專利名稱：環(huán)狀甲基化dna中的定點誘變的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于分子生物學領域，具體涉及一種定點誘變的新方法。
背景技術：
在研究DNA序列改變對蛋白質功能的影響的領域，定點誘變是一種功 能強大的工具?？刹捎枚喾N方法進行定點誘變(見例如美國專利 6，391,548,7，132,265和6，713，285，包含在此作為參考)。聚合酶鏈反應(PCR) 作為循環(huán)擴增技術己被廣泛地應用于該領域，其中利用誘變引物引入所需 突變(見Allemandou et al., J Biomed Biotechnol S， 202-207， (2003); An et al" Appl Microbiol Biotechnol S 68， 774-778, (2005); Jeltsch et al" Methods Mol Biol S 182, 85-94 (2002); Hall, et al. Protein Eng. 4:601 (1991); Hemsley, et al. Nucleic Acids Research 17:6545-6551 (1989); Ho, et al. Gene 77:51-59 (1989); Hultman, et al. Nucleic Acids Research 18:5107-5112 (1990); Jones, et al. Nature 344:793-794 (1990); Jones, et al. Biotechniques 12:528-533 (1992); Landt， et al. Gene 96:125-128 (1990); Nassal, et al. Nucleic Acids Research 18:3077-3078 (1990); Nelson, et al. Analytical Biochemistry 180:147-151 (1989); Vallette, et al. Nucleic Acids Research 17:723-733 (1989); Watkins, et al. Biotechniques 15:700-704 (1993); Weiner， et al. Gene 126:35-41 (1993);和Yao， et al. PCR Methods and Applications 1:205-207 (1992)，包含在此作為參考)。
基于這種方法，通過PCR擴增后，選擇已突變的DNA并去除母鏈質 粒DNA是定點誘變技術的一個關鍵步驟，并且這個過程可以通過各種不同 的方式實現(xiàn)。目前最常用的方法包括1)在PCR反應時，用羥基甲基化dCTP 替換dCTP，然后利用限制性內(nèi)切酶消化僅僅去除非羥甲基化的母鏈DNA; 2) 同時突變質粒上的目的基因和抗生素抗性基因，從而使質粒獲得不同的抗 生素抗性，這種新的抗生素抗性便于選擇所需的突變;3 )引入所需突變后， 利用只切割甲基化DNA的限制性內(nèi)切酶Dpnl消化掉甲基化DNA模板，從 而保留了含有突變的非甲基化DNA; 4)利用另外的連接反應使已突變的 PCR產(chǎn)物環(huán)化，提高突變DNA的轉化效率。上述方法可以在以下專利中找到美國專利號6,673,610， 5,789,166， 5,780,270， 5,354,670和5,071,743， 包含在此作為參考。此外， 一些體內(nèi)和體外的定點誘變篩選方法也在一些 文獻中提及。例如，非擴增性體內(nèi)定點誘變方法，該方法是載體生長過程 中，將dUTP摻入到親代DNA鏈中，并通過dut+, ung+大腸桿菌進行篩選(見 Kunkel Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82:488-492 (1985))。其他的體外篩選突 變DNA鏈的方法包括l)單一限制性內(nèi)切酶位點的缺失(Deng， et al. Analytical Biochemistry 200:81-88 (1992)) ; 2)固相技術(即母鏈DNA吸附于 固相)(Hultman， et al. Nucleic Acids Research 18:5107-5112 (1990); ^Veiner, et al. Gene 126:35-41 (1993)); 3)甲基化堿基的摻入(Taylor et al. Nucleic Acids Research 13:8765-8785 (1985); Vandeyar, et al. Gene 65:129-133 (1988))等等。 所有參考文獻包含在此作為參考。
在上述所有的誘變方法中，把質粒轉化進大腸桿菌是擴增質粒的共同 方法，通常也是最后一個步驟。然而，為了便于篩選突變的DNA，所有這 些方法必須在PCR擴增之前或之后添加額外的步驟，諸如體外酶消化。目 前正在使用的各種不同類型的定點誘變方法都需要更多的額外步驟以完成 對突變DNA的篩選過程，因此需要花費更多的人力，物力和時間。

發(fā)明內(nèi)容
為了給研究人員提供省時省力高效率的定點誘變方法，本發(fā)明提供了 一種篩選突變DNA以及去除母鏈質粒DNA的新方法。該發(fā)明的方法比任 何現(xiàn)有的定點誘變方法更簡單，可以更有效率地應用在各種不同類型的定 點誘變中，例如取代突變，插入突變和缺失突變。
不受任何理論限制，本發(fā)明主要是基于甲基化DNA質粒轉化甲基化酶 缺陷大腸桿菌(例如，Dam和Dcm缺陷大腸桿菌(Dam-Dcm-))的效率極低的 現(xiàn)象。甲基化DNA在Dam-Dcm-大腸桿菌中的復制效率很低；相反，非甲 基化DNA在Dam-Dcm-大腸桿菌中具有非常高的復制效率，因而具有非常 高的轉化效率。
因此，本發(fā)明為將特定的目的定點突變引入靶環(huán)狀甲基化核酸提供了 一種簡便、有效的方法，其中包括
(a)利用DNA聚合酶、互補的誘變引物，非甲基化dNTP以及所選 待誘變的甲基化環(huán)狀核酸進行聚合酶鏈反應(PCR);(b) 用步驟(a)中生成的PCR產(chǎn)物轉化甲基化酶缺陷大腸桿菌菌 株，在這種甲基化酶缺陷的大腸桿菌菌株中突變的非甲基化核酸有效復制；
(c) 從所述大腸桿菌菌株中回收突變的非甲基化核酸。 本發(fā)明一個實施方案中，利用部分互補或完全互補引物對作為誘變引
物對，其中所述的引物對包含合意的突變諸如取代、插入或缺失，從而對 耙DNA序列進行定點誘變?nèi)〈?。所述的突變位于所述引物的互補或非互補 區(qū)。
在本發(fā)明方法中，用待誘變的環(huán)狀甲基化母鏈DNk分子作為利用誘變 引物對進行聚合酶鏈反應(PCR)的模板。PCR通過變性、退火和延伸的循環(huán) 利用非甲基化dNTP進行。然后將含有甲基化母鏈DNA模板和非甲基化突 變的子鏈DNA的PCR產(chǎn)物轉化進DNA甲基化酶缺陷的宿主細胞。通常選 擇Dam-Dcm-大腸桿菌作為甲基化酶缺陷的宿主細胞。因為甲基化母鏈 DNA在甲基化酶缺陷大腸桿菌中的復制效率極低，而非甲基化DNA子鏈 復制效率非常高，所以含有突變的非甲基化DNA子鏈得到充分富集。
本發(fā)明方法中的甲基化酶缺陷細胞可以是任何一種甲基化酶缺陷細 胞。優(yōu)選，所述甲基化酶是Dam和Dcm。
在本發(fā)明一個實施方案中，甲基化酶缺陷大腸桿菌中的甲基化酶缺陷 可以是瞬時性的。另一實施方案中，甲基化酶缺陷大腸桿菌中的甲基化酶 缺陷是永久性的。
另一實施方案中，所述的甲基化酶缺陷大腸桿菌中的甲基化酶缺陷是 可誘導的。另一實施方案中，所述的甲基化酶缺陷大腸桿菌中的甲基化酶 缺陷可以是非誘導性的。
本發(fā)明更加優(yōu)選的實施方案中，甲基化酶缺陷細胞是Dam和Dcm缺陷 的大腸桿菌，并且所述的缺陷可以是非誘導性和永久性的。
更加優(yōu)選的實施方案中，用于本發(fā)明方法中的甲基化酶缺陷大腸桿菌 是菌株ER2925或SK383。
本發(fā)明的一個實施方案中，所述環(huán)狀甲基化核酸在體外甲基化。
另一實施方案中，所述環(huán)狀甲基化核酸在體內(nèi)甲基化。
本發(fā)明另一實施方案中，步驟(a)中的引物對在5，端和域3'端互補。
另一實施方案中，步驟(a)中的引物完全互補。
一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明中步驟(a)中所述的DNA聚合酶是溫度穩(wěn)定性的。
本發(fā)明另一方面提供了一種將突變引入所選待誘變的DNA分子的試 劑盒。該試劑盒含有但不限于甲基化酶缺陷細胞，優(yōu)選甲基化酶缺陷的大 腸桿菌細胞。
本發(fā)明的詳細目的、方法及優(yōu)勢將在下面的發(fā)明內(nèi)容詳述、權利要求 書和附圖及其說明等部分中進一步詳述。


圖1.本發(fā)明的定點誘變方案的圖示
步驟(a)顯示利用親代甲基化質粒作為定點誘變的模板。虛線代表甲基 化修飾的鏈。步驟(b)顯示兩條用于引入突變的互補引物分別與模板DNA中 相對應的鏈退火。X代表合意的突變。已摻入突變的非甲基化子鏈DNA通 過聚合酶鏈反應合成。實線代表非甲基化鏈。步驟(c)顯示聚合酶鏈反應的 產(chǎn)物，其中含有甲基化、非甲基化和半甲基化的雙鏈DNA。步驟(d)顯示PCR 產(chǎn)物轉化甲基化酶缺陷大腸桿菌的結果。甲基化DNA和半甲基化DNA的 復制受到抑制；而非甲基化突變子鏈DNA有效復制，從而隨后得到富集。
圖2.兩個引物中誘變位點的選擇舉例
圖中X代表誘變位點。 一個X代表一個或多個取代、插入或缺失或其 組合。本圖解舉例說明了當利用兩個引物進行誘變時，誘變位點可以位于 引物對的互補區(qū)，也可以位于引物對的非互補區(qū)，但是誘變位點的選擇并 不局限于此。定點誘變的引物對可以在5 '端部分互補(A)或完全互補(B)， 也可以在3 '端部分互補(C),但互補的形式并不局限于上述3種情況。
圖3.不同的Dam-Dcm-大腸桿菌菌株獲得相似的誘變效率
3-核苷酸取代(引物1#和引物2#)以及l(fā)l-核苷酸缺失(引物7#: gtgtcaggcccttgaaaggaattccatcagagttgaatg
弓I物#8: cctttcaagggcctgacacttttcttgaagtctcttcttc)的誘變反應利用相應的弓| 物對進行，其中利用Fip2質粒作為模板并利用KOD HiFi DNA聚合酶。PCR 產(chǎn)物轉化入兩個大腸桿菌Dam-Dcm-菌株，ER2925和SK383，并測定誘變 效率。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供有效地將特定的定點突變引入耙環(huán)狀甲基化核酸的方法， 所述方法包括
(a)利用DNA聚合酶、互補的誘變引物，非甲基化dNTP以及所選待誘 變的環(huán)狀甲基化核酸進行聚合酶鏈反應(PCR);
(b訴步驟(a)中生成的PCR產(chǎn)物的混合物轉化甲基化酶缺陷大腸桿菌 菌株，在這種甲基化酶缺陷的大腸桿菌菌株中突變的非甲基化核酸有效復 制；
(c)從甲基化酶缺陷大腸桿菌菌株中回收突變的非甲基化核酸。 本發(fā)明術語"甲基化酶"是指DNA甲基轉移酶(MTases)，其功能是把 甲基從S-腺苷甲硫氨酸轉移到腺嘌呤或胞嘧啶殘基上。甲基化酶在原核生物 和真核生物中廣泛存在。當識別位點內(nèi)的特定堿基被甲基化時，切割可能 被阻斷或阻礙，所以在使用限制性內(nèi)切酶切割DNA時需要考慮到甲基化的 影響。
在原核生物中，限制/修飾體系可以保護宿主DNA不被相應的限制性內(nèi) 切酶裂解，其中甲基化酶常常被認為是限制/修飾體系中的一個要素。大多 數(shù)實驗室的大腸桿菌菌株含有三種位點特異性的DNA甲基化酶。 一種DNA 甲基化酶由&m基因編碼(Dam甲基化酶)，功能是把甲基轉移到GATC序列 中的腺苷酸的N6位上(Marinus, et al. J. Bacteriol. 114， 1143-1150 (1973); Geier， et al. J. Biol. Chem. 254, 1408—1413 (1979))。另一種DNA甲基化酶是 Dcm甲基化酶，由dcm基因編碼，可以甲基化CCAGG和CCTGG序列中的 內(nèi)部胞嘧啶殘基的C5位點(Marinus， et al. J. Bacteriol. 114， 1143—1150 (1973); May, et al. J. Bacteriol. 123,768-770 (1975))。還有一種甲基化酶被稱為EcoKI 甲基化酶(M.EcoKI),功能是對AAC(N6)GTGC和GCAC(N6)GTT序列中的 腺嘌呤核苷酸進行修飾。如果甲基化識別位點與內(nèi)切酶識別位點重疊，從 表達Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶的菌株中分離提取出來的DNA中的部分 或全部的限制性內(nèi)切酶位點均可為切割抗性的。
幾乎所有實驗室應用的大腸桿菌菌株都為Dam+Dcm+，而且大部分大腸 桿菌菌株是]VrEcoKI。
本發(fā)明中應用的術語"定點誘變"是指在DNA分子序列中某一特定的 位點產(chǎn)生突變的過程。所述特定位點的選擇根據(jù)實驗研究中的需要而決定。 用于定點誘變的DNA分子通常是指環(huán)狀DNA分子如質粒等。一般情況下，定點誘變要求待突變基因的野生型的序列是已知的。這種突變技術也被稱 為"位點特異性誘變"或"寡核苷酸定向誘變"。
因此，"定點突變"是指利用定點誘變技術在DNA分子序列上某特定
位點產(chǎn)生的突變。該突變的位置根據(jù)不同的需要而確定。
本發(fā)明中使用的"甲基化酶缺陷大腸桿菌"指的是其中DNA甲基化酶 功能缺陷的大腸桿菌。這種DNA甲基化酶功能缺陷的原因是DNA甲基化 酶基因由于各種因素所導致的DNA甲基化酶基因的RNA轉錄水平降低和/ 或甲基化酶活性在蛋白質水平上的降低。甲基化酶缺陷是可誘導的，或者 不可誘導的；可以是瞬時性的缺陷，或是永久性的缺陷，又或者任何上述 的組合(見下文)。DNA在甲基化酶缺陷大腸桿菌內(nèi)合成時不能被有效地甲 基化，而在非甲基化酶缺陷大腸桿菌中可以被甲基化。
本發(fā)明的每一個實施方案中，本發(fā)明使用的方法利用甲基化酶缺陷大 腸桿菌作為一種篩選工具，有效地去除甲基化DNA母鏈，而突變的非甲基 化DNA子鏈被特異地富集。本發(fā)明方法省時省力即可實現(xiàn)合意的誘變，減 少了不必要的時間和實驗花費。因此，本發(fā)明具有以下優(yōu)勢(l)廣泛的兼 容性(2)高誘變效率，和(3)簡單性。
每一個實施方案中，本發(fā)明使用的方法涉及到利用甲基化DNA作為突 變的靶。 一些實施方案中，本發(fā)明的甲基化DNA在體外獲得。 一些實施方 案中，本發(fā)明的甲基化DNA在體內(nèi)獲得。另外的實施方案中，本發(fā)明的甲 基化DNA是在體外和體內(nèi)獲得的DNA分子的組合。例如，DNA的體外甲 基化可通過體外甲基化酶反應或者在體外合成的過程中摻入甲基化的 dNTP來實現(xiàn)。體內(nèi)DNA的甲基化也可以輕松地實現(xiàn)，例如在內(nèi)源性表達 甲基化酶的真核細胞或原核細胞優(yōu)選大腸桿菌細胞中進行DNA復制。本發(fā) 明的一些實施方案中，利用實驗室常見的大腸桿菌菌株產(chǎn)生甲基化DNA， 所述大腸桿菌菌株例如但不限于含有甲基化酶Dam和Dcm的DH5 a ， ToplO ， XL1-Blue等，其中的甲基化酶Dam和Dcm可以把甲基轉移到腺 嘌呤或胞嘧啶殘基。眾所周知，甲基化酶Dam和Dcm是廣泛存在于原核生 物中的兩種主要的DNA甲基化酶。它們通常被鑒定為限制/修飾系統(tǒng)中的 基本元素，可以保護宿主DNA不被體內(nèi)限制性內(nèi)切酶所切割。目前已知幾 kb長度的DNA中包含了大量的Dam甲基化位點(平均256個堿基有1個) 或Dcm甲基化位點(平均512個堿基有1個)，其中許多位點能夠被大腸桿菌中表達的Dam和Dcm甲基化酶所甲基化。此外， 一些實施方案中，本發(fā) 明的方法中所應用的靶誘變DNA序列是雙鏈的；其他實施方案中，所述靶 誘變DNA序列是單鏈的。
一些實施方案中，本發(fā)明的突變可以是目的DNA序列中的一或多個取 代，也可以是插入或缺失。 一些其他實施方案中，所述的突變可為更復雜 的突變，包括一種以上類型的突變組合。 一些實施方案中，所述的突變包 括所有三種類型取代、插入和缺失。本發(fā)明的方法利用兩種或兩種以上 的引物引入突變。優(yōu)選使用兩個引物。這兩個引物在5'端和/或3'末端序列 部分互補或完全互補。所要摻入的突變位于一條或兩個引物中，可以位于 兩引物的互補區(qū)，也可以位于非互補區(qū)(圖2)。 一個優(yōu)選實施方案中，如果 利用兩個部分互補的引物，所述突變位于兩個引物的互補區(qū)中。另一優(yōu)選 實施方案中，如果利用兩個部分互補的一物，所述突變位于一或兩個引物 的非互補區(qū)。另一優(yōu)選實施方案中，如果利用兩個完全互補的引物，所述 突變位于兩個引物的中間區(qū)域。
本發(fā)明方法中使用的引物可為化學合成的引物，其可以商購獲得。優(yōu) 選，利用非甲基化dNTP合成所述引物。本發(fā)明方法對引物純化度的要求與 普通的PCR反應相同， 一般來說，引物的脫鹽柱純化就可以滿足反應條件。 而且沒有必要使引物5'端磷酸化。
本發(fā)明中通常的引物長度一般為20個核苷酸到50個核苷酸，通常在 25個核苷酸到45個核苷酸之間。如果是插入突變，引物長度可能會長于 50個核苷酸。兩個引物互補區(qū)的長度通常在10個核苷酸到50個核苷酸左 右。設計引物對的方法是本領域已知的。
在本發(fā)明中,最初步驟一般是誘變引物對與靶核酸鏈雜交，為了使誘變 引物對與目的DNA序列充分退火，需要進行充分的變性反應。模板甲基化 DNA的充分變性很容易實現(xiàn)，例如，可以加熱變性或者化學變性。優(yōu)選， 甲基化的模板DNA加熱到94。C至98。C，持續(xù)30分鐘或以下。更優(yōu)選，模 板甲基化DNA在98°C加熱30分鐘。本領域已知，充分變性的兩個目的是 l)使雙鏈模板完全變性，使引物對與模板鏈充分退火;2)降低模板DNA的轉 化效率，最終增加本發(fā)明方法的誘變率。
變性后，利用非甲基化dNTP進行聚合酶鏈反應。在本發(fā)明的所有實施 方案中，誘變引物與甲基化DNA模板的相應鏈退火，然后延伸引物，合成兩條含有突變的新子鏈DNA。產(chǎn)生雜合的半甲基化雙鏈DNA形式，這種 半甲基化雙鏈DNA包括一條甲基化的模板DNA鏈和一條非甲基化的子鏈。 本發(fā)明方法中使用非甲基化dNTP以確保子鏈DNA為非甲基化形式。在隨 后的PCR反應循環(huán)中，a)引物可以和上一次PCR循環(huán)反應中合成的相應子 鏈退火，形成雙鏈DNA分子，進入下一次PCR循環(huán)反應繼續(xù)擴增；和/或 b)兩條互補的子鏈退火，直接形成雙鏈DNA分子。在本發(fā)明一個實施方案 中，應用5'端部分互補的兩個引物進行聚合酶鏈反應，反應得到的突變雙 鏈DNA分子分別來源于上述的a)和b)。另一實施方案中，應用完全互補的 引物進行聚合酶鏈反應，反應得到的突變雙鏈DNA分子僅僅來源于b)。在 這種情況下，PCR的產(chǎn)量不會成倍增加，因為子鏈DNA單鏈不能作為其互 補引物的模板進行下一周期的循環(huán)反應。優(yōu)選PCR的循環(huán)數(shù)不超過30個循 環(huán)，更優(yōu)選不超過20個循環(huán)。通常復雜突變諸如長核苷酸取代和/或插入和 /或缺失需要更多個PCR循環(huán)。具體的PCR循環(huán)數(shù)要根據(jù)不同突變反應中 模板的濃度、引物退火的溫度、鹽離子的濃度和DNA聚合酶的擴增效率而 決定。最少循環(huán)數(shù)是能夠合成足夠的非甲基化突變雙鏈DNA分子的循環(huán) 數(shù)，從而使DNA聚合醇所引發(fā)的隨機突變機率減少到最低。
本發(fā)明的實施方案中所使用的DNA聚合酶可以是溫度穩(wěn)定型的，也可 以是非溫度穩(wěn)定型的。 一個優(yōu)選實施方案中，所述DNA聚合酶是溫度穩(wěn)定 型聚合酶。另一優(yōu)選實施方案中，所述DNA聚合酶是高保真 (high-fidelity)DNA聚合酶，以減少DNA聚合酶所引發(fā)的隨機突變機率。適 用于本發(fā)明的示例性DNA聚合酶包括但不僅限于Taq聚合酶、pfii聚合酶、 pfk聚合酶、KOD聚合酶等。在本發(fā)明中，不同DNA聚合酶可以混合使用， 這種混合的DNA聚合酶可能是不同種類的DNA聚合酶混合物，也可能是 同一種類DNA聚合酶的野生型和其功能突變體的混合物。例如， 一個實施 方案中，DNA聚合酶的混合物包括兩種不同的聚合酶， 一種DNA聚合酶 有5'-3'外切酶活性，另一種缺乏5'-3'外切酶活性。另一實施方案中，聚合酶 的混合物包含同種聚合酶野生型和突變體，其中一種有5'- 3'外切酶活性， 而另一種沒有。如何使用聚合酶混合物的說明可以在美國專利5436149中 找到，也可參考以下文獻(Cheng et al., Proc. Natl. Aca. Sci. USA 91:5695-9 (1994)和Barnes Proc. Natl. Aca. Sci. USA 91:2216-2220 (1994》。
本發(fā)明中，PCR產(chǎn)物是雙鏈DNA混合物，其中包括l)兩條鏈都是甲基化母鏈DNA(非突變的)；2)—條鏈是甲基化母鏈DNA(非突變的)，另一條是 非甲基化子鏈DNA(突變的);3)兩條鏈都是非甲基化子鏈DNA(突變的)。PCR 產(chǎn)物不需要進行任何純化以及酶消化等處理，直接轉化感受態(tài)細胞，從而 使突變的DNA分子得以富集和回收。 一個實施方案中，本發(fā)明中被轉化的 細胞優(yōu)選為大腸桿菌細胞為甲基化酶缺陷細胞。在這種甲基化酶缺陷細胞 中，甲基化和半甲基化的DNA分子不能有效地復制，導致轉化效率極低； 而非甲基化DNA分子在甲基化酶缺陷細胞中復制效率非常高，極大地提高 了轉化效率。已經(jīng)有文獻證明，半甲基化DNA質粒的甲基化位點使復制的 初始階段受到抑制(Russell， D.W. and Zinder, N,D. (1987) Cell 50, 1071-1079)。因此，甲基化DNA在甲基化酶缺陷大腸桿菌細胞中第一輪復制 結束后成為半甲基化DNA，而其進一步的復制被抑制。通過轉化甲基化酶 缺陷細胞，PCR產(chǎn)物中只有上述3)的DNA分子得到復制和富集，而上述l) 和2)中的DNA分子的復制受到抑制，從而不能被富集。
為了區(qū)分含有兩條鏈都是非甲基化子鏈DNA(所需的DNA)的細胞和含 有的兩條鏈都不是或僅一條鏈是非甲基化子鏈DNA(不需要的DNA)的細胞 以及不含有任何相關鏈的細胞，本發(fā)明的一個實施方案中應用了一種選擇 性標記，在DNA模板中把表達該選擇性標記的基因與待誘變的基因連接。 一個優(yōu)選實施方案中，選擇性標記通常為抗生素抗性基因，例如，氨芐青 霉素耐藥性基因，卡那霉素耐藥性基因，四環(huán)素耐藥性基因，氯霉素耐藥 性基因等。這些抗生素抗性基因在聚合酶鏈反應中被完整地合成入子鏈 DNA。將上述聚合酶鏈反應產(chǎn)物轉化入甲基化酶缺陷大腸桿菌后，那些不 能復制的DNA分子就不能使所轉化的甲基化酶缺陷大腸桿菌獲得充分的抗 生素抗性，因此含有不需要的DNA的大腸桿菌細胞不能形成菌落。與此相 反，只有那些含有需要的DNA分子的細胞才能形成菌落，因為所述需要的 DNA分子可以在甲基化酶缺陷細胞中有效復制，抗生素抗性得以傳遞給下 一代細胞，進而形成菌落。因此在本發(fā)明的方法中轉化功能不僅僅意味著 轉化本身，而且也是選擇和富集突變DNA。
大腸桿菌中的甲基化酶包括，但不僅限于，dam甲基化酶，dcm甲基 化酶等。細胞中可以同時有一種或多種甲基化酶缺陷。 一個實施方案中， 同時缺乏dam和dcm(Dam-Dcm-)。適宜Dam-Dcm-大腸桿菌菌株的例子包 括，但并不僅限于，ER2925, SK383， JM110，和GM1915等。本發(fā)明中，甲基化酶缺陷可以是永久性的，也可以是瞬時性的。永久 性甲基化酶缺陷可以通過如下方法破壞大腸桿菌的基因組而獲得，所述方 法例如，但不僅限于，甲基化酶基因的缺失和/或敲除；在甲基化酶基因內(nèi) 部或其周圍取代和/或插入一段核苷酸，從而使甲基化酶基因的表達受到抑 制或產(chǎn)生移碼突變；構成性表達甲基化酶抑制劑，使其活性受到抑制；構 成性表達一種特異性降解甲基化酶的蛋白酶；構成性表達甲基化酶的抗體 從而中和甲基化酶的活性等等。瞬時性甲基化酶缺陷是指在某一特定的時 間段細胞表現(xiàn)為甲基化酶缺陷。瞬時性甲基化酶缺陷可以通過下述方法獲 得，但不僅限于，例如，甲基化酶在基因轉錄或蛋白質翻譯過程中受到瞬 時抑制；通過瞬時的方法使甲基化酶瞬時性失活，例如快速降解、使其快 速飽和、瞬時性中和、瞬時性分隔或聚集。瞬時性甲基化酶缺陷的時間應 該足夠長，使得所需DNA分子得到充分的富集同時抑制不需要的DNA。
在本發(fā)明的一些其他實施方案中，甲基化酶缺陷可以是非誘導性的， 也可以是誘導性的。對于涉及誘導性甲基化酶缺陷的實施方案中，甲基化 酶缺陷是通過以下方式實現(xiàn)的(但不僅限于下述方法)，例如，化學試劑誘導、 藥物誘導、蛋白質表達誘導等。本發(fā)明的一些實施方案中，甲基化酶缺陷 可以是非誘導性、誘導性、永久性、瞬時性的各種不同類型的組合。因此， 本發(fā)明的一些實施方案中，甲基化酶缺陷可以是非誘導性永久性缺陷、誘 導性永久性缺陷、非誘導性瞬時性缺陷和誘導性瞬時性缺陷。上述這些技 術已經(jīng)被普通的實驗室工作人員所掌握。目前廣泛使用的Dam-Dcm-大腸桿 菌菌株，如ER2925， SK383屬于非誘導性永久性甲基化酶缺陷。
上述方法主要描述了雙鏈DNA分子作為誘變的靶標。本領域技術人員 可容易地將本發(fā)明方法應用于向單鏈環(huán)狀甲基化DNA中引入突變。在本發(fā) 明的實施方案中，如果應用單鏈環(huán)狀DNA作為誘變的靶標，所需要的引物 仍然是如上所述的兩個部分互補或完全互補的引物，方法與前面所述的相 同。
本發(fā)明另一個方面是提供了一種用于進行本發(fā)明的定點誘變方法的試 劑盒。該試劑盒可能包含一些應用本發(fā)明方法進行定點誘變時所必要的試 劑和手冊。例如，在本發(fā)明的一個實施方案中，該試劑盒至少要包含甲 基化酶缺陷的大腸桿菌細胞、對照引物及對照模板。而在本發(fā)明的另一個 實施方案中，該試劑盒可能包含甲基化酶缺陷大腸桿菌感受態(tài)細胞、DNA聚合酶、三磷酸核苷酸、甲基化酶、濃縮的反應緩沖液等。本發(fā)明優(yōu)選的
試劑盒包括DNA聚合酶、甲基化酶缺陷大腸桿菌感受態(tài)細胞、對照引物對
及對照模板、三磷酸核苷酸、濃縮的反應緩沖液。
本發(fā)明方法的一個優(yōu)勢就是該方法的簡單性。即在產(chǎn)生突變的鏈后不 需要額外的篩選步驟，而目前所應用的大多數(shù)定點誘變方法都需要一個關
鍵的步驟，例如，特異性消化非突變的母鏈DNA分子。在本發(fā)明方法中， 進行宿主細胞轉化的同時，該步驟還具有篩選和回收突變子鏈DNA分子的 功能。不同的甲基化狀態(tài)使得非突變的母鏈DNA分子和突變的子鏈DNA 分子在甲基化酶缺陷細胞中通過不同的轉化效率和復制能力而區(qū)分開來。 本發(fā)明利用甲基化酶缺陷細胞作為一種選擇性的工具來有效地去除甲基化 母鏈DNA，而突變的非甲基化子鏈DNA被特異性富集。因此，篩選和回 收步驟被整合到單一的轉化步驟中，這一特點成為本發(fā)明中最顯著的優(yōu)勢。 本發(fā)明的另一個優(yōu)勢在于本發(fā)明廣泛地兼容于大多數(shù)常見的克隆系 統(tǒng)。大多數(shù)實驗室復制擴增質粒DNA所使用細胞是內(nèi)源性表達甲基化酶的 細胞。因此，大多數(shù)實驗室所擴增的質粒DNA不用經(jīng)過任何體外甲基化處 理就可以作為本發(fā)明方法中的DNA分子模板進行定點誘變。大多數(shù)細胞都 適用于環(huán)狀待誘變DNA分子的體內(nèi)甲基化，其中大腸桿菌細胞是優(yōu)選的。 另外，環(huán)狀待誘變DNA分子也可以在體外通過甲基化酶催化進行甲基化反 應而成為甲基化環(huán)狀DNA分子。
實施例
下面所闡述的實施例子在此僅僅為本發(fā)明提供了一個更清晰的理解方 式，并不意味著本發(fā)明僅僅局限于某一方面。
下述實例的目的是對被克隆到編碼卡那霉素耐藥性的質粒中的Fip2基 因進行定點誘變。質粒的長度為5kb，在大腸桿菌DH5d中復制并被純化。 DH5a組成性表達甲基化酶，使得所述的質粒在體內(nèi)甲基化，純化的質粒 可以直接作為本發(fā)明方法中的模板。
實施例1:
在Fip2定點誘變的方法中使用部分互補引物，其中誘變位點位于其中 一個引物的非互補區(qū)，所述方法步驟如下1)合成兩個在5'端部分互補的引物，其中所述突變在非互補區(qū)中，用于引入
3個核苷酸的取代，從而產(chǎn)生了 EcoRV酶切位點(大寫字母代表3個核苷酸的取代突變，粗體代表正向和反向引物的互補區(qū))
弓l物l: 5'-cccttgaaaggaaaaattctg GaTAtccatcagag-3'， 禾口
弓I物2: 5'誦cagaatttttcctttcaagggcctgacacttttc-3';
2) 制備反應溶液
2.5 U 1 10x反應緩沖液(BD Biosciences)10ng Fip2質粒(GM Biosciences, Inc)0.5iU引物1 (20y M)0.5 iU引物2(20uM)
1 U 1 10mM dNTP(每種dNTP 2.5 mM)(BD Biosciences)
補加雙蒸水使最終的反應體積達到25 y 1;
3) 在98。C在PCR儀(PTC-200 thermocycler， Bio-Rad，)中保溫步驟2)制備的反應溶液30分鐘，并在95。C保溫5分鐘使模板變性，當95。C 5min的步驟開始時，進入下一步；
4) 步驟95°C 5min開始時加入0.5單位KOD HiFi DNA聚合酶(BDBiosciences)到反應體系中，其中在加入聚合酶的過程中將試管一直保持在PCR儀中；
5)按照94。C 30sec, 60°C 15sec, 72°C 50sec進行25個循環(huán)的聚合酶鏈反
應；
6)把PCR產(chǎn)物轉化進大腸桿菌ER2925(New England Biolabs)中，其中ER2925為Dam-Dcm-菌株，步驟如下
a) 50u 1 ER2925感受態(tài)細胞在冰上緩慢融化；
b) 向步驟5的感受態(tài)細胞中加入2.5 U 1PCR產(chǎn)物，渦旋數(shù)次輕柔地混勻，冰上保溫所得混合物5分鐘；
c) 轉化反應在42。C熱休克30秒，冰上保溫2分鐘；
d) 向轉化體系中加入250ulSOC培養(yǎng)液，37。C振搖l小時；禾口
e) 將整個反應液鋪于含有卡那霉素(500ng/mL)的LB平板上，37。C培養(yǎng)過夜。
誘變的效率由小量制備的生長的集落經(jīng)EcoRV酶切的結果決定。預期的誘變效率為大約80%。實施例2:
在Fip2定點誘變的方法中使用部分互補的誘變引物，誘變位點位于兩個引物的互補區(qū)，所述方法步驟如下
l)合成兩個在5'端部分互補的引物，其中所述突變在互補區(qū)用于引入3個核
苷酸的取代，從而產(chǎn)生了 EcoRV酶切位點(大寫字母代表3個核苷酸的取代
突變，粗體代表正向和反向引物的互補區(qū))取代取代
弓l物3: 5'-ggaaaaattctgGaTAtccatcagagttgaatgaaaag-3'，國禾口弓I物4: 5'-ctctgatggaTAtCcagaatttttcctttcaagggc-3';
2) 制備反應溶液
2.5 lU 10x反應緩沖液(BD Biosciences)10ng Fip2質粒(GM Biosciences, Inc)0.5ul弓l物1 (20 y M)0.5ul引物2(20 yM)
1 y 1 lOmM dNTP(每種dNTP 2.5 mM)(BD Biosciences)
補加雙蒸水使最終的反應體積達到25 u 1;
3) 在98。C在PCR儀(PTC-200 thermocycler， Bio-Rad,)中保溫步驟2)制備的反應溶液30分鐘，并在95。C保溫5分鐘使模板變性，當95。C 5min的步驟開始時，進入下一步；
4) 步驟95°C 5min開始時加入0.5單位KOD HiFi DNA聚合酶(BDBiosciences)到反應體系中，其中在加入聚合酶的過程中將試管一直保持在PCR儀中；
5)按照94°C 30sec， 60 。C 15sec， 72 °C 50sec進行18個循環(huán)的聚合酶鏈反
應；
6)把PCR產(chǎn)物轉化進大腸桿菌ER2925(New England Biolabs)中，其中ER2925為Dam-Dcm-菌株，步驟如下
a) 50 U 1 ER2925感受態(tài)細胞在冰上緩慢融化；
b) 向步驟5的感受態(tài)細胞中加入2.5 n 1 PCR產(chǎn)物，渦旋數(shù)次輕柔地混勻，冰上保溫所得混合物5分鐘；
c) 轉化反應在42。C熱休克30秒，冰上保溫2分鐘；
d) 向轉化體系中加入250ulSOC培養(yǎng)液，37。C振搖l小時；和e)將整個反應液鋪于含有卡那霉素(500ng/mL)的LB平板上，37。C培養(yǎng)過夜。
誘變的效率由小量制備的生長的集落經(jīng)EcoRV酶切的結果決定。預期的誘變效率為大約80%。
實施例3:
根據(jù)本發(fā)明的方法步驟，用兩個完全互補的引物誘變Fip2，步驟如下
1) 合成兩個完全互補的引物，其中突變用于引入1個核苷酸的取代(大
寫字母)
弓l物5: 5'-gagctcctgaccgCgaaccaccagctgaaag-3'，禾口弓I物6: 5'-ctttcagctggtggttcGcggtcaggagctc畫3';
2) 制備反應溶液
2.5 ti 1 10x反應緩沖液(BD Biosciences)lOng Fip2質粒(GM Biosciences, Inc)0.5 ul弓l物1(20 yM)0.5 ul引物2(20 uM)
1 ii 110mM dNTP(每種dNTP 2.5 mM)(BD Biosciences)
補加雙蒸水使最終的反應體積達到25 P 1;
3) 在98。C在PCR儀(PTC-200 thermocycler， Bio-Rad,)中保溫步驟2)制備的反應溶液30分鐘，并在95。C保溫5分鐘使模板變性，當95。C 5min的步驟開始時，進入下一步；
4) 步驟95°C 5min開始時加入0.5單位KOD HiFi DNA聚合酶(BDBiosciences)到反應體系中，其中在加入聚合酶的過程中將試管一直保持在PCR儀中；
5)按照94°C 30sec， 60°C 15sec， 72°C 50sec進行17個循環(huán)的聚合酶鏈反
應；
6)把PCR產(chǎn)物轉化進大腸桿菌ER2925(New England Biolabs)中，其中ER2925為Dam-Dcm-菌株，步驟如下
a) 50 U 1 ER2925感受態(tài)細胞在冰上緩慢融化；
b) 向步驟5的感受態(tài)細胞中加入2.5 U 1 PCR產(chǎn)物，渦旋數(shù)次輕柔地混勻，冰上保溫所得混合物5分鐘；c) 轉化反應在42。C熱休克30秒，冰上保溫2分鐘；
d) 向轉化體系中加入250ulSOC培養(yǎng)液，37。C振搖l小時；禾口
e) 將整個反應液鋪于含有卡那霉素(500ng/mL)的LB平板上，37。C培養(yǎng)過夜。
誘變的效率由小量制備的生長的集落經(jīng)EcoRV酶切的結果決定。預期的突變效率為大約50%。參考文獻
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權利要求
1.一種向所選環(huán)狀甲基化核酸中引入定點突變的方法，包括(a)利用DNA聚合酶、互補的誘變引物、非甲基化dNTP和所選待誘變的環(huán)狀甲基化核酸進行聚合酶鏈反應(PCR)；(b)把步驟(a)中所獲得的PCR產(chǎn)物的混合物轉化入甲基化酶缺陷大腸桿菌，其中經(jīng)誘變的非甲基化核酸在甲基化酶缺陷大腸桿菌中有效復制；(c)從所述大腸桿菌回收經(jīng)誘變的非甲基化核酸。
2. 按照權利要求l所述的方法，其中在步驟(b)中所述甲基化酶缺陷大 腸桿菌的甲基化酶缺陷是可誘導性的。
3. 按照權利要求l所述的方法，其中在步驟(b)中所述甲基化酶缺陷大 腸桿菌的甲基化酶缺陷是不可誘導性的。
4. 按照權利要求l所述的方法，其中在步驟(b)中所述甲基化酶缺陷大 腸桿菌的甲基化酶缺陷是永久性的。
5. 按照權利要求l所述的方法，其中在步驟(b)中所述甲基化酶缺陷大 腸桿菌的甲基化酶缺陷是瞬時性的。
6. 按照權利要求l-5中任一項所述的方法，其中所述甲基化酶缺陷細胞 是Dam和Dcm缺陷大腸桿菌。
7. 按照權利要求6所述的方法，其中所述Dam和Dcm的缺陷是非誘導性 的和永久性的。
8. 按照權利要求6或7所述的方法，其中所述甲基化酶缺陷大腸桿菌菌 株是ER2925或SK383。
9. 按照權利要求l-8中任一項所述的方法，其中所述環(huán)狀甲基化核酸是 在體外被甲基化的。
10. 按照權利要求l-8中任一項所述的方法，其中所述環(huán)狀甲基化核酸 是在體內(nèi)被甲基化的。
11. 按照權利要求1-10中任一項所述的方法，其中步驟(a)中所述引物是 部分互補的。
12. 按照權利要求1-10中任一項所述的方法，其中步驟(a)中所述引物是 彼此完全互補的。
13. 按照權利要求1-12中任一項所述的方法，其中步驟(a)中所述誘變位 點位于引物的互補區(qū)和/或非互補區(qū)。
14. 按照權利要求1-13中任一項所述的方法，其中步驟(a)中所述DNA 聚合酶是溫度穩(wěn)定型的。
15. 向所選待誘變DNA分子中引入突變的試劑盒，所述試劑盒含有但 不限于甲基化酶缺陷細胞，優(yōu)選甲基化酶缺陷大腸桿菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及甲基化的環(huán)狀DNA分子的定點誘變的新方法，其中通過利用誘變引物對和甲基化酶缺陷大腸桿菌使甲基化的環(huán)狀DNA分子產(chǎn)生定點誘變。本方法選用的誘變引物對是5′端或3′端部分或完全互補的誘變引物對。首先，誘變引物與其相對應的甲基化環(huán)狀雙鏈DNA分子(母鏈)的互補鏈退火；然后，利用DNA聚合酶和非甲基化的dNTP進行聚合酶鏈反應產(chǎn)生突變的非甲基化子鏈DNA分子；最后，把含甲基化母鏈DNA分子和突變的非甲基化子鏈DNA分子的聚合酶鏈反應混合產(chǎn)物轉化進入甲基化酶缺陷的大腸桿菌。甲基化的母鏈DNA分子的復制在甲基化酶缺陷宿主細胞中受到抑制。相反，非甲基化子鏈DNA分子(含有突變)在甲基化酶缺陷宿主細胞中高效率復制，從而得到有效的富集和回收。另外，本發(fā)明還提供了根據(jù)本發(fā)明的方法引入定點誘變的試劑盒。
文檔編號C12P19/34GK101600797SQ200780051140
公開日2009年12月9日 申請日期2007年4月25日 優(yōu)先權日2007年4月25日
發(fā)明者苗 喬 申請人:苗 喬