一種抑制核酸擴(kuò)增產(chǎn)物污染的方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種抑制核酸擴(kuò)增產(chǎn)物污染的方法及應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)如今在食品質(zhì)量安全檢測(cè)、臨床醫(yī)學(xué)以及法醫(yī)鑒定中，對(duì)于致病菌、目標(biāo)DNA的 檢測(cè)大多用核酸擴(kuò)增的方法，主要為PCR、熒光定量PCR和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP)等方法。 而在檢測(cè)過(guò)程中，各檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室常被核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的污染所困擾，由于核酸污染所導(dǎo)致的 假陽(yáng)性結(jié)果會(huì)造成檢測(cè)的失敗。然而，到如今對(duì)于這種污染的預(yù)防多數(shù)都在于實(shí)驗(yàn)室對(duì)環(huán) 境和設(shè)施的嚴(yán)格分區(qū)管理和定期的清潔制度。一旦發(fā)生了核酸的污染，采取的措施就是對(duì) 污染區(qū)域用次氯酸鈉進(jìn)行徹底的清潔、2周之內(nèi)不要做任何的擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)或更換實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)，使 DNA進(jìn)行自身的降解以達(dá)到消除核酸擴(kuò)增產(chǎn)物造成的污染。這些就是現(xiàn)階段對(duì)于消除核酸 擴(kuò)增產(chǎn)物污染的有效手段。但是，所需要消耗的費(fèi)用、人員和時(shí)間都很多，不利于檢測(cè)工作 的進(jìn)行，并造成了較大的時(shí)間和經(jīng)濟(jì)損失。
[0003] 疊氮溴化丙錠（PMA)是biotium公司開(kāi)發(fā)的一種具有高親和力的光敏DNA綁定染 料。染料本身具有弱熒光的，但是和核酸結(jié)合之后熒光性變強(qiáng)。它具有高親和性并優(yōu)先結(jié) 合到雙鏈DNA上。由于光解作用，染料上光敏的疊氮基轉(zhuǎn)化為高反應(yīng)性的氮烯基，其易于與 結(jié)合部位的任何烴（碳?xì)浠衔铮┎糠址磻?yīng)，形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵的氮-碳鍵，從而導(dǎo)致永久 性的DNA修飾。染料幾乎完全細(xì)胞膜不透性，從而可以用于有選擇地修飾只從死細(xì)胞中暴 露出來(lái)的DNA，而遠(yuǎn)離活細(xì)胞中完整的DNA。目前，對(duì)PMA的應(yīng)用主要是去除死菌對(duì)檢測(cè)結(jié) 果的影響，還沒(méi)有利用PMA進(jìn)行抑制核酸擴(kuò)增產(chǎn)物污染的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種抑制核酸擴(kuò)增產(chǎn)物污染的方法，所采取的技 術(shù)方案如下：
[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種抑制核酸擴(kuò)增產(chǎn)物污染的方法，該方法是利用疊氮溴 化丙錠溶液處理污染有核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的環(huán)境，再對(duì)環(huán)境進(jìn)行曝光處理。
[0006] 所述方法的步驟如下：
[0007] 1)利用二甲基亞砜（DMS0)或水溶解疊氮溴化丙錠，配制疊氮溴化丙錠溶液； [0008] 2)將步驟1)所得的疊氮溴化丙錠溶液溶解、噴灑或涂抹到污染環(huán)境中；
[0009] 3)對(duì)步驟2)經(jīng)過(guò)處理的環(huán)境進(jìn)行曝光處理。
[0010] 優(yōu)選地，步驟1)所述配制疊氮溴化丙錠溶液，是利用二甲基亞砜或水溶解疊氮溴 化丙錠至濃度2mM以上。
[0011] 優(yōu)選地，步驟2)所述將疊氮溴化丙錠溶液溶解噴涂污染環(huán)境中，抑制PCR產(chǎn)物時(shí)， 疊氮溴化丙錠溶液工作時(shí)的濃度在〇. 〇3mM以上。
[0012] 優(yōu)選地，步驟2)所述將疊氮溴化丙錠溶液溶解噴涂污染環(huán)境中，抑制LAMP產(chǎn)物 時(shí)，疊氮溴化丙錠溶液工作時(shí)的濃度在〇. 148mM以上。
[0013] 優(yōu)選地，步驟3)所述曝光處理，是在光強(qiáng)11151ux-1115001ux下，處理0.5-30min。
[0014] 更優(yōu)選地，所述曝光處理，是在光強(qiáng)1115001ux下處理30s。
[0015] 更優(yōu)選地，所述曝光處理，是在光強(qiáng)11151ux下處理30min。
[0016] 所述方法的具體步驟如下：
[0017] 1)利用二甲基亞砜溶解疊氮溴化丙錠至濃度為2mM，獲得疊氮溴化丙錠溶液；
[0018] 2)將步驟1)所得的疊氮溴化丙錠溶液溶解、噴灑或涂抹到污染環(huán)境中，其中，在 抑制PCR產(chǎn)物時(shí)，疊氮溴化丙錠溶液工作時(shí)的濃度在0. 03mM以上，在抑制LAMP產(chǎn)物時(shí)，疊 氮溴化丙錠溶液工作時(shí)的濃度在0. 148mM以上；
[0019] 3)在光強(qiáng)1115001ux下處理30s。
[0020] 所述方法用于預(yù)防和消除實(shí)驗(yàn)室或工廠中的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。
[0021] 優(yōu)選地，所述方法，的具體步驟如下：
[0022] 1)利用二甲基亞砜溶解疊氮溴化丙錠至濃度為2mM，獲得疊氮溴化丙錠溶液；
[0023] 2)將步驟1)所得的疊氮溴化丙錠溶液溶解、噴灑或涂抹到污染環(huán)境中；
[0024] 3)在光強(qiáng)1115001ux下處理30s;
[0025] 4)處理結(jié)束后，利用無(wú)污染的水清洗或噴涂污染環(huán)境后，在光強(qiáng)1115001UX的條 件下處理30min，以消除殘留PMA對(duì)日后實(shí)驗(yàn)可能的影響。
[0026] 本發(fā)明的原理在于，由于PMA結(jié)構(gòu)中帶有一個(gè)疊氮基團(tuán)（_N3)，在光激發(fā)下脫去 (_N2)形成活躍的氮賓中間體，能與DNA形成永久性的共價(jià)鍵（-NH-CH，)，使DNA不能發(fā)生 擴(kuò)增反應(yīng)。
[0027] 本發(fā)明所取得的有益效果如下：
[0028] 1.本發(fā)明所提供的方法可以有效的抑制PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(resl-time PCR)、反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、核酸序列依賴性擴(kuò)增技術(shù)（NASBA)、鏈置換擴(kuò)增（SDA)技術(shù)和環(huán) 介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP)技術(shù)等核酸擴(kuò)增方法中所產(chǎn)生的污染，解決了陽(yáng)性核酸擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì) 日后核酸擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)的干擾問(wèn)題，能夠很好的抑制核酸擴(kuò)增過(guò)程中，假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)。
[0029] 2.本發(fā)明所提供的方法，操作步驟十分簡(jiǎn)單方便，耗時(shí)也很短。本發(fā)明所提供的方 法省略了現(xiàn)有技術(shù)在黑暗中孵育的步驟，也可以獲得良好的技術(shù)效果。同時(shí)，利用本發(fā)明所 提供的方法處理過(guò)的環(huán)境，處理結(jié)束后立即就可進(jìn)行擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，無(wú)需等待污染源自身降解， 大大縮短了處理時(shí)間。
[0030] 3.在本專利之前，疊氮溴化丙錠主要是對(duì)活菌和死菌進(jìn)行區(qū)分，細(xì)菌的DNA常為 低卷曲的負(fù)性超螺旋結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)有技術(shù)僅能說(shuō)明疊氮溴化丙錠可以與這種低卷曲的負(fù)性超螺 旋結(jié)構(gòu)DNA進(jìn)行結(jié)合，并產(chǎn)生抑制作用，卻尚無(wú)研宄證明疊氮溴化丙錠對(duì)經(jīng)過(guò)LAMP擴(kuò)增以 后形成的具有不同個(gè)數(shù)莖環(huán)結(jié)構(gòu)和多環(huán)菜花樣結(jié)構(gòu)的DNA也可以起到抑制作用。本發(fā)明所 提供的方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP)技術(shù)所產(chǎn)生的特殊的莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)擴(kuò)增產(chǎn)物的 抑制，能夠避免污染LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物所引起的假陽(yáng)性結(jié)果。
【附圖說(shuō)明】
[0031] 圖1為實(shí)施例2中PMA對(duì)LAMP產(chǎn)物的污染的抑制效果；
[0032](M:Marker;1:陽(yáng)性；2-7:暗孵育時(shí)間分別為Omin;lmin;2min;3min;4min; 5min;8 :陰性）。
[0033] 圖2為實(shí)施例3中不同光源的燈光對(duì)核酸產(chǎn)物抑制效果的影響；
[0034](M:Marker; 1 :陽(yáng)性；2 :光照強(qiáng)度為1115lux的白熾燈光照；3 :光照強(qiáng)度為 11151UX的鹵素?zé)艄庹眨? :陰性）。
[0035] 圖3為實(shí)施例4中DMSO對(duì)于LAMP產(chǎn)物污染抑制效果的影響；
[0036](M :Marker;1 :2ul2mMPMA處理LAMP產(chǎn)物；2 :2ulDMSO處理LAMP產(chǎn)物；3 :陽(yáng) 性）。
[0037] 圖4為實(shí)施例5中PMA對(duì)LAMP產(chǎn)物的抑制效果；
[0038](M:MarkerD2000 ;1:陽(yáng)性