專利名稱：雙歧桿菌中的遺傳重建的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及乳酸細(xì)菌中的抗生素敏感性。更特別地，其涉及雙歧桿菌 種中四環(huán)素抗性基因的去除，以及去除或無(wú)效雙歧桿菌種中基因的方法。
背景技術(shù)：
近幾年對(duì)于針對(duì)可用抗生素增強(qiáng)的細(xì)菌抗性的關(guān)注已經(jīng)不斷增強(qiáng)。盡 管多數(shù)關(guān)注涉及獲得的抗性，該抗性至少部分歸因于醫(yī)師對(duì)廣譜抗生素的 廣泛使用，也有一些關(guān)注是有關(guān)因食物和農(nóng)業(yè)目的使用獲得性抗生素抗性 基因的細(xì)菌所產(chǎn)生的抗生素抗性。例如，在從環(huán)境、動(dòng)物和人類包括兒童 分離的微生物中四環(huán)素抗性基因的存在和分布是普遍的。在一些情況下， 抗生素抗性對(duì)于特定種類而言可能是固有的——例如，由于特定的細(xì)胞膜 特性?？股乜剐砸部赏ㄟ^(guò)細(xì)菌基因突變而獲得，并且其可通過(guò)基因轉(zhuǎn)移 從環(huán)境中的抗性細(xì)菌中獲得。
在食物加工或農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用任何擁有或獲得性抗生素抗性的細(xì)菌 造成在消費(fèi)之前或之后的某點(diǎn)，抗性促進(jìn)基因向其它細(xì)菌轉(zhuǎn)移的潛在的理 論上的危險(xiǎn)，所述其它細(xì)菌存在于食物中、消費(fèi)食物之后人或動(dòng)物的胃腸
道(GIT)中、或環(huán)境中。此類細(xì)菌的例子可發(fā)現(xiàn)于雙歧桿菌種，例如， 動(dòng)物雙歧桿菌(^/MMfl"eW"附""/附"to)例如動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種(也 ;f爾為動(dòng)物雙歧桿菌專'L酸亞種(5,yM06flcte/7'w附flw/附fl//5 subsp. /""/s subsp. nov.)，從前稱為乳酸雙歧桿菌(5折^6""c/"/w/""/y),且有時(shí)本文也 這樣提及)。 一個(gè)此類菌種，動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種菌林NCC2818， CNCMI-3446是商業(yè)上可獲得的，已用作食品添加劑超過(guò)20年，并通常 被認(rèn)為是安全的。最近發(fā)現(xiàn)，與人和動(dòng)物來(lái)源的某些其它革蘭氏陰性和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌一樣，該細(xì)菌也有四環(huán)素抗性基因te,『存在。盡管四環(huán)素抗 性轉(zhuǎn)移在理論上是可能的，但目前即使是在實(shí)驗(yàn)室條件下仍不可能證實(shí)這 一點(diǎn)。然而，從克隆實(shí)驗(yàn)已知來(lái)自此菌林的W『在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中是有 活性的，盡管在革蘭氏陰性細(xì)菌中是無(wú)活性的。
然而，為排除該基因的任何意外轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，需要用于從此菌林中去 除該基因的方法。也需要具有對(duì)四環(huán)素降低的抗性的菌林變體。
發(fā)明簡(jiǎn)述
本發(fā)明的一個(gè)方面描述了雙歧桿菌細(xì)胞，所述細(xì)胞包含經(jīng)定制的從而 缺乏有效功能基因的基因組。在某些實(shí)施方案中，雙歧桿菌細(xì)胞是動(dòng)物雙 歧桿菌細(xì)胞，且更特別地，是動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種細(xì)胞。本文示例了動(dòng)
物雙歧桿菌乳酸亞種菌林NCC卯34。
在某些實(shí)施方案中，功能基因提供了抗生素抗性；例如，功能基因是 W『并提供對(duì)四環(huán)素的抗性。在多種實(shí)施方案中，經(jīng)定制的缺乏有效tetW 基因的雙歧桿菌細(xì)胞比含有有效tetW基因的相當(dāng)?shù)募?xì)胞對(duì)四環(huán)素更敏感 至少5-10倍。在其它實(shí)施方案中，如利用平板擴(kuò)散試驗(yàn)所測(cè)定的，細(xì)胞對(duì) 高于大約0.3微克每毫升的"環(huán)素濃度是敏感的。示例性實(shí)施方案的特征 是動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種菌林NCC9034，保藏為CNCMI-3664。定制的雙 歧桿菌細(xì)胞可基本上缺乏tetW基因的核酸序列。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，定 制的細(xì)胞在其基因組的剩余部分是基本上未改變的。
本發(fā)明的另一方面特征在于包含上述細(xì)胞的動(dòng)物雙歧桿菌。 本發(fā)明的另一方面特征在于產(chǎn)生缺乏有效的預(yù)定功能基因的雙歧桿 菌細(xì)胞的方法。該方法包括下述步驟(1)從雙歧桿菌中獲得預(yù)定功能基 因的上游和下游序列；(2 )用在雙歧桿菌中非復(fù)制的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化雙歧桿菌細(xì) 胞群體，所述質(zhì)粒包含該功能基因的上游和下游側(cè)翼序列和編碼選擇性標(biāo) 記的基因；(3)在允許含有編碼質(zhì)粒中選擇性標(biāo)記的基因的細(xì)胞生長(zhǎng)、但 那些不具有編碼選擇性標(biāo)記的基因的細(xì)胞不能生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)雙歧桿 菌細(xì)胞，從而選擇含有整合質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體；(4 )在非選擇性條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)
5化體，所述條件允許細(xì)胞的生長(zhǎng)但允許整合的質(zhì)粒丟失；(5)通過(guò)在具有 和不具有選擇壓力的平板上影印培養(yǎng)菌落并選擇那些對(duì)選擇壓力敏感的 菌落來(lái)選擇已失去所整合質(zhì)粒的細(xì)胞；和(6)確認(rèn)對(duì)選擇壓力敏感的細(xì)胞 不再具有所述功能基因的功能，從而產(chǎn)生出缺乏有效預(yù)定功能基因的雙歧 桿菌細(xì)胞。
在某些實(shí)施方案中，預(yù)定功能基因被缺失。功能基因可為提供對(duì)抗生 素增強(qiáng)的抗性的基因；例如，提供對(duì)四環(huán)素抗性的,w『基因。
在本文所述的某些實(shí)施方案中，缺失的或致使其失效的唯一功能基因 是預(yù)定的功能基因。
在多種實(shí)施方案中，選擇壓力是抗生素例如大觀霉素的存在。
在某些實(shí)施方案中，質(zhì)粒通過(guò)同源重組整合進(jìn)基因組。整合質(zhì)?？赏?過(guò)第二次同源重組而失去。
在前述方法的多種實(shí)施方案中，在非選擇性條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體至少大 約100代。
上述方法可在動(dòng)物雙歧桿菌種的雙歧桿菌細(xì)胞上實(shí)施，更特別地在動(dòng) 物雙歧桿菌乳酸亞種，且甚至更特別地動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種菌林 NCC2818細(xì)胞上實(shí)施。從對(duì)菌林NCC2818實(shí)施該方法所獲得的細(xì)胞通過(guò) 動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種菌林NCC9034來(lái)例證。
上述方法還可在長(zhǎng)雙歧桿菌/ortg"m)種的雙歧桿菌細(xì)胞上實(shí)施。
本發(fā)明的另一方面特征在于動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種細(xì)胞，如利用平板 擴(kuò)散試驗(yàn)所測(cè)定的，其對(duì)高于大約0.3微克每毫升的四環(huán)素濃度是敏感的。 在示例性實(shí)施方案中，動(dòng)物乳酸雙歧桿菌細(xì)胞是菌林NCC9034。
本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢(shì)將通過(guò)參考下列的發(fā)明詳述、附圖和實(shí)施例 而得到理解。
附圖簡(jiǎn)述


圖1. pMDY28的限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)圖譜，其顯示出大觀霉素 (spec)和氨芐青霉素(Amp)抗性標(biāo)記的位置。W『側(cè)翼序列插入Apal位點(diǎn)(堿基659 )和位于6840的Hindlll之間。質(zhì)粒不含有用于在雙歧桿 菌中復(fù)制的有效orZ。
圖2.上圖顯示了從兩個(gè)單獨(dú)的突變體(命名為A和B的泳道)獲得 的基因組DNA的Clal、 EcoRI、 Kpnl和Notl限制性片段的DNA印跡分 析。泳道C含有獲得自用于產(chǎn)生突變體的野生型菌林(NCC2818)的比較 片段。下圖顯示了在DNA印跡上觀察到的片段的大小，所述片段是獲得 自突變體(A&B)的與獲得自野生型菌林的那些。
圖3.如利用E-TEST檢測(cè)最小抑制濃度(MIC)所測(cè)定的，動(dòng)物雙 歧桿菌乳酸亞種菌抹NCC362 (野生型)(左圖，大約16 ng/ml四環(huán)素) 和NCC9034 (右圖，大約0.3 ng/ml四環(huán)素)對(duì)抗生素四環(huán)素的抗性。
圖4.NCC362 (上圖)和NCC9034 (下圖)菌林的W基因座圖譜，顯 示出后一菌林中W『基因的缺失。用于產(chǎn)生敲除突變體的W『側(cè)翼序列 顯示于兩圖中的陰影條形中。
圖5. pMDY24的限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)圖譜，顯示出氯霉素(Cm) 和氨節(jié)青霉素(Amp )抗性標(biāo)記的位置。5W7卵側(cè)翼序列插入EcoRI位點(diǎn) (堿基l)和位于5766的Sail之間。質(zhì)粒不含有用于在雙歧桿菌中復(fù)制的 有效o"'。
圖6. NCC2705 (上圖)和NCC9035(下圖)菌林的說(shuō)W卵基因座圖譜， 顯示出后一菌林中i5州/卵基因缺失。用于產(chǎn)生敲除突變體的5W/卵側(cè)翼 序列顯示于兩圖中的陰影條形中。
圖7.圖A顯示在第二次重組事件和在Bi^/M缺失方法的最后步驟中 質(zhì)粒解離后獲得的氯霉素敏感克隆的PCR分析。來(lái)自兩個(gè)菌落(第l&2 泳道)的PCR片段的大小表明5/W卵(3885bp)的缺失，然而來(lái)自IO個(gè)其 它菌落的PCR片段的大小表明5W/卵基因座的野生型構(gòu)型。圖B顯示了 取自兩個(gè)單獨(dú)的突變體(第l&2泳道)的基因組DNA的HindIII限制性 片段的DNA印跡分析。泳道3含有獲得自用于產(chǎn)生突變體的野生型菌抹 (NCC2705)的比較片段。下圖顯示了在DNA印跡上觀察到的片段的大 小，所述片段是獲得自突變體(1&2)的與獲得自野生型菌抹(3)的那些。失功能基因的通用策略的圖解。該策略是 用于本文所述的方法中以及實(shí)施例中策略的一個(gè)例子。簡(jiǎn)要地，將目的突 變區(qū)域(在此實(shí)施例中為突變的似『基因座)克隆進(jìn)大腸桿菌(E.coli) 質(zhì)粒中(A)并轉(zhuǎn)化至雙歧桿菌細(xì)胞中(B)。通過(guò)同源重組獲得質(zhì)粒向雙 歧桿菌基因組的整合，并通過(guò)在含有合適抗生素(在本實(shí)施例中為大觀霉 素)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基上平板接種細(xì)胞進(jìn)行選擇(C)。在無(wú)抗生素選擇下復(fù) 制細(xì)胞以便允許導(dǎo)致質(zhì)粒解離的第二次同源復(fù)制事件(D)且染色體區(qū)域 以如圖A中所^t粒相同的構(gòu)型突變。等位基因交換之后含有野生型基因 座區(qū)域的質(zhì)粒不能在雙歧桿菌中復(fù)制，并且在無(wú)抗生素選擇的培養(yǎng)基上培 養(yǎng)的細(xì)胞復(fù)制過(guò)程中被消除(E)。用合適的分子生物學(xué)技術(shù)例如PCR或 DNA印跡分析來(lái)檢查最終的突變細(xì)胞。
說(shuō)明性實(shí)施方案詳述 細(xì)月包和培養(yǎng)物
在本發(fā)明的幾方面的第一方面提供了雙歧桿菌細(xì)胞，例如來(lái)自動(dòng)物雙 歧桿菌或長(zhǎng)雙歧桿菌的那些，其包含定制的從而缺乏或基本缺乏有效的預(yù) 定功能基因的基因組。任何特定的預(yù)定基因的定向破壞或缺失都還未在雙 歧桿菌中完成。
在一項(xiàng)實(shí)施方案中，雙歧桿菌是來(lái)自食品或飼料加工或者飲食或藥物 補(bǔ)充物中所用菌林的細(xì)胞。合適的雙歧桿菌菌林包括但不限于動(dòng)物雙歧桿 菌和長(zhǎng)雙歧桿菌的菌林。另外合適的為分類或未分類的其它雙歧桿菌，其 被有意地添加至食品或飼料產(chǎn)品，或大量發(fā)現(xiàn)于食品或飼料產(chǎn)品中。其它 有用的雙歧桿菌種包括由于制造或生產(chǎn)食品或飼料、或通過(guò)其它商業(yè)過(guò) 程、或通過(guò)人或動(dòng)物對(duì)此類產(chǎn)品的消費(fèi)而釋放進(jìn)環(huán)境的任何細(xì)胞。雙歧桿 菌種還可以有意作為人類或動(dòng)物，包括人類嬰兒和動(dòng)物幼崽的補(bǔ)充物的多 種形式獲得，例如用來(lái)治療胃腸狀況例如腹瀉、或促進(jìn)健康的腸道微生物 區(qū)系。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，細(xì)胞是動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種細(xì)胞。
盡管所要破壞或缺失的基因可為任何功能基因(例如，為細(xì)胞編碼功
8能的任何基因)，在一項(xiàng)目前優(yōu)選的實(shí)施方案中，功能基因提供抗生素抗 性。在具體的實(shí)施方案中，基因是獲得性抗生素抗性基因，即，認(rèn)為基因 不是雙歧桿菌細(xì)胞中當(dāng)前發(fā)現(xiàn)的內(nèi)在基因，而認(rèn)為其為非外在的，例如來(lái) 自環(huán)境或另一生物。在另一實(shí)施方案中，功能基因編碼酶或酶抑制劑，例 如能夠負(fù)面影響食品加工或生物的其它目的特性(例如，促進(jìn)健康腸道微 生物區(qū)系)的抑制劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，多種此類抑制劑可由一種 或多種基因編碼。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，抑制劑是蛋白酶抑制劑。
在特別的實(shí)施方案中，基因產(chǎn)物提供了對(duì)四環(huán)素的抗性。在一項(xiàng)實(shí)施 方案中，功能基因是W『。已知W『基因分布相對(duì)廣泛。在一項(xiàng)實(shí)施方
案中，動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種菌林NCC2818目前優(yōu)選作為含有待缺失/W『 基因的細(xì)胞來(lái)源。W『基因座序列顯示于SEQIDNO:l中。
在某些實(shí)施方案中，野生型細(xì)胞與本發(fā)明的細(xì)胞即具有缺失基因的細(xì) 胞相比對(duì)更高濃度的抗生素有抗性。微生物細(xì)胞對(duì)特定抗生素的敏感性可 以多種方式進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定抗生素敏感性的一種方便的方法是利用平板擴(kuò) 散試驗(yàn)，例如E-試驗(yàn)(由ABBIODISK在商業(yè)上生產(chǎn))。E-試驗(yàn)系統(tǒng)使用在
確的最小抑制濃度(MIC)。
在目前優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙歧桿菌細(xì)胞具有^皮破壞的W釅 基因，但無(wú)其它功能基因缺失，且該細(xì)胞比含有有效W『基因的對(duì)照野生 型細(xì)胞對(duì)四環(huán)素更敏感至少5倍。在另一實(shí)施方案中，具有失效的tetW基 因的雙歧桿菌細(xì)胞比含有有效W『基因的對(duì)照細(xì)胞更敏感至少10倍。
在一項(xiàng)實(shí)施方案中，如用平板擴(kuò)散試驗(yàn)所測(cè)定的，具有失效的W『基 因的雙歧桿菌細(xì)胞對(duì)高于大約0.3pg每毫升的四環(huán)素濃度是敏感的。
如本文所用的，與基因組有關(guān)的術(shù)語(yǔ)"定制的，，表明該基因組已通過(guò)人 手進(jìn)行處理或修飾。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)缺失特定基因的整個(gè)基因座 來(lái)定制基因組。在其它定制的基因組中，調(diào)節(jié)序列中的缺失或突變可提供 預(yù)定基因功能性的完全或至少基本喪失。除了那些經(jīng)操作而喪失整個(gè)基因 座、基因或甚至編碼序列的基因組外，定制的基因組包括僅僅具有小的改變(包括插入或缺失)的那些，所述改變例如導(dǎo)致功能基因的功能喪失或 基本喪失的點(diǎn)突變或移碼突變。
盡管定制導(dǎo)致有效性的完全喪失是優(yōu)選的，但這也許不總是容易完成 的，并且有時(shí)某種活性的基本喪失將是有用的。如本文所用的"基本上喪失" 表明多于一半的功能活性喪失，即具有定制基因組的細(xì)胞具有由預(yù)定功能 基因所提供的功能屬性的一半以下。例如，當(dāng)與其所來(lái)源的親本細(xì)胞相比
較時(shí)，具有關(guān)于酶的定制基因組的細(xì)胞將具有該酶的低于50%的活性。備 選地，具有定制基因組的細(xì)胞可產(chǎn)生少于50%的與預(yù)定功能基因相關(guān)的基 因產(chǎn)物。本領(lǐng)域:汰術(shù)人員將理解，在處理某些功能活性中，具有少于50% 的特定功能基因的基因產(chǎn)物的細(xì)胞可能不總是喪失細(xì)胞中可測(cè)定活性的 50 % 。
優(yōu)選在定制的基因組中，在其本身編碼序列中至少有一個(gè)點(diǎn)突變或移 碼突變，以便阻止完整功能基因向與具有定制基因組的細(xì)胞鄰近的、或其 環(huán)境中的其它細(xì)胞轉(zhuǎn)移。因此，如本文所用的，"定制"需要有基因組的操 作，其中該操作針對(duì)預(yù)定功能基因有效性的喪失或基本喪失。
因此，在一項(xiàng)實(shí)施方案中，功能基因是完全缺失的、或至少部分缺失 的。該實(shí)施方案確保了沒(méi)有功能性抗生素抗性基因可不經(jīng)意地轉(zhuǎn)移至環(huán) 境、其它腸道樣i生物區(qū)系、或環(huán)境中的其它生物中，并且還確保了甚至沒(méi) 有一個(gè)破壞的基因可被轉(zhuǎn)移以僅通過(guò)下游事件而被恢復(fù)。因此，在優(yōu)選的 實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明此方面的雙歧桿菌細(xì)胞基本上缺乏W『基因的核 酸序列。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，編碼序列至少基本上缺失。備選地，與預(yù)定 功能基因相關(guān)的一個(gè)或更多編碼序列也可被缺失。例如功能基因的在細(xì)胞 中無(wú)其它功能的結(jié)合序列或調(diào)節(jié)序列可被缺失。在其它實(shí)施方案中，具有 定制基因組的細(xì)胞具有更精細(xì)的改變，例如導(dǎo)致預(yù)定基因的功能性喪失或 基本喪失的點(diǎn)突變或移碼突變，例如，定制的基因組的功能基因的有效性 降低。
另外在優(yōu)選的實(shí)施方案中，雙歧桿菌細(xì)胞在其基因組的剩余部分中是 基本上未改變的。換句話說(shuō)，除了喪失功能基因的有效性，并且優(yōu)選該功
10能基因完全或至少基本上從細(xì)胞缺失外，雙歧桿菌細(xì)胞與其來(lái)源的細(xì)胞 (例如親本細(xì)胞)是相同的，或接近相同的。在已經(jīng)經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間適應(yīng)從而 提供目的特性的菌抹或培養(yǎng)物的情況下，這是特別有用的，所述目的特性 對(duì)于例如食品加工，例如乳制品例如酸乳等的發(fā)酵是有用的。例如，在下
面更加詳細(xì)描述的一項(xiàng)實(shí)施方案中，其中動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種NCC2818 是起始(親本)細(xì)胞，W『是預(yù)定的功能基因的情況下，所獲得的細(xì)胞是 動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種NCC卯34，其定制的基因組與親本區(qū)別僅在于缺乏 預(yù)定的W『基因。如預(yù)期的，除了 NCC卯34細(xì)胞所展示出來(lái)的對(duì)四環(huán)素 增加的敏感性，細(xì)胞在表型上也是類似的。前述實(shí)施方案對(duì)用于幫助治療 臨床狀況的菌林也是有用的，特別是那些已經(jīng)選擇或開發(fā)而具有目的功能 例如快速的傳代時(shí)間或在腸道中延長(zhǎng)的停留時(shí)間的菌林。
在其幾個(gè)方面的另一方面，本發(fā)明提供了雙歧桿菌的培養(yǎng)物，其包含 具有缺失的、或至少失效的功能基因的細(xì)胞。此類培養(yǎng)物的用途無(wú)需詳細(xì) 討論，因?yàn)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員將理解它們。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，培養(yǎng)物包含 來(lái)源于已知培養(yǎng)物的細(xì)胞，該已知培養(yǎng)物經(jīng)發(fā)現(xiàn)或測(cè)定在其基因組中具有 不期望的功能基因。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，基因是外源獲得性基因，例如編 碼抗生素抗性的基因。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，基因是四環(huán)素抗性基因。在一 項(xiàng)特定的實(shí)施方案中，基因是似『基因，且在特別的實(shí)施方案中相關(guān)的 W『基因序列是SEQIDNO:1,中提供的序列。
制備細(xì)胞和培養(yǎng)物的方法
在另一方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)缺乏有效預(yù)定功能基因的雙歧桿菌細(xì) 胞的方法。該方法包含下述步驟
從雙歧桿菌中獲得預(yù)定功能基因的上游和下游序列；
用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化雙歧桿菌細(xì)胞群體，所述質(zhì)粒在雙歧桿菌中是非復(fù)制的且 包含所述功能基因的上游和下游側(cè)翼序列、以及編碼選擇性標(biāo)記的基因；
在僅允許含有編碼質(zhì)粒中選擇性標(biāo)記的基因的細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下培 養(yǎng)雙歧桿菌細(xì)胞，從而選擇已將質(zhì)粒整合進(jìn)染色體的功能基因的基因座上的轉(zhuǎn)化體；在非選擇性條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，所述條件允許細(xì)胞的生長(zhǎng)但允許整合質(zhì)粒的丟失；通過(guò)在具有和不具有選擇壓力的平板上影印培養(yǎng)菌落并選擇那些對(duì)選擇壓力敏感的菌落來(lái)選擇已失去所整合質(zhì)粒的細(xì)胞；確認(rèn)對(duì)選擇壓力敏感的細(xì)胞不再具有所述功能基因的功能，從而產(chǎn)生 缺乏有效預(yù)定功能基因的雙歧桿菌細(xì)胞。如上面對(duì)細(xì)胞和培養(yǎng)物的描述，優(yōu)選雙歧桿菌細(xì)胞來(lái)自食品或飼料加 工中所用的細(xì)胞，例如動(dòng)物雙歧桿菌或長(zhǎng)雙歧桿菌。考慮將其它雙歧桿菌 用于本文，例如那些用于人類或動(dòng)物臨床治療的、或其中預(yù)防所用的雙歧 桿菌。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，用作起始細(xì)胞的細(xì)胞是動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種。 在本文例證的某些實(shí)施方案中，動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種細(xì)胞是菌林 NCC2818 (商業(yè)上可以"BB12"獲得自Chr. Hansen )。缺失的基因可為任何功能基因(例如，為細(xì)胞編碼功能的任何基因)， 在一項(xiàng)目前優(yōu)選的實(shí)施方案中，功能基因提供抗生素抗性。在具體的實(shí)施 方案中，基因是獲得的抗生素抗性基因，即，認(rèn)為基因不是雙歧桿菌細(xì)胞 當(dāng)前發(fā)現(xiàn)內(nèi)在的，而認(rèn)為其為外在的，例如來(lái)自環(huán)境或另一生物。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，致使失效或缺失的基因編碼對(duì)四環(huán)素的抗性。在 一項(xiàng)實(shí)施方案中，功能基因是W^。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，W『基因具有如 SEQ ID NO:l所提供的序列，其代表了動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種NCC2818 中整個(gè)W『基因座。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，起始細(xì)胞是動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞 種細(xì)胞菌林NCC2818。這些細(xì)胞的樣品按照布達(dá)佩斯條約的規(guī)定已保藏于 巴斯德研究所的專利保藏機(jī)構(gòu)中。當(dāng)動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種NCC2818是 起始細(xì)胞時(shí)，W『是預(yù)定的功能基因，所獲得的細(xì)胞是動(dòng)物雙歧桿菌乳酸 亞種NCC卯34，其樣品也按照布達(dá)佩斯條約的規(guī)定已保藏于巴斯德研究所 的專利保藏機(jī)構(gòu)中。BIODISK)是檢測(cè)細(xì)胞對(duì)抗生素敏感性的優(yōu)選途徑。然而，所測(cè)定的抗生 素對(duì)特定生物的最小抑制濃度(MIC)是比較相對(duì)敏感性的便利途徑。在目前優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙歧桿菌細(xì)胞具有被破壞的或缺 失的似『基因，但沒(méi)有其它功能基因在其功能方面受到損失或破壞。在一 項(xiàng)實(shí)施方案中，由該方法產(chǎn)生的細(xì)胞比含有有效/W『基因的對(duì)照野生型細(xì) 胞對(duì)四環(huán)素更敏感至少5倍。更特別地，所獲得的雙歧桿菌細(xì)胞比含有有 效W『基因的對(duì)照細(xì)胞對(duì)四環(huán)素更敏感至少10倍。在其它實(shí)施方案中， 細(xì)胞比保留似W基因的對(duì)照細(xì)胞更敏感20、 30、 40或甚至50倍或更多倍。 在特定的實(shí)施方案中，如利用平板擴(kuò)散試驗(yàn)或E-TEST所測(cè)定的，所獲得 的雙歧桿菌細(xì)胞對(duì)高于大約0.3jig每毫升的四環(huán)素濃度敏感。如上所述，對(duì)于細(xì)胞和培養(yǎng)物，在一項(xiàng)實(shí)施方案中，功能基因被完全 缺失，或至少基本上缺失，使得沒(méi)有功能性抗生素抗性基因可不經(jīng)意地轉(zhuǎn) 移至環(huán)境、其它腸道^t生物、或環(huán)境中的其它生物中。類似地，甚至沒(méi)有 一個(gè)被>5皮壞的基因可轉(zhuǎn)移，因?yàn)榛旧纤械男蛄幸褟纳飦G失。因此， 在此類實(shí)施方案中，根據(jù)該方法制備所獲得的雙歧桿菌細(xì)胞基本上缺乏 似『基因的核酸序列。在多項(xiàng)實(shí)施方案中，編碼序列至少基本上缺失，且 甚至與預(yù)定功能基因相關(guān)的非編碼序列也被缺失。在目前優(yōu)選的實(shí)施方案中，除了缺失或致使失效的基因外，所獲得的 雙歧桿菌細(xì)胞基因組基本上未改變。優(yōu)選地，除了致使失效或缺失的功能 基因外，所獲得的雙歧桿菌細(xì)胞的基因組與其來(lái)源的細(xì)胞(桐如，親本細(xì) 胞)的是相同的或近乎相同的。因此，由本方法所產(chǎn)生的細(xì)胞將與其來(lái)源 的親本、野生型或原始型菌林具有基本上或甚至完全相同的功能或?qū)傩?(例如營(yíng)養(yǎng)需求、酶譜、生長(zhǎng)特性、風(fēng)味產(chǎn)生、和酸產(chǎn)生)。因此，如此 產(chǎn)生的細(xì)胞可用于產(chǎn)生有用的雙歧桿菌培養(yǎng)物，其包含具有缺失的、或至 少失效的功能基因的細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞來(lái)自已知培養(yǎng)物時(shí)這是特別正確的，其 中發(fā)現(xiàn)已知培養(yǎng)物在其基因組中具有不希望的功能基因，例如獲得的抗生 素抗性基因，例如四環(huán)素抗性基因，特別地W『基因。在本方法的一項(xiàng)實(shí)施方案中，質(zhì)粒編碼另外的選擇性標(biāo)記。在某些實(shí)13施方案中，選擇性標(biāo)記提供了抗生素抗性。在此類實(shí)施方案中，篩選整合 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體的選擇性條件包括以對(duì)應(yīng)于抗性標(biāo)記的抗生素形式的選擇 壓力。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，抗生素是大觀霉素，在另一實(shí)施方案中其為氯 霉素。在某些實(shí)施方案中，質(zhì)粒通過(guò)同源重組整合進(jìn)基因組，優(yōu)選地位于上游和/或下游側(cè)翼序列；發(fā)生交換事件，從而允許環(huán)形質(zhì)粒變?yōu)檎线M(jìn)雙歧 桿菌基因組。在另一實(shí)施方案中，整合的質(zhì)粒通過(guò)第二次同源重組事件而 丟失，優(yōu)選地伴隨著丟失全部或基本上全部的預(yù)定功能基因——例如，fe《『 基因座或其它靶向基因。如上所述，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，缺失或致使失效的唯一功能基因?yàn)?預(yù)定的功能基因。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，在非選擇條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體足夠的代數(shù)，從而允 許不需要的序列丟失，包括預(yù)定的功能基因。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，培養(yǎng)至 少100代將促進(jìn)此類丟失。提供下列實(shí)施例進(jìn)一步解釋本發(fā)明的這些或其它方面，并不應(yīng)理解為 將本發(fā)明限制至所舉例的內(nèi)容。實(shí)施例非復(fù)制性質(zhì)粒的構(gòu)建用下列引物對(duì)擴(kuò)增起始密碼子上游和其終止密碼子下游兩側(cè)的 大約3kb的DNA片段mdyl00: 5，- CGCACCGGGCCCCCTCACGCAAACTCTACG國(guó)3， (SEQ ID NO.:2);mdy98: 5，-TGTGGTGTATCACATGTGATTGTCCTCCCTTTA-3' (SEQ ID NO.:3)和mdy99: 5，-AGGACAATCACATGTGATACACCACAGCGAGG-3" (SEQ ID NO.:4)mdy89: 5，- CCGTCCAAGCTTTCTATCGCGAGATAATCAGC國(guó)3，) (SEQ ID NO.:5)。將獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物用作模板，利用引物mdy100和mdy89來(lái)進(jìn)行融合 PCR，其獲得含有通過(guò)tetW的起始和終止密碼子連接起來(lái)的tetW上游和 下游區(qū)域的DNA片段。通過(guò)HindIII和Apal在其末端消化DNA片段并將其克隆進(jìn)pJL74 (Ledeaux和Grossman, / 1995 Jan; 177(1):166-75.)中位于HindIII和Apal之間。所獲得的質(zhì)粒命名為pMDY28 (SEQ ID NO.:6)。 圖1提供了詳細(xì)的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)圖語(yǔ)。插入pJL74從而形成pMDY28 的DNA片段的序列得到驗(yàn)證并顯示與來(lái)自動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種 NCC2818染色體的序列相同。這表明在PCR介導(dǎo)的DNA擴(kuò)增過(guò)程中和 在隨后的DNA操作中均未引入突變。動(dòng)物雙歧桿菌的轉(zhuǎn)化和等位基因交換利用Argnani爭(zhēng)人1996 (Af/m^'o/og);;142:109-14.)所述的方法將質(zhì)粒 pMDY28轉(zhuǎn)化入動(dòng)物雙歧桿菌細(xì)胞中。將細(xì)胞置于每升含有100mg大觀 霉素的MRS平板上。厭氧選擇所獲得的specK轉(zhuǎn)化體。由于質(zhì)粒pMDY28 不能在動(dòng)物雙歧桿菌中復(fù)制，specR菌落最可能來(lái)自經(jīng)單次交換事件通過(guò)同 源重組而整合進(jìn)動(dòng)物雙歧桿菌基因組的質(zhì)粒。從前還未報(bào)道過(guò)非復(fù)制性質(zhì) 粒向雙歧桿菌細(xì)胞的成功轉(zhuǎn)化。在無(wú)抗生素選擇的MRS培養(yǎng)液中培養(yǎng)specR轉(zhuǎn)化體大約100代從而允 許質(zhì)粒丟失，并將單獨(dú)的菌落平板接種于MRS瓊脂培養(yǎng)基上。為了確保 質(zhì)粒已從動(dòng)物雙歧桿菌基因組中移除，通過(guò)在添加和不添加大觀霉素的 MRS瓊脂上影印培養(yǎng)測(cè)試單獨(dú)菌落的大觀霉素抗性的丟失。在所測(cè)試的750個(gè)菌落中，163個(gè)菌落是大觀霉素敏感的(21% )， 表明質(zhì)粒已通過(guò)第二次交換事件的發(fā)生從動(dòng)物雙歧桿菌染色體中切除。第二次此事件可導(dǎo)致兩種基因組構(gòu)型i)回復(fù)至帶有與野生型細(xì)胞相同的/W『基因座的野生型構(gòu)型，或者ii)缺失fef W。為了區(qū)別這兩種可能性，利用下列引物對(duì)通過(guò)直接菌落PCR測(cè)試了 上述163個(gè)大觀霉素敏感菌落中135個(gè)菌落的W『缺失mdy94: 5'-GAGCATGTATTCGGTGTCG-3， (SEQ ID NO.:7)和 mdy95: 5'-GATTTGCCCTATCGACTG-3， (SEQ ID NO.:8)。 在135個(gè)所測(cè)的菌落中，兩個(gè)產(chǎn)生了 1034bp的DNA條帶，表明似『 缺失，而其它獲得了與野生型細(xì)胞所獲得的相似的更高分子量(2949)的 PCR片段(見圖2，小圖B)。f"『缺失突變體的DNA印跡分析利用從經(jīng)PCR分析所鑒定的兩個(gè)候選突變體提取的基因組DNA，通 過(guò)PCR和DNA印跡分析證實(shí)了 te^F的缺失(見圖2，小圖A&B)。用 限制性酶(ClaI、 EcoRI或Notl)消化染色體DNA樣品。DNA印跡與來(lái)自 pMDY28的DNA雜交。DNA印跡雜交確認(rèn)W『已從兩個(gè)候選突變體的 基因組中缺失(泳道A&B)。僅保留了一個(gè)菌株，隨后將其命名為 NCC卯34。動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種菌株NCC9034相對(duì)于NCC2818的抗生素敏感性測(cè)試將動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種野生型菌林NCC2818的四環(huán)素敏感性與顯 示出缺失了基本上全部W『基因的衍生菌抹NCC卯34相比較。使用商業(yè) 化的E-TEST(AB BIODISK)測(cè)定每個(gè)菌株的四環(huán)素MIC。結(jié)果顯示于圖3中。盡管菌林NCC2818具有16 pg/ml的MIC， NCC卯34對(duì)四環(huán)素更加敏感，具有僅大約0.3照/ml的MIC。因此， NCC卯34比其親本野生型菌林NCC2818對(duì)四環(huán)素更敏感大約50倍。該 敏感表型與tetW基因功能性的喪失完全一致。如上面DNA印跡分析中所 看到的，這得到了基因分析的支持。16編碼蛋白酶抑制因子蛋白質(zhì)的長(zhǎng)雙歧桿菌基因(B10108)的缺失 非復(fù)制型質(zhì)粒的構(gòu)建
利用下列引物對(duì)擴(kuò)增B10108兩側(cè)大約3kb的DNA片段 mdy82: 5，國(guó)CGACCCAAGCTTGGATCGGCTCGTGCATCATTGC畫3， (SEQ ID NO.:9);
mdy83: 5，-GCAAACCGTACCTCAATACC -3， (SEQ ID NO.:IO)和 mdy84: 5'-CGACCCAAGCTTGCAGTCCGTCAATTAGGGTG-3" (SEQ ID NO. :11)
mdy85: 5，匿CGTTGCTGACGTTGCGGTTC-3，) (SEQ ID NO.:12)。
利用Ecorl和HindIII消化用mdy82和mdy83所獲得的PCR產(chǎn)物。 通過(guò)HindIII和Sail消化用mdy84和mdy85所獲得的PCR產(chǎn)物。
通過(guò)它們共同的HindIII限制性位點(diǎn)連接擴(kuò)增的DNA片段，并通過(guò)三 路連接將其克隆進(jìn)入pJH101(Ferrari， F.R.爭(zhēng)入，/ J ""en》/. (1983) 154:1513-1515)在EcoRI和Sail之間。將所獲得的質(zhì)粒命名為pMDY24 (SEQIDNO.:13)。 pMDY24詳細(xì)的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)圖在圖5中提供。
長(zhǎng)雙歧桿菌的轉(zhuǎn)化和等位基因交換
根據(jù)Argnani爭(zhēng)人1996 (Af/m^Zo/ogv;142:109-14)所述的方法將質(zhì)粒 pMDY24轉(zhuǎn)化進(jìn)長(zhǎng)雙歧桿菌NCC2705細(xì)胞中，只是在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中省去 蔗糖。將細(xì)胞涂布在含有每升3.5mg氯霉素的MRS平板上。厭氧選擇所 獲得的cmR轉(zhuǎn)化體。因?yàn)橘|(zhì)粒pMDY24在長(zhǎng)雙歧桿菌中不能復(fù)制，cmR 菌落最可能來(lái)自于經(jīng)單次交換事件通過(guò)同源重組整合進(jìn)長(zhǎng)雙歧桿菌基因 組的質(zhì)粒。
在將單獨(dú)的菌落平板接種于MRS瓊脂培養(yǎng)基之前，在無(wú)抗生素選擇 下培養(yǎng)cmR轉(zhuǎn)化體大約100代從而允許質(zhì)粒丟失。為確保質(zhì)粒已從長(zhǎng)雙歧 桿菌基因組中移除，通過(guò)在添加和不添加氯霉素的MRS瓊脂上影印培養(yǎng) 來(lái)測(cè)試個(gè)體菌落的氯霉素抗性的丟失。
在所測(cè)試的200個(gè)菌落中，22個(gè)菌落是氯霉素敏感的(11%)，表明質(zhì)粒已通過(guò)第二次交換事件的發(fā)生從長(zhǎng)雙歧桿菌染色體中切除。
第二次交換事件可導(dǎo)致兩種基因組構(gòu)型
i) 回復(fù)至帶有與野生型細(xì)胞相同的B10108基因座的野生型構(gòu)型，或
者
ii) 缺失B10108。
為了區(qū)別這兩種可能性，從22個(gè)氯霉素敏感菌落的12個(gè)中提取染色
體DNA。利用下列引物對(duì)通過(guò)PCR測(cè)試了染色體DNA中B10108的缺失
mdy27: 5，-TCGGAAGATCTCATGGTCAACGAGTTCGC-3， (SEQ ID NO.:14)和
mdy39: 5'畫TAGTACTAAGCTTCTTGAGCTCTTCCTTCTGC-3' (SEQ ID NO.:15)。
在所測(cè)的12個(gè)菌落中，兩個(gè)顯示出3885bp的PCR片段，表明B10108 的缺失(圖7，小圖A，泳道l-2)。測(cè)試的其它IO個(gè)菌落導(dǎo)致與野生型細(xì)胞 所獲得的片段相似的5311 bp的較大PCR片段(見圖7,小圖A，泳道 3-12)。
B10108缺失突變體的DNA印跡分析
利用從如上所述的經(jīng)PCR分析所鑒定的兩個(gè)候選突變體提取的基因 組DNA，通過(guò)PCR和DNA印跡分析證實(shí)了 B10108的缺失，并顯示于圖 7。用限制酶(EcoRI和HindIII)消化染色體DNA樣品。用來(lái)自pMDY24 的DNA與DNA印跡雜交。DNA印跡分析確認(rèn)B10108基因已從兩個(gè)候選 突變體的基因組中缺失(圖7，泳道A和B)。僅保留了一個(gè)菌林，隨后 將其命名為NCC卯35。
權(quán)利要求
1.雙歧桿菌細(xì)胞，其包含經(jīng)定制從而缺乏有效功能基因的基因組。
2. 權(quán)利要求l的雙歧桿菌細(xì)胞，其為動(dòng)物雙歧桿菌細(xì)胞。
3. 權(quán)利要求2的雙歧桿菌細(xì)胞，其為動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種細(xì)胞。
4. 權(quán)利要求1的雙歧桿菌細(xì)胞，其為動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種菌林NCC卯34。
5. 權(quán)利要求1的雙歧桿菌細(xì)胞,其中所述功能基因提供了抗生素抗性。
6. 權(quán)利要求5的雙歧桿菌細(xì)胞，其中所述功能基因是似『。
7. 權(quán)利要求6的雙歧桿菌細(xì)胞，其與含有有效如『基因的對(duì)照細(xì)胞相比對(duì)四環(huán)素更敏感至少5倍。
8. 權(quán)利要求7的雙歧桿菌細(xì)胞，其與舍有有效w『基因的對(duì)照細(xì)胞相比對(duì)四環(huán)素更敏感至少10倍。
9. 權(quán)利要求8的雙歧桿菌細(xì)胞，如利用平板擴(kuò)散試驗(yàn)所測(cè)定，其對(duì)高于大約0.3微克每毫升的四環(huán)素濃度敏感。
10. 權(quán)利要求9的雙歧桿菌細(xì)胞，其為動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種菌林NCC9034。
11. 權(quán)利要求1的雙歧桿菌細(xì)胞，其基本上缺少W『基因的核酸序列。
12. 權(quán)利要求1的雙歧桿菌細(xì)胞，其在其基因組的剩余部分中基本上未改變。
13. 動(dòng)物雙歧桿菌的培養(yǎng)物，其包舍權(quán)利要求12的細(xì)胞。
14. 生產(chǎn)缺乏有效預(yù)定功能基因的雙歧桿菌細(xì)胞的方法，其包括步驟從雙歧桿菌中獲得預(yù)定功能基因的上游和下游序列；用在雙歧桿菌中不復(fù)制的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化雙歧桿菌細(xì)胞群體，所述質(zhì)粒包含功能基因的上游和下游側(cè)翼序列和編碼選擇性標(biāo)記的基因；在允許含有編碼質(zhì)粒中選擇性標(biāo)記的基因的細(xì)胞生長(zhǎng)、但那些不具有編碼所述選擇性標(biāo)記的基因的細(xì)胞不能生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)所述雙歧桿菌細(xì)胞，從而選擇含有整合質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體；在非選擇性條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，所述條件允許細(xì)胞的生長(zhǎng)但允許整合質(zhì)粒的丟失；通過(guò)在具有和不具有選擇壓力的平板上影印培養(yǎng)菌落并選擇那些對(duì)選擇壓力敏感的菌落來(lái)選擇已失去所整合質(zhì)粒的細(xì)胞；確認(rèn)對(duì)選擇壓力敏感的細(xì)胞不再具有所述功能基因的功能，從而產(chǎn)生缺乏有效預(yù)定功能基因的雙歧桿菌細(xì)胞。
15. 權(quán)利要求14的方法，其中所述預(yù)定的功能基因被缺失。
16. 權(quán)利要求14的方法，其中所述功能基因賦予對(duì)抗生素增強(qiáng)的抗性。
17. 權(quán)利要求16的方法，其中所述抗生素是四環(huán)素。
18. 權(quán)利要求17的方法，其中所述功能基因是W『。
19. 權(quán)利要求14的方法，其中所述選擇壓力是抗生素的存在。
20. 權(quán)利要求19的方法，其中所述抗生素是大觀霉素。
21. 權(quán)利要求14的方法，其中所述質(zhì)粒通過(guò)同源重組整合進(jìn)基因組。
22. 權(quán)利要求21的方法，其中所述整合的質(zhì)粒通過(guò)第二次同源重組而丟失。
23. 權(quán)利要求15或21的方法，其中缺失或致使失效的唯一功能基因是所述預(yù)定的功能基因。
24. 權(quán)利要求14的方法，其中在非選擇條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體至少大約100代。
25. 權(quán)利要求14的方法，其中雙歧桿菌細(xì)胞是動(dòng)物雙歧桿菌細(xì)胞。
26. 權(quán)利要求14的方法，其中雙歧桿菌細(xì)胞是動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種細(xì)胞。
27. 權(quán)利要求14的方法，其中雙歧桿菌細(xì)胞是動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種NCC2818，且所獲得的細(xì)胞是動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種NCC9034。
28. 權(quán)利要求14的方法，其中雙歧桿菌細(xì)胞是長(zhǎng)雙歧桿菌細(xì)胞。
29. 動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種細(xì)胞，如利用平板擴(kuò)散試驗(yàn)所測(cè)定，其對(duì)高于0.3微克每毫升的四環(huán)素濃度敏感。
30. 權(quán)利要求30的動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種細(xì)胞，其為菌林NCC9034。
全文摘要
公開了包含經(jīng)定制從而缺乏有效功能基因的基因組的雙歧桿菌。還公開了制備此類細(xì)胞的方法。該方法用于制備雙歧桿菌細(xì)胞，其缺少某些功能性抗生素抗性基因，如tetW，并且對(duì)抗生素如四環(huán)素敏感。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101517076SQ200780033914
公開日2009年8月26日 申請(qǐng)日期2007年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月18日
發(fā)明者F·阿里戈尼, M·戴雷 申請(qǐng)人:雀巢產(chǎn)品技術(shù)援助有限公司