法進行實時PCR的方法。嵌入劑是特異結(jié)合雙鏈DNA后發(fā)熒光的試劑，如果照射激發(fā)光就發(fā)熒光。通過PCR反復(fù)進行擴增使DNA增加，嵌入劑被摻入該DNA。即，嵌入劑纟皮摻入到DNA的量由于與擴增產(chǎn)物的生成量成比例，通過檢測來自于嵌入劑的熒光強度，可以知道引物延伸產(chǎn)物的量。由于嵌入劑與所有的雙鏈DNA結(jié)合，因此可以以得到的熒光強度的測定結(jié)果為基礎(chǔ)進行熔解曲線分析。即，PCR后，一邊將得到的含有擴增產(chǎn)物的PCR反應(yīng)液的溫度慢慢地升高，一邊測定嵌入劑的熒光強度。最初由于擴增產(chǎn)物形成雙鏈，所以發(fā)熒光。然而，當(dāng)PCR反應(yīng)液的溫度達(dá)到某個特定的溫度，擴增產(chǎn)物解離為單鏈，嵌入劑的熒光急劇下降。此時的溫度是熔解溫度(Tm值)，是引物延伸產(chǎn)物的序列的固有值?？梢杂稍揟m值判定特異產(chǎn)物(目的產(chǎn)物)與非特異產(chǎn)物的峰。由于該嵌入劑法在實時PCR后不需要進行電泳，所以在臨床檢查(診斷)那樣的需要迅速判定突變時是有效的方法。作為本發(fā)明中使用的嵌入劑，只要是通常該領(lǐng)域中使用的嵌入劑，無論那種都可以用，例如SYBRTMGreenI(MolecularProbe公司的商品名)、溴乙錠、藥等。以下對本發(fā)明所涉及的"利用嵌入劑法的核酸序列突變的檢測方法"的例子進行說明。<方法(1)-1>使用本發(fā)明所涉及的引物a或引物b以及與該引物配對的通過核酸擴增反應(yīng)能夠擴增目的序列部分的寡核苷酸引物和作為嵌入劑的SYBRTMGreenI，使用從要檢測突變的樣品純化的純化DNA樣品作為模板，使用TaqDNA聚合酶進行實時PCR。然后測定嵌入到擴增產(chǎn)物的SYBRTMGreenl的熒光強度。為了檢測突變，可以進行例如擴增產(chǎn)物的熔解曲線分析。即，做成以橫軸為擴增產(chǎn)物(雙鏈DNA)的解離溫度、縱軸為熒光強度的一次微分(變化量)的熔解曲線，進^^的檢測。當(dāng)被檢測的引物延伸產(chǎn)物的峰的Tm值與預(yù)測到的通過使用上述引物組合的實時PCR被擴增的引物延伸產(chǎn)物的Tm值相同時，判定該純化DNA樣品中存在目的的核酸序列突變、即檢測對象的核酸序列突變。另外，也可以使用這樣的方法，首先對于作為模板使用的純化DNA樣品溶液的稀釋系列樣品分別擴增的產(chǎn)物做成以橫軸為擴增產(chǎn)物(雙鏈DNA)的解離溫度，縱軸為熒光強度的一次微分(變化量)的熔解曲線，進#%的檢測。當(dāng)各稀釋系列的各引物延伸產(chǎn)物的峰的Tm值相同時，判定純化DNA樣品中存在目的的核酸序列突變。另外，除了替代從要檢測突變的樣品中純化的純化DNA樣品，以來自野生型的純化DNA樣品作為模板以外，通過與上述同樣的方法進行實時PCR,同樣測定SYBRTMGreenl的熒光強度，也可以進行熔解曲線分析的對照實驗。此時由于樣品中不存在核酸序列突變，所以沒有檢測到熒光，當(dāng)然在熔解曲線分析中也不會出現(xiàn)峰。為了更確實核^列突變的判定，希望一起進行這樣的對照實驗。<方法(1)-2>使用本發(fā)明所涉及的引物c或引物d以及與該引物配對的通過核酸擴增反應(yīng)能夠擴增目的序列部分的寡核苷酸引物和嵌入劑SYBRTMGreenI，使用從要檢測突變的樣品純化的純化DNA樣品作為才莫板，使用TaqDNA聚合酶進行實時PCR。然后測定嵌入到擴增產(chǎn)物的SYBRTMGreenI的熒光強度。為了檢測突變，可以進行例如擴增產(chǎn)物的熔解曲線分析。即，做成以橫軸為擴增產(chǎn)物(雙鏈DNA)的解離溫度，縱軸為熒光強度的一次微分(變化量)的熔解曲線，進行峰的檢測。當(dāng)被檢測的引物延伸產(chǎn)物的峰的Tm值與預(yù)測到的通過使用上述引物組合的實時PCR被擴增的引物延伸產(chǎn)物的Tm值相同時，判定該純化DNA樣品中不存在目的的核酸序列突變。而當(dāng)Tm值不同時，判定該純化DNA樣品中存在目的的核,列突變。另外，也可以使用這樣的方法，首先對于作為模板使用的純化DNA樣品溶液的稀釋系列樣品分別擴增的產(chǎn)物，做成以橫軸為擴增產(chǎn)物(雙鏈DNA)的解離溫度、縱軸為熒光強度的一次微分(變化量)的熔解曲線，進行峰的檢測。當(dāng)各稀釋系列的各引物延伸產(chǎn)物的峰的Tm值相同時，判定純化DNA樣品中不存在目的的核,列突變。而當(dāng)Tm值不同時，判定該純化DNA樣品中存在目的的核酸序列突變。作為通過使用本發(fā)明所涉及的嵌入劑進行實時PCR檢測體系的核酸序列突變的檢測方法的一個例子，以使用上述的"引物^08_2"(相當(dāng)于本發(fā)明所涉及的引物a),當(dāng)檢測人型結(jié)核菌的proB基因的單堿基突變時(對上述的野生型的rpoB基因高突變區(qū)的序列中，從5，末端開始的第46位堿基"C"突變?yōu)?T"的突變進行檢測時。)(<方法(1)-1>)為例進行說明。首先通過公知方法從要檢測的核酸序列突變的樣品中中獲得純化DNA樣品。然后使用引物rpoB_2和與引物rpoB一2配對的能夠通過核酸擴增反應(yīng)擴增目的序列部分的寡核苷酸引物，進行例如像下述那樣的實時PCR。即，制備含有各50~2000nM的引物rpoB—2和與引物rpoB_2配對的能夠通過核酸擴增反應(yīng)擴增目的序列部分的寡核苷酸引物、原液約5000~100000倍稀釋(最終濃度)的SYBRTMGreenI(MolecularProbe公司商品名)、1.0~4.0mMMgCl2、80mMKCl、500jag/mLBSA、0.1%膽酸鈉、0.005~0.2%TritonX畫100、各0.2mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP、10~80單位/mL的TaqDNA聚合酶的10mMTris-HCl緩沖液(pH8.9)，作為PCR用反應(yīng)液。向20pL該PCR用反應(yīng)液中加入從要檢測突變的樣品中純化的純化DNA樣品lng，作為PCR用DNA樣品。將該樣品加到96孔反應(yīng)板的孔中，使用適當(dāng)?shù)膶崟rPCR檢測裝置等進行實時PCR。反應(yīng)反復(fù)進行30~50次循環(huán)，每1循環(huán)都測定相對于擴增產(chǎn)物嵌入的SYBRTMGreenI的熒光強度。然后，做成以橫軸為擴增產(chǎn)物(雙鏈DNA)的解離溫度、縱軸為熒光強度的一次微分(變化量)的熔解曲線，進行峰的檢測。此時，當(dāng)被檢測的引物延伸產(chǎn)物的峰的Tm值與預(yù)測到的通過使用上述？1物組合的實時PCR被擴增的引物延伸產(chǎn)物的Tm值相同時，判定該純化DNA樣品中存在檢測對象rpoB基因的突變。峰的Tm值相同時，判定在純化DNA樣品中存在rpoB基因的突變的方法。另外，作為對照，可通過常規(guī)方法合成含有野生型的人型結(jié)核菌DNA的rpoB基因的寡核苷酸，或通過常規(guī)方法從野生型的人型結(jié)核菌提取、純化含有rpoB基因的寡核苷酸。然后，除了替代"從要檢測突變的樣品中純化的純化DNA樣品，，，以此純化的樣品作為模板以外，通過與上述同樣的方法進行實時PCR，同樣測定SYBRTMGreenl的熒光強度，也可以進行熔解曲線分析。此時由于樣品中不存在核酸序列突變，所以沒有檢測到來自引物延伸產(chǎn)物的熒光，當(dāng)然在熔解曲線分析中也不會出現(xiàn)峰。為了更確實核酸序列突變的判定，希望一起進行這樣的對照實驗。另外，作為使用本發(fā)明所涉及的引物c或引物d，通過上述〈方法(1)-2>檢測人型結(jié)核菌的rpoB基因的單堿基突變的方法，可列舉例如以下的方法。即，使用以野生型的人型結(jié)核菌的上述proB基因高突變區(qū)的序列為基礎(chǔ)設(shè)計的本發(fā)明所涉及的引物c或引物d和與該引物配對的通過核酸擴增反應(yīng)能夠擴增目的序列部分的寡核苷酸引物以及嵌入劑，作為模板使用從要檢測突變的樣品純化的純化DNA，與上述<方法(1)-1>同樣利用公知嵌入劑法進行實時PCR法，同樣進行熔解曲線分析。此時當(dāng)通過熔解曲線分析檢測的引物延伸產(chǎn)物的峰的Tm值與預(yù)測到的通過使用上述引物組合的實時PCR被擴增的引物延伸產(chǎn)物的Tm值相同時，判定在該純化DNA樣品中不存在目的的rpoB基因的突變。而當(dāng)沒有得到同一的Tm值峰時，判定在該純化DNA樣品中存在目的的rpoB基因的突變。另外，當(dāng)經(jīng)熔解曲線分析得到的純化DNA樣品溶液的各稀釋系列的各引物延伸產(chǎn)物的峰的Tm值相同時，判定在該純化DNA樣品中不存在rpoB基因的突變。另外，也可以使用當(dāng)峰的Tm值不同時，判定在該純化DNA樣品中存在rpoB基因的突變的方法。另外，也可以使用本發(fā)明所涉及的引物a、b、c或d中的一種進行實時PCR，也可以同時使用多種本發(fā)明所涉及的引物，同樣進行實時PCR。當(dāng)樣品DNA中存在某種突變時，在使用一種引物時只能判定樣品DNA存在該一種突變。與此相反，當(dāng)同時使用多種引物時，由于通過使用的多種引物一次可判定樣品DNA中能夠檢測的究竟是哪種突變，在要求判定迅速的臨床檢查的領(lǐng)域中非常有效。作為使用多種本發(fā)明所涉及的引物時的例子，可以列舉例如使用多種引物a的情形、使用多種引物b的情形、使用引物a(多種)和引物b(多種)適當(dāng)組合的情形。例如，當(dāng)檢測結(jié)核菌的proB基因突變，使用引物rpoB_2進行實時PCR時，用引物rpoB_2能夠檢測的突變，即野生型的rpoB基因高突變區(qū)的序列中，只能判定是否存在第46位堿基"C"—"T"的突變，但當(dāng)存在其它突變時不能判定存在突變。與此相反，如果同時使用例如引物rpoB_2、引物rpoB_2_n3、引物rpoB_6和引物rpoB_3同樣進行實時PCR,如果在樣品DNA存在第46位堿基"C"—"T"、第68位的堿基"T"—"C"、第46位的堿基"C，，—"G"、第47位的堿基"A"—"T"中的任一種突變，由于通過熔解曲線分析可得到峰，所以可以判定該樣品存在上述4種突變中的哪種rpoB基因的突變。另外通過對峰出現(xiàn)位置進行解析，也可以判斷4種突變中具體是何種突變。(2)TaqManTM實時PCR法本發(fā)明的核酸序列突變的檢測方法也可以使用TaqMan實時擴增檢測法(參照例如美國專利第5210015號、美國專利第5538848號所述)。所謂TaqMan實時擴增檢測法(TaqMan實時PCR法)，更具體來說，是通過使用5，末端用例如FAM等熒光色素(報道)標(biāo)記，3，末端用例如TAMRA等淬滅色素標(biāo)記的探針的實時PCR法(參照例如美國專利第5538848號所述)能夠高靈敏度、而且定量地檢測目的的微量DNA的方法。以下對TaqMan實時PCR法的原理進行說明。即，使用5，末端用熒光色素(報道分子)標(biāo)記，3'末端用淬滅色素標(biāo)記的與目的基因的特定區(qū)域雜交的寡核苷酸探針。該探針在通常狀態(tài)下，報道分子的熒光^f皮淬滅色素抑制。在使該熒光探針完全與目的基因完全雜交的狀態(tài)下，自其外側(cè)使用DNA聚合酶進行PCR。通過DNA聚合酶使得延伸反應(yīng)進行，通過其外切核酸酶活性將熒光探針從5，端水解掉，使報道色素游離，發(fā)出熒光。在TaqManTM實時PCR法中，通過對該熒光強度進行實時監(jiān)測可以正確對模板DNA的初期量進行定量。作為在本發(fā)明所涉及的TaqManTM實時PCR檢測法中使用的、S，末端用熒光色素(報道分子)、3'末端用淬滅色素標(biāo)記的探針中使用的探針，可以使用具有用所選擇的正向引物和反向引物組合進行實時PCR時得到的(預(yù)測被擴增)引物延伸產(chǎn)物的堿基序列的探針、或具有再由該序列設(shè)計的堿基序列的探針。另外，作為對5'末端進行標(biāo)記的"^艮道熒光物質(zhì)，如羧基熒光素(FAM)、六氯熒光素(HEX)、四氯熒光素(TET)、Cy5(AmershamBioscience有限公司)等，其中優(yōu)選FAM。作為對3，末端進行標(biāo)記的淬滅色素，如羧基四曱基羅丹明(TAMRA)等熒光物質(zhì)、BlackHoleQuencher色素(例如BHQ2)，4-((4-(二甲基氨基)苯基)偶氮)苯甲酸(DABCYL)等非熒光物質(zhì)，其中優(yōu)選TAMRA。TaqMan實時PCR法中使用的其它的脫氧核糖核苷三磷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、DNA聚合酶等試劑可以使用通常的實時PCR中使用的試劑。TaqMan實時PCR的方法除了使用本發(fā)明所涉及的引物和探針以外，可按照TaqMan實時PCR的一般程序進行。以下對本發(fā)明所涉及的"運用TaqMan實時PCR檢測法進行的核酸序列突變的檢測方法"的例子進4亍說明。<方法(2)-1>使用本發(fā)明所涉及的引物a或引物b以及與該引物配對的通過核酸擴增反應(yīng)能夠擴增目的序列部分的寡核苷酸引物，另外，由預(yù)測到通過使用該引物的組合進行PCR被擴增的引物延伸產(chǎn)物的核^列設(shè)計具有適當(dāng)長度的寡核苷酸，用常規(guī)方法進行合成。使用該寡核苷酸的5，末端用報道色素標(biāo)記，3，末端用淬滅色素標(biāo)記的產(chǎn)物作為標(biāo)記探針，以從要檢測突變的樣品純化的純化DNA樣品作為模板，進行TaqMan實時PCR。當(dāng)測定到來自報道色素的熒光時，可判定該純化DNA樣品中存在目的的核酸序列突變。在實施方法<(2)-1>時，與嵌入劑法的情況同樣，希望一起進行使用來自野生型的純化DNA樣品作為模板的對照實驗。<方法(2)-2>使用本發(fā)明所涉及的引物c或引物d以及與該引物配對的通過核酸擴增反應(yīng)能夠擴增目的序列部分的寡核苷酸引物，另外，由通過使用該引物的組合的PCR而預(yù)測被擴增的引物延伸產(chǎn)物的核酸序列設(shè)計具有適當(dāng)長度的寡核苷酸，通過常規(guī)方法進行合成。使用該寡核苷酸的5'末端用報道色素標(biāo)記，3，末端用淬滅色素標(biāo)記的產(chǎn)物作為標(biāo)記探針，以從要檢測突變的樣品純化的純化DNA樣品作為模板，進行TaqMan實時PCR。在測定到來自報道色素的熒光時，可判定該純化DNA樣品中不存在目的的核酸序列突變。而當(dāng)沒有測定到熒光時，可判定在該純化DNA樣品中存在目的的核酸序列突變。也可以使用本發(fā)明所涉及的多種引物進行TaqMan實時PCR，從而同時判定多個突變，這與運用上述嵌入法的情況相同。作為本發(fā)明所涉及的運用TaqManTM實時PCR檢測法檢測核酸序列突變的檢測方法的一個例子，以使用上述"引物^08_2",檢測人型結(jié)核菌的proB基因的單堿基突變的情況(對于上述的野生型的rpoB基因高突變區(qū)的序列中，從5，末端開始的第46位堿基"C，，突變?yōu)?T"的突變進行檢測時。)(<方法(2)-1>)為例說明如下。首先通過公知方法由要檢測核酸序列突變的樣品中得到純化DNA樣口口o然后，由預(yù)測到的通過4吏用引物rpoB一2和與引物rpoB_2配對的通過核酸擴增反應(yīng)能夠擴增目的序列部分的寡核苷酸引物的組合進行PCR而被擴增的引物延伸產(chǎn)物的核^列設(shè)計具有適當(dāng)長度的寡核苷酸，用常規(guī)方法進行合成。通過常規(guī)方法在該寡核苷酸的5'末端結(jié)合報道色素FAM，3，末端結(jié)合淬滅色素(報道消光體)的TAMRA，得到標(biāo)記探針。然后使用引物rpoB—2和與引物rpoB一2配對的通過核酸擴增反應(yīng)能夠擴增目的序列部分的寡核苷酸引物以及上述得到的標(biāo)記探針，例如像下述那樣進行TaqManTM實時PCR。即，制備含有各1|iM的引物rpoB一2和與引物rpoB一2配對的通過核酸擴增反應(yīng)能夠擴增目的序列部分的寡核苷酸引物、100~1000nM的標(biāo)記探針、1.0~4.0mMMgCl2、80mMKC1、500|ig/mLBSA、0.1%膽酸鈉、0.005~0.2%TritonX國lOO、各0.2mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP、10~80單位/mL的TaqDNA聚合酶的10mMTris-HCl緩沖液(pH8.9)，作為PCR用反應(yīng)液。向20|aL的PCR用反應(yīng)液中加入lng的從要檢測突變的樣品純化的純化DNA樣品，作為PCR用DNA樣品。然后將樣品加到96孔反應(yīng)板的孔中，使用適當(dāng)?shù)膶崟rPCR檢測裝置等進行實時PCR。反應(yīng)反復(fù)進行30~50次循環(huán)，每1循環(huán)都測定來自報道色素的熒光強度。此時當(dāng)測定到來自報道色素的熒光時，可判定純化DNA樣品中存在目的的rpoB基因突變。另外如上所述那樣，希望一起進行使用含有野生型的人型結(jié)核菌rpoB基因的純化DNA樣品作為模板的對照實驗。作為使用本發(fā)明所涉及的引物c或引物d，運用上述<方法(2)-2>檢測人型結(jié)核菌的rpoB基因的單堿基置換的方法，可以列舉例如以下的方法。即，運用以野生型的人型結(jié)核菌的上述proB基因高突變區(qū)序列為基礎(chǔ)設(shè)計的本發(fā)明所涉及的引物c或引物d以及與該引物配對的通過核酸擴增反應(yīng)能夠擴增目的序列部分的寡核苷酸引物和用與上述方法<方法(2)-1>同樣的方法制備的標(biāo)記探針，與上述<方法(2)-1>同樣地進行TaqManTM實時PCR。此時，對于測定到來自報道色素的熒光的情形，可判定為在該純化DNA樣品中不存在目的的rpoB基因的突變。而當(dāng)沒有測定到熒光時可判定為在該純化DNA樣品中存在目的的rpoB基因的突變。另外，至于本發(fā)明的檢測方法中的核酸擴增工程，除了實時PCR之外，可以適用利用RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的檢測法。例如NASBA(基于核酸序列的擴增)法(日本專利第2650159號)、3SR(自我維持的序列復(fù)制)法(特公平7-114718號)、TAS(基于轉(zhuǎn)錄的擴增系統(tǒng))法(特表平2-500565號國際公開WO88/10315號)、TMA(轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增)法(特開平11-46778號)等，其中利用逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA聚合酶的協(xié)同作用(在逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA聚合酶協(xié)同作用那樣的條件下進行反應(yīng))的恒定溫度核酸擴增法適于使測定系統(tǒng)自動化。(3)進行核酸擴增反應(yīng)后，對得到的引物延伸產(chǎn)物進行電泳，根據(jù)電泳結(jié)果進行的方法作為該方法，可以列舉例如"以包括下述步驟為特征的核酸序列突變的檢測方法(i)使用從本發(fā)明所涉及的引物a、引物b、引物c或引物d選擇的引物和與該引物配對的通過核酸擴增反應(yīng)能夠擴增目的序列部分的寡核苷酸引物，以樣品中的核酸為模板進行核酸擴增反應(yīng)(PCR)，(ii)對上述(i)得到的引物延伸產(chǎn)物進行電泳，根據(jù)電泳結(jié)果對核^列突變進行檢測"。作為進行電泳，根據(jù)電泳結(jié)果檢測核酸序列突變的方法，例如(3-1)通過確認(rèn)目的大小(堿基對數(shù))的引物延伸產(chǎn)物部分進行檢測的方法、(3-2)通過使用標(biāo)記探針的雜交進行檢測的方法等。電泳法的條件、操作方法等可以依據(jù)該領(lǐng)域中通常使用的常規(guī)方法。(3-1)通過確認(rèn)目的大小(堿基對數(shù))的引物延伸產(chǎn)物部分進行檢測的方法作為通過確認(rèn)目的大小(堿基對數(shù))的引物延伸產(chǎn)物部分進行檢測的方法，例如，首先進行PCR，然后對得到的引物延伸產(chǎn)物進行電泳。預(yù)先對預(yù)測到通過利用本發(fā)明所涉及的引物、以及與該引物配對的通過核酸擴增反應(yīng)能夠擴增目的序列部分的寡核苷酸引物的組合進行PCR被擴增的擴增產(chǎn)物的大小(堿基對數(shù))進行預(yù)測。然后通過常規(guī)方法確認(rèn)得到的部分的大小是否與預(yù)測的擴增產(chǎn)物的大小相當(dāng)。例如，通過用溴乙錠等對得到的部分染色，進行可視化的方法來根據(jù)該擴增產(chǎn)物的特征性大小進行檢測(確認(rèn))等方法。以下對本發(fā)明所涉及的"通過確認(rèn)目的大小(堿基對數(shù))的引物延伸產(chǎn)物部分進行檢測的方法"的例子進行說明。<方法(3-1)-1>選擇本發(fā)明所涉及的引物a或引物b以及與該引物配對的通過核酸擴增反應(yīng)能夠擴增目的序列部分的寡核苷酸引物。預(yù)先對預(yù)測到使用該引物組合進行PCR而被擴增的擴增產(chǎn)物的大小(堿基對數(shù))進行預(yù)測。使用該引物的組合，使用從要檢測突變的樣品純化的純化DNA樣品作為模板進行PCR，對得到的引物延伸產(chǎn)物進行電泳。然后可以通過常規(guī)方法確認(rèn)得到的部分的大小是否與預(yù)測的擴增產(chǎn)物的大小相當(dāng)。例如，通過將得到的行檢測，當(dāng)確認(rèn)得到的部分的大小與預(yù)測的擴增產(chǎn)物的大小相當(dāng)時，判定在該純化DNA樣品中存在目的的核酸序列突變。<方法(3-1)_2>選擇本發(fā)明所涉及的引物c或引物d以及與該引物配對的通過核酸擴增反應(yīng)能夠擴增目的序列部分的寡核苷酸引物。預(yù)先對預(yù)測到使用該引物組合進行PCR而被擴增的擴增產(chǎn)物的大小(堿基對數(shù))進行預(yù)測。使用該引物的組合，使用從要檢測突變的樣品純化的純化DNA樣品作為模板進行PCR，對得到的引物延伸產(chǎn)物進行電泳。然后可以通過常規(guī)方法確認(rèn)得到的部分的大小是否與預(yù)測的擴增產(chǎn)物的大小相當(dāng)。例如，通過將得到的行檢測，當(dāng)確iU尋到的部分的大小與預(yù)測的擴增產(chǎn)物的大小相當(dāng)時，判定在該純化DNA樣品中不存在目的的核^列突變。而當(dāng)不能確認(rèn)那樣的部分時，可判定在該純化DNA樣品中存在目的的核酸序列突變。使用多種本發(fā)明所涉及的引物如上所述進行PCR和電泳，也可以同時對多個突變進行判定，這與運用上述嵌入法的情況相同。作為運用本發(fā)明所涉及的(3-1)的方法檢測核酸序列突變的檢測方法的一個例子，以使用上述的"引物rpoB一2"，對人型結(jié)核菌的proB基因的單堿基突變進行檢測的情況(上述的野生型的rpoB基因高突變區(qū)的序列中，對從5，末端開始的第46位堿基"C"突變?yōu)?T"的突變進行檢測時。)(<方法(3-1)-1>)為例i兌明力口下。首先運用公知方法從要檢測核酸序列突變的樣品中得到純化DNA樣口口,然后，使用引物rpoB一2以及與該引物rpoB一2配對的通過核酸擴增反應(yīng)能夠擴增目的序列部分的寡核苷酸引物，使用從要檢測突變的樣品純化的純化DNA樣品作為模板進行PCR。然后對得到的引物延伸產(chǎn)物進行電泳。預(yù)先對預(yù)測到使用該引物組合進行PCR而被擴增的擴增產(chǎn)物的大小(堿基對數(shù))進行預(yù)測。然后可以通過常規(guī)方法確認(rèn)得到的部分的大小是否與預(yù)測的擴增產(chǎn)物的大小相當(dāng)。當(dāng)確i人得到的部分的大小與預(yù)測的擴增產(chǎn)物的大小相當(dāng)時，可判定在該純化DNA樣品中存在目的的rpoB基因的突變。另外，作為使用本發(fā)明所涉及的引物c或引物d,運用上述<方法(3-l)-2〉檢測人型結(jié)核菌的proB基因的單堿基突變的方法，可列舉如下的方法。即，使用以野生型的人型結(jié)核菌的上述rpoB基因高突變區(qū)序列為基礎(chǔ)設(shè)計的引物c或引物d以及與該引物配對的通過核酸擴增反應(yīng)能夠擴增目的序列部分的寡核苷酸引物，以從要檢測突變的樣品純化的純化DNA樣品作為才莫板，與上述方法<方法(3-1)-1>同樣地進行PCR。然后對得到的引物延伸產(chǎn)物進行電泳。預(yù)先對預(yù)測到使用該引物組合進行PCR而被擴增的擴增產(chǎn)物的大小(堿基對數(shù))進行預(yù)測。然后可以通過常規(guī)方法確認(rèn)得到的部分的大小是否與預(yù)測的擴增產(chǎn)物的大小相當(dāng)。當(dāng)確認(rèn)得到的部分的大小與預(yù)測的擴增產(chǎn)物的大小相當(dāng)時，可判定在該純化DNA樣品中不存在目的的rpoB基因的突變。而當(dāng)不能確認(rèn)那樣的部分時，可判定在該純化DNA樣品中存在目的的rpoB基因的突變。(3-2)通過使用標(biāo)記探針的雜交進行判定的方法作為通過使用標(biāo)記探針的雜交進行判定的方法，例如以下的方法。首先對PCR擴增產(chǎn)物進行電泳。然后使用用標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記的含有要檢測的序列的寡核苷酸作為標(biāo)記探針，將得到的部分與該標(biāo)記探針進行雜交。然后通過對該標(biāo)記探針的標(biāo)記進行檢測，確認(rèn)有無與該標(biāo)記探針雜交的部分存在，檢測核酸序列突變的存在。作為該方法中使用的"含有要檢測的序列的寡核苷酸，，，如具有預(yù)測通過使用該引物組合進行PCR而被擴增的擴增產(chǎn)物的堿基序列的寡核苷酸，或進一步由該序列設(shè)計的具有適當(dāng)長度的寡核苷酸。對該方法中使用的探針進行標(biāo)記的標(biāo)記物質(zhì)的具體例子、以及探針的標(biāo)記方法與上述的標(biāo)記引物中使用的標(biāo)記物質(zhì)和引物的標(biāo)記方法相同。對本發(fā)明所涉及的"通過使用標(biāo)記探針的雜交進行判定的方法"的例子說明如下。<方法(3-2)-1>使用本發(fā)明所涉及的引物a或引物b以及與該引物配對的通過核酸擴增反應(yīng)能夠擴增目的序列部分的寡核苷酸引物，使用從要檢測突變的樣品純化的純化DNA樣品作為模板進行PCR，對得到的引物延伸產(chǎn)物進行電泳。預(yù)先制備用標(biāo)記物質(zhì)對含有要檢測序列的寡核苷酸進行了標(biāo)記的標(biāo)記探針。將得到的部分與該標(biāo)記探針進行雜交。然后通過對該標(biāo)記探針的標(biāo)記進行檢測，當(dāng)確認(rèn)與該標(biāo)記探針雜交的部分存在時，可判定在該純化DNA樣品中存在目的的核^列突變。<方法(3-2)-2〉使用本發(fā)明所涉及的引物c或引物d以及與該引物配對的通過核酸擴增反應(yīng)能夠擴增目的序列部分的寡核苷酸引物，使用從要檢測突變的樣品純化的純化DNA樣品作為模板進行PCR。對得到的引物延伸產(chǎn)物進行電泳。預(yù)先制備用標(biāo)記物質(zhì)對含有要檢測序列的寡核苷酸進行了標(biāo)記的標(biāo)記探針。將得到的部分與該標(biāo)記探針進行雜交。然后通過對該標(biāo)記探針的標(biāo)記進行檢測，當(dāng)確認(rèn)與該標(biāo)記探針雜交的部分存在時，判定在該純化DNA樣品中不存在目的的核酸序列突變。另外，當(dāng)不能確認(rèn)這樣的部分時，判定在該純化DNA樣品中存在目的的核酸序列突變。也可以使用本發(fā)明所涉及的多種引物如上所迷進行PCR和電泳，同時判定多個突變，這與運用上述嵌入法的情況相同。作為本發(fā)明所涉及的運用(3-2)的方法檢測核酸序列突變的檢測方法的一個例子，以使用上述的"引物rpoB一2",檢測人型結(jié)核菌的proB基因的單堿基突變的情況(對于上述的野生型的rpoB基因高突變區(qū)的序列中，從5，末端開始的第46位堿基"C"突變?yōu)?T"的突變進行檢測時。)(<方法(3-2)-1>)為例說明如下。首先通過公知方法由要檢測核酸序列突變的樣品中得到純化DNA樣品。然后，通過使用引物rpoB一2和與引物rpoB_2配對的通過核酸擴增反應(yīng)能夠擴增目的序列部分的寡核苷酸引物，使用從要檢測突變的樣品純化的純化DNA樣品作為模板進行PCR。然后對得到的引物延伸產(chǎn)物進行電泳。預(yù)先才艮據(jù)通過使用該引物組合的PCR預(yù)測到^L擴增的擴增產(chǎn)物的核酸序列設(shè)計用作探針的具有適當(dāng)長度的序列，通過常規(guī)方法合成該序列的寡核苷酸。用標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記該寡核苷酸后預(yù)先制作標(biāo)記探4h得到的部分與該標(biāo)記探針進行雜交。通過對該標(biāo)記探針的標(biāo)記進行檢測，當(dāng)確認(rèn)與該標(biāo)記探針雜交的部分存在時，則判定在該純化DNA樣品中存在目的的rpoB基因的突變。另夕卜，作為使用本發(fā)明所涉及的引物c或引物d，運用上述<方法(3-2)-2〉檢測人型結(jié)核菌的rpoB基因的單堿基突變的方法，可以列舉例如以下的方法。即，使用以野生型的人型結(jié)核菌的上述rpoB基因高突變區(qū)序列為基礎(chǔ)設(shè)計的引物c或引物d以及與該引物配對的通過核酸擴增反應(yīng)能夠擴增目的序列部分的寡核苷酸引物，用從要檢測突變的樣品純化的純化DNA樣品作為模板，與上述<方法(3-2)-1>同樣進行PCR和電泳。根據(jù)預(yù)先預(yù)測到通過使用該引物組合進行PCR而被擴增的擴增產(chǎn)物的核酸序列設(shè)計用作探針的具有適當(dāng)長度的序列，通過常規(guī)方法合成該序列的寡核苷酸。用標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記該寡核普酸后，事先制備標(biāo)記探針。得到的部分與該標(biāo)記探針進行雜交。通過對該標(biāo)記探針的標(biāo)記進行檢測，當(dāng)確認(rèn)與該標(biāo)記探針雜交的部分存在時，可判定在該純化DNA樣品中不存在rpoB基因的突變。而當(dāng)不能確認(rèn)那樣的部分時，判定在該純化DNA樣品中存在目的的rpoB基因的突變。(4)對使用標(biāo)記引物進行核酸擴增反應(yīng)得到的引物延伸產(chǎn)物的標(biāo)記進行測定的方法作為這樣的方法，可以列舉使用用上述方法對本發(fā)明所涉及的引物進行了標(biāo)記的標(biāo)記引物和與該標(biāo)記引物配對的能夠進4亍核酸擴增反應(yīng)的寡核苷酸引物(沒有標(biāo)記)，用樣品中的核酸作為模板進行PCR,對得到的引物延伸產(chǎn)物的標(biāo)記進行測定的方法。對該例說明如下。<方法(4)-1>使用標(biāo)記的引物a或標(biāo)記的引物b以及與該標(biāo)記引物配對的能夠進行核酸擴增反應(yīng)的寡核苷酸引物(沒有標(biāo)記)，用從要檢測突變的樣品純化的純化DNA樣品作為模板進行PCR。然后除去游離的標(biāo)記引物，測定引物延伸產(chǎn)物的標(biāo)記。當(dāng)能夠檢測標(biāo)記時，判定在該純化DNA樣品中存在目的的核^列突變。<方法(4)-2>使用標(biāo)記的引物c或標(biāo)記的引物d以及與該標(biāo)記引物配對的能夠進行核酸擴增反應(yīng)的寡核苷酸引物(沒有標(biāo)記)，用從要檢測突變的樣品純化的純化DNA樣品作為模板進行PCR。然后除去游離的標(biāo)記引物，測定引物延伸產(chǎn)物的標(biāo)記。當(dāng)能夠檢測標(biāo)記時，可判定在該純化DNA樣品中不存在目的的核酸序列突變。而當(dāng)不能檢測標(biāo)記時判定為在該純化DNA樣品中存在目的的核酸序列突變。作為在上述方法除去游離的標(biāo)記引物的方法，如通過使核酸沉淀的常規(guī)方法(乙醇沉淀法、使用異丙醇的沉淀法等)使進行PCR后得到的反應(yīng)物中的引物延伸產(chǎn)物沉淀后，除去含有未沉淀的游離標(biāo)記引物的上清的方法等。另外，還可以列舉將進行PCR得到的反應(yīng)物在適當(dāng)條件下經(jīng)凝膠層析處理后，將引物延伸產(chǎn)物與游離的標(biāo)記引物分離的方法以及通過電泳法進行分離的方法等。另外，至于本發(fā)明的核,列突變的檢測方法中使用的試劑，可以使用通常在該領(lǐng)域中使用的試劑類，例如緩沖劑、穩(wěn)定劑、防腐劑等，且其不妨礙共存的試劑等的穩(wěn)定性，不抑制PCR或雜交反應(yīng)。而試劑的濃度可以從通常該領(lǐng)域中通常使用的濃度范圍適宜選擇。緩沖液的具體例子，例如Tris緩沖液、磷酸緩沖液、佛羅那緩沖液、硼酸緩沖液、Good緩沖液等通常在實施PCR或雜交反應(yīng)時使用的緩沖液，200780008760.5說明書第39/54頁其pH也沒有特別限定，通常優(yōu)選5~9的范圍。另外，根據(jù)需要可以使用核酸合成酶(DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等)、酶相應(yīng)的底物(dNTP、rNTP等)、以及雙鏈嵌入劑(溴乙錠、SYBRTMGreen等)或FAM和TAMRA等標(biāo)記檢測物質(zhì)等。作為本發(fā)明所涉及的核酸序列突變的檢測用試劑盒，如"含有下述(a)~(d)任一項所述的寡核苷酸或其鹽作為引物的核酸序列突變的檢測用試劑盒，(a)i)在3，末端部位具有與對象基因的突變核苷酸相同的核苷酸，ii)3，末端部位以外的部位與對象基因的核苷酸序列相同，具有與可能存在上述突變核苷酸的上述對象基因上的位置5'側(cè)的對象基因的核苷^列相同的序列，iii)并且從3，末端開始的第2位核普酸帶有能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾的寡核苷酸或其鹽，(b)i)在3，末端部位具有與對象基因的突變核苷酸互補的核苷酸，ii)3'末端部位以外的部位與對象基因的核苷酸序列互補，具有與可能存在上述突變核苷酸的上述對象基因上的位置3'側(cè)的對象基因的核苷^f列互補的序列，iii)并且從3，末端開始的第2位核苷酸帶有能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾的寡核苷酸或其鹽，(c)i)在3，末端部位具有與對象基因的基準(zhǔn)核苷酸相同的核苷酸，ii)3，末端部位以外的部位與對象基因的核苷i^列相同，具有與上述基準(zhǔn)核苷酸在上述對象基因上的位置5，側(cè)的對象基因的核苷酸序列相同的序列，iii)并且從3，末端開始的第2位核苷酸帶有能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾的寡核苷酸或其鹽，或(d)i)在3，末端部位具有與對象基因的基準(zhǔn)核苷酸互補的核苷酸，ii)3，末端部位以外的部位與對象基因的核普酸序列互補，具有與上述基準(zhǔn)核苷酸在上述對象基因上的位置3，側(cè)的對象基因的核苷酸序列互補的序列，iii)并且從3，末端開始的第2位核苷酸帶有能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾的寡核苷酸或其鹽"。構(gòu)成這些試劑盒的構(gòu)成試劑的優(yōu)選方式和具體例子如上所述。另外在上述的試劑盒中，如還可含有"l)核苷三磷酸、2)核酸合成酶、3)與該寡核苷酸配對的通過核酸擴增反應(yīng)能夠擴增目的序列部分的寡核苷酸、以及4)PCR緩沖液"的試劑盒。作為上述2)的核酸合成酶，例如DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等。作為上述4)的PCR緩沖液而使用的緩沖液的具體例子，例如Tris緩沖液、磷酸緩沖液、佛羅那緩沖液、硼酸緩沖液、Good緩沖液等通常實施PCR或雜交反應(yīng)時使用的所有緩沖液，其pH也沒有特別限定，通常優(yōu)選5~9的范圍。另外在本發(fā)明的核#列突變的檢測用試劑盒中根據(jù)需要還可以含有對應(yīng)于酶的底物(dNTP、rNTP等)、以及例如SYBRTMGreenI(MolecularProbe公司商品名，溴乙錠、藥等雙鏈嵌入劑、FAM和TAMRA等標(biāo)記檢測物質(zhì)等。另外還可以含有穩(wěn)定劑、防腐劑等，例如不妨礙共存的試劑等的穩(wěn)定性、不抑制PCR或雜交反應(yīng)的穩(wěn)定劑、防腐劑。而這些試劑的濃度也可以從通常該領(lǐng)域中使用的濃度范圍適宜選擇。作為本發(fā)明所涉及的核酸序列的檢測中使用的材料，如從檢體采取的血漿、血清、髓液、各種生體組織的成分提取液、組織切片、糞便、尿等來自生物體的樣品。又如來自上述各種組織的細(xì)胞等。作為例如人型結(jié)核菌的突變的檢測中使用的材料，如喀痰、經(jīng)支氣管采取物、咽喉粘液、胃液、支氣管清洗液、胸水等穿刺液等各種臨床材料。作為本發(fā)明所涉及的核酸序列突變的檢測中使用的樣品，如含有核酸的樣品。也可以是從上述材料分離、純化的核酸、或通過核酸擴增檢測體系等擴增的核酸。以下舉出實施例和比較例，對本發(fā)明進行更具體的說明，但本發(fā)明并不限定于這些實施例。另夕卜，在實施例和比較例中，作為核酸堿基表示的"A，，表示腺嘌呤，"G"表示鳥嘌呤，"C"表示胞嘧啶，"T"表示胸腺嘧啶。實施例實施例l.耐藥性結(jié)核菌的模型檢測實驗l(1)質(zhì)粒DNA的構(gòu)建1)含有突變型rpoB基因序列—2的質(zhì)粒DNA的構(gòu)建參考VIVEKKAPUR等人報告的rpoB基因高突變區(qū)的序列(非專利文獻2:J.Clin.Microbiol"第32巻，4期，1994.pl095-1098，圖1)，通過以下的方法按照基因工程原理制備"具有結(jié)核菌rpoB基因上的1堿基突變的序列的質(zhì)粒DNA，，。而該rpoB基因高突變區(qū)的堿基序列在人型結(jié)核菌(結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis))和牛型結(jié)核菌(牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis))中是相同的。首先以從牛分枝桿菌BCG(牛型結(jié)核菌，菌林編號RIMD1314006，日本細(xì)菌學(xué)會)提取、純化的基因組DNA作為起始材料，根據(jù)生物化學(xué)實驗法47PCR實驗手冊駒野徹編著所述的公知PCR法進行部位特異的突變導(dǎo)入法，對處于結(jié)核菌基因組DNA中的rpoB基因高突變區(qū)部分的序列(序列號1)的5，末端開始的第46位堿基(在野生型中為"C，，)，進行使它突變?yōu)?T"的突變導(dǎo)入。將導(dǎo)入了突變的DNA片段使用QIAGEN公司生產(chǎn)的柱子進行純化后，插入克隆載體(Invitrogen公司生產(chǎn))。然后使用QIAprepSpinMiniprepKit(QIAGEN公司生產(chǎn))，對含有目的序列的質(zhì)粒DNA進行用上述方法得到的質(zhì)粒DNA含有下述序列號3的堿基序列。以下將該序列號3表示的堿基序列記為"突變型rpoB基因序列一2"。在"突變型rpoB基因序列—2"的序列中，從該5，端開始的第64位用下劃線表示的堿基對應(yīng)于從rpoB基因高突變區(qū)的序列的5，末端開始的第46位堿基。而在野生型的rpoB基因中該部分的堿基是"C"，而在"突變型rpoB基因序列一2"中突變?yōu)?T"。序列號3:5'陽TTCTTCGGCACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATGGACCAGAACGGGG-3'(突變型rpoB基因序列—2)2)含有野生型rpoB基因序列的質(zhì)粒DNA的構(gòu)建rpoB基因序列的質(zhì)粒DNA。即，該質(zhì)粒DNA含有用下述序列號2表示的堿基序列。序列號2:5'國TTCTTCGGCACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTCGGCGCTGGGG陽3，(2)突變型rpoB基因檢測用引物(引物rpoB—2)的構(gòu)建以突變型rpoB基因序列一2為^i^出用下述方法設(shè)計引物。首先，(i)將突變型rpoB基因序列一2的導(dǎo)入突變的位點，即從其5，末端開始的第64位堿基"T"配置為相當(dāng)于引物的3，末端，(ii)引物的其它序列配置為與突變型^08基因序列_2的5'末端的第64位堿基"T"5，側(cè)的16個堿基序列相同，而且(iii)按照從引物的3，末端開始的第2位堿基"C，，變成用2，-0，4'-C-亞乙基橋接的核酸修飾的"C"那樣設(shè)計突變型rpoB基因檢測用引物序列。將這樣設(shè)計的寡核苷酸記為"引物rpoB—2"。"引物rpoB一2"的堿基序列如以下序列號7所示。即，在下述序列號7的堿基序列中帶有下劃線的核苷酸的3，末端(野生型為"C")突變?yōu)?T"的部分。而從3，末端開始的第2位的堿基"C"是用2'-0，4，-C-亞乙基橋接的核酸修飾的"C"。序列號7:5'-GCTGTCGGGGTTGACCI-3，設(shè)計的"引物rpoB_2"可以利用SigmaGenosys公司的客戶服務(wù)(customservice)獲得。(3)通過實時PCR檢測進行突變型rpoB基因的檢測和假陽性出現(xiàn)的判定1)PCR用DNA才羊品的制備通過測定上述(l)得到的含有突變型rpoB基因序列_2的質(zhì)粒DNA樣品的吸光度，測定質(zhì)粒DNA樣品中的DNA量。然后制備使用lOmMTris-HCl緩沖液(pH8.9)將質(zhì)粒DNA樣品稀釋為105，104，103，102個拷貝/ML的稀釋系列的樣品，作為PCR用DNA樣品。2)PCR用反應(yīng)液的制備制備含有上述(2)得到的引物rpoB一2和通用引物(M13正向引物、Takara-Bio公司)各300nM、原液30倍稀釋(最終30000倍稀釋)的發(fā)色試劑SYBRTMGreenI(MolecularProbe公司商品名)、1.5mMMgCl2、80mMKCl、500|Jg/mLBSA、0.1%膽酸鈉、0.1%TritonX-100、dATP、dCTP、dGTP、dTTP各0.2mM、和TaqDNA聚合酶(Mppongene生產(chǎn))40單位/mL的10mMTris-HCl(pH8.9)，作為PCR用反應(yīng)液。而此次作為與引物rpoB一2組合的引物，使用M13正向引物，這是由于此次PCR用DNA樣品使用了含有突變型rpoB基因序列—2的質(zhì)粒DNA的緣故(以下同)。3)實時PCR作為模板DNA(擴增靶)使用上述(l)l)制備的含有突變型rpoB基因序列—2的質(zhì)粒DNA進行實時PCR。而在以下方法中運用嵌入法進行定量監(jiān)測，進行實時PCR的結(jié)果的研究、評價。即，將上述(3)1)制備的各稀釋系列的PCR用DNA樣品1jjL、以及200780008760.5說明書第44/54頁上述(3)2)制備的PCR用反應(yīng)液19jiiL加入到96孔反應(yīng)板(MicroAmpoptical96孑L反應(yīng)板，AppliedBiosystem的日本公司制)的孔中，使用TaqManTMPCR專用熱循環(huán)儀檢測器(ABI7500,AppliedBiosystem的日本公司制)進行實時PCR。即，于95'C保溫10分鐘后，反復(fù)進行40次循環(huán)的于95。C15秒鐘、60°Cl分鐘的反應(yīng)。然后測定相對于擴增產(chǎn)物嵌入的SYBRTMGreenI的熒光強度。另夕卜，作為模板DNA使用上述(1)2)制備的含有野生型的rpoB基因序列的質(zhì)粒DNA，除此之外用與上述(3)同樣的方法進行PCR用DNA樣品的制備、PCR用反應(yīng)液的制備和實時PCR。(4)熔解曲線分析對于對應(yīng)于PCR用DNA樣品的稀釋系列的各個擴增產(chǎn)物，做成以橫軸為擴增產(chǎn)物(雙鏈DNA)的解離溫度、縱軸為熒光強度的一次樣史分(變化量)的熔解曲線，進行峰的檢測。(5)結(jié)果圖l和圖2給出了以使用各DNA樣品作為模板進行實時PCR得到的結(jié)果為^出做成的熔解曲線。圖1是使用本發(fā)明所涉及的引物rpoB_2、以含有突變型rpoB基因序列一2的質(zhì)粒DNA為模板的實時PCR的結(jié)果。而圖2是使用本發(fā)明所涉及的引物rpoB一2、以含有野生型rpoB基因序列的質(zhì)粒DNA為模板的實時PCR的結(jié)果。就象圖l表明的那樣，當(dāng)使用本發(fā)明所涉及的引物rpoB一2、以含有突變型rpoB基因序列一2的質(zhì)粒DNA為模板進行實時PCR時，可確認(rèn)DNA的擴增。另外，105，104,103，102個拷貝的DNA樣品的熔解曲線的峰位置一致。即Tm值一致。而與此相反，就象圖2表明的那樣，當(dāng)使用本發(fā)明所涉及的引物rpoB一2、以含有野生型rpoB基因序列的質(zhì)粒DNA為模板，同樣地進行實時PCR時，卻沒有出現(xiàn)峰，沒有得到DNA的引物延伸產(chǎn)物。由以上的現(xiàn)象判斷，通過使用本發(fā)明的在3，末端具有1堿基置換部位，在從3，末端開始的第2位配置帶有能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾的核苷酸的引物進行實時PCR，能夠完全抑制檢測的假陽性出現(xiàn)，特異而且高準(zhǔn)確度地只檢測到帶有突變序列的乾，即帶有突變序列的DNA樣品。比較例1.(1)含有突變型rpoB基因序列的質(zhì)粒DNA使用實施例l(l)得到的"突變型^08基因序列_2"。(2)突變型rpoB基因檢測用引物(引物rpoB—2j3的構(gòu)建)設(shè)計帶有與實施例1(2)得到的引物rpoB一2相同的用序列號7表示的堿基序列，但從引物的3，末端開始的第3位的"C"被用核苷酸類似體(2'-0，4'-C-亞乙基橋接的核酸)修飾，而從3，末端開始的第2位的"C，，沒有被2，-0，4'-C-亞乙基橋接的核酸修飾的引物。將該引物記為"引物rpoB丄n3，，。設(shè)計的"引物rpoB—2_n3"可以利用SigmaGenosys公司的客戶服務(wù)獲得。(3)通過實時PCR檢測進行突變型rpoB基因的檢測和假陽性出現(xiàn)的判定1)PCR用DNA樣品使用與實施例1(3)1)制備的樣品同樣的樣品(含有突變型rpoB基因序列一2的質(zhì)粒DNA樣品的稀釋系列)。2)PCR用反應(yīng)液的制備制^有上述(2)得到的引物rpoB—2一n3和通用引物(M13正向引物，Takara-Bio公司)各300nM、原液30倍稀釋(最終30000倍稀釋)的發(fā)色試劑SYBRGreenI(MolecularProbe乂A司商品名)、1.5mMMgCl2、80mMKCl、500jLig/mLBSA、0.1%膽酸鈉、0.1%TritonX-lOO、dATP、dCTP、dGTP、dTTP各0.2mM、和TaqDNA聚合酶(Nippongene生產(chǎn))40單位/mL的lOmMTris-HCl(pH8.9)，作為PCR用反應(yīng)液。3)實時PCR除了作為反應(yīng)液使用上述(3)2)制備的PCR用反応液以外，其它用與實施例1(3)3)同樣的方法進行實時PCR，測定擴增產(chǎn)物中嵌入的SYBRTMGreenI的熒光強度。另外除了作為DNA樣品(模板DNA)使用實施例(1)2)制備的含有野生型的rpoB基因序列的質(zhì)粒DNA以外，用同樣的方法進行PCR用DNA樣品的制備、反應(yīng)液的制備和實時PCR。(4)熔解曲線分析對于對應(yīng)于DNA樣品的稀釋系列的各個擴增產(chǎn)物，做成以橫軸為擴增產(chǎn)物(雙鏈DNA)的解離溫度、縱軸為熒光強度的一次微分(變化量)的熔解曲線，進行峰的檢測。(5)結(jié)果圖3和圖4給出了以使用各DNA樣品作為模板進行實時PCR得到的結(jié)果為基礎(chǔ)做成的熔解曲線。圖3是使用引物rpoB—2_n3、以含有突變型rpoB基因序列_2的質(zhì)粒DNA為模板的實時PCR的結(jié)果。而圖4是使用引物rpoB_2_n3、以含有野生型rpoB基因序列的質(zhì)粒DNA為模板的實時PCR的結(jié)果。就象圖3表明的那樣，當(dāng)使用引物rpoB—2_n3、以含有突變型rpoB基因序列_2的質(zhì)粒DNA為模板進行實時PCR時，可確認(rèn)DNA的擴增。然而，就象圖4表明的那樣，當(dāng)使用引物rpoB—2一n3、以含有野生型rpoB基因序列的質(zhì)粒DNA為模板，同樣進行實時PCR時，也確認(rèn)DNA的擴增。即確i人有假陽性的峰出現(xiàn)。由以上的現(xiàn)象判斷，使用從3，末端開始的第3位配置帶有能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾的核苷酸的寡核苷酸作為引物進行實時PCR時，不能進行突變型的正確判定。實施例2.耐藥性結(jié)核菌的模型檢測實驗2(1)含有突變型rpoB基因序列一6的質(zhì)粒DNA的構(gòu)建使用與實施例l(l)l)同樣的方法，從rpoB基因高突變區(qū)部分的序列的5，末端開始的第68位堿基(野生型為"T，，)進4亍4吏"T"突變?yōu)?C"的突變導(dǎo)入。將導(dǎo)入了突變的DNA片段使用QIAGEN公司生產(chǎn)的柱子進行純化后，插入克隆載體(Invitrogen公司生產(chǎn))。然后使用QIAprepTMSpinMiniprepKit(QIAGEN公司生產(chǎn))，對含有目的序列的質(zhì)粒DNA進行用上述方法得到的質(zhì)粒DNA含有下述序列號4的堿基序列。以下將該序列號4表示的堿基序列記為"突變型rpoB基因序列—6"。在"突變型^08基因序列_6"的序列中，從其5，端開始的第86位用下劃線表示的堿基對應(yīng)于從rpoB基因高突變區(qū)的序列的5，末端開始的第68位堿基。在野生型的rpoB基因中該部分的堿基是"T",而在"突變型rpoB基因序列—6"中突變?yōu)?C"。序列號4:5'-TTCTTCGGCACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCTACAAGCGCCGACTGTCGGCGC￡GGGG-3'(突變型rpoB基因序列—6)(2)突變型rpoB基因檢測用引物(引物rpoB—6)的構(gòu)建以突變型rpoB基因序列一6為基礎(chǔ)，用下述方法設(shè)計引物。首先，(i)將突變型rpoB基因序列一6的導(dǎo)入突變的位點，即從其5，末端開始的第86位堿基"C"配置為相當(dāng)于引物的3，末端，(ii)引物的其它序列配置為與突變型rpoB基因序列—6的5'末端的第86位堿基"C"5'側(cè)的14個堿基序列相同，而且(iii)按照從引物的3，端開始的第2位堿基"C"是用2'-0,4'-C-亞乙基橋接的核酸修飾的"C，，那樣設(shè)計突變型rpoB基因檢測用引物序列。將這樣設(shè)計的寡核苷酸記為"引物^08_6"。"引物rpoB一6"的堿基序列如以下序列號8所示。即，在下述序列號8的堿基序列中帶有下劃線的核苷酸的3，末端(野生型為"T")是突變?yōu)?C"的部分。而從3，末端開始的第2位的堿基"C"是用2'-0,4'-C-亞乙基橋接的核酸修飾的"C，，。序列號8:5，-CCGACTGTCGGCGC￡-3，設(shè)計的"引物rpoB—6"可以利用SigmaGenosys公司的客戶服務(wù)獲得。(3)通過實時PCR檢測進行突變型rpoB基因的檢測和假陽性出現(xiàn)的判定1)PCR用DNA樣品的制備通過測定上述(l)得到的含有突變型rpoB基因序列一6的質(zhì)粒DNA樣品的吸光度，測定質(zhì)粒DNA樣品中的DNA量。然后制備使用10mMTris-HCl緩沖液(pH8.9)將質(zhì)粒DNA樣品稀釋為105，104，103，102個拷貝/ML的稀釋系列的樣品，作為PCR用DNA樣品。2)PCR用反應(yīng)液的制備制備含有上述(2)得到的引物rpoB_6、以及通用引物(M13正向引物、Takara-Bio公司)各300nM、原液稀釋30倍(最終30000倍稀釋)的發(fā)色試劑SYBRTMGreenI(MolecularProbe公司商品名)、1.5mMMgCl2、80mMKCl、500|Jg/mLBSA、0.1%膽酸鈉、0.1%TritonX-100、dATP、dCTP、dGTP、dTTP各0.2mM、和TaqDNA聚合酶(Mppongene生產(chǎn))40單位/mL的10mMTris-HCl(pH8.9)，作為PCR用反應(yīng)液。3)實時PCR作為模板DNA(擴增靶)使用上述(l)制備的含有突變型rpoB基因序列—6的質(zhì)粒DNA進行實時PCR。另外，在以下方法中運用嵌入法進行定量監(jiān)測，進行實時PCR的結(jié)果的研究、評價。即，將上述(3)1)制備的各稀釋系列的PCR用DNA樣品1jjL、以及上述(3)2)制備的PCR用反應(yīng)液19jaL加入到96孔反應(yīng)板(MicroAmpoptical96孔反應(yīng)板，AppliedBiosystem的日本公司制)的孔中，使用TaqManTMpCR專用熱循環(huán)儀'檢測器(ABI7500，AppliedBiosystem的日本公司制)進行實時PCR。即于95。C保溫10分鐘后，反復(fù)進行40次循環(huán)的95'C15秒鐘、60'C1分鐘的反應(yīng)。然后測定擴增產(chǎn)物中嵌入的SYBRTMGreenI的焚光強度。另外除了作為模板DNA使用實施例(1)2)制備的含有野生型的rpoB基因序列的質(zhì)粒DNA以外，用與實施例2(3)同樣的方法進行PCR用DNA樣品的制備、PCR用反應(yīng)液的制備和實時PCR。(4)熔解曲線分析對于對應(yīng)于PCR用DNA樣品的稀釋系列的各個擴增產(chǎn)物，做成以橫軸為擴增產(chǎn)物(雙鏈DNA)的解離溫度、縱軸為熒光強度的一次微分(變化量)的熔解曲線，進行峰的檢測。(5)結(jié)果圖5和圖6給出了以使用各DNA樣品作為模板進行實時PCR得到的結(jié)果為^i^出做成的熔解曲線。圖5是使用本發(fā)明所涉及的引物rpoB—6、以含有突變型rpoB基因序列一6的質(zhì)粒DNA為模板的實時PCR的結(jié)果。而圖6是使用本發(fā)明所涉及的引物rpoB一6、以含有野生型rpoB基因序列的質(zhì)粒DNA為才莫板的實時PCR的結(jié)果。就象圖5表明的那樣，當(dāng)使用本發(fā)明所涉及的引物rpoB一6、以含有突變型rpoB基因序列_6的質(zhì)粒DNA為模板進行實時PCR時，可確認(rèn)DNA的擴增。另外105，10101(^個拷貝的DNA樣品的熔解曲線的峰位置一致。即Tm值一致。與此相反，就象圖6表明的那樣，當(dāng)使用本發(fā)明所涉及的引物^08_6、以含有野生型rp0B基因序列的質(zhì)粒DNA為模板進行實時PCR時，沒有出現(xiàn)峰，沒有得到DNA的引物延伸產(chǎn)物。由以上的現(xiàn)象判斷出通過使用在本發(fā)明的3，末端具有1堿基置換部位，在從3，末端開始的第2位配置帶有能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾的核苷酸的引物進行實時PCR，能夠完全抑制檢測的假陽性出現(xiàn)，特異而且高準(zhǔn)確度地只檢測帶有突變序列的靶。實施例3，多個突變基因的同時檢測(1)含有突變型rpoB基因序列的質(zhì)粒DNA的構(gòu)建1)含有突變型rpoB基因序列一3的質(zhì)粒的構(gòu)建使用與實施例l(l)l)同樣的方法，對從rpoB基因高突變區(qū)部分的序列的5，末端開始的第46位堿基(野生型為"C")，進行使"C"突變?yōu)?G"的突變導(dǎo)入。將導(dǎo)入了突變的DNA片段使用QIAGEN公司生產(chǎn)的柱子進行純化后，插入克隆載體(Invitrogen公司生產(chǎn))。然后使用QIAprepTMSpinMiniprepKit(QIAGEN公司生產(chǎn))，對含有目的序列的質(zhì)粒DNA進行純化、回收。用上述方法得到的質(zhì)粒DNA含有下述序列號5的堿基序列。以下將該序列號5表示的堿基序列記為"突變型^08基因序列_3"。在"突變型^<^基因序列_3"的序列中，從其5，末端開始的第64位用下劃線表示的堿基對應(yīng)于從rpoB基因高突變區(qū)的序列的5'末端開始的第46位堿基。因此，在野生型的rpoB基因中該部分的堿基是"C"，但在"突變型rpoB基因序列一3"中突變?yōu)?G"。序列號5:5'TTCTTCGGCACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATGGACCAGAACTGGGG-3'(突變型rpoB基因序列—3)2)含有突變型rpoB基因序列一4的質(zhì)粒的構(gòu)建使用與實施例l(l)l)同樣的方法，從rpoB基因高突變區(qū)部分的序列的5，末端開始的第47位堿基(野生型為"A")，進行使"A"突變?yōu)?T"的突變導(dǎo)入。將導(dǎo)入了突變的DNA片段使用QIAGEN公司生產(chǎn)的柱子進行純化后，插入克隆載體(Invitrogen公司生產(chǎn))。然后使用QIAprepTMSpinMiniprepKit(QIAGEN公司生產(chǎn))，對含有目的序列的質(zhì)粒DNA進行純化、回收。用上述方法得到的質(zhì)粒DNA含有下述序列號6的堿基序列。以下將該序列號6表示的堿基序列記為"突變型rpoB基因序列一4"。在"突變型^08基因序列_4"的序列中，從其5，末端開始的第65位用下劃線表示的堿基對應(yīng)于從rpoB基因高突變區(qū)的序列的5，末端開始的第47位堿基。因此在野生型的rpoB基因中該部分的堿基是"A"，但在"突變型rpoB基因序列_4"中突變?yōu)?T"。序列號6:5'畫TTCTTCGGCACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATGGACCAGAACGGGG-3，(突變型rpoB基因序列—4(2)突變型rpoB基因檢測用引物的構(gòu)建1)"引物rpoB—3"的構(gòu)建以突變型rpoB基因序列一3為基礎(chǔ)用下述方法設(shè)計引物。首先，(i)將突變型rpoB基因序列一3的導(dǎo)入突變的位點，即從其5，末端開始的第64位堿基"G"配置為相當(dāng)于引物的3，末端，(ii)引物的其它序列配置為與突變型rpoB基因序列一3的5'末端的第64位堿基"G"5，側(cè)的16個堿基序列相同，而且(iii)按照從引物的3，末端開始的第2位堿基"C，，變成用2，-0，4，-C-亞乙基橋接的核酸修飾的"C"那樣設(shè)計突變型rpoB基因檢測用引物序列。將這樣設(shè)計的寡核苷酸記為"引物rpoB—3"。"引物rpoB—3"的堿基序列如以下序列號9所示。即，在下述序列號9的堿基序列中帶有下劃線的核苷酸的3，末端(野生型為"C")是突變?yōu)?G"的部分。而從3，末端開始的第2位的堿基"C"是用2，-0，4，-C-亞乙基橋接的核酸修飾的"C"。序列號9:5'畫GCTGTCGGGGTTGACQg-3'設(shè)計的"引物rpoB—3"可以利用SigmaGenosys公司的客戶服務(wù)獲得。2)"引物rpoB—4"的構(gòu)建以突變型rpoB基因序列—4為^5出，用下述方法設(shè)計引物。首先，(i)將突變型rpoB基因序列一4的導(dǎo)入突變的位點，即從其5，末端開始的第47位堿基"T"配置為相當(dāng)于引物的3，末端，(ii)引物的其它序列配置為與突變型rpoB基因序列一4的5，末端的第47位堿基"T"5，側(cè)的16個堿M基序列相同，而且(iii)按照從引物的3，末端開始的第2位堿基"C"變成用2'-0，4'-C-亞乙基橋接的核酸修飾的"C，那樣設(shè)計突變型rpoB基因檢測用引物序列。將這樣設(shè)計的寡核苷酸記為"引物rpoB_4"。"引物rpoB—4"的堿基序列如以下序列號10所示。即，在下述序列號10的堿基序列中帶有下劃線的核苷酸的3，末端(野生型為"A")是突變?yōu)?T，，的部分。而從3，末端開始的第2位的堿基"C"是用2'-0，4'-C-亞乙基橋接的核酸修飾的"C"。序列號10:5'-CTGTCGGGGTTGACCCi;-3'設(shè)計的"引物rpoB—4"可以利用SigmaGenosys公司的客戶服務(wù)獲得。(3)通過實時PCR檢測進行突變型rpoB基因的檢測和假陽性出現(xiàn)的判定1)PCR用DNA樣品的制備通過測定上述(l)l)得到的含有突變型rpoB基因序列—3的質(zhì)粒DNA樣品、上述(1)2)得到的含有突變型rpoB基因序列一4的質(zhì)粒DNA樣品的吸光度，測定各個質(zhì)粒DNA樣品中的DNA量。然后制備j吏用10mMTris-HCl緩沖液(pH8.9)分別將實施例1(1)1)得到的含有突變型rpoB基因序列一2的質(zhì)粒DNA樣品、上述(1)1)得到的含有突變型印08基因序列_3的質(zhì)粒DNA樣品、上述(1)2)得到的含有突變型rpoB基因序列—4的質(zhì)粒DNA樣品稀釋成105，104，103，102個拷貝/pL的稀釋系列的樣品，分別作為PCR用DNA樣品。2)PCR用反應(yīng)液的制備制備含有實施例1(2)得到的引物rpoB—2、上述(2)得到的引物rpoB一3以及引物rpoB—4和通用引物(M13正向引物、Takara-Bio公司)各300nM、原液稀釋30倍(最終30000倍稀釋)的發(fā)色試劑SYBRTMGreenI(MolecularProbe公司商品名)、1.5mMMgCl2、80mMKC1、500|Jg/mLBSA、0.1%膽酸鈉、0.1%TritonX-100、dATP、dCTP、dGTP、dTTP各0.2mM、和TaqDNA聚合酶(Mppongene制)40單位/mL的lOmMTris-HCl(pH8.9)，作為PCR用反應(yīng)液。即，該反應(yīng)液含有引物rpoB一2、引物rpoB—3和引物rpoB一4這3種突變型rpoB基因檢測用引物。2)實時PCR作為模板DNA(擴增靶)使用實施例l(l)l)制備的含有突變型rpoB基因序列_2的質(zhì)粒DNA,上述(l)l)制備的含有突變型rpoB基因序列_3的質(zhì)粒DNA，或上述(1)2)制備的含有突變型rpoB基因序列一4的質(zhì)粒DNA進行實時PCR。另外，在以下方法中運用嵌入法進行定量監(jiān)測，對實時PCR的結(jié)果進行研究和評價。即，將上述(3)1)制備的各稀釋系列的PCR用DNA樣品ljiL、以及上述(3)2)制備的PCR用反應(yīng)液19yL加入到96孔反應(yīng)板(MicroAmpoptical96孑L反應(yīng)板，AppliedBiosystem的日本7>司制)的孑L中，使用TaqManTMpCR專用熱循環(huán)儀檢測器(ABI7500，AppliedBiosystem的日本公司制)進行實時PCR。即于95"C保溫10分鐘后，反復(fù)進行40次循環(huán)于95C15秒鐘、60C1分鐘的反應(yīng)。然后測定擴增產(chǎn)物中嵌入的SYBRTMGreenI的熒光強度。(4)熔解曲線分析對于對應(yīng)于PCR用DNA樣品的稀釋系列的各個擴增產(chǎn)物，做成以橫軸為擴增產(chǎn)物(雙鏈DNA)的解離溫度、縱軸為熒光強度的一次微分(變化量)的熔解曲線，進行峰的檢測。(5)結(jié)果圖7~圖9給出了以使用各DNA樣品作為模板，使用引物rpoB—2、引物rpoB—3和引物rpoB—4的混合引物進行實時PCR得到的結(jié)果為^i^出做成的熔解曲線。圖7是使用含有突變型rpoB基因序列一2的質(zhì)粒DNA為模板進行實時PCR的結(jié)果。圖8是使用含有突變型rpoB基因序列一3的質(zhì)粒DNA為模板進行實時PCR的結(jié)果。圖9是使用含有突變型rpoB基因序列一4的質(zhì)粒DNA為模板進行實時PCR的結(jié)果。比較例2.除了作為模板DNA使用實施例1(1)2)得到的含有野生型rpoB基因序列的質(zhì)粒DNA以外，用與實施例3(3)同樣的方法進行PCR用DNA樣品的制備、PCR用反應(yīng)液的制備以及使用引物rpoB—2、引物rpoB—3、引物rpoB一4和M13正向引物進行實時PCR，測定擴增產(chǎn)物中嵌入的SYBRTMGreenI的熒光強度。然后對于對應(yīng)于PCR用DNA樣品的稀釋系列的各個擴增產(chǎn)物，做成以橫軸為擴增產(chǎn)物(雙鏈DNA)的解離溫度、縱軸為熒光強度的一次微分(變化量)的熔解曲線，進行峰的檢測。圖10給出了以各DNA樣品作為模板進行實時PCR得到的結(jié)果為基礎(chǔ)做成的熔解曲線。就象圖IO表明的那樣，使用多種本發(fā)明所涉及的引物、以具有野生型的序列的質(zhì)粒DNA作為模板進行實時PCR時，沒有出現(xiàn)引物延伸產(chǎn)物的峰。與此相反，就象圖7~9表明的那樣當(dāng)使用多種本發(fā)明所涉及的引物，分別以具有突變型rpoB基因序列_2、突變型rpoB基因序列_3或突變型rpoB基因序列一4的質(zhì)粒DNA作為模板進行實時PCR時，無論那種情況都能得到引物延伸產(chǎn)物。即，通過一次使用3種本發(fā)明所涉及的引物，可以檢測3種基因突變。由以上現(xiàn)象判斷出在使用多個本發(fā)明所涉及的引物進行實時PCR時，也能夠完全抑制假陽性，而且由于通過一次反應(yīng)的PCR對應(yīng)多種突變模式，所以組成利用多重PCR(multiplexPCR)的耐藥性判定系統(tǒng)成為可能。產(chǎn)業(yè)上利用的可能性對于在例如結(jié)核癥診斷(治療)中認(rèn)為必須要進行的菌的耐性研究的藥劑敏感性試驗，作為基因診斷項目利用在線(in-Line)(芯片上(Onchip)PCR系統(tǒng))的分離檢測，并與結(jié)核菌和非結(jié)核性抗酸菌癥的基因診斷聯(lián)用，可以在一個試管(l個系統(tǒng))內(nèi)進行耐藥性判定。特別是通過本發(fā)明由于能夠完全抑制判定的假陽性，而且通過1次PCR反應(yīng)對應(yīng)于多種類的突變模式，所以有可能組成通過多重PCR—次檢測多個可能的基因突變的耐藥性判定系統(tǒng)。權(quán)利要求1.核酸序列突變的檢測方法，其特征在于，使用如下(a)～(d)中任一項所述的寡核苷酸或其鹽作為引物，以樣品中的核酸作為模板進行核酸擴增反應(yīng)，檢測反應(yīng)產(chǎn)物，(a)i)在3’末端部位具有與對象基因的突變核苷酸相同的核苷酸，ii)3’末端部位以外的部位與對象基因的核苷酸序列相同，具有與可能存在上述突變核苷酸的上述對象基因上的位置5’側(cè)的對象基因的核苷酸序列相同的序列，iii)并且從3’末端開始的第2位核苷酸帶有能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾的寡核苷酸或其鹽，(b)i)在3’末端部位具有與對象基因的突變核苷酸互補的核苷酸，ii)3’末端部位以外的部位與對象基因的核苷酸序列互補，具有與可能存在上述突變核苷酸的上述對象基因上的位置3’側(cè)的對象基因的核苷酸序列互補的序列，iii)并且從3’末端開始的第2位核苷酸帶有能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾的寡核苷酸或其鹽，(c)i)在3’末端部位具有與對象基因的基準(zhǔn)核苷酸相同的核苷酸，ii)3’末端部位以外的部位與對象基因的核苷酸序列相同，具有與上述基準(zhǔn)核苷酸在上述對象基因上的位置5’側(cè)的對象基因的核苷酸序列相同的序列，iii)并且從3’末端開始的第2位核苷酸帶有能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾的寡核苷酸或其鹽，(d)i)在3’末端部位具有與對象基因的基準(zhǔn)核苷酸互補的核苷酸，ii)3’末端部位以外的部位與對象基因的核苷酸序列互補，具有與上述基準(zhǔn)核苷酸在上述對象基因上的位置3’側(cè)的對象基因的核苷酸序列互補的序列，iii)并且從3’末端開始的第2位核苷酸帶有能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾的寡核苷酸或其鹽。2.權(quán)利要求l所述的檢測方法，其中作為引物還含有與權(quán)利要求l中作為引物使用的寡核苷酸配對的、通過核酸擴增反應(yīng)能夠擴增目的序列部分的寡核苷酸。3.權(quán)利要求1或2所述的檢測方法，其中組成引物的堿基為15~30個。4.權(quán)利要求l所述的檢測方法，其中通過使用引物的組合，特異地檢測核酸的突變型，所述引物的組合為在3，末端部位具有與對象基因的突變核苷酸相同的核苷酸；3，末端部位以外的部位與對象基因的核苷酸序列相同，具有與可能存在上述突變核苷酸的上述對象基因上的位置5，側(cè)的對象基因的核苷酸序列相同的序列；并且從3，末端開始的第2位核苷酸帶有能夠阻止核酸合成反應(yīng)的纟務(wù)飾的寡核苷酸或其鹽和與該寡核苷酸配對的通過核酸擴增反應(yīng)能夠擴增目的序列部分的寡核苷酸的組合，當(dāng)所述組合的引物以樣品中的核酸作為模板進行核酸擴增反應(yīng)時，若該樣品中的核酸為突變型的情形時，能夠得到目的的反應(yīng)產(chǎn)物，若該樣品中的核酸為野生型的情形時，不能得到目的的反應(yīng)產(chǎn)物。5.權(quán)利要求l所述的檢測方法，其中核^列突變是基因多態(tài)性。6.權(quán)利要求5所述的檢測方法，其中基因多態(tài)性是單堿基置換、單堿基缺失或單堿基插入。7.權(quán)利要求l所述的檢測方法，其中結(jié)合了阻止核酸合成反應(yīng)的修飾的核苷酸是下式1<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>(式中，B代表核酸堿基，R，代表氧原子、-NH-基或低級亞烷基，R:代表氫原子或低級烷基)或下式IIJ<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>(式中，B代表核酸堿基，R3代表氧原子、氮原子、-NH-基、或低級亞烷基)表示的核苷酸。8.權(quán)利要求l所述的檢測方法，其中結(jié)合了阻止核酸合成反應(yīng)的修飾的核苷酸是結(jié)合了2，-0，4，-C-亞乙基橋接的核酸(ENA)的核苷酸。9.權(quán)利要求1所述的檢測方法，其中核酸擴增反應(yīng)是聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。10.核酸序列突變的檢測用試劑盒，其包含下述(a)~(d)中任一項所述的寡核苷酸或其鹽作為引物(a)i)在3，末端部位具有與對象基因的突變核苷酸相同的核苷酸，ii)3，末端部位以外的部位與對象基因的核苷酸序列相同，具有與可能存在上述突變核苷酸的上述對象基因上的位置5，側(cè)的對象基因的核苷^列相同的序列，iii)并且從3，末端開始的第2位核苷酸帶有能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾的寡核苷酸或其鹽，(b)i)在3，末端部位具有與對象基因的突變核苷酸互補的核苷酸，ii)3，末端部位以外的部位與對象基因的核苷酸序列互補，具有與可能存在上述突變核苷酸的上述對象基因上的位置3，側(cè)的對象基因的核苷#列互補的序列，iii)并且從3，末端開始的第2位核苷酸帶有能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾的寡核苷酸或其鹽，(c)i)在3，末端部位具有與對象基因的基準(zhǔn)核苷酸相同的核苷酸，ii)3，末端部位以外的部位與對象基因的核苷酸序列相同，具有與上述基準(zhǔn)核苷酸在上述對象基因上的位置5，側(cè)的對象基因的核苷酸序列相同的序列，iii)并且從3，末端開始的第2位核苷酸帶有能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾的寡核苷酸或其鹽，或(d)i)在3，末端部位具有與對象基因的基準(zhǔn)核苷酸互補的核苷酸，ii)3，末端部位以外的部位與對象基因的核苷酸序列互補，具有與上述基準(zhǔn)核苷酸在上述對象基因上的位置3，側(cè)的對象基因的核苷酸序列互補的序列，iii)并且從3，末端開始的第2位核苷酸帶有能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾的寡核苷酸或其鹽。11.權(quán)利要求10所述的試劑盒，其中還含有與該寡核苷酸配對的、通過核酸擴增反應(yīng)能夠擴增目的序列部分的寡核苷酸作為引物。12.權(quán)利要求ll所述的試劑盒，其中還含有1)核苷三磷酸、2)核酸合成酶、3)與該寡核苷酸配對的、通過核酸擴增反應(yīng)能夠擴增目的序列部分的寡核苷酸、和4)PCR緩沖液。全文摘要公開了核酸序列突變的檢測方法，其特征在于，使用從3’末端開始的第2位的核苷酸為帶有能夠阻止核酸合成反應(yīng)的修飾的核苷酸的寡核苷酸或其鹽作為引物，以樣品中的核酸作為模板進行核酸擴增反應(yīng)，然后檢測反應(yīng)產(chǎn)物；還公開了用于該方法的試劑盒。由于根據(jù)本發(fā)明能夠完全抑制判定的假陽性，另外，由于通過1次PCR反應(yīng)可以對應(yīng)多種的突變模式，所以通過多重PCR，組成可一次檢測多個可能的基因突變的耐藥性判定系統(tǒng)成為可能。文檔編號C12Q1/68GK101400806SQ200780008760公開日2009年4月1日申請日期2007年3月12日優(yōu)先權(quán)日2006年3月13日發(fā)明者石川友一申請人:和光純藥工業(yè)株式會社