專利名稱：：利用pcr的擴增產(chǎn)物的制造方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及利用PCR的擴增產(chǎn)物的制造方法，及對于使用該方法獲得的擴增產(chǎn)物和目標(biāo)核酸的分析方法。
背景技術(shù)：
：在臨床、病理學(xué)等各種領(lǐng)域中，以基因的表達(dá)解析、功能解析、診斷等為目的，廣泛使用PCR(聚合酶鏈反應(yīng)，polymerasechainreaction)法。一般來說，PCR法是如下的方法以下述3個步驟為一個循環(huán)，(1)通過熱處理進(jìn)行DNA變性(由雙鏈DNA解離為單鏈DNA)、(2)模板單鏈DNA和引物的退火、(3)使用DNA聚合酶的上述引物的延伸，通過重復(fù)上述循環(huán)來擴增與樣品中的目標(biāo)核酸互補的DNA。但是，在PCR中使用生物樣品中的全血樣品的情況下，以使DNA變性為目的的熱處理，將導(dǎo)致上述樣品中含有的糖、蛋白質(zhì)等變性，產(chǎn)生不溶的沉淀物、混濁等。這樣的沉淀物等的產(chǎn)生在例如通過電泳確認(rèn)有無擴增產(chǎn)物的情況下，不會成為大問題。但是，在通過光學(xué)手段確認(rèn)有無擴增產(chǎn)物的情況下，由于沉淀物、混濁遮住入射光，會產(chǎn)生無法得到正確的測定結(jié)果的問題。特別是通過在PCR中隨時間監(jiān)測擴增產(chǎn)物的生成過程的方法(即，實時定量PCR法)，例如可以對每l循環(huán)的擴增產(chǎn)物進(jìn)行定量或?qū)U增產(chǎn)物到達(dá)設(shè)定量(閾值)時的循環(huán)次數(shù)進(jìn)行計數(shù)，另外基于這些信息，還可對生物樣品中的目標(biāo)核酸進(jìn)行定量。因此，通過光學(xué)手段實現(xiàn)準(zhǔn)確測定受到極度的重視。因此，為了解決這樣的問題，目前采用預(yù)先純化(前處理)生物樣品后再作為PCR用樣品的方法或采用在反應(yīng)后純化(后處理)PCR反應(yīng)液的方法。上述生物樣品的前處理是指例如預(yù)先將生物樣品進(jìn)行熱處理，除去產(chǎn)生的沉淀物等，使用得到的上清作為PCR樣品的方法，或預(yù)先從生物樣品中去除引起沉淀物、混濁的物質(zhì)的方法。另外，PCR反應(yīng)液的后處理是指例如在PCR反應(yīng)后，除去產(chǎn)生的沉淀物等再進(jìn)行^^測的方法。另一方面，對于使用生物樣品的PCR,從工序的簡便性和快捷性的觀點出發(fā)，追求不進(jìn)行純化處理等前處理而直接使用上述生物樣品。而且，有報道說此種情況下，PCR反應(yīng)液中的全血樣品的添加比例為1~10體積％左右(專利文獻(xiàn)l、非專利文獻(xiàn)1及非專利文獻(xiàn)2)。然而，如上所述，通過光學(xué)手段檢測擴增產(chǎn)物的情況下，在前者的方法中，必須進(jìn)行生物樣品的前處理(純化處理)。另外，在后者的方法中，雖然可以直接使用未進(jìn)行前處理的生物樣品，-f旦必須在反應(yīng)結(jié)束后除去沉淀物，因此和前者一才羊工序繁復(fù)，而且存在不待反應(yīng)結(jié)束就不能進(jìn)行分析的問題。因此，雖然能夠?qū)ψ罱K獲得的擴增產(chǎn)物進(jìn)行分析，但難以使用光學(xué)手段對擴增產(chǎn)物的生成過程進(jìn)行隨時間監(jiān)測。另外，如對以全血樣品為代表的生物樣品不進(jìn)行前處理，還存在其中含有的成分干擾PCR反應(yīng)的問題(非專利文獻(xiàn)3及非專利文獻(xiàn)4)。專利文獻(xiàn)l:日本專利第3727667號公報非專利文獻(xiàn)l:NucleicAcidsResearch,Vol.18，No.19,5908(1990)非專利文獻(xiàn)2:NucleicAcidsResearch,Vol.19,No.5,1151(1991)非專利文獻(xiàn)3:NucleicAcidsResearch,Vol.16,No.20，9775-9787(1988)非專利文獻(xiàn)4:JournalofClinicalMicrobiology,Vol.39,6No.2，p485-493(2001)
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明的目的在于提供在通過光學(xué)手段對擴增核酸進(jìn)^f亍的一企測中，4吏用PCR制造擴增產(chǎn)物的方法，該方法可以抑制全血樣品來源的沉淀物、混濁等對上述檢測產(chǎn)生的影響。進(jìn)一步詳細(xì)而言，例如，本發(fā)明涉及無需在PCR反應(yīng)前對全血樣品進(jìn)行純化處理(前處理)或在PCR反應(yīng)后對PCR反應(yīng)液進(jìn)行純化處理(后處理)，可以抑制在4企測時沉淀物、混濁等對;險測的影響的PCR擴增產(chǎn)物的制造方法。而且，本發(fā)明的目的在于提供抑制沉淀物、混濁等的影響，使用光學(xué)手段對擴增產(chǎn)物進(jìn)行定性或定量的擴增產(chǎn)物的分析方法和全血樣品中的目標(biāo)核酸的分析。為了達(dá)成上述目的，本發(fā)明的擴增產(chǎn)物的制造方法是通過PCR制造與全血樣品中的目標(biāo)核酸互補的擴增產(chǎn)物的方法，PCR的反應(yīng)液中全血樣品的添加比例是0.01~0.9體積％。而且，上述PCR反應(yīng)液中全血樣品的添力口比例換算成血紅蛋白(hemoglobin)量可以在0.01~1.8g/L的范圍。本發(fā)明的擴增產(chǎn)物的分析方法，其特征在于，是對通過PCR生成的擴增產(chǎn)物進(jìn)行定性或定量的擴增產(chǎn)物的分析方法，含有以下(A)~(B)的工序。(A)通過本發(fā)明的擴增產(chǎn)物的制造方法生成與全血樣品中的目標(biāo)核酸互補的擴增產(chǎn)物的工序。(B)使用光學(xué)手段檢測上述擴增產(chǎn)物的工序。本發(fā)明的目標(biāo)核酸的分析方法，其特征在于，是對樣品中所含的目標(biāo)核酸進(jìn)行定量的目標(biāo)核酸的分析方法，上述樣品是全血樣品，上述方法包括下述(A)~(C)的工序。(A)通過本發(fā)明的擴增產(chǎn)物的制造方法生成與全血樣品中的目標(biāo)核酸互補的擴增產(chǎn)物的工序。(B)通過光學(xué)手段檢測上述擴增產(chǎn)物，對上述擴增產(chǎn)物進(jìn)行定量的工序。(C)通過對上述擴增產(chǎn)物到達(dá)設(shè)定量時的PCR循環(huán)次數(shù)進(jìn)行計數(shù)，對上述全血樣品中所含的目標(biāo)核酸進(jìn)行定量的工序。若使用本發(fā)明的擴增產(chǎn)物的制造方法，只要將PCR反應(yīng)液中的全血樣品的添加比例設(shè)定在上述范圍，就可以無需進(jìn)行如現(xiàn)有技術(shù)中的全血樣品的前處理或PCR反應(yīng)液的后處理等，可以得到抑制混濁、沉淀等對檢測的影響的擴增產(chǎn)物。另外，已經(jīng)確認(rèn)若為上述添加比例的話，只要全血樣品中存在目標(biāo)核酸，就可以使用PCR進(jìn)行擴增，可以確保充分的擴增效率。因此，由于通過本發(fā)明可以抑制混濁、沉淀等的影響，不使用傳統(tǒng)的電泳而使用光學(xué)手l殳也可以檢測擴增產(chǎn)物。而且，由于可以使用光學(xué)手段進(jìn)行檢測，可以實現(xiàn)使用電泳不能進(jìn)行的擴增產(chǎn)物生成過程中的隨時間監(jiān)測。因此，使用本發(fā)明，即使在使用未經(jīng)純化處理的未處理的全血樣品的情況下，例如，不僅可以進(jìn)行擴增產(chǎn)物的定性、定量，也可以進(jìn)行全血樣品中的目標(biāo)核酸的定性、定量。而且，在擴增產(chǎn)物的檢測中，上述的混濁、沉淀等成為問題的情況下(即，使用光學(xué)手段檢測的情況)，如下所述，由于使用未處理的全血樣品本身從未進(jìn)行過嘗試，本發(fā)明的技術(shù)理所當(dāng)然是新穎的，本發(fā)明的課題也是新穎的。圖l是表示本發(fā)明的實施例1中，PCR反應(yīng)液中的全血添加比例和對應(yīng)于PCR擴增物的熒光值的關(guān)系的圖。圖2是表示本發(fā)明的實施例2中，含有BSA的PCR反應(yīng)液中的全血添加比例和對應(yīng)于PCR擴增物的焚光值的關(guān)系的圖。圖3是表示本發(fā)明的實施例3中，反應(yīng)液中BSA的濃度和反應(yīng)液的熒光值的關(guān)系的圖。圖4是表示本發(fā)明的實施例4中，對于各樣品，實時定量PCR的循環(huán)次數(shù)和熒光值的關(guān)系的圖。圖5是表示本發(fā)明的實施例5中，對于各樣品，實時定量PCR的循環(huán)次數(shù)和熒光值的關(guān)系的圖。具體實施例方式擴增產(chǎn)物的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的擴增產(chǎn)物的制造方法，如前所述，是通過PCR制造與全血樣品中的目標(biāo)核酸互補的擴增產(chǎn)物的方法，PCR的反應(yīng)液中全血樣品的添加比例是約0.01~約0.9體積％。在本發(fā)明中，全血樣品的添加比例是指上述PCR反應(yīng)液中的終濃度(體積％)。如果全血樣品的添加比例超過0.9體積％，可能會產(chǎn)生例如不能充分抑制PCR中的熱處理導(dǎo)致的上述樣品中蛋白質(zhì)等變性、不能充分抑制上述反應(yīng)液中沉淀物等的產(chǎn)生對檢測的影響。而且，如果全血才羊品的添加比例超過0.9體積％,可能會產(chǎn)生例如不能充分抑制上述樣品中的成分對PCR反應(yīng)的干擾，擴增效率不充分。在此情況下，本發(fā)明還可以稱為抑制沉淀物、混濁產(chǎn)生的方法。而且，由于這些沉淀物等是如同上述的在使用光學(xué)手段檢測擴增產(chǎn)物時干擾檢測的物質(zhì)，本發(fā)明也可以稱為抑制上述干擾檢測物質(zhì)產(chǎn)生的方法。而且，全血的添加比例相對于上述的專利文獻(xiàn)或非專利文獻(xiàn)中的1~10體積％左右，在本發(fā)明中減少至O.Ol~0.9體積％。因此，例如因為可以降低源于全血樣品中含有的成分對PCR反應(yīng)的干擾，可以提高擴增效率。上述反應(yīng)液中的全血樣品的添加比例的下限是上述的0.01體積％以上，優(yōu)選0.02體積％以上，更優(yōu)選0.05體積％以上，最優(yōu)選0.1體積％以上。又，上述添加比例的上限是上述的0.9體積%以下，優(yōu)選0.8體積％以下，更優(yōu)選0.7體積％以下，最優(yōu)選0.6體積％以下。又，在本發(fā)明中，上述反應(yīng)液中的全血樣品的比例可以不是上述的體積比例，而以血紅蛋白(以下，簡稱"Hb")的重量比例來表示。在此情況下，上述反應(yīng)液中的全血樣品的比例換算為Hb的量是約0.01~約1.8g/L的范圍。Hb量的下限優(yōu)選0.05g/L以上，更優(yōu)選0.1g/L以上；Hb量的上限優(yōu)選1.5g/L以下，更優(yōu)選lg/L以下。優(yōu)選的范圍是，例如0.05~1.5g/L,更優(yōu)選0.1~lg/L。另夕卜，上述反應(yīng)中，全血樣品的添加比例可以同時滿足上述體積比例和Hb重量比例兩方，也可以只滿足任一方。通常，全血是由包含血小板、白細(xì)胞(粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞)及紅細(xì)胞的血細(xì)胞(固體成分)和血漿(液體成分)構(gòu)成的，例如，紅細(xì)胞中含有Hb等，血漿中含有白蛋白、球蛋白、凝血因子等。如前所述，根據(jù)本發(fā)明，不需要在PCR反應(yīng)前進(jìn)行例如對全血樣品進(jìn)行熱處理并除去產(chǎn)生的沉淀物以及回收上清的前處理或除去會產(chǎn)生沉淀物等的糖類、蛋白質(zhì)等的前處理。因此，本發(fā)明中的"全血樣品"是指通常未進(jìn)行以除去會產(chǎn)生沉淀物的成分或已產(chǎn)生的沉淀物等為目的的前處理的樣品(以下，稱為"未處理的全血樣品，，)。提供給PCR的全血樣品的形態(tài)沒有特別限制，可以是例如直接使用從患者采集的全血，也可以〗吏用解凍的冷凍^f呆存的全血。又，也可以是例如;容血后的全血、未溶血的全血、抗凝全血、含有凝固成分的全血等的任意一種。通過PCR擴增的目標(biāo)核酸可以列舉例如全血來源的DNA、RNA(mRNA、總RNA),以及通過細(xì)菌或病毒等引入全血的外來核S臾(DNA、RNA)等。又，可以才艮據(jù)上述目標(biāo)核酸的存在，決定例如是否進(jìn)行全血樣品的溶血等。作為本發(fā)明更優(yōu)選的形態(tài)，進(jìn)一步在PCR反應(yīng)開始前在上述PCR反應(yīng)液中力口入白蛋白。如此，若力口入白蛋白，可以進(jìn)一步抑制沉淀物、混濁等的影響，而且可以進(jìn)一步提高擴增效率。如上所述，已知以全血樣品為代表的生物樣品中含有的成分會干擾PCR反應(yīng)，作為減輕這種反應(yīng)干擾的方法，已報道了在PCR反應(yīng)液中添加白蛋白的技術(shù)(非專利文獻(xiàn)3和非專利文獻(xiàn)4)。但是，之前并不了解如本發(fā)明更優(yōu)選的形態(tài)所示的通過在上述PCR反應(yīng)液中添加白蛋白，可以進(jìn)一步抑制沉淀物等對才全測造成的影響，如上事實是本發(fā)明者在深入研究的結(jié)果中得出的結(jié)論。特別是在本發(fā)明中，在上述PCR反應(yīng)液中添加白蛋白的前提是在上述PCR反應(yīng)液中全血樣品的添加比例必須設(shè)定在上述范圍內(nèi)，l又^義添加白蛋白并不能抑制沉淀物等對^r測造成的影響。即，4又在PCR反應(yīng)液中添加白蛋白不能抑制沉淀物等對檢測造成的影響，通過將全血樣品的添加比例設(shè)定在上述范圍內(nèi)可以抑制影響，進(jìn)一步在反應(yīng)液中添加白蛋白，使其共存，可以進(jìn)一步抑制上述影響。對此，記載了添加白蛋白的非專利文獻(xiàn)3和4中，當(dāng)然未公開全血樣品的添加比例，而對于使用未處理的全血樣品、光學(xué)檢測等中的沉淀物等問題也未公開。而且，在公開了全血樣品的專利文獻(xiàn)1和非專利文獻(xiàn)2中，因為使用所記載的全血添加比例(1體積％以上)，即使添加白蛋白也會使PCR反應(yīng)液變?yōu)槟z狀，從而得到難以進(jìn)行光學(xué)檢測的結(jié)果。更重要的是，正是因為本發(fā)明以使用光學(xué)手段檢測擴增產(chǎn)物為目的，所以期望抑制混濁等造成的影響，如上所述，使用未處理的全血樣品且進(jìn)行光學(xué)纟全測從來未#L嘗試。上述PCR反應(yīng)液中白蛋白的添加比例沒有限制，下限是例如0.01重量％以上，優(yōu)選0.1重量％以上，更優(yōu)選0.2重量％以上；上限是例如5重量％以下，優(yōu)選2重量％以下，更優(yōu)選1重量％以下，進(jìn)一步優(yōu)選0.8重量％以下。優(yōu)選的范圍是0.01~5重量％，更優(yōu)選0.1~2重量％，進(jìn)一步優(yōu)選0.2~0.8重量％。作為上述的白蛋白沒有特別限制，可以列舉例如牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白、大鼠血清白蛋白、馬血清白蛋白等?？梢允褂眠@些的任一種也可以同時使用兩種以上。本發(fā)明中，白蛋白的添加比例是指例如上述PCR反應(yīng)液中的終濃度(重量％)。又，作為本發(fā)明的更優(yōu)選的形態(tài)，進(jìn)一步含有在PCR反應(yīng)開始前對全血樣品進(jìn)行加熱處理的工序。若如此，在PCR反應(yīng)開始前對全血樣品進(jìn)行加熱處理，可以例如進(jìn)一步增加初始模板量，因此可以進(jìn)一步提高擴增效率。另外，通過全血樣品的加熱處理，例如即^吏產(chǎn)生混濁、沉淀等的情況下，通過在PCR反應(yīng)時，-使PCR反應(yīng)液中的全血樣品的比例為上述添加比例，可以抑制上述混濁等的影響，因此，可以通過光學(xué)手l史4全測擴增產(chǎn)物，而且，可以進(jìn)一步提高擴增效率。又，如上所述添加白蛋白的情況下，可以進(jìn)行加熱處理，例如，在添加白蛋白的前后均可以進(jìn)4亍。上述加熱處理工序中，上述全血樣品優(yōu)選為稀釋后的樣品。通過使用稀釋樣品，可以抑制例如為了提高擴增效率而進(jìn)行的加熱處理所產(chǎn)生的沉淀或混濁等。上述稀釋樣品中全血樣品的比例沒有特別限制，例如是O.Ol~90體積％的范圍，優(yōu)選0.05~50體積％,更優(yōu)選0.5~5體積％。進(jìn)行加熱處理的情況可以是例如在加熱處理上述稀釋樣品后，在PCR反應(yīng)液中4安照上述范圍添加全血樣品，也可以是在PCR反應(yīng)液中4安照上述范圍添加全血樣品后，在PCR反應(yīng)前對其進(jìn)4于加熱處理。上述加熱處理工序的加熱溫度沒有限制，例如是80。C以上，優(yōu)選8099。C，更優(yōu)選9099。C，特另'J優(yōu)選95~99°C。又，處理時間沒有限制，可以是例如30秒以上，優(yōu)選30秒15分鐘，更優(yōu)選1分鐘15分鐘，特別優(yōu)選3分鐘~15分鐘。接下來，舉出全血樣品中的才莫板核酸是DNA,使用上述DNA作為PCR的模板的例子，來說明本發(fā)明的擴增產(chǎn)物的制造方法。另外，本發(fā)明的特征在于將PCR反應(yīng)液中的全血樣品的添加比例設(shè)定在上述范圍，對其它的技術(shù)和條件無任何限制。首先，調(diào)制PCR反應(yīng)液，使全血樣品在上述范圍內(nèi)。只要全血樣品在PCR反應(yīng)液中的添加比例在上述范圍內(nèi)即可，其添加方法無限制。例如，可以在PCR反應(yīng)液中直接添加全血樣品，也可以預(yù)先用水或者緩沖液等溶劑將全血樣品稀釋后再添加入PCR反應(yīng)液中。在預(yù)先稀釋全血樣品的情況下，其稀釋率只要使PCR反應(yīng)液中的全血樣品的最終的添加比例在上述范圍內(nèi)即可，例^口是100~200(H咅，fil選200~IOO(H咅。又，PCR反應(yīng)'液的總體積沒有特別限制，例如可以根據(jù)使用的儀器(例如，熱循環(huán)儀(Thermalcycler))等適當(dāng)決定，通常是l500]dl，優(yōu)選IO~lOO(il。上述PCR反應(yīng)液中全血樣品以外的組成成分沒有特別限制，可以列舉現(xiàn)有的公知成分，其比例沒有特別限制。作為上述組成成分，可以列舉DNA聚合酶、核苷三磷酸、引物及溶劑等。又，如上所述，優(yōu)選在上述PCR反應(yīng)液中添加白蛋白。另外，上述PCR反應(yīng)液中，各組成成分的添加順序沒有任何限制。作為上述DNA聚合酶，沒有特別限制，例如可以使用現(xiàn)有公知的來自耐熱菌的聚合酶。作為具體例子，可以從市面得到來自棲熱水生菌(r/zerwwa《wa"cw)的DNA聚合酶(美國專利第4，889，818號以及美國專利第5,079,352號)(商品名T叫聚合酶)、來自才及端嗜熱菌J7/2^mws^ze^77op/n7z^)的DNA聚合酶(WO91/09950)(rTthDNApolymerase)、來自強烈火J求菌(尸yracoccz^/wr/osws)的DNA聚合酵(WO92/9689)(PfuDNApolymerase:Stratagenes公司產(chǎn))、來自嗜熱球菌(T7ze環(huán)ococcws/"on2/z\y)的DNA聚合酶(EP-A455430X商標(biāo)Vent:NewEnglandBiolabs公司產(chǎn))等，其中，優(yōu)選來自棲熱水生菌(^zwwwsa《wa"cw)的耐熱性DNA聚合酶。上述反應(yīng)液中的DNA聚合酶的添加比例沒有特別卩艮制，例如是550U/ml，優(yōu)選l100U/ml，更優(yōu)選20~30U/ml。DNA聚合酶的活性單位(U)—般定義如下，使用活化鮭魚精子DNA作為才莫板引物，在活性測定用反應(yīng)液(25mMTAPSbuffer(pH9.3、25°C)、50mMKCl、2mMMgCl2、lmM巰基乙醇、200|iMdATP、200|iMdGTP、200|iMdTTP、100jiM"a-32p，，dCTP、0.25mg/ml活化鮭魚精子DNA)中，74。C下、30分鐘內(nèi)，將10nmol的全核香酸纟參入不i^性沉淀物的活性定義為1U。作為上述核苷三磷酸，通常可以列舉dNTP(dATP、dCTP、dTTP)。上述反應(yīng)液中的dNTP的添加比例沒有特別限制，例如0.01~lmmol/L，優(yōu)選0.05~0.5mmol/L，更優(yōu)選O.l~0.3mmol/L。上述引物可以根據(jù)目標(biāo)核酸的序列、長度適宜地決定。引物的長度一4殳為1050bp左右。上述反應(yīng)液中的引物的添加比例沒有特別限制，例如O.Ol~5(imol/L,優(yōu)選O.l~3pmol/L,更優(yōu)選O.l~l阿ol/L。作為上述溶劑，可以列舉例如三(羥曱基)曱基甘氨酸(Tricine)、MES、MOPS、HEPES、CAPS等緩沖液，可以使用市售的PCR用緩沖液或市售的PCR試劑盒的緩沖液等。又，上述PCR反應(yīng)液可以進(jìn)一步含有甘油、肝素、三曱銨乙內(nèi)酯等，例如其添加比例只要設(shè)定為不干擾PCR反應(yīng)的范圍即可。PCR的循環(huán)條件沒有特別限制，例如，(1)解離為單鏈DNA,(2)引物的退火，(3)引物的延伸(聚合酶反應(yīng))都依照以下的設(shè)定。又，雖然循環(huán)次數(shù)也沒有特別限制，以以下(1)~(3)的3步為1循環(huán)時，例如優(yōu)選30循環(huán)以上。雖然上限沒有特別限制，為例如合計100循環(huán)以下，優(yōu)選70循環(huán)以下，更優(yōu)選50循環(huán)以下。各步的溫度變化例如可以-使用熱循環(huán)卩義等自動控制。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>如上所述制造與目標(biāo)核酸互補的擴增產(chǎn)物，可以得到通過光學(xué)手段檢測時不易受混濁、沉淀物等影響的擴增產(chǎn)物。又，在全血樣品中的目標(biāo)核酸是RNA(mRNA、總RNA)的情況下，除例如通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)由上述RNA產(chǎn)生cDNA，<吏用上述cDNA作為PCR的才莫々反以外，可以與上述一樣進(jìn)行PCR(即，逆轉(zhuǎn)錄PCR(REVERSETRANSCRIPTIONPCR))。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可以例如在含有現(xiàn)有7>知的逆轉(zhuǎn)錄酶、對應(yīng)于上述RNA的引物和核苷三石奔酸(dNTP)的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液中添加上述全血樣品而進(jìn)4于。上述反應(yīng)液中的全血樣品的添加比例可以例如設(shè)定為與上述PCR反應(yīng)液中的添加比例一致。此逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)通常在上述PCR反應(yīng)之前進(jìn)行。雖然可以例如在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，在其反應(yīng)液中進(jìn)一步添加PCR反應(yīng)液的組成成分，但是，為了簡便而且可以減少污染的危險性，優(yōu)選在l個反應(yīng)體系內(nèi)連續(xù)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)(即，一步PCR(One-StepRT-PCR)法)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的反應(yīng)條件雖沒有特別限制，但反應(yīng)溫度為例如30~70°C，反應(yīng)時間為l~120分鐘；伊乙選反應(yīng)溫度4060°C,反應(yīng)時間10~60分4中；更優(yōu)選反應(yīng)溫度45~50°C,反應(yīng)時間20~40分鐘。擴增產(chǎn)物的分析方法如上所述，本發(fā)明的擴增產(chǎn)物的分析方法，其特征在于，其是對通過PCR生成的擴增產(chǎn)物進(jìn)行定性或定量的擴增產(chǎn)物的分析方法，含有以下(A)~(B)的工序。(A)使用本發(fā)明的擴增產(chǎn)物的制造方法生成與全血樣品中的目標(biāo)核酸互補的擴增產(chǎn)物的工序。(B)使用光學(xué)手段檢測上述擴增產(chǎn)物的工序。本發(fā)明的分析方法的特征在于，在生成擴增產(chǎn)物的工序中，如上所述，將PCR反應(yīng)液中的全血樣品設(shè)定為上述添加比例。由此，可以抑制沉淀物、混濁等的影響，可以4吏用光學(xué)手革殳高精度進(jìn)行擴增產(chǎn)物的檢測。所以，本發(fā)明的分析方法中，只要PCR反應(yīng)液中的全血樣品的比例在上述范圍內(nèi)即可，對于其它的條件或工序等沒有任何限制。實時定量PCR法一般是指在PCR中隨時間監(jiān)測擴增產(chǎn)物的產(chǎn)生過程的方法。以下，在本發(fā)明中，將上述(B)工序"通過光學(xué)手段檢測擴增產(chǎn)物的工序"稱為實時定量PCR。另外，上述(B)工序中的擴增產(chǎn)物的一企測例如可以在上述(A)工序完成時或完成后、即PCR反應(yīng)完成時或完成后進(jìn)4亍，也可以與上述(A)工序同時進(jìn)行。與上述(A)工序同時進(jìn)行的情況下，上述(B)工序中的擴增產(chǎn)物的4企測例如可以隨時間進(jìn)行。隨時間檢測(監(jiān)測)可以是例如連續(xù)的，也可以是非連續(xù)(間斷)的。又，也可以4又在上述(A)工序中PCR反應(yīng)過程中監(jiān)測。通過上述方法生成的擴增產(chǎn)物的一企測可以通過測定上述擴增產(chǎn)物產(chǎn)生的熒光強度來進(jìn)行。作為熒光檢測沒有特別限制，有現(xiàn)有7>知的嵌入法、TaqMan(商標(biāo))#笨針法、雜交法(hybridization)、環(huán)狀探針法(cyclingprobe)等。嵌入法是使用能嵌入雙鏈DNA、照射激發(fā)光后可產(chǎn)生熒光的嵌入劑的方法。利用此方法的情況下，可以例如預(yù)先在上述PCR反應(yīng)液中添加上述嵌入劑，用激發(fā)光照射上述反應(yīng)液(上述反應(yīng)液中的嵌入劑)，測定通過上述嵌入劑產(chǎn)生的熒光。T叫Man(商標(biāo))探針法是使用與PCR的模板互補的部分序列且其上含有熒光物質(zhì)和猝滅劑的探針的方法。作為上述探針，可以列舉在與模板的目標(biāo)序列特異性退火的寡核苷酸的末端分別標(biāo)記有熒光物質(zhì)(5'末端)和猝滅劑(3'末端)的探針。上述探針雖沒有特別限制，但是優(yōu)選例如20~30mer左右的寡核苷酸。利用此方法的情況下，可以例如預(yù)先在PCR反應(yīng)液中添加上述探針，用激發(fā)光照射上述反應(yīng)液(上述反應(yīng)液中的熒光物質(zhì))，測定上述熒光物質(zhì)產(chǎn)生的熒光。此方法是基于如下原理在PCR反應(yīng)液中，上述探針僅與模板退火，雖使用激發(fā)光照射，但上述猝滅劑會抑制熒光物質(zhì)的熒光，但是如果延伸工序中DNA發(fā)生了延伸，上述探針由于DNA聚合酶的5，—3'核酸外切酶活性而被分解，熒光物質(zhì)與猝滅劑分離從而產(chǎn)生熒光。雜交法是使用2種與PCR的模板互補的部分序列、且相互鄰近的探針的方法。作為上述兩種探針，可以列舉例如與模板的3，端退火且3，末端用受體熒光物質(zhì)標(biāo)記的寡核苷酸探針和與模板的5，端退火且5，末端用供體熒光物質(zhì)標(biāo)記的寡核苷酸探針的組合。利用此方法的情況下，可以例如預(yù)先在PCR反應(yīng)液中添加上述兩種探針，用激發(fā)光照射上述反應(yīng)液(上述反應(yīng)液中的受體熒光物質(zhì))，測定上述受體熒光物質(zhì)產(chǎn)生的熒光。此方法是基于如下原理在PCR反應(yīng)液中，若上述兩種探針與模板退火，各受體熒光物質(zhì)和供體熒光物質(zhì)接近而產(chǎn)生熒光，如果延伸工序中DNA發(fā)生了延伸，由于被受體熒光物質(zhì)標(biāo)記的探針分解，由于受體熒光物質(zhì)與供體熒光物質(zhì)分離從而熒光消失。環(huán)狀探針法是使用與PCR的模板互補的序列、末端分別被焚光物質(zhì)(5'末端)和猝滅劑(3，末端)標(biāo)記且僅僅中央部分是RNA序列(核糖核苷酸序列)的探針的方法。利用此方法的情況下，可以例如預(yù)先在PCR反應(yīng)液中添加上述探針和RNaseH，用激發(fā)光照射上述反應(yīng)液(上述反應(yīng)液中的熒光物質(zhì))，測定上述熒光物質(zhì)產(chǎn)生的熒光。此方法是基于如下原理在PCR反應(yīng)液中，上述探針僅與模板退火，雖使用激發(fā)光照射，但上述猝滅劑會抑制熒光物質(zhì)的熒光，但是如果RNaseH切斷了形成嵌合體雙鏈的RNA部分，由于兩端的熒光物質(zhì)和猝滅劑分離從而產(chǎn)生熒光，若RNA部位中存在4普配則不發(fā)生由RNaseH進(jìn)行的切斷。熒光強度的檢測可以使用例如熒光光度計進(jìn)行。又，一般使用同時具備PCR反應(yīng)單元(例如熱循環(huán)儀)和光學(xué)系統(tǒng)單元(例如熒光光度計)的裝置。作為具體例，可以列舉市售的SmartCycler(商品名，takara-bio7>司產(chǎn))、LightCycler(商品名，roche-diag謹(jǐn)tics公司產(chǎn))、ABIPRISM7000(商品名，AppliedBiosystems公司產(chǎn))。若使用這樣的光學(xué)手段進(jìn)行檢測，可以例如對擴增產(chǎn)物定性(有無擴增或有無模板核酸)以及定量(擴增產(chǎn)物的量)。實時定量PCR中，通常對每個循環(huán)的熒光強度作圖來制作擴增曲線，分析擴增產(chǎn)物達(dá)到設(shè)定值(閾值例如，擴增停止的量)的循環(huán)次數(shù)(Ct值ThresholdCycle)。根據(jù)此分析內(nèi)容，可以對擴增產(chǎn)物定性或定量，同時也可以對全血樣品中所含的目標(biāo)核酸進(jìn)4亍定性和定量。另外，閾值的i殳定或定量方法可以應(yīng)用現(xiàn)有已知的方法。又，若在PCR反應(yīng)完成后，應(yīng)用上述光學(xué)手段檢測(分析)反應(yīng)液的溫度上升時擴增產(chǎn)物的熔解溫度(Tm值)，例如可以確認(rèn)所得擴增產(chǎn)物是一種還是一種以上。目標(biāo)核酸的分析方法接下來，本發(fā)明的目標(biāo)核酸的分析方法是如上所述的對樣品中所含的目標(biāo)核酸進(jìn)行定量的目標(biāo)核酸的分析方法，其特征在于，上述樣品是全血樣品，上述方法包括下述(A)~(C)的工序。(A)通過本發(fā)明的擴增產(chǎn)物的制造方法生成與全血樣品中的目標(biāo)核酸互補的擴增產(chǎn)物的工序。(B)通過光學(xué)手段檢測上述擴增產(chǎn)物，對上述擴增產(chǎn)物進(jìn)行定量的工序。(C)通過對上述擴增產(chǎn)物到達(dá)設(shè)定量時的PCR循環(huán)次數(shù)進(jìn)行計數(shù)，對上述全血樣品中所含的目標(biāo)核酸進(jìn)行定量的工序。本發(fā)明中，上述(A)工序和(B)工序相當(dāng)于上述本發(fā)明的擴增產(chǎn)物的分析方法。本發(fā)明的特征在于，在生成擴增產(chǎn)物的工序中，如上所述，將PCR反應(yīng)液中的全血樣品設(shè)定為上述添加比例。由此，可以抑制沉淀物、混濁等的影響，可以使用光學(xué)手段高精度進(jìn)行擴增產(chǎn)物的檢測，結(jié)果可以高精度分析目的核酸。所以，本發(fā)明的分析方法中，PCR反應(yīng)液中的全血樣品的比例只要在上述范圍內(nèi)即可，對于其它的條件、工序等沒有任何限制。通常PCR中，若擴增產(chǎn)物達(dá)到一定的量(閾值)，則不會產(chǎn)生超過此量的擴增。因此，若僅僅測定最終產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物的量，則難以對全血樣品中的目標(biāo)核酸的量進(jìn)行定量。但是，如果如上所述通過實時定量PCR,由于監(jiān)測每循環(huán)的擴增產(chǎn)物的產(chǎn)生，對達(dá)到設(shè)定的閾值時的循環(huán)次數(shù)(Ct值)進(jìn)行計數(shù)，可以例如基于閾值和Ct值對全血樣品中所含的目標(biāo)核酸進(jìn)行定量。實施例以下，對本發(fā)明的實施例、比較例一并進(jìn)行說明。但是，本發(fā)明并受下述實施例和比較例的限定。[實施例1]本實施例是將PCR反應(yīng)液中全血樣品的添加比例設(shè)定為各種值來進(jìn)行PCR,對得到的擴增產(chǎn)物的Tm進(jìn)行分析的例子。作為引物，使用由序列號l和2表示的forwardprimerGH20(商品名，Takara公司產(chǎn))、reverseprimerGH21(商品名,Takara公司產(chǎn))，擴增p-球蛋白(人)中的408bp的區(qū)域。又，作為用于確認(rèn)PCR的擴增的熒光物質(zhì)，4吏用商品名為SYBERGreenl的嵌入劑。序歹ll號1(forwardprimerGH20)5'—gaagagccaaggacaggtac—3'序歹ll號2(reverseprimerGH21)5'—gg肌肌tagaccaataggcag—3'將健康人的全血以i殳定的添加比例(0.02、0.025、0.033、0.036、0.038、0.042、0.045、0.05、0.056、0.0625、0.071、0.083、0.1、0.125、0.17、0.25、0.29、0.33、0.4、0.5、0.67、1、2、2.5、3.3、5、10體積％)添加入下述PCR反應(yīng)液中。使用擴增于PCR反應(yīng)后的反應(yīng)液，使用波長515~555nm測定熒光值(%),進(jìn)行Tm分析。Tm分析的條件如下。另外，作為上述擴增裝置，使用由熱循環(huán)儀(商品名EppendorfMasterCyclerepS:EppendorfV^司產(chǎn))和下述光學(xué)系統(tǒng)(商品名ArkraysystemVer.4)組合的裝置(其它的實施例也同樣)，進(jìn)行PCR和Tm的分析(參考W02005/118772)。(PCR反應(yīng)液)Taqbuffer(商品名，Takara公司產(chǎn))0.2mMdNTP(Takara公司產(chǎn))0.5!iM正向引物0.5|iM反向引物25U/mlLr-Taq(Takara公司產(chǎn))1/5000倍稀釋SYBERGREENI全血樣品_合計50jil[表3]過濾范圍LED_發(fā)光側(cè)_受光側(cè)chl405證370~415腿450~480匪ch2470證420~485證515~555腿ch3525證_490~555腿_585~700謹(jǐn)發(fā)光元件LED(EpitexInc產(chǎn))受光元件PD(型號6931:HamamatsuPhotonicsK.K.產(chǎn))[表4]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>其結(jié)果由圖l表示。圖1是表示PCR反應(yīng)液中的全血樣品添加比例和熒光值的關(guān)系的圖。該圖中，縱軸為熒光值(％),橫軸為PCR反應(yīng)液中全血樣品的添加比例(終濃度體積％)。其結(jié)果如圖1所示，PCR反應(yīng)液中的全血的添加比例為高濃度(特別是2體積％以上)的情況下，不能使用熒光測定確認(rèn)PCR的擴增。推測這是因為PCR反應(yīng)中，上升反應(yīng)液中產(chǎn)生沉淀物、混濁等，所以照射光被遮住。相對的，如圖1所示，將PCR反應(yīng)液中全血添加比例設(shè)定為0.5體積％以下，則PCR擴增產(chǎn)物的焚光測定完全可以進(jìn)行。推測這是因為充分保持了PCR的擴增效率且抑制了混濁等的產(chǎn)生。其結(jié)果可以說通過將全血添加比例設(shè)定在上述范圍內(nèi)，可以例如不對全血樣品進(jìn)行前處理而對目標(biāo)核酸進(jìn)4于定性或定量。確認(rèn)了添加BSA對加熱產(chǎn)生的沉淀物等的生成的影響。又，由于上述影響是通過熒光測定中對光的阻擋來確認(rèn)的，因此僅僅進(jìn)行熱處理，沒有使用PCR進(jìn)行擴增反應(yīng)。具體而言，向下述組成的反應(yīng)液中，使全血的添加比例為0.4體積％,而BSA以i殳定的添力口比例(0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.2、0.24、0.28、0.32、0.36、0.4、0.44、0.48、0.52、0.56、0.6、0.64、0.68、0.72、0.76、0.8%)分別添加。此后，4吏用與上述實施例1同樣的裝置，將上述反應(yīng)液在95。C下處理5分鐘后，進(jìn)行Tm分析(測定波長515~555nm)。其結(jié)果以圖3表示。圖3是表示反應(yīng)液中BSA的濃度和熒光值的關(guān)系的圖。T叫buffer(商品名，Takara公司產(chǎn))熒光物質(zhì)(商品名，BODIPYFL、Invhrogen7^司產(chǎn))全血樣品_合計50(^1如該圖所示，確:〖人通過添加BSA可增加熒光il。特別確"i人通過將BSA添加比例設(shè)定為0.2體積％以上時，熒光值的增加顯著。推測這是因為通過添加BSA抑制了沉淀物等的產(chǎn)生。由此結(jié)果可知，確認(rèn)通過將PCR反應(yīng)液中血液添加比例設(shè)定為0.5體積％以下，進(jìn)一步添加BSA(特別是0.2體積％以上)，可更加準(zhǔn)確地測定PCR擴增物的焚光。[實施例4]本實施例是在PCR反應(yīng)前加熱全血的稀釋樣品的基礎(chǔ)上，將PCR反應(yīng)液中全血的添加比例設(shè)定為特定的比例，進(jìn)行PCR和Tm分析。<吏用由序歹ll號3禾口4表示的正向引物(forwardprimer)、反向引#勿(reverseprimer)4乍為引#勿，才廣i曽月iU定素(amylin)基因上的105bp的區(qū)域。又，為了確認(rèn)PCR的擴增，使用由序列號5表示的下述探針。序列號3(正向引物)5'—cacatgtgcaacgcagcg—3'序列號4(反向引物)5'—ctcttgccatatgtattggatccc—3'序列號5(檢測用探針)5，一(FAM)-ttcattccagcaacaactttggtgccattctctc-(DABCYL)—3'將使用肝素采血管采集的健康人的全血10pl添加入90[il的下述分析物稀釋液l,混合。將此混合液10jil添加入90)il的下述分析物稀釋液2，混合。以此作為稀釋樣品。進(jìn)一步，在95。C對10pl上述稀釋樣品加熱處理5分鐘。此后，使用非加熱的稀釋樣品lOial或加熱后的稀釋樣品10jil，使用下述組成的PCR反應(yīng)液進(jìn)行實時定量PCR。同時，對每份樣品進(jìn)行3次分析(n=3)。(分析物稀釋液l:以下同樣)10mMTris畫HCl(pH8)24O.lmMEDTA0.05%NaN30.3%SDS(分析物稀釋液2:以下同樣)10mMTris-HCl(pH8)O.lmMEDTA0.05%NaN3(PCR反應(yīng)液單位pl)蒸餾水30.420%BSA110xGeneTaqbuffer*10mMdAUGC1lOOmMMgCl20.755jiM檢測用探針1IOOjiM正向引物0.25lOOfiM反向引物0.252U/|xlUNG**0.15U/plGeneTaqNT*0.25稀釋樣品10合計50|il*商品名GeneTaqNT(nippongene公司產(chǎn))**尿嘧咬畫N畫糖苷酶(腦cil國N-glycosylase)上述實時定量PCR的條件如下。使用i-Cycler(商品名，BIO-RAD^^司產(chǎn))，50。C下2分鐘，95。C下2分鐘處理后，以95。C、15秒和56。C、45秒作為一個循環(huán)，重復(fù)50個循環(huán)。并且，在各循環(huán)中56。C、45秒的步驟中，使用波長530nm監(jiān)測上述檢測用探針中FAM的熒光。在下表中顯示使用上述i-Cycler計算的Ct(ThresholdCycle)的值。如上所述，Ct表示與擴增產(chǎn)物的量相關(guān)的熒光值達(dá)到設(shè)定值(閾值)時的循環(huán)次數(shù)。上述閾值也使用i-Cycler算出，本實施例中焚光值的閾值是184.2。同時，根據(jù)實時定量PCR的原理，可以判斷Ct值相對越小，初始沖莫^反量相對越多。Ct平均值_Ct34.7力口熱33.933.7_32.1力口熱32.231.9_32.7又，圖4的圖中分別顯示對非加熱的稀釋樣品和加熱的稀釋樣品的測定值(n=3)的平均值。圖4是表示各樣品的循環(huán)次數(shù)和熒光值的關(guān)系的圖，粗線表示加熱處理的稀釋樣品的結(jié)果，細(xì)線表示非加熱處理的稀釋樣品的結(jié)果。如上述表7所示，通過預(yù)先對稀釋樣品進(jìn)行加熱處理，與非加熱的稀釋樣品相比，Ct值平均減少了1.7個循環(huán)。這意味著通過加熱處理，初始模板量多了約3.2倍。又，如圖4所示，以圖表表示的情況下，與非加熱的稀釋樣品比較，明顯發(fā)現(xiàn)加熱處理的稀釋樣品的熒光值從30個循環(huán)附近開始增加。通過上述的實施例可知，通過將PCR反應(yīng)液中的全血樣品的比例設(shè)定在特定范圍內(nèi)，可以充分保持PCR的擴增效率且可以抑制混濁等的影響。進(jìn)而，通過本實施例也發(fā)現(xiàn)在PCR反應(yīng)前加熱稀釋樣品可以進(jìn)一步提高PCR的擴增效率。[實施例5]除使用采用EDTA采血管代替肝素采血管采集到的健康人的全血10(il以外，與上述實施例4一樣進(jìn)4亍實時定量PCR。在下表8中顯示使用上述i-Cycler計算的Ct值。又，圖5中分別顯示對非加熱的稀釋樣品和加熱的稀釋樣品的測定值(n=3)的平均值。圖5是表示各樣品循環(huán)次數(shù)和熒光值的關(guān)系的圖，粗線表示加熱處理的稀釋樣品的結(jié)果，細(xì)線表示非加熱處理的稀釋樣品的結(jié)果。<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>如上述表8所示，通過預(yù)先對稀釋樣品進(jìn)行加熱處理，與非加熱的稀釋樣品相比，Ct值平均減少了2.4個循環(huán)。這意味著通過加熱處理，初始模板量多了約5.3倍。又，如圖5所示，以圖表表示的情況下，與非加熱的稀釋樣品比較，明顯發(fā)現(xiàn)加熱處理的稀釋樣品的熒光值從30個循環(huán)附近開始增加。通過上述的實施例可知，通過將PCR反應(yīng)液中的全血樣品的比例設(shè)定在特定范圍內(nèi)，可以充分保持PCR的擴增效率且可以抑制混濁等的產(chǎn)生。進(jìn)而，通過本實施例也發(fā)現(xiàn)在PCR反應(yīng)前加熱全血樣品可以進(jìn)一步提高PCR的擴增效率。本實施例是在PCR反應(yīng)前在設(shè)定的溫度下加熱全血的稀釋樣品的基礎(chǔ)上，將PCR反應(yīng)液中全血的添加比例設(shè)定為特定的比例，進(jìn)行PCR和Tm分析。使用與上述實施例4相同的正向引物(forwardprimer)、反向引物(reverseprimer)作為引物。又，為了確i^PCR的擴增，使用由序列號6表示的下述探針。序列號6(檢測用探針)5'—(FAM)—ttggtagatgagagaatggcaccaaagttgttgc—(DABCYL)—3'將使用EDTA采血管采集的健康人的全血10jil添加入90nl的前述分析物稀釋液l,混合。將此混合液10fil添加入90pl的前述分析物稀釋液2，混合。以此作為稀釋樣品。進(jìn)一步，在特定的溫度下(99°C、95°C、90°C、85°C、80°C)對10pl上述稀釋樣品加熱處理5分鐘。此后，使用非加熱的稀釋樣品10(il或加熱PCR。實時定量PCR的條件與上述實施例4相同。[表9](PCR反應(yīng)液單位fil)蒸餾水26.2520%BSA0.510xGeneTaqbuffer*510mMdNTP4100mMMgCl20.755|iM才全測用^笨4十2lOOfiM正向引物0.25100|iM反向引物0.255U/nlGeneTaqNT*0.25稀釋樣品_10合計50(il*商品名GeneTaqNT(nippongene公司產(chǎn))下表中顯示使用上述i-Cycler計算的Ct值。本實施例中熒光值的閾值是335.2。[表IO]Ct非加熱34.2力口熱80°C32.785°C32.890°C32.895°C32.699°C31.7如上述表所示，預(yù)先在80。C~99。C對稀釋樣品進(jìn)行加熱處理的情況下，與非加熱的稀釋樣品的Ct的差在0.6個循環(huán)以上。0.6個循環(huán)以上意p未初始才莫板量為約1.5倍以上。因此，發(fā)現(xiàn)在80°C以上加熱處理稀釋樣品可以進(jìn)一步提高PCR的擴增效率。同時也發(fā)現(xiàn)加熱溫度相對越高，擴增效率相對提高越多。本實施例是在PCR反應(yīng)前在80。C或99。C下對全血的稀釋樣品加熱特定的時間的基礎(chǔ)上，將PCR反應(yīng)液中全血的添加比例設(shè)定為特定的比例，進(jìn)行PCR和Tm分析。除以80°C或99。C作為加熱溫度，將加熱處理的時間設(shè)定為特定的時間(30秒、l分鐘、3分鐘、IO分鐘、15分鐘)之外，與上述實施例6—樣，進(jìn)行實時定量PCR。下表中顯示使用上述i-Cycler計算的Ct的值。本實施例中熒光值的閾值是165.4。[表ll]<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>如上述表所示，預(yù)先在80。C或99。C對稀釋樣品加熱處理30秒以上的情況下，與非加熱的稀釋樣品的Ct值的差在0.6個循環(huán)以上。如前所述，0.6個循環(huán)以上意味初始模板量為約1.5倍以上。因此，發(fā)現(xiàn)在80。C以上加熱處理30秒以上稀釋樣品，可以進(jìn)一步提高PCR的擴增效率。產(chǎn)業(yè)上的利用可能性如上所述，若使用本發(fā)明的擴增產(chǎn)物的制造方法，只要將PCR反應(yīng)液中的全血樣品的添加比例設(shè)定在上述范圍，就可以無需進(jìn)行如現(xiàn)有技術(shù)中的全血樣品的前處理或PCR反應(yīng)液的后處理等而抑制混濁、沉淀等對檢測的影響。因此，由于這樣可以抑制混濁、沉淀等的影響，不使用傳統(tǒng)的電泳而使用光學(xué)手段也可以檢測擴增產(chǎn)物。而且，由于可以使用光學(xué)手賴:一僉測，可以實現(xiàn)使用電泳不能進(jìn)行的擴增產(chǎn)物生成過程中的隨時間監(jiān)測。因此，根據(jù)本發(fā)明，即使在使用全血樣品的情況下，例如，不僅可以進(jìn)行擴增產(chǎn)物的定性、定量，也可以進(jìn)行全血樣品中的目標(biāo)核酸的定性、定量。權(quán)利要求1.擴增產(chǎn)物的制造方法，其為通過PCR制造與全血樣品中的目標(biāo)核酸互補的擴增產(chǎn)物的方法，在PCR反應(yīng)液中，全血樣品的添加比例是0.01～0.9體積％。2.擴增產(chǎn)物的制造方法，其為通過PCR制造與全血樣品中的目標(biāo)核酸互補的擴增產(chǎn)物的方法，在PCR反應(yīng)液中，全血樣品的添加比例換算成血紅蛋白量在O.Ol~1.8g/L的范圍。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的擴增產(chǎn)物的制造方法，在PCR反應(yīng)開始前，向所述PCR反應(yīng)液中加入白蛋白。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的擴增產(chǎn)物的制造方法，所述PCR反應(yīng)液中的所述白蛋白的添加比例在O.l~l重量％的范圍。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的擴增產(chǎn)物的制造方法，所述白蛋白是選自牛血清白蛋白、人血清白蛋白、大鼠血清白蛋白和馬血清白蛋白所組成的組中的至少一種。6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的擴增產(chǎn)物的制造方法，包括在PCR反應(yīng)開始前對全血樣品實施加熱處理的工序。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的擴增產(chǎn)物的制造方法，在所述加熱處理工序中，對全血樣品稀釋后的稀釋樣品實施加熱處理，所述稀釋樣品中，全血樣品的比例在0.01~90體積％的范圍。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的擴增產(chǎn)物的制造方法，所述加熱處理工序的加熱溫度在80。C~99。C的范圍。9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的擴增產(chǎn)物的制造方法，所述加熱處理工序的處理時間是30秒以上。10.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的擴增產(chǎn)物的制造方法，所述全血樣品中的目標(biāo)核酸是DNA,以所述DNA作為PCR的模板。11.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的擴增產(chǎn)物的制造方法，所述全血樣品中的目標(biāo)核酸是RNA,以通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)由所述RNA生成的cDNA作為PCR的模板。12.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的擴增產(chǎn)物的制造方法，PCR的擴增次數(shù)是30個循環(huán)以上。13.擴增產(chǎn)物的分析方法，其對通過PCR生成的擴增產(chǎn)物進(jìn)行定性或定量，其特征在于，含有以下(A)~(B)的工序，(A)通過權(quán)利要求1或2所述的擴增產(chǎn)物的制造方法生成與全血樣品中的目標(biāo)核酸互補的擴增產(chǎn)物的工序，(B)通過光學(xué)手段檢測所述擴增產(chǎn)物的工序。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的擴增產(chǎn)物的分析方法，在所述(B)工序中，隨時間檢測所述擴增產(chǎn)物。15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的擴增產(chǎn)物的分析方法，通過測16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的擴增產(chǎn)物的分析方法，所述光學(xué)手段是熒光光度計。17.根據(jù)權(quán)利要求13所述的擴增產(chǎn)物的分析方法，PCR反應(yīng)液中還含有能嵌入雙鏈DNA的嵌入劑，在所述(B)工序中，通過測定向所述嵌入劑照射激發(fā)光而產(chǎn)生的熒光來檢測所述擴增產(chǎn)物。18.根據(jù)權(quán)利要求13所述的擴增產(chǎn)物的分析方法，PCR反應(yīng)液中還含有探針，所述探針帶有焚光物質(zhì)和猝滅劑且作為與PCR的模板互補的部分序列，在所述(B)工序中，通過測定向所述熒光物質(zhì)照射激發(fā)光而產(chǎn)生的熒光來檢測所述擴增產(chǎn)物。19.根據(jù)權(quán)利要求13所述的擴增產(chǎn)物的分析方法，在所述(B)工序中，所述擴增產(chǎn)物的檢測方法是Tm分析。20.目標(biāo)核酸的分析方法，其是對樣品中所含的目標(biāo)核酸進(jìn)行定量的目標(biāo)核酸的分析方法，其特征在于，所述樣品是全血樣品，所述方法包括下述(A)~(C)的工序，(A)通過權(quán)利要求1或2所述的擴增產(chǎn)物的制造方法生成與全血樣品中的目標(biāo)核酸互補的擴增產(chǎn)物的工序，(B)通過光學(xué)手段檢測所述擴增產(chǎn)物，對所述擴增產(chǎn)物進(jìn)行定量的工序，(C)通過對所述擴增產(chǎn)物到達(dá)設(shè)定量時的PCR循環(huán)次數(shù)進(jìn)行計數(shù)，對所述全血樣品中所含的目標(biāo)核酸進(jìn)行定量的工序。21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的目標(biāo)核酸的分析方法，在所述(B)工序中，隨時間4全測所述擴增產(chǎn)物。22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的目標(biāo)核酸的分析方法，通過測23.根據(jù)權(quán)利要求20所述的目標(biāo)核酸的分析方法，所述光學(xué)手段是熒光光度計。24.根據(jù)權(quán)利要求20所述的目標(biāo)核酸的分析方法，在所述(B)工序中，所述擴增產(chǎn)物的檢測方法是Tm分析。全文摘要本發(fā)明提供PCR擴增產(chǎn)物的制造方法，其在通過光學(xué)手段對擴增核酸進(jìn)行的檢測中，可以抑制來自全血樣品的沉淀物、混濁等對上述檢測的影響。使PCR反應(yīng)液中的全血樣品的添加比例為0.1～0.9體積％或換算成血紅蛋白量為0.01～1.8g/L，并通過PCR制造與全血樣品中的目標(biāo)核酸互補的擴增產(chǎn)物。若在這樣的條件下進(jìn)行PCR，即使是未處理的全血樣品，也可以抑制沉淀物、混濁的影響，通過光學(xué)手段對擴增產(chǎn)物進(jìn)行監(jiān)測。文檔編號C12N15/09GK101443457SQ20078001714公開日2009年5月27日申請日期2007年8月7日優(yōu)先權(quán)日2006年8月9日發(fā)明者和泉澤裕司,間島智史申請人:愛科來株式會社