專利名稱：：用微通道設(shè)備檢測或分離靶分子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一般涉及靶分子的檢測或分離，更具體涉及檢測或分離所需耙細胞或生物分子的裝置或方法。
背景技術(shù)：
：有效分離和收集異質(zhì)細胞群中的稀有細胞仍然令人很感興趣，因為對分離細胞群用于疾病診斷和治療(如基因治療)以及基礎(chǔ)科學(xué)研究的需求不斷增長。例如，可將正常較大細胞群中的病變細胞(如癌細胞)分離出來、然后將清除后的細胞群再回輸給病人。一種突出的需求是分離胎兒細胞以進行早期胎兒診斷，如在妊娠期間早期篩選潛在的染色體異常；己經(jīng)通過例如羊膜穿刺術(shù)或絨膜絨毛取樣等方法獲得了胎兒細胞。盡管采用這種方法可獲得有效量的胎兒細胞，例如能進行可靠的診斷，但由于這種方法需要侵入子宮且通常只有在妊娠前三個月后才能進行，因此尤其對胎兒而言具有風(fēng)險。胎兒細胞會從胎兒進入母體血流從而也存在于母親的血液循環(huán)中，盡管其數(shù)量非常低；然而，這會導(dǎo)致胎兒細胞與母細胞的比例只有幾個ppm的級別。原則上，通過靜脈刺穿獲得的母血樣品可用于胎兒診斷；然而，用這種方法從大量母體細胞群中分離和收集稀少的胎兒細胞有一些重大挑戰(zhàn)。從宮頸粘膜中分離胎兒細胞時也存在這些挑戰(zhàn)，從體液等物質(zhì)中回收稀少的細胞以及檢測和分離僅以微小量存在的其他生物分子也會存在這些挑戰(zhàn)。細胞檢測和分離是生物醫(yī)學(xué)和臨床發(fā)展中的一個迅速成長的領(lǐng)域，分離復(fù)雜細胞群中所需細胞亞組方法的改進拓寬了對相對均質(zhì)和特性明確的細胞的研究和應(yīng)用。分離的細胞也廣泛用于研究，例如測定藥物或治療對靶細胞群的作用，研究生物學(xué)通路、分離和研究轉(zhuǎn)化或修飾的細胞群等。目前的臨床應(yīng)用包括，例如，分離造血干細胞以重建血細胞，特別是與損傷性化療和放療聯(lián)用。細胞分離時通常將分子靶向具有特異性親和配體的細胞表面以便將靶細胞群有選擇地、可逆地附連于固相。在隨后的步驟中，通過洗滌除去非特異性吸附的細胞，然后釋放耙細胞。這種特異性親和配體可以是抗體、凝集素、受體配體、或者是結(jié)合蛋白質(zhì)、激素、碳水化合物或其他具有生物活性的分子的其他配體。目前用來從大量無關(guān)(bystander)細胞群回收稀有細胞的方法之一是使用靶細胞群選擇性抗體涂布的聚苯乙烯巨珠。這種特異性抗體涂布的巨珠通常在重力作用下在異源細胞群懸浮液中沉降，從而通過中途攔截捕獲耙細胞。用柱從樣品液中分離靶細胞時還使用其他物質(zhì)，通常，選擇進行分離的物質(zhì)類型將決定從樣品液中分離何種目標(biāo)以及最終如何分離。所述物質(zhì)通常具有以下特征，即所需目標(biāo)與該物質(zhì)的結(jié)合傾向通常不同于樣品中其余組分的結(jié)合傾向。用于細胞分離的一種柱型裝置的離子可在1993年8月31日提交的美國專利5,240,856中找到，其中，細胞與柱內(nèi)基質(zhì)結(jié)合。在1997年12月9日提交的美國專利5,695,989中，柱被設(shè)計成作為軟管，它可被擠壓以便于除去結(jié)合的細胞。1997年9月30日提交的美國專利5,672,481描述了一種在封閉無菌情況下進行分離的裝置，其中用一個硬質(zhì)容器來收集、濃縮和轉(zhuǎn)移。美國專利5,763,194描述了一種細胞分離裝置，其包括內(nèi)表面附有配體的半透中空纖維陣列。上述方法中存在許多問題和技術(shù)難題，且未被廣泛使用，由于巨珠捕獲方法通常采用裝在柱內(nèi)的巨珠因此通常被稱為柱方法。為使柱方法能廣泛應(yīng)用，一個需要解決的主要障礙是非特異性結(jié)合造成的困難。而且，在這種柱分離方法中采用巨珠來捕獲靶細胞需要從液流中回收珠子，然后清潔，常用的清潔方法是洗滌。在洗滌過程中，珠子可能丟失、損壞或聚集，從而不能有效收集靶細胞。捕獲劑，通常是特定靶細胞群的選擇性抗體，一般通過物理或化學(xué)方法附于珠表面。與珠物理結(jié)合的捕獲劑在轉(zhuǎn)移和操作過程中可能會脫落或移位。然而，如果它們是通過共價鍵牢固結(jié)合的，則捕獲的細胞在洗滌過程中干脆會留在珠上，因此在收集過程中不會被釋放和回收。除了柱分離方法，現(xiàn)在開發(fā)了從不同細胞群(如體液中發(fā)現(xiàn)的細胞群等)中分離耙細胞的其他方法。例如，美國專利公布2004/0142463提出了從母血等中分離胎兒細胞的系統(tǒng)，其中，首先利用攜帶特異性結(jié)合元件的平板或其他固體支持物(包括柱)的表面分離不需要的血樣組分；然后利用電穿孔等方法完成對靶細胞的分離和分析。已公布的美國專利申請2004/038315描述了將可釋放接頭連接于毛細管內(nèi)腔表面來結(jié)合所需細胞，然后通過切割試劑釋放，并回收細胞。已公布的美國專利申請2002/132316通過采用移動的梯度光場利用微通道裝置分離細胞群。美國專利No.6,074,827公開了采用微流體(床)裝置構(gòu)成的"富集通道"，利用在該通道中電泳來分離和鑒定樣品中的特定核酸。還提到可任選利用抗體或其它結(jié)合片段來保留所需的靶生物材料。美國專利6,432,630公開了采用一種微流體系統(tǒng)，用于引導(dǎo)含生物顆粒的液體流過通道而被選擇性偏流(收集)，表明可利用該系統(tǒng)來分離母血樣品中的胎兒細胞。K.Takahashi等，納米生物科技雜志(7.Nanobiotechnologv).2，5(2004/6/13)(第6頁)公開了一種在芯片上分揀細胞的系統(tǒng)，此系統(tǒng)中有多個微流體入口通道通向固定在玻璃平板上的PDMS板(用主鑄模以光阻環(huán)氧樹脂制作)中形成的中央細胞分揀區(qū)。PDMS板中的瓊脂凝膠電極通過施加靜電作用力促使分離(去掉)不需要的細胞，使這些細胞在流過會聚的短小細胞分選區(qū)時進入平行的緩沖液連續(xù)液流中。也披露過采用立式過濾排列(posttypefilterarrangement)可物理性捕獲大的塵埃顆粒。美國專利6,454,924公開了微流體裝置，其中可使含分析物的液體樣品向下流過其上頂部安置有樣品表面的直立立柱，立柱上連接有捕獲試劑，立柱側(cè)表面為疏水性因而有利于使液體在它們限定的通道中流動。已公布的國際申請WO2004/029221公開了可用于細胞分離，如從母血中分離胎兒紅細胞的微流體裝置。可將含有細胞的樣品導(dǎo)入分離全血的微流動通道裝置中，此裝置含有多個障礙物，其表面具有結(jié)合部分(如適合偶聯(lián)于其上的抗體)而能結(jié)合樣品中的細胞。美國專利號6,344,326披露了具有多個富集通道的微流體裝置，結(jié)合元件如抗體在通道中與交聯(lián)的玻璃絲等偶聯(lián)以捕獲感興趣的生物分子。美國專利No.5，147，607描述了將抗體固定在微通道中進行免疫試驗(如夾心試驗)所用的裝置。微通道中的凹陷區(qū)域可含有一組從通道底面向上延伸的突出物，抗體即固定在其上。以上簡述的參考文獻表明，仍然在不斷尋求改進分離或檢測體液等中的細胞或其它生物材料的方法。發(fā)明概述本發(fā)明披露了一種隨機化流動模式，尤其是由隨機化流體多通道模式提供的隨機化流動模式，它可用于分離或檢測靶分子或?qū)嶓w。因此，本發(fā)明提供了用于分離或檢測靶分子，尤其是靶細胞或生物分子的裝置和方法。在一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種微流體裝置，其包括具有隨機化流徑并包括入口機構(gòu)、出口機構(gòu)及在所述入口和出口機構(gòu)之間延伸的微通道排列的主體，其中所述微通道排列包括眾多與所述微通道的基面整合在一起并從基面伸出的橫置分離立柱，其中所述立柱的排列模式能夠提供所述隨機化流徑。在另一實施方式中，本發(fā)明提供了一種試劑盒，其包含本發(fā)明的裝置以及用螯合劑涂布所述裝置的所述微通道表面的說明書。再在另一實施方式中，本發(fā)明提供了一種包含本發(fā)明裝置的試劑盒，其中，所述裝置的所述微通道表面涂有螯合劑。在又一實施方式中，本發(fā)明提供了一種捕獲樣品中靶分子的方法，所述方法包括使含有所述樣品的流體流過本發(fā)明所述裝置的微通道，其中所述微通道的表面涂有能夠結(jié)合所述靶分子的螯合劑。再在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種檢測樣品中靶分子的方法，所述方法包括使含有所述樣品的流體流過本發(fā)明所述裝置的微通道，其中所述微通道的表面涂有能夠結(jié)合所述靶分子的螯合劑，然后檢測所述靶分子。附圖簡述圖l是微流體裝置基材的透視圖，顯示在微流體通道中制作的簡化含立柱收集區(qū)。圖2是局部放大圖，顯示位于圖1收集區(qū)部分的圖案立柱。圖3是圖1基材沿直線3-3橫截面的前視圖，有一蓋板附著在其底面。圖4是圖1一般所示包括二個閥門的基材的示意性透視圖，其中有一中間板。圖5是沿圖4直線5-5的橫截面視圖。圖6是圖1所示類型基材的示意性平視圖，其中制作的泵是該流體裝置的一部分。圖7是供應(yīng)區(qū)中加入了微量混合器的基材部分的示意圖。圖8是通過加入的親水性涂層使抗體結(jié)合于整個收集區(qū)的示意圖。圖9和10是利用親水性涂層使螯合劑(即選擇抗體)共價結(jié)合于整個收集區(qū)所用的化學(xué)原理，以及描述捕獲所需的靶細胞的示意圖。圖ll是流程圖，說明利用圖案立柱回收細胞的操作步驟，及細胞裝置。優(yōu)選實施方式詳述本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，隨機化流徑，尤其是由隨機化流體多通道模式提供的隨機化流徑可用于分離或檢測靶分子或?qū)嶓w。因此，本發(fā)明提供了用于分離或檢測靶分子，尤其是靶細胞或生物分子的裝置和方法。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種包括入口機構(gòu)、出口機構(gòu)及在所述入口和出口機構(gòu)之間延伸的微通道排列的裝置。本發(fā)明的微通道排列可以是能夠提供隨機化流徑的任何微通道圖案。根據(jù)本發(fā)明，隨機化流徑可以是含有最小量(如不顯著量)液體或不含液流型流動模式或重復(fù)流動模式的任何流徑。一實施方式中，本發(fā)明的隨機化流徑是不含液流型流動模式或重復(fù)流動模式的流徑。在另一實施方式中，本發(fā)明的隨機化流徑是能打斷或抑制直線型流動的流徑。再在另一實施方式中，本發(fā)明的隨機化流徑是與精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的算術(shù)隨機模式相對應(yīng)的流徑。本發(fā)明的隨機化流徑可采用本領(lǐng)域已知的或日后開發(fā)的任何合適方法提供。例如，本發(fā)明的隨機化流徑可利用微通道排列產(chǎn)生，其中所述微通道排列包括眾多與所述微通道的基面整合在一起并從基面伸出到所述封閉平板表面的橫置分離立柱，且立柱的排列模式能夠提供本發(fā)明的隨機化流徑。通常，微通道排列如一個單元或區(qū)域內(nèi)的立柱大小如橫截面尺寸和形狀可以不同。例如，本發(fā)明的微通道排列可包括具有至少兩種或三種不同橫截面尺寸，如大、小和中等尺寸的立柱。本發(fā)明的微通道排列還可包括具有一種形狀或一種以上形狀的立柱。通常，具有不同尺寸和/或形狀的本發(fā)明立柱是根據(jù)本發(fā)明的隨機模式連續(xù)或不均勻分布的。一實施方式中，立柱的平均橫截面尺寸與要流過微通道排列的靶分子的大小相關(guān)。立柱的平均橫截面尺寸與耙分子大小的相對比例通常約為0.5:5、0.5:8、1:5、1:8、2:5、2:9、3:5或3:8。在另一實施方式中，立柱的橫截面占其中包含立柱的微通道基面的橫截面的約20-75%。再在另一實施方式中，所述立柱的總體積(如，固相體積部分)為所述微通道總體積(如，空隙體積部分)的約15-25%。再在另一實施方式中，兩個立柱之間的最小距離與立柱的最小橫截面尺寸相關(guān)，例如，等于立柱的最小橫截面尺寸。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，本發(fā)明的立柱可排列成與通過數(shù)學(xué)算法如計算機程序產(chǎn)生的隨機模式相對應(yīng)的模式。例如，我們可采用一種數(shù)學(xué)算法基于某些預(yù)定參數(shù)如立柱的總數(shù)和兩個所述立柱之間的最小距離產(chǎn)生隨機模式。具體地說，我們可通過一種數(shù)學(xué)算法通過確定各種規(guī)格的組中立柱的總數(shù)以及兩個立柱之間的最小距離來獲得一種隨機模式。根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方式，本發(fā)明的微通道排列表面可任選用至少一種螯合劑部分或全部涂布。螯合劑通?？梢允悄軌蛞蕴囟ǚ绞脚c靶分子如生物分子相互作用從而以物理方式螯合靶分子的任何實體。本發(fā)明的螯合劑可包括核酸，如DNA、RNA、PNA或寡核苷酸，配體，蛋白質(zhì)，如受體、肽、酶、酶抑制劑、酶底物、免疫球蛋白(具體是抗體或其片段)、抗原、凝集素、修飾的蛋白質(zhì)、修飾的肽、生物胺和復(fù)雜的碳水化合物。也可采用合成分子，如藥物和設(shè)計成具有某些特異性結(jié)合活性的合成配體。"修飾的"蛋白質(zhì)或多肽指蛋白質(zhì)或肽分子中所含的一個或多個氨基酸由于加入了新的化學(xué)基團，或去除了原有的某些化學(xué)基團，或發(fā)生去除和加入二者的某種組合而改變的蛋白質(zhì)或肽。這種改變可包括天然和合成修飾。天然修飾可包括，但不限于，磷酸化、硫酸化、糖基化、加入核苷酸和脂化。合成性修飾可包括，但不限于，加入化學(xué)接頭以利于與水凝膠、微米結(jié)構(gòu)、納米結(jié)構(gòu)(如量子點)材料或其它合成材料結(jié)合。此外，修飾可包括去除現(xiàn)有的官能部分，如羥基、巰基或苯基，或去除或改變天然側(cè)鏈或多肽的酰胺骨架。復(fù)雜碳水化合物的例子包括，但不限于，天然或合成的直鏈或支鏈寡糖，修飾的多糖，如糖脂、肽聚糖、糖胺聚糖或乙?；?，及異質(zhì)性寡糖如N-乙?；咸前坊蛄蛩峄?。天然產(chǎn)生的復(fù)雜碳水化合物的例子是殼多糖、透明質(zhì)酸、硫酸角蛋白、硫酸軟骨素、肝素、纖維素和見于修飾的蛋白質(zhì)(如白蛋白和IgG)上的糖部分。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的微通道排列表面可被涂布，例如直接或間接連接于或偶聯(lián)于至少一種或兩種或多種螯合劑。一實施方式中，兩種或多種此類試劑的組合隨機分布在本發(fā)明的微通道的表面，如基面和/或立柱表面，且這種組合可作為兩種實體的混合物加入或者可連續(xù)加入。在另一個實施方式中，一種或多種螯合劑偶聯(lián)于用一種或多種封閉劑處理過的本發(fā)明的微通道表面。例如，本發(fā)明的微通道表面可用過量菲可(Ficoll)或任何其他合適的封閉劑處理以降低本發(fā)明微通道的背景信號。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了包含本發(fā)明的裝置以及任選的說明書的試劑盒。一實施方式中，本發(fā)明的試劑盒包括本發(fā)明的裝置，該裝置的微通道表面未涂有螯合劑，且該試劑盒任選包括用螯合劑涂布所述微通道表面的說明書。再在另一實施方式中，本發(fā)明的試劑盒包括本發(fā)明的裝置，其中所述裝置的微通道表面涂有螯合劑和任選的封閉劑，且所述試劑盒任選包括使用該裝置的說明書。根據(jù)本發(fā)明的再一個方面，提供了利用本發(fā)明裝置來捕獲或檢測靶分子，如耙生物分子的方法。這些靶生物分子可以是多種細胞類型中的任何一種，以及核酸、蛋白質(zhì)、肽、病毒、碳水化合物，等等。然而，不在任何方面受到限制，據(jù)信，本發(fā)明在細胞分離和檢測方面具有特殊效率和特殊優(yōu)勢。盡管術(shù)語"細胞"用于整篇申請中，應(yīng)理解，該術(shù)語包括可能攜帶螯合劑特異性表面配體的細胞片段和/或殘余物。一實施方式中，本發(fā)明的靶細胞是成瘤性細胞，如癌細胞或腫瘤細胞。在另一實施方式中，本發(fā)明的靶細胞是胎兒細胞，如來自攜帶胎兒對象的血液或?qū)m頸粘液樣品。再在另一實施方式中，所述靶細胞以極低比例存在于樣品中，例如，樣品中的靶細胞與總細胞群的比例小于約1:107、1:108或1:109。被本發(fā)明的裝置捕獲的靶分子可在原位或在從微通道表面釋放之后來檢測或分析。例如，可通過FISH或任何其他合適方法直接原位檢測細胞。也可對核苷酸和蛋白質(zhì)進行直接原位分析或在從本發(fā)明的微通道表面釋放之后再分析。根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施方式，提供的裝置包括基材ll，其中界定的流徑包括至少一個具有收集區(qū)17的微通道13，該流徑與樣品入口15和液體出口19相連。如本文以下所述，該流徑包括連續(xù)排列的幾個微通道，各通道有一個收集區(qū)?；蛘?，如該領(lǐng)域熟知的那樣，一個微通道可有一個以上的連續(xù)排列的收集區(qū)，也可能具有多個入口和多個出口。然而，該主體可以是構(gòu)建在芯片、園盤等上的集成微流體(床)裝置的一部分；此類裝置中，可以摻入用于細胞回收和/或分離樣品中的生物分子診斷所需的基本上整個MEMS(微電子機械系統(tǒng))或組件，作為一個緊湊的易操作單元。圖1是基材11的透視圖，基材中形成的流徑包括微通道13，通過作為入口的開口或孔15向其提供液體樣品，而開口19作為出口。收集區(qū)17的橫截面大于通向入口15的進入?yún)^(qū)18的橫截面。入口區(qū)有一對軸向排列的分流柱/支撐柱21，它們位于拓寬的收集區(qū)17上游的進入?yún)^(qū)18端。這些位于中央的分流柱使液體分流進入二流徑，作用是更均勻地分配液流將其輸送至收集區(qū)17的入口處。收集區(qū)包含眾多直立的立柱23，立柱橫向于液體流徑并不規(guī)則排列，通常在流動通道收集區(qū)部分的整個寬度上以隨機模式排列。眾立柱的排列方式可使流體僅在最小程度上以直線或以非直線流經(jīng)收集區(qū)，而破壞或抑制流線型液流，以確保沿此流徑流動的液體與立柱表面之間良好接觸。立柱與收集區(qū)17的平底面22整合在一起并從其垂直延伸，產(chǎn)生的表面垂直于液體水平流徑，引導(dǎo)液體流經(jīng)基材11中的流體通道。優(yōu)選液體延伸流過結(jié)合的封閉平襯板27的表面而粘附于其游離表面，如以下所詳述，封閉平板27與底面22平行，作用是封閉流體通道。可在封閉平板中鉆孔產(chǎn)生入口和出口孔24a和24b，但優(yōu)選在基材ll中形成出入孔。另一液體分流柱/支撐柱21a位于收集區(qū)的出口處。如該領(lǐng)域所熟知的那樣，可在基材中形成包括一對平行的、各含有收集區(qū)的微通道流徑。這種流徑可用于連續(xù)液體流動，或可用于平行流動操作?？捎帽?，如注射器泵等推動液流，或用真空泵通過大直徑入口孔24a抽吸貯存池的液體通過。優(yōu)選這種孔能容納約50-500微升的液體樣品。設(shè)計流體通道，使流經(jīng)該裝置的流速在合理范圍內(nèi)，如采用標(biāo)準(zhǔn)的Harvard灌注注射器泵注射母血于收集區(qū)產(chǎn)生約為0.01-100毫米/秒的流速，這基本上破壞了流經(jīng)該區(qū)的流線型液流而不會產(chǎn)生紊流，這是由于整個收集區(qū)中隨機排列著大小不同的立柱和立柱的相對空間位置排列所致。通過抽吸大小限定的入口孔，可實現(xiàn)平均流速宜約為0.3-10毫米/秒之間的較為平緩的非流線型液流而無死腔，更優(yōu)選平均流速維持在0.5-5毫米/秒之間。一般而言，基材ll可用實驗室可接受的任何合適材料，如硅、熔融二氧化硅、玻璃和聚合物制作。理想的是采用光學(xué)透明的材料，特別是當(dāng)需要用于診斷時可任選采用。在其最簡單實施方式中，將攜帶有制作的微通道的基材密封在板27中，如圖3所示，板27的平坦表面朝向緊靠基材11的表面。可用相同的材料制作此板，或是簡單的玻璃蓋板；然而，如下文所述，可包含一個中間流體調(diào)節(jié)板25?？刹捎玫暮线m塑料包括聚二甲基硅氧垸(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚對苯二甲酸乙二酯以及其它熟知的實驗室應(yīng)用可接受的聚合樹酯。這類圖案的基材可用常規(guī)方法，如選自常規(guī)模鑄和澆鑄技術(shù)的方法制作。可用聚合材料制作主鑄?；蜿庤T模結(jié)構(gòu)的常規(guī)基材，可用光蝕刻法用厚的負光阻材料產(chǎn)生所述陰鑄模結(jié)構(gòu)，這是該領(lǐng)域熟知的，見納米生物技術(shù)雜志(JNanobiotechnology)的文章中所述，該文內(nèi)容納入本文作參考。例如，可用商品化購得的標(biāo)準(zhǔn)等級的環(huán)氧樹酯(EPONSU-8)光刻膠和硬化劑(SU-82025)的混合物形成此結(jié)構(gòu)層，在二氧化硅晶片基材上以2000rpm旋轉(zhuǎn)形成(例如)40或50微米厚的光刻膠膜。此厚度確定了收集區(qū)流徑的高度。將此膜預(yù)先在精準(zhǔn)水平面的熱平板上6(TC烘烤3分鐘，然后95'C烘烤7分鐘以確保整體厚度均勻，室溫冷卻得到的樣品。在最終裝置中用卡爾蘇斯接觸式掩模對準(zhǔn)器(KarlSussContactMaskAligner)通過理想流徑圖案使該膜顯影。然后6CTC烘烤膜2分鐘，再95'C烘烤5分鐘，接著在購得的SU-8曝光室中曝光5分鐘，曝光時實施光攪動。這樣產(chǎn)生了光阻環(huán)氧樹酯圖案的陰模具，將其用于制作主模具，復(fù)制產(chǎn)生PDMA或其它合適的聚合物樹酯的圖案立柱基材。一個例子是，用重量比為10:1的PDMS預(yù)聚物和熟化劑混合物(Sylgard184試劑盒，道康寧公司(DowComing))制作PDMS組合物。抽真空該組合物去除混合時可能形成的氣泡，然后將其倒入放在所需深度槽中的環(huán)氧樹酯主模具上形成所需厚度的基材。主模具任選涂有一薄層(約50nm)合適的金屬(如金)以有利于固化后取出PDMS復(fù)制物?？捎?(TC90分鐘固化PDMS基材，然而先要使PDMS欠固化，這樣才可能有利于收集區(qū)(包括立柱表面)的后續(xù)功能化。13微通道13和圖案立柱的布局和尺寸取決于制作主模具時曝光步驟所用的掩蔽物。微通道13的深度受主模具SU-8層厚度的控制，取決于旋涂條件。圖2提供了微通道13的俯視圖，顯示收集區(qū)17中以優(yōu)選隨機方式排布的立柱23的放大圖。在另一實施方式中，可在平板中鉆孔或產(chǎn)生孔洞24而不破裂取出的PDMS模板基材表面，或在蓋板中鉆孔以提供入口和出口連接。前者，可與一張顯微鏡蓋玻片或其它合適的平板(如一薄片PDMS)配對，為基材提供無孔蓋板或底板。使此二組件經(jīng)歷等離子(共振)清洗2分鐘，將清洗后的二表面立即置于表面接觸，而不觸及其襯面，通過該領(lǐng)域熟知的表面反應(yīng)方法密封此二襯面，形成永久性密封，并封閉微流體裝置的流徑。如果想要在此類裝置的整合芯片上處理液流，可類似地制作具有可調(diào)節(jié)流動性能(如氣動閥門)的摻有槽穴的SU-8分離主模具。先將此主模具產(chǎn)生的流體調(diào)節(jié)板或調(diào)節(jié)層25薄片疊壓成微通道基材ll(見圖4和圖5)，進而疊壓成密封平板27。微流體裝置中采用的這種流體調(diào)節(jié)組件和其它MEMS見美國專利No.6，074，827和6，454，924，其內(nèi)容納入本文作參考。小心地排列對齊此流體調(diào)節(jié)板25與攜帶有微通道的基材11，然后8(TC退火過夜，制成組合結(jié)構(gòu)。然后用先前描述的相同技術(shù)以一平板或載玻片封閉流體調(diào)節(jié)板25中的槽穴。作為進一步選擇，可用同樣技術(shù)在第一塊板25上疊壓第二塊流體調(diào)節(jié)板，應(yīng)想到這樣可加入更復(fù)雜精致的控制和任選的處理。例如，可在密封于基材的流體調(diào)節(jié)層25中安置芯片流體調(diào)節(jié)機制，以在基材11中形成多通道系統(tǒng)。圖4和圖5說明了一種簡單的系統(tǒng)，其中通路24a和24b連接于入口和出口。氣動閥門29供應(yīng)的空氣可通過在基材11中鉆通的孔或適當(dāng)形成的孔30進入板25中。流體調(diào)節(jié)板25和基材ll可任選含有其它供應(yīng)通路，將液體輸送給入口15，也可包含該領(lǐng)域熟知的另一出口或釋放通路。如上所述，提供了二個連續(xù)連接的收集區(qū)，這種排列導(dǎo)致其自身可用于不同的操作方法和應(yīng)用。例如，當(dāng)要處理可能含有兩種不同亞群靶生物分子或感興趣細胞(樣品)時，可將一種類型的多價螯合試劑結(jié)合于一個收集區(qū)或室中的立柱，另一種類型的多價螯合試劑結(jié)合于下游收集室中的立柱。或者，當(dāng)靶細胞極其稀少時，可能需要將同樣的多價螯合試劑結(jié)合于二個收集室，以提高捕獲液體樣品中的細胞可能達到約100%?？梢愿鞣N方法衍生圖案立柱區(qū)的聚合物表面，使所需靶細胞或其它生物分子的特異性多價螯合試劑能結(jié)合于所有柱表面。例如，用等離子處理密封攜帶微通道的基材后，可向微通道中注入1-50%容量的氨基官能化硅烷(如10%道康寧(DowComing)Z-6020溶液)，或硫代官能化硅烷的乙醇溶液，充填開口15和19之間的區(qū)域17，然后使灌滿溶液的微通道13室溫孵育30分鐘?？蓪]有完全固化的聚合物(如PDMS)進行衍生，然后密封板中的微通道區(qū)。此時，如上所述，一種替代方法是先略微欠固化PDMS基材，在貼上密封板和用取代的硅烷或其它官能化試劑處理后再完全固化。例如，用Z-6020處理后可采用最后約50-9(TC加熱約90分鐘步驟來完成固化?；蛘叻胖檬覝?或2天也可完成固化。也可在密封微通道前作衍生處理，因為平坦表面的衍生處理不是真正需要的結(jié)局。用乙醇灌洗該流徑后，微通道已準(zhǔn)備好(接受)結(jié)合生物分子的多價螯合試劑?？蓪Ⅱ蟿┲苯踊蜷g接固定在立柱上，并且可預(yù)先處理和/或涂布立柱以利于結(jié)合。間接固定顯然是優(yōu)選的，考慮采用中介試劑或底物先連接于立柱，此外，可能需要采用一對偶聯(lián)劑來連接中間試劑。例如，可將鏈霉親和素或針對另一種抗體(Ab)的抗體與中介試劑連接，中介試劑再與生物素化Ab或針對其它Ab的抗體偶聯(lián)。細胞分離和粘附優(yōu)選利用抗體作為螯合劑，描述見美國專利5，646，404和4,675，286及現(xiàn)有技術(shù)。例如，美國專利No,4，528，267描述了非共價結(jié)合方法。IchiroChibata在固定化酶(IMMOBILIZEDENZYMES);Halstead新聞(HalsteadPress):NewYork(1978)中和在A.Cuatrecasas，生物化學(xué)雜志(JBioChem).245:3059，1970中也描述了抗體共價結(jié)合固相支持物的方法，此二文內(nèi)容納入本文作參考。優(yōu)選用間接法，如利用含有可結(jié)合Ab的長接頭的表面層或涂布層使抗體結(jié)合于立柱的固相表面。例如，可先用雙功能或多功能試劑(如蛋白質(zhì))涂布表面，然后用偶聯(lián)劑(如戊二醛)偶聯(lián)該試劑與抗體。也可將抗體水溶液加到已涂布了一層游離異硫氰酸酯或等價基團(如異硫氰酸聚酯)的表面而有效結(jié)合抗體，或可用溴化氰使抗體與羥基化材料偶聯(lián)。特別優(yōu)選采用具有游離異氰酸酯基團的親水性聚氨酯基水凝膠層(披露于待批專利申請并在下文的實施例中描述)，或采用具有適當(dāng)長度的親水性接頭，如PEG、聚甘氨酸之一。采用抗體時，可用該領(lǐng)域熟知的機制使之適當(dāng)?shù)?，?yōu)選通過中介試劑結(jié)合。例如，用2-氨基硫垸處理Ab使之硫醇化，將得到的硫醇化抗體與已用PEG-馬來酰亞胺處理的立柱偶聯(lián)；或者，可使抗體直接結(jié)合于合適的反應(yīng)活性親水異硫氰酸酯基團或硫氰酸酯基團。當(dāng)將抗體或其它螯合試劑安置在圖案的整個立柱收集區(qū)中后，微通道裝置即已準(zhǔn)備好使用。通過小心地將含有或懷疑含有耙細胞群的體液(如血液，尿液樣品)或某些其它經(jīng)預(yù)處理的液體從標(biāo)準(zhǔn)的注射器泵排放到通向微通道裝置入口15的進入通道24a中，或用真空泵等抽吸，使其沿流徑流過收集區(qū)17，直徑較大入口通道24a提供了樣品貯存孔，可保留測試所需體積的樣品。使用時，開口24a可含與注射器泵相連管道相配的附件(未顯示)。可操作此泵產(chǎn)生約0.5-10微升/分的液流通過該裝置。根據(jù)所要處理和/或分析的體液或其它含細胞液體，如該領(lǐng)域所知，可采用預(yù)處理步驟減少其體積和/或去除不需要的生物分子。為了大大提高細胞分離方法的整體效率，需要收集流出出口19的樣品，使之(反復(fù))流過微通道一次以上；當(dāng)所述細胞特別罕見而在樣品中數(shù)量非常少時這種反復(fù)處理可能特別有用。然而，由于該裝置實現(xiàn)的捕獲效率高，預(yù)計這種反復(fù)流動偶而才需要?；蛘?，如以上所述將二個收集室串聯(lián)使用。然而，如果要處理的體液樣品體積較大，可利用基材中的二個或多個平行微通道?？墒跪蟿?如抗體)結(jié)合于微通道收集室的底面、襯面、立柱和側(cè)壁。然而側(cè)壁破壞液流不如底面、襯面和立柱那樣有效。業(yè)已測定到含細胞或其它生物分子的液體流過甚至限定的腔時，細胞主要存在于中央液流區(qū)中，此處的剪切力最??；因此，與橫置立柱從而破壞流線型液流的直接區(qū)域表面的捕獲量相比，帶有螯合劑的側(cè)壁捕獲量相當(dāng)少。這些區(qū)域中，由于正確偶聯(lián)，螯合劑可確保其天然的三維構(gòu)象，而效果令人驚奇。使液體樣品完全流過該裝置后，靶細胞如果存在即被捕獲在收集區(qū)中，先用緩沖液清洗收集區(qū)，去除所有無關(guān)生物物質(zhì)，這些物質(zhì)是樣品的一部分但不能被抗體或其它螯合劑牢固捕獲。用有效的緩沖液清洗后預(yù)計只留下結(jié)合在微通道裝置收集區(qū)中的靶細胞，而除去了所有非特異性結(jié)合物質(zhì)。一旦完成緩沖液清洗，如果該處理方法的目的只是收集細胞，隨后可適當(dāng)?shù)蒯尫偶毎?。如以下所述，某些情況時，可能需要原位進行某些分析。例如，可對結(jié)合著的細胞進行計數(shù)，或可在收集室或下游區(qū)域中裂解細胞然后進行PCR?；蛘撸稍诩毎徊东@或附著時直接觀察或檢測，例如通過FISH或任何其他合適檢測方法。當(dāng)要釋放細胞時，可采用該領(lǐng)域已知的方法，如機械法(如高速液流)、化學(xué)法(如改變pH)，或利用酶切割劑等。例如，可加入試劑切除螯合劑，或切斷螯合劑與細胞之間的連接鍵將靶細胞從收集區(qū)釋放出來。例如，可采用胰蛋白酶或特異性聚焦酶來降解Ab和/或細胞表面抗原。結(jié)合Ab等然后有效除去捕獲配體的特定方法描述見美國專利No.5,378，624。例如，如果細胞已通過所用的針對罕見細胞的表面特異性抗體而結(jié)合，可用含胰蛋白酶或其它合適的蛋白酶(如蛋白酶K)處理而釋放?；蛘?，可釆用膠原酶從其他螯合劑釋放，或者可使用可特異性切割的接頭來附連螯合劑。切割時，將微通道出口與貯存器或其它收集器相連，收集含有釋放細胞的流出液作進一步分析。制作的微通道可有一個以上的排出通路和出口，及調(diào)節(jié)出口開放的閥門；從而可在初步實驗步驟中用一個出口通路來釋放廢物，用另一出口通路使靶細胞液流入收集容器。已發(fā)現(xiàn)可工程改造圖案立柱收集區(qū)17中的立柱23排列和形狀，通過其表面特性來優(yōu)化流體動力學(xué)和增進對靶細胞的捕獲。非常一般地說，在大多數(shù)情況下，橫置固定立柱23的水平橫截面優(yōu)選形狀應(yīng)避免尖角，因其可能促進各柱橫向表面產(chǎn)生非特異性結(jié)合。立柱23可為直線形外表面，宜為通用的圓形橫截面或6邊或更多邊的規(guī)則多角形。或者，可用的形狀是淚珠形，尖端朝向下游略彎曲，或卵圓形；然而若需要更具沖擊性可采用正方形。立柱的圖案在液流中所產(chǎn)生的流動模式應(yīng)能增進結(jié)合于柱表面、底面和襯面的螯合劑對靶細胞的捕獲。為實現(xiàn)此目的，已發(fā)現(xiàn)立柱應(yīng)有不同尺寸和隨機圖案排列。令人驚奇的是，橫截面大小不同，例如至少3或4種不同尺寸、直徑約70-130微米的圓形橫截面，收集區(qū)高約100微米，寬約2-4微米的立柱23隨機圖案，看來能特別有效地捕獲流動液體樣品中的細胞，立柱之間的最小間隔是50-70微米，優(yōu)選約60微米。特別優(yōu)選立柱區(qū)的橫截面積，即由垂直于底面的平行線所形成的側(cè)壁所圍17的面積約占收集區(qū)容積的15-25%。優(yōu)選立柱圖案占收集區(qū)容積的約20%，留下給液流的空容積約為80%。圖2所顯示立柱位置的具體隨機圖案看來能特別增進細胞被螯合劑捕獲的傾向，因這些區(qū)域中的流線型液流已受到有效破壞。立柱23基本上相互隔開，例如隔開至少約60微米，且優(yōu)選將不同大小的立柱分別置于上游和下游。在較大立柱下游的較小立柱可能產(chǎn)生渦流區(qū)，由于產(chǎn)生此流動模式，附近區(qū)域的表面可顯示出對于捕獲靶細胞特別有效。如圖2所示，所述流徑縱向直線延伸距離側(cè)壁約100微米以上，橫貫多個立柱。如上所述，將眾立柱與基材底面20整合在一起，優(yōu)選將它們的相對端或游離端固定于襯面，即固定于流體調(diào)節(jié)板25或密封平板27。如上所述，用專門的親水性水凝膠物質(zhì)或親水接頭，如分子量至少約1000道爾頓、優(yōu)選分子量約2000-100000道爾頓、更優(yōu)選3000-50000道爾頓的PEG、聚甘氨酸等薄層來涂布此表面有助于螯合劑(如抗體)在整個收集區(qū)的結(jié)合并且能使螯合劑更有效。特別優(yōu)選采用親水性水凝膠涂層，它們是一種含異硫氰酸酯功能基團聚合物的PEG、PPG，或它們的經(jīng)脲烷鍵聚合的共聚物，含有反應(yīng)活性異硫氰酸酯基團。這種涂層材料的詳細配方描述于待批2004年12月23曰提交的美國專利申請序列號11/021,304中，將其納入本文作為參考。圖8顯示的示意圖提供了微通道收集區(qū)，區(qū)中有多個直徑不同的立柱61，它們隨機排列破壞了通過該室的流線型液流，各個立柱61和平坦襯面都有外涂層63。還描述了抗體形式的螯合劑65結(jié)合于立柱上的親水水凝膠涂層；因此螯合劑保留了其天然三維構(gòu)象，不會因結(jié)合于主要成分為水的水凝膠而改變。圖9提供了采用圖8所示的性能優(yōu)選親水水凝膠涂層49時，可用的化學(xué)反應(yīng)的示意圖。顯示了結(jié)合于收集區(qū)17"所有表面的螯合劑(如抗體)的代表性序列，收集區(qū)表面有親水性水凝膠聚合物涂層49。圖9中的1表示用氨基硅垸等進行氨基衍生后的表面。此步之后采用脫脂奶(封閉)酪蛋白涂布的表面，見2。3表示用含有末端帶有甲苯二異氰酸酯的分子量約3400的PEG的預(yù)聚物涂布后的涂布的表面。這種預(yù)聚物可溶于與水混溶的有機溶劑，如NMP和CH3CN的混合物。水凝膠配方中優(yōu)選含有功能性三元醇或更高級醇，如PEG和PPG，可含有三功能異硫氰酸酯(基團)。制備含水98.5%的水溶液，將該溶液泵送通過微通道，由于與氨基衍生表面的封端異硫氰酸酯基團的反應(yīng)，收集區(qū)立柱表面和襯面被此親水水凝膠涂層涂布。最終結(jié)果在圖9中用3表示。4表示加入含表面氨基的抗體。如5所示，這種抗體可通過Ab的氨基與親水涂層所含異硫氰酸酯或硫氰酸酯基團共價結(jié)合，直接結(jié)合于立柱的親水性水凝膠涂層?；蛘撸扇鐖D9中6所示先硫醇化抗體，然后供給收集室這些硫醇化抗體水溶液，它們進而易于共價結(jié)合涂層聚合物的異硫氰酸酯基團，見圖7。如圖8和圖92所示，當(dāng)使液體樣品中的細胞流經(jīng)收集室時，由于流線型液流受到破壞，細胞接觸立柱和/或襯面，細胞表面上該抗體的特異性抗原與之結(jié)合，細胞被有效地捕獲。圖10提供了當(dāng)采用延長的PEG或PPG線性聚合物將螯合劑(特別是抗體)連接于收集區(qū)表面時，可采用的代表性化學(xué)試劑示意圖。選擇的線性聚合物長度應(yīng)使抗體在捕獲(細胞)時的水環(huán)境中能保持其天然三維構(gòu)象。圖10的1顯示了用氨基硅烷等處理而氨基衍生的表面。此步后也如上所述用脫脂奶(封閉)酪蛋白涂布的表面。洗滌后用分子量至少約2000、優(yōu)選約3000的線性PEG或PPG(其一端為NHS基團，另一端為馬來酰亞胺基團)處理所有表面。N-羥基琥珀酰亞胺酯基團易與表面上的氨基起反應(yīng)，產(chǎn)生至少厚約l微米的涂層。經(jīng)適當(dāng)培育后，用合適的緩沖液灌洗微通道，圖10的3表示留下的馬來酰亞氨-PEG涂布的表面。4表示滋養(yǎng)層細胞特異性抗體，其固有表面氨基。抗體宜用合適的試劑(如Traut試劑)硫醇化，與圖10中5所示位置反應(yīng)。將純化的巰基抗體緩沖溶液導(dǎo)入微通道作適當(dāng)培育，使巰基抗體與馬來酰亞胺-PEG涂布的立柱偶聯(lián)。用適當(dāng)緩沖液洗滌微通道，圖6所示即為獲得的偶聯(lián)排列。圖10提供的7的示意圖，顯示通過線性PEG偶聯(lián)劑連接于表面的抗體對滋養(yǎng)層細胞的捕獲。以下實施例說明了此型的原型微通道裝置可有效用于螯合(捕獲)宮頸粘膜提取物中的滋養(yǎng)層細胞。當(dāng)然，這些實施例應(yīng)理解只是為了闡述本發(fā)明的某些實施方式，不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制，本發(fā)明的范圍由本說明書所附的權(quán)利要求書所定義。實施例1如實施例1所述，用原型基材構(gòu)建用于分離生物分子的一種微流體裝置。使由PDMS形成的基材與玻璃平板粘合以密封流體通道。室溫下與10體積％的DowComingZ-6020溶液培育30分鐘以衍生整個收集區(qū)的內(nèi)表面。用乙醇洗滌后用脫脂奶室溫處理約1小時，產(chǎn)生酪蛋白薄涂層。用10%乙醇水溶液洗滌后，用基于平均MW為6000的異氰酸酯封端的PEG三醇的水凝膠進行處理。采用的配方中含有約3%聚合物。水凝膠預(yù)聚物由一份重量的該聚合物和6份重量的有機溶劑(即乙腈和DMF)制成，并將其與含BSA的100mM硼酸鈉(pH8.0)配制的1mg/ml抗體溶液混合。該專用制劑含有100mg溶于Acn/DMF的預(yù)聚物；含0.25mg/ml抗體混合物的硼酸緩沖液35(Hil;lmg/mlBSA硼酸緩沖液350W，含有重量比約2%的聚合物。在該測試中，需要從宮頸粘液樣品中分離滋養(yǎng)層細胞，Kawata等，JExpMed.160:653(1984)描述了采用細胞特異性Ab，如抗人滋養(yǎng)層細胞單克隆抗體(抗-Trop-l和抗Trop-2)檢測靶細胞來分離胎盤細胞群的方法。596號專利提出使用其他此類Ab用于相同目的，同時，美國專利5,503,981定義了三種可用于此目的的單克隆Ab。Trop-l和Trop-2的抗體特異于胎兒來源的滋養(yǎng)層細胞外表面攜帶的配體。首先對為這些抗體選擇的緩沖液進行改變以使其更加適應(yīng)計劃的改變和抗體的穩(wěn)定性，方法是在Amicon的Centricon-30TM基于膜的微米濃縮器上反復(fù)濃縮。然后將抗體溶于100pl含5mMEDTA(pH8.3)的0.2M硼酸鈉/0.15MNaCl中，室溫與5^140mMTraut試劑反應(yīng)1小時以進行硫醇化。過量的Traut試劑與10^1lOOmM甘氨酸反應(yīng)，然后在Centricon-30上純化硫醇化的抗體。用標(biāo)準(zhǔn)實驗室方法驗證硫醇化。在預(yù)處理過的微流體裝置上加入濃度約0.5mg/ml的總共含約5微克硫醇化的抗-Tr叩-l和2的水溶液，并將溶液在25'C培育2小時。該培育期之后用1%PBS/BSA沖洗流動通道以得到涂有抗體的表面，然后用它來試圖分離胎兒滋養(yǎng)層細胞。用HAM液(Vitrogen)將懷孕母親(妊娠8-12周)的宮頸粘液稀釋到10ml，37'C用DNA酶處理30分鐘。用100微米細胞濾器過濾后，1500rpm離心細胞30分鐘。用100微升HAM液重懸沉淀細胞，將微流體分離裝置連接于Harvard20裝置注射器泵(其中裝有約5(^1宮頸粘液提取物的細胞懸液)的輸出管使細胞懸液流過Trop-l和Trop-2抗體涂布的微通道。室溫推動注射器泵使液體樣品緩慢連續(xù)流過該微流體裝置，流速約10微升/分。此時，已結(jié)合于收集區(qū)中隨機分布圖案橫置立柱上的Trop-l和Trop-2抗體捕獲樣品中存在的滋養(yǎng)層細胞。用注射器泵輸送所有樣品后，用1。/。PBS/BSA緩沖液緩緩沖洗。將此緩沖液約10(^l送入該裝置約IO分鐘，有效除去該裝置流體通道中所有非特異結(jié)合的生物物質(zhì)。然后再沖洗二次，每次用約10(^1的1%PBS和1%BSA沖洗約10分鐘。此時，如光透明材料制備的裝置那樣，用光學(xué)顯微鏡檢查捕獲效果。用對所捕獲滋養(yǎng)層來源細胞的特有細胞角蛋白7和細胞角蛋白17(抗體)染色結(jié)合細胞。光學(xué)顯微鏡計數(shù)細胞，樣品中被圖案立柱收集區(qū)捕獲的細胞估計基本上97%為滋養(yǎng)層細胞，認(rèn)為此結(jié)果非常優(yōu)秀。重復(fù)整個捕獲和洗滌過程，在27'C使100pl0.25%的胰蛋白酶溶液緩慢流經(jīng)流體通道20分鐘以釋放被捕獲的滋養(yǎng)層細胞。該試劑消化Ab后將滋養(yǎng)層細胞釋放到水流中，隨水流流到出口而收集。用基于PCR和FISH的技術(shù)分析收集的細胞，顯示的確是所用抗體靶向的滋養(yǎng)層細胞。實施例2如實施例1所述，用原型基材構(gòu)建用于分離生物分子的一種微流體裝置。使由PDMS形成的基材與玻璃平板粘合以密封流體通道。室溫下與10體積％的DowComingZ-6020溶液培育30分鐘以衍生整個收集區(qū)的內(nèi)表面。用乙醇洗滌后用脫脂奶室溫處理約1小時，產(chǎn)生酪蛋白薄涂層。用10%乙醇水溶液洗滌后,用基于平均MW為6000的異氰酸酯封端的PEG三醇的水凝膠進行處理。采用的配方中含有約3%聚合物。水凝膠預(yù)聚物由一份重量的該聚合物和6份重量的有機溶劑(即乙腈和DMF)制成，并將其與含BSA的100mM硼酸鈉(pH8.0)配制的1mg/ml抗體溶液混合。所得專用制劑含有100mg溶于Acn/DMF的預(yù)聚物；含0.25mg/ml抗體混合物的硼酸緩沖液35(Hil;lmg/mlBSA硼酸緩沖液35(^1，含有重量比約2%的聚合物。仍舊使用特異于滋養(yǎng)層細胞外表面攜帶的配體的Trop-l和Tr叩-2抗體。在預(yù)處理過的微流體裝置上加入總共約5微升Trop-l和2水凝膠水溶液，然后將溶液在25'C培育約30分鐘。這段培育期之后沖洗流體通道，采用礦物油慢慢推入流體通道以取代水凝膠，并推出過剩的水凝膠。這導(dǎo)致流體通道填入油，其具有一水凝膠薄涂層，使得油與PDMS材料分離。3小時后水凝膠完全固化，用lxPBS/0.1。/。Tween溶液沖洗排出油。然后用lxPBS溶液充滿此裝置保存Ab。用HAM液(Vitrogen)將懷孕母親(妊娠8-12周)的宮頸粘液稀釋到10ml，37'C用DNA酶處理30分鐘。用100pm細胞濾器過濾后，1500RPM離心細胞30分鐘。用100微升HAM液重懸沉淀細胞，將微流體分離裝置連接于Harvard裝置注射器泵(其中裝有約50^1宮頸粘液提取物的細胞懸液)的輸出管使細胞懸液流過Trop-l和Trop-2抗體涂布的微通道。室溫推動注射器泵使液體樣品緩慢連續(xù)流過該微流體裝置，流速約10微升/分，期間，附連在收集區(qū)表面的Trop-l和Trop-2抗體捕獲樣品中存在的滋養(yǎng)層細胞。用注射器泵液輸送所有樣品后，用1%PBS和1%BSA緩沖液緩慢沖洗。將此緩沖液約100^1送入該裝置約10分鐘，有效除去該裝置流體通道中所有非特異結(jié)合的生物物質(zhì)。然后再沖洗二次，每次用約lO(Hil的1%PBS和1%BSA沖洗約10分鐘。用細胞角蛋白7和細胞角蛋白17(抗體)染色結(jié)合細胞后，再用光學(xué)顯微鏡檢査捕獲效果。用光學(xué)顯微鏡計數(shù)細胞，經(jīng)測定估計達到了對樣品中存在的滋養(yǎng)層細胞極佳捕獲。實施例3如實施例1所述，用原型基材構(gòu)建用于分離生物分子的另一種微流體裝置。使由PDMS形成的基材與玻璃平板粘合以密封流體通道。室溫下與10體積％的DowComingZ-6020溶液培育30分鐘以衍生整個收集區(qū)的內(nèi)表面。用乙醇洗滌后用脫脂奶室溫處理約1小時，產(chǎn)生酪蛋白薄涂層。用10%乙醇水溶液洗滌后，將用0.2MOPS/0.5MNaCl，pH7.0配的2.5mMNHS-聚甘氨酸(平均分子量約4500)溶液室溫用泵在通道中輕輕來回抽動以提供攪動，溫育2小時進行處理。用pH7.0的MOPS緩沖液500W洗滌微通道三次獲得馬來酰亞胺-聚甘氨酸涂布的通道。按實施例1所述處理滋養(yǎng)層細胞外表面配體特異性抗體Trop-l和Trop-2使之硫醇化。在預(yù)處理過的微流體裝置上加入濃度約0.25mg/ml的總共含約5微克硫醇化的抗-Trop-l和2的水溶液，并將溶液在25'C培育2小時。該培育期之后用1%PBS/BSA沖洗流動通道(三次)以得到涂有抗體的表面，然后用它來試圖分離胎兒滋養(yǎng)層細胞。用HAM液(Vitrogen)將懷孕母親(妊娠8-12周)的宮頸粘液稀釋到lOrnl，37"C用DNA酶處理30分鐘。用100微米細胞濾器過濾后，1500rpm離心細胞30分鐘。用100微升HAM液重懸沉淀細胞，將微流體分離裝置連接于Harvard裝置注射器泵(其中裝有約50^il宮頸粘液提取物的細胞懸液)的輸出管使細胞懸液流過Trop-l和Trop-2抗體涂布的微通道。室溫推動注射器泵使液體樣品緩慢連續(xù)流過該微流體裝置，流速約10微升/分，期間，附連在收集區(qū)表面的Trop-l和Trop-2抗體捕獲樣品中存在的滋養(yǎng)層細胞。用注射器泵液輸送所有樣品后，用1。/。PBS禾B1。/。BSA緩沖液緩慢沖洗。將此緩沖液約100pl送入該裝置約10分鐘，有效除去該裝置流體通道中所有非特異結(jié)合的生物物質(zhì)。然后再沖洗二次，每次用約100^1的1%PBS和1%BSA沖洗約10分鐘。用細胞角蛋白7和細胞角蛋白17(抗體)染色結(jié)合細胞后，再用光學(xué)顯微鏡檢査捕獲效果。用光學(xué)顯微鏡計數(shù)細胞，經(jīng)測定估計達到了對樣品中存在的滋養(yǎng)層細胞極佳捕獲。雖然已通過本發(fā)明人目前所知的構(gòu)成實施本發(fā)明最佳模式的某些優(yōu)選實施方式說明了本發(fā)明，但應(yīng)理解本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯然知道，可對其作出各種改變和修飾，這不脫離以下權(quán)利要求書所確定的本發(fā)明的范圍。例如，雖然已描述了用于制作微通道基材的某些優(yōu)選材料，但可采用本領(lǐng)域熟知的許多結(jié)構(gòu)材料，它們適合用作這種實驗室裝置。雖然總體上本文著重講了從母血樣品分離胎兒細胞和從宮頸粘膜提取物分離滋養(yǎng)層細胞，但應(yīng)理解本發(fā)明可用于分離各種各樣血細胞，如無核紅細胞、淋巴細胞、轉(zhuǎn)移癌細胞、干細胞等；也可分離液體樣品中的其它生物物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、糖、病毒等。然而，一旦收集到靶細胞，可原位裂解提供細胞DNA，收集后供下游分析或在收集室內(nèi)作PCR。美國專利申請2003/0153028描述了裂解結(jié)合的細胞獲得其釋放的核酸。如果樣品中含二種不同靶細胞亞群，可使不同的螯合劑結(jié)合于上下游收集室中的立柱上。另一種情況，優(yōu)選在上游收集室中收集一種細胞，釋放，再在下游收集室中篩選、分離細胞亞屬。從結(jié)構(gòu)觀點上說，可任選加入此裝置中的某些其它組件見圖6和圖7說明。圖6顯示，在類似于圖l的微通道中，在連接收集室入口通路和出口通路的流徑中加入了一組蠕動泵。圖解說明了微通道13'包括一個入口15，、一個收集室17，和一個出口19，，室中整合的泵組41含有加入的專門設(shè)計的三個膜閥門，這些閥門位于通向收集室的入口通路18'中。此圖提供的排列類似于圖4和圖5，將空氣或其它高壓氣體施加于通路30'，導(dǎo)致流體調(diào)節(jié)層或板的各閥門膜側(cè)面受壓，引起膜膨脹，擠壓與微通道相連的毗鄰區(qū)中的液體。通過編程控制單元自左到右依次操縱三個閥門，產(chǎn)生的波動將入口區(qū)18'中的液體泵送到右側(cè)流入收集裝置17'。如果需要，也可在收集室17'下游的出口區(qū)45中加入一組相似的蠕動型泵裝置43。作為另一可能的替代方法，圖7說明了一種微量混合排列。闡述的微混合器51包括通向供應(yīng)通道55的環(huán)形通路53，通道55可以是通向上述基材收集室的進入通道。一對入口通道57a和57b向環(huán)形通路53提供液體，通過氣動閥門59可控制液體流經(jīng)通道55、57a和57b。三個附加的氣動閥門61位于該通道本身中，構(gòu)成了上述類型的蠕動型泵63。這種排列提供了微量混合基材自身中兩種液體的有效方法，然后將其輸送至收集室等。例如，要將一個入口通道57a中的一些液體和入口通道57b中的一些緩沖液充填環(huán)形通路53，可通過順序操縱三個閥門61進行混合將液體泵送至環(huán)形通路沿環(huán)道流動而徹底混合，再將混合液通過輸送通道55釋放。實施例4:分離血樣中的胎兒細胞一MACS和CEE基本試驗方法從每位供體收集6x10ml血液從每10ml制備菲可細胞團(主要含有具核白細胞血液組分)在每個細胞團內(nèi)注入約50正G細胞運行3次MACS;3次CEE;即對相同供體運行三復(fù)份24MACS和CEE都用EpCAM抗體涂布，MACS通常使用該抗體來捕獲血液中的上皮細胞計算從MACS和CEE中回收的JEG細胞的數(shù)目計算MACS和CEE上背景DAPI陽性細胞的數(shù)目對6名不同供體重復(fù)該過程(每個裝置總共測試18個樣品)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>結(jié)論累積CEE捕獲比MACS高出約2倍(pO.OOOl)總的MACS非特異性捕獲比CEE高出約13倍(pO.OOOl)兩種方法中，菲可(Ficoll)的特異性和非特異性捕獲差異較大，這似乎主要是由于樣品處理而并非樣品差異本文具體披露的所有美國專利和申請被納入本文作為參考。在下面的權(quán)利要求書中強調(diào)了本發(fā)明的特殊特征。權(quán)利要求1.一種微流體裝置，所述裝置包括具有隨機化流徑的主體，其包括入口機構(gòu)、出口機構(gòu)及在所述入口和出口機構(gòu)之間延伸的微通道排列，其中所述微通道排列包括眾多與所述微通道的基面整合在一起并從基面伸出的橫置分離立柱，其中所述立柱的排列模式能夠提供所述隨機化流徑。2.如權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，所述立柱基本垂直于所述基面。3.如權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，所述立柱排列成通過數(shù)學(xué)算法產(chǎn)生的隨機圖案。4.如權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，所述立柱排列成通過數(shù)學(xué)算法由所述立柱的總數(shù)和兩個所述立柱之間的最小距離產(chǎn)生的隨機圖案。5.如權(quán)利要求l所述的裝置，其特征在于，所述立柱具有至少兩種不同的橫截面尺寸。6.如權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，所述立柱的平均橫截面尺寸與流過所述微通道的耙分子的大小相關(guān)。7.如權(quán)利要求l所述的裝置，其特征在于，所述立柱的橫截面約占所述微通道所述基面橫截面的20-75%。8.如權(quán)利要求l所述的裝置，其特征在于，所述立柱的總體積約占所述微通道總體積的15-25%。9.如權(quán)利要求l所述的裝置，其特征在于，兩個所述立柱之間的最小距離與所述立柱的最小橫截面尺寸相關(guān)。10.如權(quán)利要求l所述的裝置，其特征在于，所述微通道的表面涂有親水層。11.如權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，所述微通道表面涂有至少約1微米厚的包含PEG、PPG或其共聚物的異硫氰酸酯功能性聚合物的親水層。12.如權(quán)利要求l所述的裝置，其特征在于，所述微通道的表面涂有螯合劑。13.如權(quán)利要求l所述的裝置，其特征在于，所述微通道表面涂有選自下組的螯合劑抗體、抗原、受體、配體、寡核苷酸和肽。14.如權(quán)利要求l所述的裝置，其特征在于，所述螯合劑通過接頭偶聯(lián)于所述微通道的表面。15.如權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，所述螯合劑通過親水性接頭或水凝膠層偶聯(lián)于所述微通道的所述表面。16.如權(quán)利要求l所述的裝置，其特征在于，所述入口機構(gòu)包括能夠容納液體樣品的孔。17.如權(quán)利要求l所述的裝置，其特征在于，所述微通道用與附于所述立柱游離端的平板密封。18.如權(quán)利要求l所述的裝置，其特征在于，所述微通道包含光學(xué)透明基面并且可通過光學(xué)檢測裝置觀察。19.如權(quán)利要求l所述的裝置，其特征在于，所述微通道用與附于所述立柱游離端的平板密封，且其中所述微通道的所述基面和所述平板是光學(xué)透明的。20.—種試劑盒，其包含如權(quán)利要求l所述的裝置以及用螯合劑涂布所述微通道的表面的說明書。21.—種試劑盒，其包含如權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述微通道的表面涂有螯合劑。22.—種捕獲樣品中靶分子的方法，所述方法包括使含有所述樣品的流體流過權(quán)利要求1所述裝置的所述微通道，其中所述微通道的表面涂有能夠結(jié)合所述靶分子的螯合劑。23.—種檢測樣品中的靶分子的方法，所述方法包括使含有所述樣品的流體流過權(quán)利要求1所述裝置的所述微通道，其中所述微通道表面涂有能夠結(jié)合所述耙分子的螯合劑，和檢測所述耙分子。24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述靶分子是條件相關(guān)細胞。25.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述靶分子是癌細胞或腫瘤細胞。26.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述靶分子是胎兒細胞。27.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述靶分子是靶細胞，且所述靶細胞數(shù)目與樣品中總細胞數(shù)的比例至少為1:107、1:108或1:109。28.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，含有所述樣品的流體以每秒約0.5-5mm的速度流過所述微通道。全文摘要一種用于提取或分離體液或其它液體樣品中的細胞的微流體裝置，其所采用的流徑中的直線液流被橫置立柱圖案結(jié)構(gòu)打亂。流徑中的眾立柱占收集區(qū)的整個寬度，并在其上下表面之間延伸；立柱有具有弓形截面的直線表面，隨機排列以破壞流線型液流。螯合劑，如抗體，通過親水性涂層(優(yōu)選含異硫氰酸酯基團的水凝膠或者PEG或一定長度的聚甘氨酸)結(jié)合于收集區(qū)的整個表面，作為層流中斷的結(jié)果，可高效地捕獲細胞或其它靶生物分子并水平排出液體樣品中的其余物質(zhì)。文檔編號C12M3/00GK101535466SQ200780032530公開日2009年9月16日申請日期2007年7月18日優(yōu)先權(quán)日2006年7月19日發(fā)明者P·欽伯格,R·S·巴特,唐忠良申請人:生物概念股份有限公司