專利名稱：馬鈴薯x病毒組衍生的復(fù)制子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用馬鈴薯X病毒組衍生的復(fù)制子在植物、在植物組織或
在植物細胞中高產(chǎn)量表達目的基因的過程，以及涉及包含或編碼可用于表
達目的基因的馬鈴薯X病毒組RNA復(fù)制子的核酸。本發(fā)明還涉及包含兩 個或多個載體的部分的試劑盒，所述載體一起編碼本發(fā)明的RNA復(fù)制子。
背景技術(shù)：
可以使用病毒載體在植物中高產(chǎn)量表達異源蛋白質(zhì)。主要開發(fā)病毒栽 體系統(tǒng)用于瞬時表達，然后感染(Donson等人，1991，尸wc A^/爿c""5W/7 S A ^:7204-7208; Chapman， Kavanagh & Baulcombe， 1992，尸/a"f /" ^:549-557 )或轉(zhuǎn)染(Marillonnet等人，2005， B/otec/mo/" ^!:718-723; Santi 等人 ， 2006，尸wc淑/加rf S A
巡:861-866; WO2005/049839 )植物宿主。最佳建立和商業(yè)可行的系統(tǒng)是 基于正義的單鏈RNA病毒，優(yōu)選是基于煙草花葉病毒(TMV)-衍生的病 毒(Kumagai等人，1994，A^/. ^c"rf. Sc/. C/SA ■， 427-430; Mallory 等人，2002, A^m" B^&c/i冊/. ^ 622-625; US5316931; US5589367; US5866785; US5977438; WO02088369; WO02097080; WO0229068; US5491076)。
另 一組衍生自馬鈴薯X病毒組PVX (馬鈴薯X病毒)的基于RNA病 毒的載體也提供了合理的重組蛋白質(zhì)的高產(chǎn)量，盡管產(chǎn)量顯著低于TMV 衍生的載體(Chapman, Kavanagh & Baulcombe， 1992，尸/fl",/" ^:549-557; Baulcombe, Chapman & Santa Cruz, 1995，尸/做〃"？1045-1053; Zhou等 人，2006, v4p/7/. ^f/oY76/( /. BZofecArto/" 4月13曰，《卩席'J前電子^^布；Zelada等人，2006， r"6ccw/仍/s， ^:263-267 )。顯然，此類系統(tǒng)需要進一步改良以 增加目的重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。
在系統(tǒng)病毒載體的最初產(chǎn)生中，為了產(chǎn)生病毒復(fù)制子的系統(tǒng)(systemic) 移動所需要的病毒外殼蛋白浪費了大量的植物資源。對于TMV-衍生的載 體而言，這一問題通過移除外殼蛋白基因并且通過使用農(nóng)桿菌浸潤用于復(fù) 制子的有效系統(tǒng)遞送來解決，從而顯著地增強了目的重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)量
(WO2005/049839; Marillonnet 等人，(2005), 7V"t B/o&dmo/" g:718-723)。但是，與TMV-衍生的復(fù)制子不同，馬鈴薯X病毒組衍生 的復(fù)制子需要病毒外殼蛋白不僅是用于系統(tǒng)移動，還用于短距離(細胞間) 移動。因此，不能夠在不嚴(yán)重損失蛋白質(zhì)表達效率的情況下移除馬鈴薯X 病毒組衍生的病毒栽體的外殼蛋白基因。此外，反式改造提供病毒外殼蛋 白的植物宿主由于基因沉默而很少成為良好的解決方案。同樣，表達外殼 蛋白的轉(zhuǎn)基因植物可以表現(xiàn)出外殼蛋白-介導(dǎo)的對由植物病毒引起的攻擊 的抗性(Beachy， RN.， 1999，7>w^.兄5W'.必肌o/. Sc/" ^:659-664; Wisniewski等人，1990, /V"w《Ce〃， 2:559-567 )。被稱為異源 CP-介導(dǎo)的抗性的另一類似的現(xiàn)象也造成問題，例如當(dāng)表達PVX CP的轉(zhuǎn) 基因植物減少TMV RNA的細胞間擴散時(Bazzini等人，2006，丄 F,VW.， ^:1005-1012)。此外，在轉(zhuǎn)基因煙草植物中的PVX外殼蛋白的表 達減少了移動缺陷的PVX，但是破壞了細胞間移動以及病毒復(fù)制的效率
(Spillane等人，1997， K/Vy^^v， ^:76-84 )。當(dāng)這可以在當(dāng)表達異源-寡聚 蛋白質(zhì)需要在同一植物細胞中使用兩種病毒載體(例如基于TMV和PVX 的載體)時將成為問題(例如，為了共表達單克隆抗體的重鏈和輕鏈)
(WO2006/079546; Giritch等人，2006，7Vfl"5W. (7^4，刊印中)。
發(fā)明簡述
因此，本發(fā)明的目標(biāo)是提供用于在植物中、在植物組織中或在植物細 胞中目的蛋白質(zhì)高產(chǎn)量表達的基于馬鈴薯X病毒組的病毒載體。病毒載體應(yīng)當(dāng)能夠細胞間移動，并且應(yīng)當(dāng)盡可能少的浪費植物宿主的資源來產(chǎn)生病 毒外殼蛋白。
本目標(biāo)通過下述核酸或其互補序列來解決，所述核酸包含或編碼RNA 復(fù)制子，所述復(fù)制子以這樣的順序包含下述區(qū)段
(i) 編碼RNA依賴性RNA聚合酶或其功能保守的衍生物的核酸序列；
(ii) 編碼所述復(fù)制子在植物或在植物組織中進行細胞間移動所需的一 種或多種蛋白質(zhì)的核^列；
(iii) 在植物或在植物組織中可從所述復(fù)制子表達的異源核酸序列。 本目標(biāo)還通過下述核酸或其互補序列來解決，所述核酸包含或編碼
RNA復(fù)制子，所述復(fù)制子以這樣的順序包含下述區(qū)段
(i) 編碼RNA依賴性RNA聚合酶或其功能保守的衍生物的核酸序列；
(ii) 包含馬鈴薯X病毒組三基因塊或其功能保守的變體以及馬鈴薯X 病毒組的外殼蛋白或其功能保守的變體的核酸序列；
(iii) 在植物或在植物組織中可從所述復(fù)制子表達的異源核酸序列。 本目標(biāo)還通過下述核酸或其互補序列來解決，所述核酸包含或編碼
RNA復(fù)制子，所述復(fù)制子以這樣的順序包含下述區(qū)段
(i) 編碼RNA依賴性RNA聚合酶或其功能保守的衍生物的核酸序列；
(ii) 包含馬鈴薯X病毒組三基因塊或其功能保守的變體以及煙草花葉 病毒組移動蛋白的核,列；以及
(m) 在植物或在植物組織中可從所述復(fù)制子表達的異源核酸序列。
所述RNA復(fù)制子可以是在植物或在植物組織中用于復(fù)制和表達所述 異源核酸序列的復(fù)制子。所述RNA復(fù)制子可以基于馬鈴薯X病毒組建立 并且使用馬鈴薯X病毒組的復(fù)制和表達系統(tǒng)用于表達異源核酸序列。
本發(fā)明的核酸可以是經(jīng)分離的，或經(jīng)分離和純化的核酸。本發(fā)明的核 酸通常用作為用于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化植物或植物細胞的載體。
本發(fā)明還提供了包含至少兩個載體(前-載體)的部分的試劑盒，所述 載體能夠在植物細胞中通過位點定向重組裝配本發(fā)明的所述核酸。
本發(fā)明還提供了在植物或植物組織中表達目的異源核酸序列的方法，包括對植物或植物組織提供本發(fā)明的所述核酸。本發(fā)明還提供了在植物或 植物組織中表達目的異源核酸序列的方法，包括向植物或植物組織提供兩 個或多個栽體，所述載體能夠在植物細胞中通過位點定向重組裝配本發(fā)明 的所述核酸。
發(fā)明人已經(jīng)令人驚訝地鑒定了一種方式，來增加在植物或植物組織中
從馬鈴薯X病毒組栽體表達的目的蛋白質(zhì)的表達產(chǎn)量，這是通過載體設(shè)計 來實現(xiàn)的，在所述設(shè)計中，在條目(ii)中定義的序列位于條目(i)的RNA 依賴性RNA聚合酶編碼序列(RdRp或RdRP )之后(5，到3'方向的下游)， 并且在條目(iii)的所述異源核酸序列之前。在馬鈴薯X病毒組載體的特 定情形中，該載體設(shè)計使得RNA復(fù)制子能夠細胞間移動，并且同時，與 常規(guī)馬鈴薯X病毒組載體相比，達到異源核酸更高的表達水平，在所述常 規(guī)馬鈴薯X病毒組載體中，異源核酸位于馬鈴薯X病毒組外殼蛋白基因的 上游。發(fā)明人鑒定的效果可能是由于下述事實條目(ii)序列的位置導(dǎo)致 這些蛋白質(zhì)的更低的表達水平，并且導(dǎo)致用于表達這些蛋白質(zhì)的植物資源 的更少的浪費，使得3，目的蛋白質(zhì)的表達水平更高。重要地，本發(fā)明中馬 鈴薯X病毒組外殼蛋白的受限表達水平足以支持用于目的異源序列高產(chǎn)量 表達的有效的細胞間移動。
馬鈴薯X病毒組是具有正義單鏈基因組的植物RNA病毒。因此，本 發(fā)明的所述核酸可以是作為或者包含所述RNA復(fù)制子的RNA，或者可以 是編碼所述RNA復(fù)制子的DNA。在本文中，術(shù)語"馬鈴薯X病毒組載體" 或者"馬鈴薯X病毒組復(fù)制子，，意思是該載體或復(fù)制子使用馬鈴薯X病毒 組的復(fù)制和蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)。所述核酸可以基于天然馬鈴薯X病毒組建立， 例如通過使用來自馬鈴薯X病毒組的遺傳成分。本發(fā)明的所述核酸可以通 過將所述異源核酸序列插入編碼馬鈴薯X病毒組的核酸構(gòu)建體中來獲得， 其中所述目的異源核^列被插入到編碼所述馬鈴薯X病毒組的外殼蛋白 的序列的下游。但是，可以對天然馬鈴薯X病毒組的多種遺傳成分進行多 種修飾，例如對RdRP基因，三基因塊、外殼蛋白基因，或?qū)︸R鈴薯X病 毒組的5，或3，未翻譯區(qū)，下文描述了實例。本發(fā)明的所述RNA復(fù)制子以從5，端到3，端的順序包含本發(fā)明的所述區(qū)段(i)至(iii)。其它遺傳元件通常將存在于所述復(fù)制子上，用于復(fù)制和表達。對于作為RNA復(fù)制子，即對于在植物細胞中自主復(fù)制，所述RNA復(fù)制子編碼RdRp或其功能保守的衍生物。所述RNA復(fù)制子還在所述RNA復(fù)制子的5，-或3，-未翻譯區(qū)中具有馬鈴薯X病毒組5，-或3'-未翻譯區(qū)和啟動子序列，用于結(jié)合所述RdRp和用于復(fù)制所述RNA復(fù)制子。所述RNA復(fù)制子還可以在條目(ii)和(iii)的區(qū)段中具有次基因組啟動子，用于產(chǎn)生次基因組RNA，所述次基因組RNA用于表達由條目(ii)和(iii)的區(qū)段所編碼的蛋白質(zhì)。如果所述核酸是DNA，其通常將具有轉(zhuǎn)錄啟動子，用于允許在體外或在植物中通過所述RNA復(fù)制子的轉(zhuǎn)錄來產(chǎn)生。在植物中
植物生物技術(shù)的35S啟動子。
所述區(qū)段(i )可以編碼馬鈴薯X病毒組(例如馬鈴薯X病毒)的RdRp，或所述馬鈴薯X病毒組RdRp的功能保守的變體。在所述RNA復(fù)制子中使用的RdRp可以被認為是馬鈴薯X病毒組RdRp的功能保守的變體的條件是，如果條目(i)的所述序列編碼與SEQIDNO: 4所編碼的蛋白質(zhì)具有至少36%的序列同一性的蛋白質(zhì)。在另一個實施方案中，與SEQ ID NO:4所編碼的蛋白質(zhì)的所述序列同一性為至少45%,在其它實施方案中，至少55%，在另一個實施方案中，至少65%，以及在甚至其它實施方案中，至少75%。這些序列的同一性可以在SEQ ID NO: 4的整條序列上存在?？蛇x地，這些序列同一性可以在至少300個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)序列區(qū)段中，在至少500個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)序列區(qū)段中，在至少卯0個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)序列區(qū)段中，或在至少1400個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)序列區(qū)段中存在。
在本文中，使用標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置，使用BLASTX 2.2.14確定M酸序列的同一性。這些標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置允許例如在比對中有序列空位。
在一個實例中，SEQ ID NO: 4所編碼的蛋白質(zhì)和馬鈴薯X病毒組RdRp的功能保守的變體之間的所述序列同一性在至少900個氛基酸殘基的蛋白質(zhì)序列區(qū)段中是45%。在另一個實例中，SEQ ID NO: 4所編碼的蛋白質(zhì)和馬鈴薯X病毒組RdRp的功能保守的變體之間的所述序列同一性在至少900個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)序列區(qū)段中是55%。
可選地，在所述RNA復(fù)制子中使用的RdRp可以被認為是馬鈴薯X病毒組RdRp的功能保守的變體的條件是，如果條目(i)的所述序列編碼與SEQ ID NO: 4所編碼的蛋白質(zhì)具有至少50%的序列同源性的蛋白質(zhì)。在另一個實施方案中，與SEQ ID NO: 4所編碼的蛋白質(zhì)的所迷序列同源性為至少60%，在另一個實施方案中為至少70%,并且在另一個實施方案中為至少80%。這些序列同源性可以是在SEQ ID NO: 4的整條序列上存在。可選地，這些序列同源性可以在至少300個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)序列區(qū)段中，在至少500個M酸殘基的蛋白質(zhì)序列區(qū)段中，在至少卯0個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)序列區(qū)段中，或在至少1400個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)序列區(qū)段中存在?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)設(shè)置，使用BLASTX 2.2.14確定M酸序列的同源性。這些標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置允許例如在比對中有序列空位。
在一個實例中，SEQ ID NO: 4所編碼的蛋白質(zhì)和馬鈴薯X病毒組RdRp的功能保守的變體之間的所述序列同源性在至少900個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)序列區(qū)段中是70%。在另一個實例中，SEQ ID NO: 4所編碼的蛋白質(zhì)和馬鈴薯X病毒組RdRp的功能保守的變體之間的所述序列同 一性在至少卯0個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)序列區(qū)段中是80%。
可選的，用在所述RNA復(fù)制子中的RdRp可以被認為是馬鈴薯X病毒組RdRp的功能保守的變體的條件是，如果條目(i)的所述序列與SEQII) NO: 4具有至少55%、至少60%、或至少70%的序列同一性。所述序列同一性可以存在于SEQ ID NO: 4中，或者在SEQ ID NO: 4的至少900個核苷酸的序列區(qū)段中，在SEQ ID NO: 4的至少1500個核苷酸的序列區(qū)段中、在SEQ ID NO: 4的至少2000個核苷酸的序列區(qū)段中，或在SEQ IDNO: 4的至少4200個核苷酸的序列區(qū)段中。可以使用標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置，使用BLASTX 2.2.14確定核苷酸序列的同一性。這些標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置允許例如在比對中有序列空位。所述RNA復(fù)制子包含條目(ii)的所述核酸序列，用于允許所述RNA復(fù)制子在植物或在植物組織中進行細胞間移動。所述RNA復(fù)制子的細胞間移動對于在所述植物或所述組織的盡可能多的細胞中實現(xiàn)條目(iii)的序列表達是重要的。條目(ii)的所述核酸序列可以包含馬鈴薯X病毒組三基因塊(在本文中縮寫為"TGB，，)，或者其功能保守的變體(對于TGB的綜述見/. Wra/. (2003) 84， 1351-1366 )。馬鈴薯X病毒組三基因塊編碼向馬鈴薯X病毒組提供細胞間移動能力所需要的三個蛋白質(zhì)。因此，如果所述TGB的變體可以(任選地與其它所需成分)提供具有在植物或植物組織中進行細胞間移動能力的本發(fā)明的RNA復(fù)制子，則該變體被認為是TGB的功能保守的變體。
馬鈴薯X病毒組TGB的實例是馬鈴薯X病毒的TGB(在本文中被稱作"PVXTGB")。 PVXTGB由編碼三個蛋白質(zhì)(根據(jù)其適當(dāng)?shù)姆肿恿勘环Q為25K、 12K和8K)的三個基因組成。編碼PVX 25K、 PVX12K蛋白質(zhì)和PVX 8K蛋白質(zhì)的基因序列分別在SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 11和SEQIDNO: 13中給出。PVX25K蛋白質(zhì)、PVX 12 K蛋白質(zhì)和PVX 8K蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)序列分別在SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO: 12和SEQ IDNO: 14中給出。
在一個實施方案中，所述馬鈴薯X病毒組TGB的功能保守的變體是三基因的區(qū)塊(block),所述區(qū)塊編碼三個蛋白質(zhì)，其中之一與PVX25K蛋白質(zhì)具有至少33。/。的序列同一性，一個與PVX 12K蛋白質(zhì)具有至少36。/。的序列同一性， 一個與PVX8K蛋白質(zhì)具有至少30%的序列同一性。在另一個實施方案中，所述馬鈴薯X病毒組TGB的功能保守的變體編碼三個蛋白質(zhì)，其中之一與PVX 25K蛋白質(zhì)具有至少40%的序列同一性， 一個與PVX 12K蛋白質(zhì)具有至少40%的序列同一性， 一個與PVX 8K蛋白質(zhì)具有至少40。/。的序列同一性。在另一個實施方案中，所述馬鈴薯X病毒組TGB的功能保守的變體編碼三個蛋白質(zhì)，其中之一與PVX 25K蛋白質(zhì)具有至少50。/。的序列同一性， 一個與PVX 12K蛋白質(zhì)具有至少50%的序列同一性， 一個與PVX8K蛋白質(zhì)具有至少50%的序列同一性。在另一個實施方案中，相應(yīng)的序列同一性值對于每個蛋白質(zhì)而言是60%。在另一個實施方案中，相應(yīng)的序列同 一性值對于每個蛋白質(zhì)而言是70%。
在另一個實施方案中，馬鈴薯X病毒組TGB的所述功能保守的變體編碼如下的三個蛋白質(zhì)第一個蛋白質(zhì)包含至少200個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)序列區(qū)段，所述區(qū)段與PVX 25K蛋白質(zhì)的序列區(qū)段具有至少40%的序列同一性；第二個蛋白質(zhì)包含至少100個M酸殘基的蛋白質(zhì)序列區(qū)段，所述序列區(qū)段與PVX 12K蛋白質(zhì)的序列區(qū)段具有至少40%的序列同一性；以及第三個蛋白質(zhì)包含至少55個M酸殘基的蛋白質(zhì)序列區(qū)段，所述序列區(qū)段與PVX8K蛋白質(zhì)的序列區(qū)段具有至少40%的序列同一性。在另一個實施方案中，對于每個蛋白質(zhì)而言相應(yīng)的序列同一性值為50%。在另一個實施方案中，對于所述第一、第二和第三蛋白質(zhì)的每一個而言相應(yīng)的序列同一性值為60%。
條目(ii)的所述核酸序列可以包含另一個序列，其編碼所述RNA復(fù)制子的細胞間移動所需的蛋白質(zhì)(例如馬鈴薯X病毒組外殼蛋白或其功能保守的變體)。所述馬鈴薯X病毒組外殼蛋白的變體被認為是所述外殼蛋白的功能保守的變體的條件是，如果它能夠與其它所需成分(例如TGB)
在一個實施方案中，當(dāng)所述RNA復(fù)制子包含馬鈴薯X病毒組外殼蛋白(或其功能保守的變體)時，所述RNA復(fù)制子不具有病毒顆粒裝配的起點，以避免所述RNA復(fù)制子以經(jīng)裝配的植物病毒的形式從植物向植物擴散。如果所述RNA復(fù)制子包含馬鈴薯X病毒組外殼蛋白基因(或其功能保守的變體)以及TGB (或其功能保守的變體)，則可能所述TGB位于所述外殼蛋白基因的上游，或者反過來。因此，所述馬鈴薯X病毒組外殼蛋白基因(或其功能保守的變體)和所述TGB (或其功能保守的變體)可以以任何順序在條目(ii)的所述核酸序列中存在。
PVX外殼蛋白的編碼序列作為SEQ ID NO: 7給出，而PVX外殼蛋白的M,列作為SEQ ID NO: 8給出。蛋白質(zhì)可以被認為是馬鈴薯X病毒組外殼蛋白的功能保守的變體的條件是，如果其包含至少200、可選至少220、另外可選237個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)序列區(qū)段，所述序列區(qū)段與 SEQ ID NO: 8的序列區(qū)段具有至少35%的序列同一性。在另一個實施方 案中，蛋白質(zhì)可以被認為是馬鈴薯X病毒組外殼蛋白的功能保守的變體的 條件是，如果其包含至少200、可選至少220、另外可選237個氨基酸殘基 的蛋白質(zhì)序列區(qū)段，所述序列區(qū)段與SEQ ID NO: 8的序列區(qū)段具有至少 45%的序列同一性。在可選的實施方案中，相應(yīng)的序列同一性值為55%或 65%。
可選地，條目(ii)的所述核酸序列可以包含(任選地代替編碼所述馬 鈴薯X病毒組外殼蛋白的所述序列)編碼植物病毒移動蛋白(MP)的序 列。適當(dāng)?shù)腗P的實例是煙草花葉病毒組MP例如煙草花葉病毒的MP或 者蕪青脈明病毒(turnip vein clearing virus)的MP。所述編碼植物病毒 移動蛋白的序列和所述馬鈴薯X病毒組TGB (或其功能保守的變體)可以 以任何順序存在于條目(ii)的所述核酸序列中。
條目(iii)的所述異源核酸序列通常包含在植物或植物組織中待表達 的目的蛋白質(zhì)的編碼序列。條目(iii)的此類編碼序列在本文中也是指目 的基因。條目(iii)的所述序列對于所述RNA復(fù)制子所基于的所述植物病 毒而言是異源的。在許多情形中，所述序列對于其所待在其中表達的所述 植物或所述植物組織而言也是異源的。為了可在植物或植物組織中從所述 RNA復(fù)制子表達，條目(iii)的所述序列通常包含次基因組啟動子和表達 所需的其它序列，例如核糖體結(jié)合位點和/或內(nèi)部核糖體進入位點(IRES )。 在優(yōu)選的實施方案中，條目(iii)的所述異源核酸序列具有編碼一種目的 蛋白質(zhì)的一種目的基因。
本發(fā)明的所述核酸可以包含馬鈴薯X病毒組5，-未翻譯區(qū)(5'NTR )和 馬鈴薯X病毒組3，-未翻譯區(qū)(3，NTR).
本發(fā)明的方法可以用于在植物或植物組織中產(chǎn)生一種目的蛋白質(zhì)或多 于一種目的蛋白質(zhì)。所述方法包括向植物、植物組織或植物細胞提供本發(fā) 明的所述核酸。本發(fā)明的方法優(yōu)選在植物或植物組織中進行。在一個實施 方案中，所述方法是瞬時表達方法，其中不需要將本發(fā)明的核酸摻入到植物宿主的染色體DNA中。
如果本發(fā)明的所述核酸是RNA,則其可以用于感染植物或植物組織， 優(yōu)選與感染的植物組織(例如葉)的機械損傷組合。在另一實施方案中， 本發(fā)明的所述核酸是DNA，并且可以通過例如粒子轟擊或通過農(nóng)桿菌介導(dǎo) 的轉(zhuǎn)化來將所述DNA引入植物或植物組織的細胞中。如果要向多個植物 中提供本發(fā)明的所述核酸，即，用于大規(guī)模蛋白質(zhì)產(chǎn)生方法，則選擇農(nóng)桿 菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法。
可以使用前-栽體方法(WO02088369; Marillonnet等人，2004, vV"". ^caf/. Sc/. 1M:6852-6857 )，通過向植物或植物組織提供本發(fā)明
的所述試劑盒或部分，來進行本發(fā)明的方法。在所述植物的細胞中，然后 通過前-載體之間位點特異的重組來產(chǎn)生本發(fā)明的核酸。在一個實施方案 中，向植物或植物組織提供包含或編碼條目(i)和(ii)的區(qū)段的第一載 體(前-載體)和包含或編碼條目(iii)的區(qū)段的第二載體(前-載體)，其 中所述第一和所述第二前栽體各自具有重組位點，所述重組位點用于允許 通過在所述第一和所述第二前-載體之間的位點-特異性重組來實現(xiàn)的本發(fā) 明的核酸的裝配?？梢酝ㄟ^向植物或植物組織提供載體的混合物或者農(nóng)桿 菌菌林的混合物(每個菌林包含所述栽體之一)來向植物或植物組織提供
兩個或更多個栽體。
在所述植物或植物組織中產(chǎn)生后，可以純化所述一個或多于一個的目 的蛋白質(zhì)。從植物或植物細胞中純化蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域已知的。在一 個方法中，可以將目的蛋白質(zhì)導(dǎo)向植物質(zhì)外體，并且從其中純化，如WO 03/020938中所述。
如果要產(chǎn)生一個目的蛋白質(zhì)，則可以在編碼所述RNA復(fù)制子的所述 核苷酸序列中包括編碼所述目的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。如果要在同一植物 或同 一植物組織中產(chǎn)生兩個或多個蛋白質(zhì)，則向所述植物或植物細胞提供 包含或編碼第二或另一 RNA復(fù)制子的第二核酸。所述另一 RNA復(fù)制子隨 后可以編碼一個或多個另一目的蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，本發(fā)明的第 一和第二核酸可以包含或編碼非竟?fàn)幮訰NA復(fù)制子，如W02006/079546所述。
本發(fā)明原則上可以應(yīng)用于對于其而言感染性馬鈴薯X病毒組存在并且
建立了病毒載體系統(tǒng)的任何植物。在一個實施方案中，雙子葉植物或其組
織或細胞可以使用。在另一個實施方案中，使用煙草屬(7V/cW/a ")物種， 例i口本生煙(7Y/cW/fl/ift 6eAi幼a/m'flWfl)和煙草(A^cW/flwa to6flcw附)；優(yōu)選的除 煙草屬物種外的植物物種是碧冬茄(尸Wwm'a /^6nWfl)、蕓莒(Braw/ai cfl附/7e欲/s)、齊茱(5,/7mmi)、 7K芽、芝麻菜、齊、草蕃、菠菜、Orewo/wWw附 ca尸/似mm、苜蓿、萵苣、向日葵、馬鈴薯和黃瓜。本發(fā)明的RNA復(fù)制子 所可以基于的最優(yōu)選的植物RNA病毒是馬鈴薯X病毒組，例如馬鈴薯X 病毒(PVX)、木瓜環(huán)花葉馬鈴薯X病毒(papaya mosaic potexvirus )或 箣竹花葉馬鈴薯X病毒(bamboo mosaic potexvirus )。
本發(fā)明的主要應(yīng)用是在植物、植物葉或植物組織或細胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生 目的蛋白質(zhì)。如果本發(fā)明的方法在植物中進行，則優(yōu)選不進入人或動物食 物鏈的植物，例如煙草屬物種。不ii^v人或動物食物鏈的植物可以在開放 的田地中栽培，并且用所述RNA復(fù)制子感染后在某一時期內(nèi)收獲。優(yōu)選地， 整林植物或植物部分應(yīng)當(dāng)被限制在包含的環(huán)境中，例如溫室或特別設(shè)計的 用于提供所述水平表達所需的孵育時期的室。
本發(fā)明的產(chǎn)生方法的效率是這樣的，使得達到植物表達系統(tǒng)中的新規(guī) 模。用本發(fā)明可達到的表達水平是這樣的，從而使得用于下游加工(包括 目的蛋白質(zhì)的分離和純化)的支出足夠低，使得本發(fā)明的方法與其它大規(guī) 模表達系統(tǒng)不相上下。本發(fā)明提供了可以大M^莫使用的第 一高產(chǎn)量馬鈴薯 X病毒組植物表達系統(tǒng)。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案
在從屬權(quán)利要求中所述或如本文所述的優(yōu)選的實施方案可以組合。例 如，本發(fā)明提供了包含或編碼RNA復(fù)制子的核酸，所述復(fù)制子以這樣的順 序包含下列區(qū)段(i)至(iii):
(i) 編碼馬鈴薯X病毒組RNA依賴性RNA聚合酶或其功能保守的變體的核酸序列；
(ii) 核酸序列，其包含
(a) 馬鈴薯X病毒組三基因塊或其功能保守的變體，和
(b) 編碼馬鈴薯X病毒組外殼蛋白或其功能保守的變體的序 列；以及
(iii) 在植物或在植物組織中可從所述復(fù)制子表達的異源核酸序列； 其中所述馬鈴薯X病毒組三基因塊的所述功能保守的變體編碼如下三
個蛋白質(zhì)包含至少200個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)序列區(qū)段的第一蛋白質(zhì)，所 述蛋白質(zhì)序列區(qū)段與SEQ ID NO: IO的序列區(qū)段具有至少40%的序列同一 性；包含至少100個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)序列區(qū)段的第二蛋白質(zhì)，所述蛋白 質(zhì)序列區(qū)段與SEQ ID NO: 12的序列區(qū)段具有至少40。/。的序列同一性；以 及包含至少55個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)序列區(qū)段的第三蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì) 序列區(qū)段與SEQ ID NO: 14的序列區(qū)段具有至少40%的序列同一性；
其中所述馬鈴薯X病毒組外殼蛋白的所述功能保守的變體包含至少 200個氨基端殘基的蛋白質(zhì)序列區(qū)段，所述序列區(qū)段與SEQ ID NO: 8的序 列區(qū)段具有至少35。/。的序列同一性；以及其中條目(i)的所述序列編碼這 樣的蛋白質(zhì)，其在至少300個氨基酸殘基(優(yōu)選至少500個氨基酸殘基、更 優(yōu)選至少卯O個氨基酸殘基，以及最優(yōu)選至少1400個氨基酸殘基)的蛋白質(zhì) 序列區(qū)段中與SEQ ID NO: 4所編碼的蛋白質(zhì)具有至少36%的序列同一性。
上述實施方案中給出的序列同 一性的值可以由在本發(fā)明簡述中所公開 的更加具體的同一性值和/或更大的序列區(qū)段所改變。此外，上述實施方案 可以與在從屬權(quán)利要求中所定義的或在本說明書中所描述的優(yōu)選的實施方 案組合。上述核酸可以用于在植物或植物組織(例如煙草屬植物或煙草屬 植物組織或其細胞)中表達目的異源核酸序列的方法。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含或編碼RNA復(fù)制子的核酸， 所述RNA復(fù)制子以這樣的順序包含下列區(qū)段(i)至(iii):
(i) 編碼馬鈴薯X病毒組RNA依賴性RNA聚合酶或其功能保守的變 體的核酸序列；(ii) 核酸序列，其包含
(a )馬鈴薯X病毒組三基因塊的功能保守的變體和
(b )編碼馬鈴薯X病毒組外殼蛋白的功能保守的變體的序列；
以及
(iii) 在植物或在植物組織中可從所述復(fù)制子表達的異源核酸序列； 其中所述功能保守的變體如上所述。
附圖簡述
圖l.A-在用不同的PVX載體農(nóng)桿菌-浸潤后，在UV光下監(jiān)控的本生 煙植物(TV. 6ew幼"附/flrt")(左圖)和植物葉(右圖)。35S-PVX-CP:提 供在CaMV35S啟動子控制下的PVX外殼蛋白(CP )的栽體；35S-TVCV MP:提供在CaMV 35S啟動子控制下的煙草花葉病毒組蕪青脈明病毒 (TVCV )移動蛋白(MP )的栽體。B -構(gòu)建體pICH20799和pICH21333 的T-DNA區(qū)域的圖示。PVX Pol:馬鈴薯X病毒RNA依賴性RNA聚合 酶；35S: CaMV 35S啟動子；25K， 12K， 8K:三基因塊；CP: PVX外殼蛋白; PVX ntr: PVX未翻譯區(qū)；GFP: 7jC母綠色熒光蛋白；sgc:外殼蛋白基因的 次基因組啟動子；RB: T-DNA右邊界；LB: T-DNA左邊界。刪除ATG意思 是將ATG密碼子突變以防止在所標(biāo)位置處的翻譯起始。
圖2.使用不同PVX前載體構(gòu)件的GFP表達。A-在用不同的5'PVX 前載體與3，前栽體pICH21282組合并且在噬菌體C31整合酶存在時進行 農(nóng)桿菌浸潤后在UV光下監(jiān)控的本生煙葉，所述整合酶提供了編碼病毒復(fù) 制子的DNA的位點特異性重組介導(dǎo)的裝配。僅5，前載體(例如plCH22922; pICH22942等)標(biāo)記出了接種點。35S-TVCV MP:提供在CaMV 35S啟 動子控制下的煙草花葉病毒組蕪青脈明病毒移動蛋白(MP)的載體。該圖 在浸潤后7天(7dpi)攝得。將用于浸潤的農(nóng)桿菌懸液稀釋105倍，用于 達到允許視覺檢測表達水平差異的表達水平。
B描述了質(zhì)粒pIC22922、 pICH22939、 pICH22942、 pICH22953和 pICH21282的T-DNA區(qū)域。PVX Pol:馬鈴薯X病毒RNA依賴性RNA聚合酶；35S: CaMV 35S啟動子；25K， 12K， 8K:三基因塊；25K (trunk):截 短的編碼25K蛋白質(zhì)的基因；CP: PVX外殼蛋白；Pvx ntr: PVX未翻譯區(qū)； GFP:水母綠色熒光蛋白；sgc:外殼蛋白基因的次基因組啟動子；int:植 物內(nèi)含子的5，端；AttP和AttB:噬菌體C31的位點特異性整合酶所識別 的序列。
圖3.使用在植物組織中不提供(pICH22922)或提供(pICH22939 或pICH22988)細胞間移動的PVX前載體構(gòu)件的GFP表達的比較。A-用不同的5，PVX前栽體與3，前載體pICH21282組合并且在噬菌體C31整 合酶存在時進行農(nóng)桿菌浸潤后在UV光下監(jiān)控的本生煙葉，所述整合酶提 供了編碼病毒復(fù)制子的DNA的位點特異性重組介導(dǎo)的裝配。該圖在浸潤 后7天(7dpi)獲得。將用于浸潤的農(nóng)桿菌懸液如所示稀釋103或105倍。
B —標(biāo)示了質(zhì)粒pIC22922、 pICH22939和pICH22988, pICH22953 和pICH21282的T-DNA區(qū)域。PVX Pol:馬鈴薯X病毒RNA依賴性RNA 聚合酶；35S: CaMV 35S啟動子;25K， 12K, 8K:三基因塊；25K (trunk): 截短的編碼25K蛋白質(zhì)的基因；TVCVMP:煙草花葉病毒組蕪青脈明病毒 移動蛋白；CP:PVX外殼蛋白；Pvxntr:PVX未翻譯區(qū)；GFP:水母綠色熒 光蛋白；sgc:外殼蛋白基因的次基因組啟動子；int:植物內(nèi)含子的5'端； AttP和AttB:噬菌體C31的位點特異性整合酶所識別的序列。
圖4.使用不提供(pICH22577)或提供(pICH22988或pICH24180) 細胞間移動的PVX前載體構(gòu)件的GFP表達的比較。A -用不同的5'PVX 前載體與3，前載體pICH21282組合并且在噬菌體C31整合酶存在時進行 農(nóng)桿菌浸潤后在UV光下監(jiān)控的本生煙葉，所述整合酶提供了編碼病毒復(fù) 制子的DNA的位點特異性重組介導(dǎo)的裝配。該圖在浸潤后7天(7dpi)獲 得。將用于浸潤的農(nóng)桿菌懸液如所示稀釋103或105倍。
B —標(biāo)示了質(zhì)氺立pIC22577、 pICH22988和pICH24180的T-DNA區(qū) 域。PVX Pol:馬鈴薯X病毒RNA依賴性RNA聚合酶；35S: CaMV 35S 啟動子；25K， 12K, 8K:三基因塊；CP: PVX外殼蛋白；PVX ntr: PVX未 翻譯區(qū)；sgc:外殼蛋白基因的次基因組啟動子；sg25: 25K基因的次基因組啟動子；int:植物內(nèi)含子的5，端；AttP:噬菌體C31的位點特異性整合酶 識別的序列。
圖5.使用不同的PVX表達盒(前栽體構(gòu)件和裝配的載體)的GFP 表達，所述表達盒具有在GFP基因之前的不同位置上的CP。 A-在用裝 配的病毒載體pICH25491 、 pICH25488或不同的5， PVX前載體 (pICH22988或pICH24180 )與3，前載體pICH21282組合并且在噬菌體 C31整合酶存在時進行農(nóng)桿菌浸潤后在UV光下監(jiān)控的本生煙葉，所述整 合酶提供了編碼病毒復(fù)制子的DNA的位點特異性重組介導(dǎo)的裝配。該圖 在浸潤后7天(7dpi)獲得。將用于浸潤的農(nóng)桿菌懸液稀釋105倍。
B -標(biāo)示質(zhì)粒pIC22988、 pICH25491、 pICH25488和pICH24180的 T-DNA區(qū)域。PVX Pol:馬鈴薯X病毒RNA依賴性RNA聚合酶；35S: CaMV35S啟動子；25K，12K，8K:三基因塊；CP: PVX夕卜殼蛋白；Pvx ntr: PVX未翻譯區(qū)；sgc:外殼蛋白基因的次基因組啟動子；sg25: 25K基因的次 基因組啟動子；int:植物內(nèi)含子的5'端；AttP:噬菌體CM的位點特異性 整合酶識別的序列。
圖6.使用裝配的PVX表達盒的GFP表達，所述表達盒具有在GFP 基因之前的不同位置上的CP。 A-在用裝配的病毒載體pICH25491、 pICH25488和pICH20799進行農(nóng)桿菌浸潤后，在浸潤后10天(左圖)和 16天(右圖)在UV光下監(jiān)控的本生煙葉。將用于浸潤的農(nóng)桿菌懸液稀釋 105倍。
B —標(biāo)示了質(zhì)氺立pIC20799、 pICH25491和pICH25488的T-DNA區(qū) 域。PVX Pol:馬鈴薯X病毒RNA依賴性RNA聚合酶；35S: CaMV 35S 啟動子；25K， 12K， 8K:三基因塊；CP: PVX外殼蛋白；PVX ntr: PVX未 翻譯區(qū)；sgc:外殼蛋白基因的次基因組啟動子；sg25: 25K基因的次基因組 啟動子。
圖7標(biāo)示了具有多個克隆位點(CS)的PVX克隆栽體.PVX Pol:馬 鈴薯X病毒RNA依賴性RNA聚合酶；35S: CaMV 35S啟動子；25K， 12K， 8K:三基因塊；CP: PVX外殼蛋白；PVX ntr: PVX未翻譯區(qū)；sgc:外殼蛋白基因的次基因組啟動子；sg25: 25K基因的次基因組啟動子。
圖8顯示了 pICH25491的圖。pICH25491的T-DNA區(qū)域的核苷斷
列在SEQ ID NO: 6中給出。
圖9顯示了 pICH25488的圖。pICH25488的T-DNA區(qū)域的核普紗
列在SEQ ID NO: 5中給出。
發(fā)明詳述
本發(fā)明描述了用于馬鈴薯X病毒組衍生的RNA復(fù)制子的新設(shè)計，其提 高了在植物或植物組織中要從所述RNA復(fù)制子表達的目的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。 本發(fā)明的方法比常規(guī)的馬鈴薯X病毒組衍生的RNA復(fù)制子具有更好的生物 安全性特征，因為其產(chǎn)生了更少的病毒外殼蛋白并且因此可以形成更少的
病毒顆粒。
我們已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)外殼蛋白或異源移動蛋白的編碼序列的位置 在編碼目的蛋白質(zhì)的所述異源核酸序列(iii)之前會在消耗病毒外殼蛋白 時增加所述重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。PVX外殼蛋白不僅對于系統(tǒng)移動是必需 的，而且與三基因塊的三個其它蛋白質(zhì)一起用于細胞間(短距離)移動
(Yang等人，2000， Mo/， /V做/M/cr^e/"&m"" 1^:599-605; Fedorkin等人， 2001， / Gew. K/m/.， ^:449-458 )。在本文中，顯示了 (見實施例1和

圖1 ) 缺乏PVX外殼蛋白使得PVX衍生的RNA復(fù)制子不能進行長距離(圖1A， 左圖)和細胞間(圖1A，右圖)移動?？梢酝ㄟ^提供反式PVX外殼蛋白
(CP)或煙草花葉病毒組移動蛋白(例如煙草花葉病毒(TMV)移動蛋 白(MP)(圖1A，右圖))來恢復(fù)細胞間移動。還顯示(實施例2，圖2) 了具有TVCV移動蛋白的PVX衍生的RNA復(fù)制子能夠進行短距離(細胞 間)移動。使用前載體系統(tǒng)進行實驗(Marillonnet等人，2004，A^/.
t/W, 101:6852-6857)，所述前載體系統(tǒng)允許在植物中通過例如 前載體AttP和AttB位點之間的位點特異性重組來裝配RNA復(fù)制子的 I)NA前體(圖2B )。
具有TVCV MP ( pICH22939 )或PVX CP的PVX衍生的RNA復(fù)制子的比較分析描述在實施例3中并且顯示在圖3中。如上文所述的情形中， 使用前載體系統(tǒng)。從圖3中很明顯看出位于目的基因之前的PVX CP提 供了所述RNA復(fù)制子的細胞間移動。根據(jù)GFP點的亮度和密度(圖3A) 可以得出，細胞間移動的效率顯著高于TVCVMP。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，測試了 PVXCP在目的基因之前的位 置的效率。從圖4A中很明顯，CP在三基因塊之后的位置與所述CP在PVX RNA依賴性RNA聚合酶和三基因塊之前的位置相比，提供了更有效的細 胞間移動。也在此實驗中使用前載體系統(tǒng)。在使用前載體或提供PVX衍生 的RNA復(fù)制子的轉(zhuǎn)配的載體的情形之間發(fā)現(xiàn)沒有目的蛋白質(zhì)(GPF)表 達水平上的差異(見實施例5，圖5)。當(dāng)我們在比較研究中包括這樣的載 體(所述載體提供了在目的基因之后包含CP的RNA復(fù)制子)時，所述目 的基因從此類載體中的表達水平(GFP表達區(qū)域的亮度)令人驚訝地顯著 弱于CP位于目的基因之前的載體(pICH20799對pICH25488或 pICH25491，圖6,實施例6)。
在實施例中，我們使用基于PVX的RNA復(fù)制子。但是，屬于馬鈴薯 X病毒組分類學(xué)組的其它病毒可以用于構(gòu)建本發(fā)明的基于RNA病毒的載 體?？捎糜诒景l(fā)明的病毒物種包括但不限于箣竹花葉馬鈴薯X病毒 (bamboo mosaic potexvirus )、木瓜環(huán)花葉馬鈴薯X病毒(papaya mosaic potexvirus )、蓮子草花葉馬鈴著X病毒(alternanthera mosaic potexvirus )、 三葉草黃花葉病毒(clover yellow mosaic virus )、車前草X病毒(plantain virus X )、 白三葉草花葉病毒(white clover mosaic virus)和奧古巴馬鈴 薯花葉病毒(potato aucuba mosaic virus)。植物病毒移動蛋白的細節(jié)見 近期的綜述WJ Lucas(2006， Virology, 344:169-184)。
衍生自一種植物病毒的一種RNA復(fù)制子可以用于本發(fā)明的方法，例 如衍生自馬鈴薯X病毒(PVX)。但是，兩種或多種不同的RNA復(fù)制子 也可以用于植物或植物組織中，用于表達兩種不同的目的蛋白質(zhì)，其中此 類不同的RNA復(fù)制子優(yōu)選衍生自不同的植物病毒。所述不同的RNA復(fù)制 子所來源的此類不同的植物病毒優(yōu)選是協(xié)同或非竟?fàn)幮圆《?。在本文?協(xié)同，，和"非竟?fàn)幮?同義。協(xié)同病毒可以在相同的植物細胞中共存在并且
有效擴增。類似地，衍生自協(xié)同RNA病毒的RNA復(fù)制子可以在相同的植 物細胞中共存在且有效擴增。此類RNA復(fù)制子的協(xié)同對的實例為這樣的 RNA復(fù)制子對，其中一個RNA復(fù)制子衍生自TMV或TVCV，而另 一個 RNA復(fù)制子f汴生自馬鈴薯X病毒組例如PVX。協(xié)同RNA復(fù)制子可以用
克隆抗體的重鏈和輕鏈。在相同的植物或相同的植物細胞中使用不同(非 竟?fàn)幮?病毒載體表達兩種或多種目的蛋白質(zhì)的方法描述在EP1686176中。
在實施例中，我們在植物細胞中主要使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的病毒載體的遞 送。可以使用多種通常用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物的其它方法將載體遞送到植物細 胞中，例如將異源核苷酸序列通過下述方法直接引入到細胞中微粒轟擊、 電穿孔或PEG-介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化是優(yōu)選的。 因此，可以通過多種技術(shù)將異源核苷酸序列轉(zhuǎn)化到植物細胞中，例如通過 農(nóng)桿菌(/^/Y^""eW"附)攜帶的Ti-質(zhì)粒載體(US 5，591，616; US 4,940,838; US 5,464,763)、粒子或樣吏粒轟擊(US 05100792; EP 00444882B1; EP 00434616B1)。原則上，其它植物轉(zhuǎn)化方法也可以使用，例如顯微注射(WO 09209696; WO 09400583A1; EP 175966Bl)、電穿孔(EP00564595B1; EP002卯395B1; WO 08706614Al)等。轉(zhuǎn)化方法的選擇取決于待轉(zhuǎn)化的植 物物種及其它。例如對于單子葉植物轉(zhuǎn)化，微粒轟擊可以是優(yōu)選的，而對 于雙子葉植物，農(nóng)桿菌-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化一般給出更優(yōu)結(jié)果。
本發(fā)明優(yōu)選用高等多細胞植物進行。用于本發(fā)明中的優(yōu)選的植物包括 優(yōu)先提供農(nóng)業(yè)經(jīng)濟和園藝重要物種的任何植物物種。用于本發(fā)明的常規(guī)作 物植物包括苜蓿、大麥、菜豆、卡諾拉油菜、豇豆、棉、谷類、三葉草、 蓮、兵豆、羽扇豆、黍、燕麥、豌豆、花生、稻、黑麥、草木樨、向曰葵、 香豌豆、大豆、高粱、黑小麥、西印度豆薯、黎豆、野豌豆、小麥、紫藤 和堅果植物。優(yōu)選用于實踐本發(fā)明的植物物種包括但不限于禾本科 (Graminae)、菊科(Compositae )、癡科(Solanacea )和薔薇科(Rosaceae ) 的代表。此外用于本發(fā)明的優(yōu)選的物種，以及上文特定指出的那些植物來自屬鼠耳芥屬(Arabidopsis)、剪股穎屬(Agrostis)、蔥屬(Allium)、 金魚草屬(Antirrhinum)、芽屬(Aphim)、落花生屬(Arachis)、天門冬屬 (Asparagus)、顛癡屬(Atropa)、燕麥屬(Avena)、 山白竹屬(Bambusa)、蕓 苔屬(Brassica)、雀麥屬(Bromus)、 Browaalia、 山茶屬(Camellia)、 大麻屬 (Cannabis),辣椒屬(Capsicum)、鷹嘴豆屬(Cicer)、藜屬(Chenopodium)、 菊苣屬(Chichorium)、柑橘屬(Citrus)、咖啡屬(Coffea)、薏苡屬(Coix)、香 瓜屬(Cucumis)、 南瓜屬(Curcubita)、狗牙根屬(Cynodon)、鴨茅屬 (Dactylis)、曼陀羅屬(Datura)、胡蘿卜屬(Daucus)、毛地黃屬(Digitalis)、 薯蕷屬(Dioscorea)、油棕屬(Elaeis)、糝屬(Eleusine)、羊茅屬(Festuca)、草 莓屬(Fragaria)、老鸛草屬(Geranium)、大豆屬(Glycine)、向日葵屬 (Heiianthus)、 Heterocallis、橡膠樹屬(Hevea)、大麥屬(Hordeum)、天仙子 屬(Hyoscyamus)、番薯屬(Ipomoea)、 萵苣屬(Lactuca)、兵豆屬(Lens)、百 合屬(Lilium)、亞麻屬(Linum)、黑麥草屬(Lolium)、百樂M艮屬(Lotus)、番 癡屬(Lycopersicon)、 Majorana、蘋果屬(Malus)、 芒果屬(Mangifera)、木 薯屬(Manihot)、 苜蓿屬(Medicago)、龍面花屬(Nemesia)、 煙草屬 (Nicotiana)、驢食豆屬(Onobrychis)、稻屬(Oryza)、稷屬(Panicum)、天竺 葵屬(Pelargonium)、狼尾草屬(Pennisetum)、碧冬茄屬(Petunia)、豌豆屬 (Pisum)、菜豆屬(Phaseolus)、梯牧草屬(Phleum)、早熟禾屬(Poa)、李屬 (Prunus)、 毛炙屬(Ranunculus)、 蘿卜屬(Raphanus) 、 Ribes、 茶薦子屬 (Ricinus)、 懸鉤子屬(Rubus)、甘蔗屬(Saccharum)、智利喇叭花屬 (Salpiglossis)、黑麥屬(Secale)、千里光屬(Senecio)、狗尾草屬(Setaria)、白 芥屬(Sinapis)、 茄屬(Solaniim)、蜀黍?qū)?Sorghum)、 鈍葉草屬 (Stenotaphrum)、可可樹屬(Theobroma)、車軸草屬(Trifolium)、胡盧巴屬 (Trigonella)、小麥屬(Triticum)、野豌豆屬(Vicia)、豇豆屬(Vigna)、葡萄 屬(Vitis)、玉蜀黍?qū)?Zea)、以及莪利竹族(Olyreae)、 Pharoideae和許多其 它。
在本發(fā)明方法的一個特定實施方案中，衍生自PVX的RNA復(fù)制子與 煙草屬植物^f吏用。粉修飾酶(淀粉合酶、淀粉磷酸化酶、脫支酶、淀粉分支酶、淀粉分支酶 II、顆粒體結(jié)合的淀粉合酶)、蔗糖磷酸合酶、蔗糖磷酸化酶、多聚半乳 糖醛酸酶、多聚果聚糖蔗糖酶、腺苷二磷酸-葡糖焦磷酸化酶、環(huán)化糊精糖 基轉(zhuǎn)移酶、果糖基轉(zhuǎn)移酶、糖原合酶、果膠酯酶、抑酶肽、抗生物素蛋白、
細菌果聚糖蔗糖酶、大腸桿菌(Eco//) glgA蛋白、MAPK4和直向同源物、 氮同化/代謝酶、谷氨酰胺合酶、植物滲透蛋白、2S清蛋白、奇異果甜蛋白、 位點特異性重組酶/整合酶(FLP、 Cre、 R重組酶、Int、 SSVI整合酶R、 整合酶phiC31、或其活性片段或變體)、異戊烯基轉(zhuǎn)移酶、ScaM5(大豆 鈣調(diào)蛋白)、鞘翅類之昆蟲型毒素(coleopteran type toxin)或殺蟲活性的 片段、泛素綴合酶(E2)融合蛋白、代謝脂類、氨基酸、糖類、核酸和多糖 的酶、超氧化物岐化酶、蛋白酶的非活性酶原形式、植物蛋白毒素、在纖 維生產(chǎn)植物中改變纖維的性狀、來自蘇云金芽孢桿菌(必《"7/附 //mW"g/ews/s)的鞘翅類之昆蟲活性毒素(Bt2毒素、殺蟲晶體蛋白(ICP)、 CryIC毒素、S內(nèi)毒素、多肽毒素、毒素原等)、昆蟲特異性毒素AaIT、 纖維素降解酶、來自解纖維熱酸菌U"V/W/^r附"s )的El纖維
素酶、木質(zhì)素修飾酶、肉桂酰醇脫氫酶、海藻糖-6-磷酸合酶、細胞分裂素 代謝途徑的酶、HMG-CoA還原酶、大腸桿菌無機焦磷酸酶、種子貯存蛋 白、草生歐文氏菌(五nWmVi /^M/co/fl)番茄紅素合酶、ACC氧化酶、 pTOM36編碼的蛋白質(zhì)、肌醇六磷酸酶、酮水解酶(ketohydrolase)、乙 酰乙酰輔酶A還原酶、PHB (聚羥基丁酸酯(polyhydroxybutanoate))合 酶、?；d體蛋白、油菜籽蛋白、EA9、非高等植物八氫番茄紅素合酶、 pTOM5編碼的蛋白質(zhì)、ETR (乙烯受體)、質(zhì)體丙酮酸磷酸雙激酶(plastidic pyruvate phosphate dikinase)、線蟲4秀導(dǎo)型跨膜孔蛋白、增強植物細胞 的光合或質(zhì)體功能的性狀、芪合酶(stilbene synthase ),能夠羥基化酚類 的酶、兒茶酚雙加氧酶、兒茶酚2，3-雙加氧酶、氯勦康酸環(huán)化異構(gòu)酶、鄰 氨基苯曱酸合酶、蕓苔屬AGL15蛋白、果糖1，6-二磷酸酶(FBPase)、 AMV RNA3、 PVY復(fù)制酶、PLRV復(fù)制酶、馬鈴薯Y病毒組外殼蛋白、CMV外殼蛋白、TMV外殼蛋白、黃矮病毒組復(fù)制酶、MDMV信使RNA、 突 變雙粒病毒組復(fù)制酶、加州月桂(f/附&〃w/"r/fl ai/"^"/ai) C12:0優(yōu)選的 ?；?ACP硫酯酶、植物C10或C12:0優(yōu)選的?；?ACP硫酯酶、C14:0優(yōu) 選的?；?ACP硫酯酶(luxD)、植物合酶因子A、植物合酶因子B、 6-去飽 和酶、在植物細胞中脂肪酸的過氧化物酶體(peroxysomal)-氧化中具有 酶促活性的蛋白質(zhì)、?；o酶A氧化酶、3-酮脂酰輔酶A硫解酶、脂肪酶、 玉米乙酰輔酶A羧化酶、5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶 (5-enolpyruvylshikimate曙3-phosphate synthase) (EPSP)、膦絲菌素乙?；D(zhuǎn) 移酶(BAR、 PAT)、 CP4蛋白、ACC脫氨酶、核酶、具有翻譯后切割位 點的蛋白質(zhì)、由Gal4轉(zhuǎn)錄激活子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域組 成的蛋白質(zhì)融合、能夠?qū)⑷诤系鞍装邢虻街嗟挠唾|(zhì)蛋白與目的蛋白質(zhì)的 翻譯融合、賦予氨磺?？剐缘腄HPS基因、細菌腈水解酶、2，4-D單加氧 酶、乙酰乳酸合酶或乙酰羥酸合酶(ALS、 AHAS)、多聚半乳糖醛酸酶、細 菌腈水解酶、位于質(zhì)體的內(nèi)包膜的成熟磷酸易位蛋白的氨基末端疏水區(qū)域 與待靶向到所述膜中的目的蛋白質(zhì)的融合等。
可以使用本發(fā)明的系統(tǒng)表達任何人或動物蛋白質(zhì)。此類目的蛋白質(zhì)的 實例包括下述蛋白質(zhì)(藥物蛋白質(zhì))等免疫應(yīng)答蛋白(單克隆抗體、單 鏈抗體、T細胞受體等)、抗原、集落刺激因子、松弛素、多肽激素、細 胞因子及其受體、干擾素、生長因子和凝固因子、酶促活性的溶酶體酶、 纖維蛋白溶酶多肽、凝血因子、胰蛋白酶原、l-抗胰蛋白酶(AAT)，以 及功能性保守的蛋白質(zhì)例如上述蛋白質(zhì)融合體(fusion)、突變形式和合 成衍生物。
本專利申請要求優(yōu)先權(quán)的在2006年9月6日提交的歐洲專利申請No. 06 018 713.5的內(nèi)容在本文以其全文引入作為參考。
實施例 實施例1
缺乏CP的PVX構(gòu)建體不進行細胞間移動從Yuri Dorokhov教授處(莫斯科州立大學(xué)，俄羅斯(Moscow State University, Russia ))獲得包含GFP基因的PVX構(gòu)建體(pA3151)。這一 構(gòu)建體通過下述制備將包含GFP編碼序列的Nhel-Sall片段克隆到用 Nhel和Sail消化的pPVX201 ( Baulcombe， D.， Chapman, S. & Santa Cruz, S.， 1995， Plant丄，7:1045-1053 )中，然后從得到的構(gòu)建體中將 Hind3-Sacl片段(包含完整的病毒插入片段和GFP基因)亞克隆到 pBIN19。然后將病毒插入片段作為Sacl-Sphl片段從pA3151亞克隆到 pICBV52(小的基于pBIN19的KanR二元載體)中，得到質(zhì)粒pICH20799。 該構(gòu)建體包含克隆的在35S啟動子控制下的PVX構(gòu)建體(圖IB ) 。 GFP 編碼序列從重復(fù)CP次基因組啟動子(sgc )表達，并且位于三基因塊(TGB ) 和CP編碼序列之間。由于CP上游的重復(fù)次基因組啟動子片段也包含CP 起始密碼子，因此通過從ATG突變成AGG來消除該起始密碼子。
通過刪除CP基因和其次基因組啟動子(使用一條引物重疊住缺失終 點的PCR)，從pICH20799 (圖IB)制備缺乏CP的對照構(gòu)建體。將得到 的構(gòu)建體pICH21333 (圖1B)轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌(爿gn ^icteWM附)中，并且浸 潤在本生煙葉中。如所預(yù)期的，病毒復(fù)制子不能進行細胞間或系統(tǒng)移動。 當(dāng)將pICH21333與構(gòu)建體pICH10745或pICH22066 —起共浸潤時會恢復(fù) 復(fù)制子移動，所述pICH10745或pICH22066分別提供TVCV MP或PVX CP的瞬時表達(圖1A )。pICH10745和pICH22066構(gòu)建體分別包含TVCV MP或PVX CP編碼序列，它們受到35S啟動子的控制。
實施例2
具有在TGB和目的基因之間克隆的TVCV MP基因的PVX復(fù)制子能 夠細胞間移動
由于TVCV MP能夠向缺乏PVX CP的PVX復(fù)制子提供細胞間移動， 將TVCV MP基因克隆到PVX構(gòu)建體的三基因塊和目的基因(在該情形 中是GFP)之間，受到重復(fù)CP次基因組啟動子的控制。為了實踐的原因， 將該構(gòu)建體(pICH22939，圖2B和SEQ ID NO:l )制備為5'前載體構(gòu)件， 所述構(gòu)件包含與5'病毒栽體序列融合的35S啟動子但是缺乏構(gòu)建體的3，部分(包括目的基因的編碼序列和PVX 3'NTR)。重組位點(鏈霉菌屬 (Streptomyces )噬菌體C31 AttP位點)和內(nèi)含子序列在病毒構(gòu)建體序列 之后。3'前載體構(gòu)件pICH21282 (圖2B)包含相容的重組位點(鏈霉菌屬 噬菌體C31 AttB重組位點)，其后接著內(nèi)含子序列、GFP基因和PVX NTR。 通過包含5，和3'構(gòu)件的農(nóng)桿菌與PhiC31重組酶(pICH10881，包含受到 擬南芥ACT2啟動子控制的PhiC31重組酶，見Marillonnet等人，2005，/Voc A^/. ^aw/. CAS^， 6852-6857 )的共浸潤，在重組位點進行位點特異 性重組，來體內(nèi)裝配構(gòu)建體的5'和3，部分。在將5，和3，構(gòu)件向植物細胞進 -f亍T-DNA遞送并且在AttP和AttB位點重組后，從35S啟動子轉(zhuǎn)錄重組 I)NA。通過側(cè)翼內(nèi)含子序列的剪接將重組位點從轉(zhuǎn)錄物切除，并且剪接的 轉(zhuǎn)錄物從核輸出到細胞質(zhì)中，在其中被擴增為正常的病毒RNA復(fù)制子。
對照前栽體構(gòu)建體(pICH22922，無TVCV MP序列的5'前載體)與 3'前栽體pICH21282的浸潤導(dǎo)致形成不能進行細胞間移動的復(fù)制子。相反， pICH22939的浸潤產(chǎn)生了能夠進行細胞間移動的復(fù)制子(圖2A)。
由于不需要其它病毒蛋白質(zhì)，TMV就能夠向TMV復(fù)制子提供細胞間 移動，因此，制備了第二PVX構(gòu)建體，其中刪除了三基因塊的12K和8K 蛋白質(zhì)，產(chǎn)生了構(gòu)建體pICH22953 (圖2B和SEQIDNO:2)。在該情形 中，TMV MP從12K次基因組啟動子(sgl2)表達。pICH22953與 pICH21282的浸潤產(chǎn)生了能夠細胞間移動的復(fù)制子。但是細胞間移動和 GFP熒光并不優(yōu)于或強于使用構(gòu)建體pICH22939時(圖2 )。
實施例3
具有在TGB和目的基因之間克隆的PVX CP基因的PVX載體能夠細 胞間移動。
制備類似于pICH22939但是用PVX CP替換了 TVCV MP的構(gòu)建體。 該構(gòu)建體的序列與野生型病毒從病毒的5，端直到CP末端的序列相同。CP 后面是用于表達目的基因的重復(fù)CP次基因組啟動子。將該構(gòu)建體 pICH22988 (圖3B)與pICH21282 (圖2B)浸潤導(dǎo)致形成這樣的復(fù)制子，其 與產(chǎn)生自pICH22939(圖3A)的復(fù)制子相比，有更快的細胞間移動并且產(chǎn)生更亮的GFP熒光。 實施例4
具有在RdRP和TGB之間克隆的PVX CP基因的PVX栽體能夠細胞 間移動
在重復(fù)25K次基因組啟動子(sg25)的控制下，將PVXCP基因克隆 到RdRp和三基因塊之間，得到構(gòu)建體pICH24180 (圖4B， SEQ ID NO:3)。 pICH24180與pICH21282組合與整合酶來源(pICH10881 )的浸潤導(dǎo)致形 成能夠細胞間移動的病毒復(fù)制子(圖4A)。在對照實驗中將構(gòu)建體 pICH22577 (與pICH22922類似但是在一些限制性位點上不同)而不是 pICH24180浸潤，其如預(yù)期表現(xiàn)出不進行細胞間移動。與用pICH22988 類似，來自pICH24180的GFP熒光強于用構(gòu)建體pICH22939的熒光。
實施例5
包含CP的完全裝配的PVX病毒載體也提供了細胞間移動
制備包括具有GFP部分的3，前載體(pICH21282，圖2B )并且對應(yīng) 于前載體pICH22988或pICH24180的裝配的構(gòu)建體，分別產(chǎn)生質(zhì)粒 pICH25488和pICH25491 (圖5B ) 。 pICH25488和pICH25491的T-DNA 區(qū)域的核苷酸序列分別如SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6所給出的。發(fā)現(xiàn) 兩個構(gòu)建體都如所預(yù)期的與前載體一樣工作，并且提供細胞間移動和強的 GFP熒光(圖5A) 。 GFP熒光也比標(biāo)準(zhǔn)構(gòu)建體(pICH20799)強得多， 表明有更多重組蛋白質(zhì)表達(圖6A)，其中在所述標(biāo)準(zhǔn)構(gòu)建體中，CP基 因位于目的基因之后?？捡R斯染色的蛋白質(zhì)凝膠顯示與pICH20799相比， 從pICH25491和pICH25488表達出了高得多的量的GFP蛋白質(zhì)，并且相 反，從pICH20799比其它兩種構(gòu)建體產(chǎn)生了高得多的量的PVX CP。
實施例6
PVX克隆載體
顯示了在RdRP和TGB之間或在TGB和目的基因之間具有CP的兩 種類型的PVX克隆載體的圖示。CS:克隆位點。
權(quán)利要求
1. 包含或編碼RNA復(fù)制子的核酸，所述RNA復(fù)制子以這樣的順序包含下列區(qū)段(i)至(iii)(i)編碼馬鈴薯X病毒組RNA依賴性RNA聚合酶或其功能保守的變體的核酸序列；(ii)核酸序列，其包含(a)馬鈴薯X病毒組三基因塊或其功能保守的變體和(b)編碼馬鈴薯X病毒組外殼蛋白或其功能保守的變體的序列；或編碼煙草花葉病毒組移動蛋白的序列；以及(iii)在植物或在植物組織中可從所述復(fù)制子表達的異源核酸序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的核酸，其中所述馬鈴薯X病毒組三基因塊的所述 功能保守的變體編碼如下三種蛋白質(zhì)包含至少200個M酸殘基的蛋白 質(zhì)序列區(qū)段的第一蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)序列區(qū)段與SEQ ID NO: 10的序列 區(qū)段具有至少40%的序列同一性；包含至少100個^J^酸殘基的蛋白質(zhì)序 列區(qū)段的第二蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)序列區(qū)段與SEQ ID NO: 12的序列區(qū)段 具有至少40。/。的序列同一性；以及包含至少55個M酸殘基的蛋白質(zhì)序 列區(qū)段的第三蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)序列區(qū)段與SEQ ID NO: 14的序列區(qū)段 具有至少40%的序列同一性。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1的核酸，其中所述馬鈴薯X病毒組三基因塊的所述 功能保守的變體編碼三種蛋白質(zhì)，其中之一與SEQ ID NO: 10具有至少 33%的序列同一性； 一種與SEQIDNO: 12具有至少36%的序列同一性； 并且一種與SEQ ID NO: 14具有至少30%的序列同一性。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3的核酸，其中所述馬鈴薯X病毒組三基因塊的所述 功能保守的變體編碼三種蛋白質(zhì)，其中之一與SEQ ID NO: 10具有至少 50%的序列同一性； 一種與SEQ ID NO: 12具有至少50%的序列同一性； 并且一種與SEQ ID NO: 14具有至少50%的序列同一性。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項的核酸，其中所述馬鈴薯X病毒組外 殼蛋白的所述功能保守的變體包含至少200個M酸殘基的蛋白質(zhì)序列區(qū) 段，所述序列區(qū)段與SEQ ID NO:8的序列區(qū)段具有至少35%的序列同一性。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項的核酸，其中條目(i)的所述序列編 碼這樣的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)與SEQIDNO:4所編碼的蛋白質(zhì)在至少300 個氨基酸殘基、優(yōu)選至少500個氨基酸殘基、更優(yōu)選至少卯0個氨基酸殘 基、以及最優(yōu)選至少1400個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)序列區(qū)段中具有至少36% 的序列同一性。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項的核酸，其中條目(i)的所述序列編 碼這樣的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)與SEQ ID NO:4所編碼的蛋白質(zhì)在至少300 個氨基酸殘基、優(yōu)選至少500個氨基酸殘基、更優(yōu)選至少卯0個氨基酸殘 基、以及最優(yōu)選至少1400個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)序列區(qū)段中具有至少45% 的序列同一性。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項的核酸，其中條目(i)的所述序列編 碼這樣的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)與SEQIDNO:4所編碼的蛋白質(zhì)在至少300 個氨基酸殘基、優(yōu)選至少500個氨基酸殘基、更優(yōu)選至少卯0個氨基酸殘 基、最優(yōu)選至少1400個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)序列區(qū)段中具有至少50%的 序列同源性。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項的核酸，其中條目(i)的所述核^ 列與SEQ ID NO:4在至少900個核苷酸、優(yōu)選至少1500個核苷酸、更優(yōu) 選至少2700個核普酸、最優(yōu)選至少4200個核苷酸的序列區(qū)段中具有至少 55%，優(yōu)選至少60%的序列同一性。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項的核酸，其中所述復(fù)制子是馬鈴薯 X病毒組復(fù)制子，優(yōu)選是衍生自馬鈴薯X病毒、自箣竹花葉馬鈴薯X病毒、 或自木瓜環(huán)花葉馬鈴薯X病毒的復(fù)制子。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項的核酸，其中所述復(fù)制子不具有病 毒顆粒裝配的起點。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項的核酸，所述核酸包含選自以下的 序列在條目(i)的上游在植物細胞中有活性的轉(zhuǎn)錄啟動子、病毒次基因 組啟動子、馬鈴薯X病毒組5，或3，未翻譯區(qū)。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項的核酸，其中條目(a)和(b)在 條目(U)的所述核酸序列中可以是任何順序。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13的核酸，其中，在條目(ii)中，所述馬鈴薯X 病毒組三基因塊或其功能保守的變體位于所述馬鈴薯X病毒組外殼蛋白基 因或其功能保守的變體的上游，或者反過來。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項的核酸，其中所述煙草花葉病毒組 移動蛋白是煙草花葉病毒或者蕪青脈明病毒的移動蛋白或者所述移動蛋白 的功能保守的變體。
16. 核酸，其包含權(quán)利要求1至15中任一項的所述核酸的互補序列。
17. 包含或編碼RNA復(fù)制子的核酸，所述RNA復(fù)制子以這樣的順序 包含下列區(qū)段(i)至(iii):(i) 編碼馬鈴薯X病毒組RNA依賴性RNA聚合酶或其功能保守 的變體的核酸序列；(ii) 核酸序列，其包含(a) 馬鈴薯X病毒組三基因塊和(b) 編碼馬鈴薯X病毒組外殼蛋白的序列；或者編碼煙草 花葉病毒組移動蛋白的序列；以及(iii) 在植物或在植物組織中可從所述復(fù)制子表達的異源核酸序列。
18. 包含至少兩種載體的部分的試劑盒，所述載體能夠在植物細胞中 通過位點定向重組裝配權(quán)利要求1至16中任一項的所述核酸。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18的部分的試劑盒，其包含至少兩種載體，第一載 體包含或編碼權(quán)利要求l至15中任一項的條目(i)和(ii)的區(qū)段，并且 第二載體包含或編碼權(quán)利要求1至15中任一項的條目(iii)的區(qū)段，其中 所述第一和所述第二栽體每個具有重組位點，所述重組位點用于允許通過 位點特異性重組來裝配根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項的核酸。
20.在植物或植物組織中表達目的異源核酸序列的方法，其包括向植 物或植物組織提供權(quán)利要求1至16中任一項的所述核酸。
全文摘要
包含或編碼RNA復(fù)制子的核酸，所述復(fù)制子以這樣的順序包含下列區(qū)段(i)至(iii)(i)編碼馬鈴薯X病毒組RNA依賴性RNA聚合酶或其功能保守的變體的核酸序列；(ii)核酸序列，其包含(a)馬鈴薯X病毒組三基因塊或其功能保守的變體和(b)編碼馬鈴薯X病毒組外殼蛋白或其功能保守的變體的序列；或編碼煙草病毒組移動蛋白的序列；以及(iii)在植物或在植物組織中可從所述復(fù)制子表達的異源核酸序列。
文檔編號C12N15/82GK101512002SQ200780032636
公開日2009年8月19日 申請日期2007年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月6日
發(fā)明者C·恩格勒, S·馬里約內(nèi), V·克利姆克, Y·格萊巴 申請人:愛康遺傳有限公司