專利名稱：用于作為具有完整細胞壁的懸浮單細胞的植物細胞系的誘導和維持的體外方法及其轉化的制作方法
對相關申請的交叉引用
本申請要求2006年12月29日提交的臨時申請流水號60/878,028的權益。
發(fā)明領域 本發(fā)明部分地屬于植物細胞系增殖的領域，包括增殖作為單細胞的、在懸浮液中的植物細胞的方法。

背景技術：
在過去的20年里，快速出現(xiàn)了與用于有用次級代謝產物生產的大規(guī)模植物細胞培養(yǎng)過程的開發(fā)中的重大改善相聯(lián)系的植物遺傳工程技術。自1995年起(Moffat，1995；Ma等，2003)，此類植物細胞懸浮培養(yǎng)物日益作為有價值的宿主細胞系統(tǒng)用于重組蛋白表達。
生長素誘導的胼胝體(callus)組織或懸浮液(盡管它們有單一的組織起源)通常含有具有多種表型的細胞。如此，自此類細胞類型開發(fā)的轉基因系通常是高度異質的，具有不一致的表達水平。因此，已經(jīng)自單一原生質體獲得了產生許多有用次級代謝產物的克隆，即自紫草(Lithospermumerythrorhizon)原生質體制備的高紫草寧生成細胞克隆(Maeda等，1983)。
迄今為止，必須形成原生質體以解開細胞，這不僅為了細胞選擇，而且也為了培養(yǎng)的植物細胞的電穿孔/PEG介導的轉化。從植物組織分離單細胞克隆需要制備原生質體。然而，原生質體通常難以再生其正常的壁，因為分離的原生質體通常是停滯的，而且難以分裂(Hahne和Hoffmann，1984)。在許多對培養(yǎng)的原生質體的研究中，產生的第一和主要的多糖是胼胝質(callose)，其由1-、3-、8-吡喃葡萄糖構成(Klein等，1981)。
受傷的或受亞的植物通常將大量的這種葡聚糖分泌入壁膜間隙中(Currier，1957)。在壁再生的早期期間，纖維素和木葡聚糖之間的結合不如它在完整植株中時強烈(Hayashi等，1986)。因為木葡聚糖和纖維素在初生細胞壁中的大分子組織表現(xiàn)出負責強度和延伸性(Hayashi和Maclachlan，1984)，原生質體周圍的木葡聚糖以及纖維素沉積表現(xiàn)出對于它們的分裂和生長潛力是至關重要的。這種先決條件使原生質體的分裂延遲，如此增加再生成具有親本系的細胞特征的正常細胞的時間。
因此，植物細胞培養(yǎng)領域中正在進行的技術挑戰(zhàn)是分離能從培養(yǎng)中的植物組織克隆的活的單細胞(Bourgin，1983；Tabata等，1976)。在懸浮培養(yǎng)中，總是形成非均一的細胞聚集體，而且每個此類聚集體含有近百個細胞。關于這些聚集的細胞之間的接合一無所知，而且尚未有報告鑒定出能解散細胞聚集體并將它們作為具有完整細胞壁的單細胞在體外維持的單酶。
在數(shù)份報告中提示了果膠在細胞粘附特性中的作用，但是這樣的聯(lián)系相對更近一些才確立的(Bouton等，2002)。另外，報告了細胞粘附特性的強烈下降(Sterling等，2006)。
qua1-1突變體顯示了脫離的單根細胞(Bouton等，2002)。通過使用針對特定果膠表位而制備的抗體進行的免疫熒光實驗，進一步確證了果膠含量的降低。這些觀察結果提示所編碼的酶可能牽涉果膠多糖的合成，并清楚地指明果膠牽涉植物細胞的粘附特性。
如此，破壞果膠合成以消除細胞粘附特性能促進細胞分離。已經(jīng)有報告，用一次果膠降解酶處理進行的單細胞分離(Naill，2005)幫助紫杉(Taxus)細胞懸浮培養(yǎng)物中單細胞的分離。使用此類紫杉單細胞來篩選具有更高紫杉醇(Taxol)生成水平的良種(elite)克隆系。然而，此方法在培養(yǎng)基中連續(xù)存在酶的情況中在懸浮單細胞維持中是沒用的。還有，用酶或酶組合的此類短脈沖處理的最高單細胞產率僅是17.1％-34.4％(Naill，2005)。稻懸浮液中的連續(xù)果膠酶處理僅導致了0.005％濃度的細微懸浮聚集體，但是對作為單細胞的懸浮液的維持沒有幫助(Lee等，2004)。酶組合(即果膠酶和纖維素酶)超過8小時的延長處理導致了細胞溶解(Naill，2005)。
已經(jīng)有報告，大豆細胞懸浮培養(yǎng)物中細胞分離的增強在存在秋水仙素的情況中得到增強(Umetsu等，1975)。為了分離細胞，以比用于產生染色體多倍性的濃度(5-20mM)低的濃度(0.1-1.0mM)將生物堿添加至培養(yǎng)基。不過，秋水仙素抑制植物和動物細胞中的有絲分裂(Lewin，1980)。秋水仙素結合微管蛋白，并阻止微管的裝配。因此，為了獲得細胞分離，秋水仙素濃度和處理時間應當盡可能的低。
秋水仙素生物堿已經(jīng)被用于使培養(yǎng)的動物細胞中的生長同步化，其中通常以0.5mM添加生物堿，并且應當在有絲分裂之前的幾小時內使細胞停滯。雖然形態(tài)發(fā)生效應與動物細胞中的相當類似，但是植物細胞能在存在0.1mM秋水仙素的情況中的生長過程中分裂(Umetsu等，1975)。大豆懸浮細胞在1mM秋水仙素中培養(yǎng)4天后，細胞生存力下降。另外，僅44.8％的細胞在這些處理中是能生存的，但是將它們保持分裂是有可能的，這不像在動物細胞中那樣。
已經(jīng)調查了微管蛋白解聚抑制劑或寡糖素在植物體外培養(yǎng)物中維持單細胞懸浮液中的用途。早在1975年，文獻便有一些關于使用秋水仙素來進行細胞分離的信息；參見下文參考文獻部分。還已經(jīng)調查了作為除草劑的微管蛋白抑制劑。
良種轉基因事件產生和發(fā)現(xiàn)嚴重依賴于使能技術(enabling technology)的開發(fā)。適于轉化懸浮細胞聚集體的當前方法是土壤桿菌(Agrobacterium)和晶須介導的方法。土壤桿菌法顯示了高達67-90％的主鏈整合率，使其成為非常低效的過程，而WHISKERSTM介導的轉化不會充當高通量過程(HTP)。表明PEG介導的方法總是與原生質體一起使用，并且煙草的原生質體雖然易于轉化，但是由于細胞壁再生問題，其不易于進行HTP轉化過程。
關于供基于單細胞懸浮培養(yǎng)的轉化用的方案，本領域似乎是沒有記載的。有數(shù)份關于基于原生質體的方案的報告，但是它們是缺乏細胞壁的，不像下文所討論的植物細胞的單細胞懸浮液那樣。
發(fā)明概述 本發(fā)明提供了將懸浮細胞聚集體破碎成具有完整初生細胞壁的單細胞的簡單且一致的方法。以下的公開內容討論含有果膠降解酶或微管蛋白解聚化合物(包括秋水仙素)的培養(yǎng)基中所培養(yǎng)的懸浮細胞聚集體的細胞分離。
本發(fā)明還涉及化合物用于此類目的的新用途。
本發(fā)明的一方面涉及目的物(即分離的細胞)的轉化。此類過程將基于單細胞的轉化和選擇過程簡化并整合入轉基因和轉質體(transplastomic)事件產生的工作過程。本發(fā)明還消除了技術約束，并以高通量方式產生無標志物的且均一表達的轉基因系，用以支持動物保健、生物制藥(biopharma)、及性狀和作物保護平臺的各種需要。
附圖簡述

圖1在培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)7天，在連續(xù)果膠裂合酶(Pectolyase)處理中具有完整細胞壁的JTNT1懸浮細胞的單細胞分離。
A正常的BY2懸浮液；B與A相同，但經(jīng)I2KI染色的細胞，以顯示細胞的聚集；C和D連續(xù)酶處理6天后所分離的細胞；E和F在有和沒有I2KI染色的情況中所分離的單細胞。注意正常細胞分裂(F)。
圖2連續(xù)果膠裂合酶處理(用FDA和PI來處理細胞)后6天的BY2細胞生存力及單細胞產率。
ABY2細胞聚集體；B1ml接種物中的BY2在果膠裂合酶中在培養(yǎng)基中達5天；C6ml接種物與酶一起在培養(yǎng)基中5天；D、E和FC的顯微鏡視野快相；GBAP和12％蔗糖中形成的具有BY2細胞變體的對照團塊；H和I來自G的、來自5天連續(xù)酶處理的單細胞。FDA和PI中染色的細胞。注意經(jīng)PI染紅的死亡細胞。
圖3在來自BY2和Xanthi煙草懸浮液的細胞聚集體懸浮液的培養(yǎng)基中，自7天秋水仙素處理誘導單細胞懸浮液。
A正常的BY2懸浮聚集體(經(jīng)Calcafluor染色的)；B在1mM秋水仙素中達7天的單細胞BY2懸浮液；C與B相同，但擴大的，以顯示具有完整壁的單細胞；DXanthi的懸浮聚集體；E在0.5mM秋水仙素中處理7天的Xanthi懸浮聚集體。注意0.5mM中單細胞的部分釋放；和F1mM秋水仙素中所分離的Xanthi單細胞。
圖4在秋水仙素處理中自BY2和Xanthi煙草懸浮聚集體釋放具有完整細胞壁的單細胞。
A正常的BY2懸浮聚集體；B在1mM秋水仙素中達7天的單細胞BY2懸浮液；C和D除去秋水仙素后細胞恢復成聚集體(以1個秋水仙素處理培養(yǎng)周期進行傳代培養(yǎng)后4天)；EXanthi的懸浮聚集體；F在1mM秋水仙素中處理7天的Xanthi懸浮聚集體。注意BY2和Xanthi培養(yǎng)物中所釋放的單細胞和完整細胞壁的存在，如在存在熒光增白劑Calcafluor的情況中所看到的。(用0.1％Calcafluor處理所有樣品，并在Leica熒光顯微鏡下檢查)。
圖5在秋水仙素處理中自BY2變體煙草(在EP 12％蔗糖培養(yǎng)基中適應的)和曼陀羅懸浮聚集體釋放具有完整細胞壁的活的單細胞。
A正常的BY2-V懸浮聚集體；B未處理聚集體的更近視圖；C、D和E單細胞BY2懸浮液在1mM秋水仙素中誘導7天(10X、20X和40X放大率下的細胞)；F在1mM秋水仙素處理中達7天，曼陀羅懸浮液中的單細胞誘導。用FDA和PI處理所有樣品，并在Leica熒光顯微鏡下檢查。注意這里在FDA染色劑中看到的細胞的高生存力且在PI中具有非常少的染紅細胞。
圖6DAS-PMTI-1(Dow AgroSciences(DAS)專賣的甲基吲哚衍生物和有力的微管抑制劑除草劑)對NT1煙草細胞生長的影響。在不存在或存在25nM或50nM的DAS-PMTI-1的情況中在含有3％甘油作為唯一碳源的NT1B培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。所有鮮重值表示來自重復樣品的均值±0.18。
圖7來自DAS GAD1762-034懸浮系的單細胞和集落生成。
圖8A、8B和8C來自DAS GAD1762-034單細胞的集落的2-6周生長。
圖9在7天和13天收集樣品達超過4輪傳代培養(yǎng)周期，并實施表達分析。將所獲得的表達數(shù)據(jù)繪圖。
圖10使用DAS-PMTI-1來分離的BY2細胞的單細胞。使用20-50nM濃度來在傳代培養(yǎng)5天后產生單細胞。注意細胞是單細胞(一對具有交疊的邊緣)，并在附接有共焦成像系統(tǒng)的微差干涉相差顯微鏡(Differential InterferenceContrast Scope)下拍攝照片。
圖11PEG處理72小時后的YFP表達(Ubi10-YFP質粒)。焦平面中小的子(分裂)細胞之一顯示GFP表達，指明表達可以是穩(wěn)定的。
圖12左，由100mg/L卡那霉素抑制的未處理對照組織；右，選擇培養(yǎng)基上生長的單細胞衍生的推定轉質體分離群。
圖13自胡蘿卜單細胞懸浮液產生克隆系。用未處理的懸浮聚集體鋪板的M培養(yǎng)基上的胞苔生長(lawn growth)(小圖A)。用單細胞鋪板的培養(yǎng)基上的離散集落生長(小圖B)。
圖14液體培養(yǎng)基中的0.5-1mM秋水仙素處理和啟動傳代培養(yǎng)后第14天(第2輪傳代培養(yǎng)周期結束時)所分析的培養(yǎng)物。A自簇釋放單細胞；B用FDA活體染色劑染色的緊密擠壓的細胞聚集體；C和D過濾懸浮液(使用具有100um孔徑的濾器)后，經(jīng)FDA染色的分別在1mM和0.5mM處理中釋放的單細胞；E和F來自D的單細胞的更近視圖。
圖15JTNT1單細胞響應MTI的生長曲線。
發(fā)明詳述 分離和培養(yǎng)單細胞的能力具有許多可能的應用。例如，本文所述方法可用于改善與用于動物保健應用的植物細胞培養(yǎng)物的生產力有關的過程。
如此，本發(fā)明的方法對于增強基于植物細胞的動物保健和生物制藥產物的過程功效是有用的。本發(fā)明的實施方案能有助于篩選轉基因細胞系良種克隆，諸如在迷你懸浮細胞培養(yǎng)啟動中，使批次間變化(batch to batch variation)最小化，用以為基于單細胞的轉化系統(tǒng)開發(fā)標準操作方案(SOP)，以使聚集體中的非轉基因細胞最小化或將其消除。總之，本發(fā)明的各方面在動物保健HTP(高通量過程)篩選和宿主細胞系改善程序中是有用的。
本發(fā)明還例示并容許基于單細胞的測定法和細胞分選過程的進一步開發(fā)，以根據(jù)與細胞猝滅熒光探針有聯(lián)系的RNA表達來鑒定穩(wěn)定表達的細胞。
此類單細胞在定點同源重組瞬時篩選中也是有用的，代替當前基于原生質體的瞬時系統(tǒng)。例如，黑墨西哥甜(Black Mexican Sweet，BMS)玉米懸浮液和蕓苔(canola)懸浮液可為此類應用提供單一系統(tǒng)。如此，例如，靶向同源重組可在本發(fā)明的實施方案中使用。這種類型的技術是例如WO 03/080809 A2和相應公布的美國申請(USPA 20030232410)的主題，所述申請涉及鋅指用于靶向重組的用途。重組酶(例如cre-lox和flp-frt)的用途在本領域中也是已知的。
可使用體外植物表達系統(tǒng)來生成有用的藥用和動物保健重組蛋白。此類植物表達系統(tǒng)的關鍵優(yōu)勢在于它們本質上是真核的——擁有與哺乳動物細胞的內膜系統(tǒng)和分泌途徑類似的內膜系統(tǒng)和分泌途徑。因此，復雜蛋白質一般有效地折疊并進行裝配，具有合適的翻譯后修飾。
植物生產系統(tǒng)的另一個益處是放大(scale-up)的潛力。篩選良種表達克隆和放大(bulk up)此類同質表達細胞系之后，實質上無限量的重組蛋白可以或是在所包含的綠色組織中培養(yǎng)或是使用發(fā)酵或生物反應器系統(tǒng)在工業(yè)設備中放大。
本文中例示了用于產生單細胞的兩種策略。兩者都成功地起作用來分離活的單細胞。然而，在至少在兩種懸浮細胞類型中獲得大體積的具有完整細胞壁的單細胞懸浮液方面，秋水仙素方法相對于酶降解方法是更優(yōu)選的。酶方法不僅顯示對細胞生長的抑制，而且顯示更高程度的死亡率。還有，在不除去或漂洗所使用的培養(yǎng)基的情況中將活細胞鋪板于凝膠培養(yǎng)基上時，細胞死亡，而且沒有觀察到集落生長。推薦的是，可使用經(jīng)由酶降解方法所產生的此類單細胞懸浮液的應用，但是會需要進一步的優(yōu)化。
相反地，此研究中所測試的微管蛋白抑制劑(如秋水仙素)的添加表現(xiàn)出對于分離植物細胞和選擇單細胞是非常有用的。此方法是簡單的，因為其僅牽涉在傳代培養(yǎng)階段期間將合適體積的秋水仙素添加至液體培養(yǎng)基。這會是樞要的工具，其對于過程(諸如用作為起始細胞的高度存活細胞的均一接種物來啟動迷你懸浮培養(yǎng))中的給定懸浮液會具有重大意義。該技術能提高電穿孔、WhiskersTM、和土壤桿菌介導的轉化的效率。還可使用此類單細胞制備物來從轉基因懸浮聚集體中分離重組蛋白生成系的良種克隆。
雖然原生質體方法已經(jīng)用于單細胞分離，該主題秋水仙素方法是更容易和更有力的。因為存在壁，通過秋水仙素方法所獲得的單細胞比原生質體更穩(wěn)定，而且不需要細胞壁的再生。細胞具有壁，該壁具有正常的木葡聚糖/纖維素網(wǎng)絡組成(Hayashi和Maclachlan，1984)。它們在細胞擴展和分離過程中不產生胼胝質，如在如下觀察中所看到的，其中在存在秋水仙素的情況中伸長的松幼苗細胞沒有異常的壁增厚，但是放射狀擴大(Itoh，1976)。在無秋水仙素的培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)后，細胞的生長是正常的，而大多數(shù)原生質體是停滯的，并且難以分裂(4)。秋水仙素培養(yǎng)的細胞可具有一定程度的多倍性，然而，此研究中所使用的秋水仙素濃度(0.1-1.0mM)比誘導多倍性所需要的濃度(5-20mM)低10-100倍。用秋水仙素方法回收單細胞比用原生質體回收單細胞好得多(Hyashi和Yoshida，1988)。可使用流式細胞術來進一步測試主題細胞以評估多倍性水平和基因組穩(wěn)定性。另外，倍性水平提高可經(jīng)由轉化細胞的拷貝數(shù)目增加而提供重組蛋白水平增強的額外益處。
聚半乳糖醛酸(galacturonan)活性在大豆懸浮細胞中顯示了分離細胞的生物學功能，并且報道為寡糖素，因為其對細胞分離顯示了生物學功能(Albersheim和Darvill，1985)。因此，半乳糖醛酸也在這些懸浮細胞中進行測試以實現(xiàn)細胞分離而沒有任何倍性變化，以防存在有這里報道的單細胞懸浮液中觀察到的任何秋水仙素誘導的倍性變化。因此，正在進一步評估聚半乳糖醛酸和其它類似寡糖素的直接應用以比較在通過破壞細胞粘附特性來分離細胞中的功效。如此，本發(fā)明提供了經(jīng)過數(shù)輪懸浮細胞傳代周期而細胞同時維持基因組穩(wěn)定性的可再現(xiàn)且一致的簡單方法。
本文中所例示的一種優(yōu)選的化合物是DAS-PMTI-1。此化合物表現(xiàn)為非常有效力的(在影響培養(yǎng)物生長方面是秋水仙素的約100-1000倍)。處理7天后，在0.5mM濃度中有相當多的細胞死亡，但是在這些培養(yǎng)物在沒有DAS-PMTI-1的情況中進行傳代培養(yǎng)時，在2周后PH懸浮細胞以低頻率作為單細胞回收。根據(jù)對單細胞分離的優(yōu)選應用(諸如細胞類型等)，可實施進一步優(yōu)化以確定此化合物的優(yōu)選濃度。具有類似功能的其它MTI抑制劑可通過破壞果膠合成而在主題細胞分離中使用。根據(jù)本公開內容，可測試別的MTI抑制劑及其類似物，并篩選其在產生和維持單細胞中的功效。
DAS-PMTI-1(也稱為4-氯-1，5-二苯基-1H-吡唑-3-基氧)-乙酸乙酯)的化學結構如下
供依照本發(fā)明使用的化合物的優(yōu)選類屬是DAS-PMTI-1型化合物。此類化合物可符合上文所提供的通用結構，而且包括其功能性(供依照本發(fā)明使用)衍生物和類似物。
下面是供依照本發(fā)明使用的一些已知微管蛋白抑制劑的類屬化學式。雖然DAS-PMTI-1是一個優(yōu)選的實施方案，但是實際上任何微管蛋白抑制劑均可依照本發(fā)明使用。在一些優(yōu)選的實施方案中，與秋水仙素組合地使用如下二芳基吡唑類屬的一個或多個成員
其中 X＝CO2R、CH2CO2R、CH2CH2CO2R、(CH2)3CO2R、OCH2CO2R、OCH(CH3)CO2R、OC(CH3)2CO2R、CH2OCH2CO2R、CH2CH(CO2CH2CH3)CO2R、或OCH(CO2CH2CH3)CO2R， Y＝CN、Cl、Br、F、或NO2， Ar1＝未取代的苯基、未取代的吡啶、1-3取代的苯基、1-3取代的吡啶、或用鹵素或CN取代， Ar2＝未取代的苯基、未取代的吡啶、1-3取代的苯基、1-3取代的吡啶或用鹵素或CN取代，且 R＝H或1-5個碳的直鏈或支鏈酯。
如此，已經(jīng)使用微管抑制劑來產生單細胞植物懸浮培養(yǎng)物，并且它們可在培養(yǎng)中維持至少2輪傳代培養(yǎng)周期。這些單細胞懸浮液的獨特之處在于它們具有完整的細胞壁，但是它們仍彼此分離地存在。
“轉基因的”植物、植物細胞等是(除非另有說明)自如下經(jīng)轉化植物細胞(或原生質體等)衍生的整個植株、植物細胞、植物細胞培養(yǎng)物、植物細胞系、植物組織培養(yǎng)物、低等植物、單子葉植物細胞培養(yǎng)物、雙子葉植物細胞培養(yǎng)物或其后代，所述經(jīng)轉化的植物細胞(或原生質體等)含有由實驗室技術導入的、最初不存在于相同物種的天然非轉基因植物細胞中的外來DNA。術語“轉基因植物”和“經(jīng)轉化的植物”在本領域中有時已經(jīng)作為同義術語使用，定義其DNA包含外源DNA分子的植物。轉基因植物可被穩(wěn)定地轉化以含有在植物的基因組DNA內發(fā)揮功能并整合入植物基因組DNA中的外來DNA，或者是已經(jīng)被基于病毒的載體轉化并瞬時表達外來DNA的轉基因植物。
“分離的”和“純化的”暗示“人為的”(“hand of man”)，并可應用于多核苷酸和蛋白質。例如，克隆的多核苷酸是分離的多核苷酸。
轉化方法。已經(jīng)使用用于核轉化的土壤桿菌和聚乙二醇(PEG)和用于質體轉化的生物射彈轟擊來對這些單細胞測試核轉化和質體轉化。在核轉化嘗試中，已經(jīng)證明了質粒DNA的投遞和黃色熒光蛋白瞬時表達。已經(jīng)在質體轉化中回收細胞，并經(jīng)由PCR分析顯示了穩(wěn)定轉化。放大(bulk)轉質體胼胝體分離群，并正在經(jīng)由ELISA分析選擇標志nptII基因表達。
本文所述轉化方法可應用于動物保健過程。然而，在用于重組蛋白生產的細胞類型的宿主之外，經(jīng)由新的投遞方法(包括納米微粒投遞)的基于單細胞的轉化還可為轉化作物植物提供獨特的辦法。
經(jīng)由PEG和/或電穿孔方法的主題單細胞轉化的開發(fā)使具有完整壁的單細胞像細菌/哺乳動物細胞系統(tǒng)一樣順從(amenable)，并且在用于那些細胞類型的高通量轉化系統(tǒng)中也是有用的。
轉化單細胞的能力具有許多可能的應用。例如，本文所述方法可用于改善與用于動物保健應用的植物細胞培養(yǎng)物的生產力有關的過程。再則，主題過程對于增強基于植物細胞的動物保健和生物制藥產物的過程功效是有用的。主題方法還可幫助篩選轉基因細胞系的良種克隆。此類應用可用于迷你懸浮細胞培養(yǎng)啟動，使批次間表達變化最小化，并用以開發(fā)SOP，以使聚集體中的非轉基因細胞或多種事件的存在最小化或將其消除。
如發(fā)明背景部分中所討論的，土壤桿菌法是非常低效的，而WHISKERSTM介導的轉化不會充當高通量過程。PEG介導的方法與原生質體一起使用。雖然煙草原生質體易于轉化，但是由于細胞壁再生問題，它們不易于進行HTP轉化過程。
相比之下，本發(fā)明提供了完整的細胞壁。PEG介導的過程是具有完整細胞壁的單細胞的第一份報告。本方法還是高度有效的。還有，通過使用片段純化的質粒來進行轉染，此過程消除了主鏈整合。經(jīng)由諸如熒光激活細胞分揀(FACS)等過程的、牽涉植物單細胞的快速轉化方案對于過程的小型化和自動化會是理想的，以便以降低的費用、資源和預定時間限度(timeline)來篩選合適的事件。這可如下徹底改善當前的胼胝體或懸浮聚集體選擇過程，即經(jīng)由細胞分選儀來篩選經(jīng)轉化的細胞，并經(jīng)由工業(yè)研究或生產流水線為進一步的推進確定同質表達的良種事件。
如此，例如，主題過程為新的生物加工研究和開發(fā)，為HTP篩選動物保健需要和宿主細胞系改善提供了基本的基礎。
本發(fā)明容許進一步開發(fā)基于單細胞的測定法和細胞分選過程，用以根據(jù)與細胞猝滅熒光探針有聯(lián)系的RNA表達來鑒定穩(wěn)定表達的細胞。
此類單細胞在對感興趣基因(GOI)瞬時和/或穩(wěn)定篩選性狀和作物保護平臺中也是有用的。
除非明確指明或暗示，術語“一個”、“一種”和“所述”在用于本文時表示“至少一個”、“至少一種”。
通過提及而完整收錄本文中所提及或引用的所有專利、專利申請、臨時申請、和出版物，其程度為它們不與本說明書的明確教導相矛盾。
實施例 實施例1——材料和方法 BY2懸浮培養(yǎng)的細胞自日本煙草獲得，并以7天周期在LSBY2培養(yǎng)基中維持。曼陀羅懸浮液和Pettite哈瓦那煙草懸浮液自在DAS啟動的胼胝體啟動，而Xanthi懸浮液作為來自UIUC(IL)的Jack Widholm教授的樣品獲得。JT-NT1懸浮細胞(自華盛頓大學獲得，以7天周期在NT1B培養(yǎng)基中維持)僅用于果膠降解酶研究以將細胞分離成單細胞。將細胞在搖瓶中在黑暗中于25-28℃在定軌搖床上以150rpm培養(yǎng)。秋水仙素自Fluka獲得，DAS-PMTI-1(Martin等，2001；Smith等，2001)自DAS CRS獲得，而果膠降解酶(果膠裂合酶Y和果膠酶)來自Sigma。在此調查中所使用的兩種微管蛋白聚合抑制劑的儲存濃縮液溶解于DMSO中以制備0.5M儲液。果膠酶和果膠裂合酶的測試濃度在0.0005％-0.005％范圍中。例如，煙草懸浮細胞系NT-1和BY-2適于實施本發(fā)明。例如，BY-2細胞是商品化的，并可依照Nagata等獲得(Nagata，T.，Nemoto，Y.，和Hasezawa，S.[1992]，煙草BY-2細胞系作為高等植物的細胞生物學中的“HeLa”細胞。Int.Rev.Cytol.1321-30)。NT-1細胞最初自煙草栽培變種嫩黃2(Nicotiana tabacum L.cv.bright yellow 2)開發(fā)。NT-1細胞系被廣泛使用，并易于獲得；雖然，任何煙草懸浮細胞系符合本發(fā)明的實施。值得注意的是，NT-1細胞系的起源是不清楚的。此外，該細胞系表現(xiàn)出可變異，并傾向于隨培養(yǎng)條件而變化。適于在下文實施例中使用的NT-1細胞可以以編號ATCC No.74840自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)獲得。還可參見美國專利No.6,140,075。
實施例2——顯微觀察 通過光學顯微鏡檢術(以Nomarski和暗視野光學)來觀察細胞擴展和分離。通過使用血細胞計數(shù)器來對球狀細胞和單細胞計數(shù)以分別測定細胞擴展和分離的程度。通過用5％(wt/vol)三氧化鉻處理16小時并對細胞計數(shù)來測定聚集體中的細胞數(shù)目(Henshaw等，1966)。使用熒光顯微鏡(ZeissPhotomicroscope)通過用熒光素二乙酸酯(FDA)和碘化丙錠(PI)對細胞染色(Yokoyama等，1997)來測定細胞生存力。為了測定此單細胞培養(yǎng)物中細胞壁的存在，使用熒光增白劑。在此研究中使用自Sigma獲得的Calcafluor(其是對纖維素特異性的熒光染料)，并通過熒光顯微鏡檢術(Zeiss Photomicroscope)來觀察纖維素-Calcafluor絡合。將Calcafluor(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo.)制備成PBS緩沖液中的0.1％(wt/vol)溶液，并在黑暗中于室溫貯存(Kwok等，2003)。使用前，將Calcafluor染色劑以15,000g離心2分鐘以除去沉淀物。將1滴或2滴Calcafluor溶液添加至分離的細胞。于室溫2或3分鐘后，用水漂洗細胞懸浮液，并用TBS(pH 7.2)中0.1％Evan氏藍(Sigma；E-2129)于室溫復染色1分鐘，并在紫外顯微鏡下以395-415nm波長(455nm的觀察光)觀察。細胞壁表現(xiàn)為淺藍色-白色或藍綠色的橢圓形暈。
實施例3——培養(yǎng)基中連續(xù)果膠酶和果膠裂合酶處理的結果 使用Petite哈瓦那、BY2和NT1煙草懸浮液來調查不同濃度的果膠降解酶(即果膠酶和果膠裂合酶)的效果。JT-NT1懸浮液確實更好地響應果膠酶處理，而BY2懸浮液比其它酶對應物更好地響應果膠裂合酶處理。然而，存在有細胞死亡率，如通過各細胞類型的活體染色劑和抑制性生長所顯現(xiàn)的。增加傳代培養(yǎng)階段的細胞接種物體積，多至12倍，以具有合理的單細胞產率?？梢詫H和BY2細胞在含果膠裂合酶的培養(yǎng)中培養(yǎng)至少7天。這些細胞在低濃度果膠裂合酶(3個活性單位)中的連續(xù)培養(yǎng)表現(xiàn)為有害的。培養(yǎng)第6天的細胞在接種物體積是6ml(處于穩(wěn)定期的起始接種物體積)并與酶一起在50ml新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)時產生高的單細胞。這些細胞在培養(yǎng)6天后用FDA和PI測試時顯示了更高程度的活單細胞(圖1和2)。懸浮培養(yǎng)物的生長在酶處理中受到徹底地影響，并且將細胞在含有相同酶的培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)表現(xiàn)為有害的。推薦的是，可以將細胞在培養(yǎng)中新鮮處理長至最大限度7天的持續(xù)時間，然后應當將這些細胞轉移至不含酶的培養(yǎng)基以恢復生長。此方法充其量可用于篩選異質聚集體中的良種轉基因克隆或用以用一致的細胞體積開始高通量懸浮培養(yǎng)。
圖1在培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)7天，在連續(xù)果膠裂合酶處理中具有完整細胞壁的JTNT1懸浮細胞的單細胞分離。
A正常的BY2懸浮液；B與A相同，但經(jīng)I2KI染色的細胞，以顯示細胞的聚集；C和D連續(xù)酶處理6天后所分離的細胞；E和F在有和沒有I2KI染色的情況中所分離的單細胞。注意正常細胞分裂(F)。
圖2連續(xù)果膠裂合酶處理(用FDA和PI來處理細胞)后6天的BY2細胞生存力及單細胞產率。
ABY2細胞聚集體；B1ml接種物中的BY2在果膠裂合酶中在培養(yǎng)基中達5天；C6ml接種物與酶一起在培養(yǎng)基中5天；D、E和FC的顯微鏡視野快相；GBAP和12％蔗糖中形成的具有BY2細胞變體的對照團塊；H和I來自G的、來自5天連續(xù)酶處理的單細胞。FDA和PI中染色的細胞。注意經(jīng)PI染紅的死亡細胞。
實施例4——秋水仙素對BY2、NT1、Petite哈瓦那(PH)和Xanthi(Xan)及曼陀羅(JM)懸浮細胞生長的影響 培養(yǎng)7天后，在0.5mM和1mM秋水仙素濃度，BY2、Xan、和JM細胞的細胞數(shù)目有響應(圖3、4、和5)。然而，在1mM BY2懸浮細胞和JM細胞中看到高程度的懸浮單細胞。有意義的是，注意到JM細胞生長即使在0.5mM秋水仙素中也受到徹底地影響，并且生長即使在相同培養(yǎng)基中再生長一周后也不能恢復。這指明JM細胞中細胞分裂受到秋水仙素抑制，并且需要進一步測試更低的濃度以優(yōu)化細胞分離而不降低培養(yǎng)物密度或生長。有趣的是，BY2懸浮細胞沒有觀察到這樣的生長抑制，BY2懸浮細胞能在存在1mM秋水仙素的情況中連續(xù)培養(yǎng)至少14天。在第3天首次觀察到細胞膨脹，并且隨著培養(yǎng)在BY2懸浮細胞中繼續(xù)，細胞形成球形。因為球狀細胞逐漸從聚集體中釋放，推測細胞分離伴有細胞擴展。7天后在含有1mM秋水仙素的培養(yǎng)基中有與對照培養(yǎng)物中大約相等數(shù)量的BY2細胞。在將1mM秋水仙素中培養(yǎng)7天的細胞傳代培養(yǎng)至無秋水仙素的培養(yǎng)基時，以聚集體生長的能力沒有完全恢復，代替地，看到約90％的懸浮細胞為完整單細胞。細胞擴展和分離也部分地在含有0.5mM秋水仙素的培養(yǎng)基中所測試的所有其它細胞懸浮液的細胞懸浮聚集體中發(fā)生。存在有JT-NT1和JM懸浮細胞中觀察到的抑制性細胞生長應答。NT1懸浮細胞在1mM秋水仙素中記錄到幾乎50％的生長下降。
在這些細胞中觀察到大的分離細胞，這與qua1-1果膠突變體中報道的分離的表皮根細胞中的那些類似(Bouton，2002)。用DAS-PMTI-1測試的所有細胞懸浮類型中觀察到具有一般球形的細胞的類似部分分離。然而，在經(jīng)0.5mM濃度DAS-PMTI-1處理的懸浮液中細胞生長受到非常顯著地影響。可實施進一步的實驗以優(yōu)化用此化合物進行細胞分離的條件，及以使細胞抑制性生長最小化。如FDA和PI染色測試所證明的，所測試的BY2和JM細胞懸浮液中有高程度的細胞生存力。細胞是高度圓形的，并且在許多細胞中顯示喙樣的凸出物，指明活性細胞的細胞壁延伸，這可能在細胞分裂之前。分離的細胞是大的、擴展的，并具有原生質體典型的球形。使用Calcafluor染色劑來測定完整細胞壁的存在或缺失。圖4.顯示了環(huán)繞這些球形細胞的細胞壁的清晰存在。在顯微鏡的暗場聚光器下對這些細胞的觀察顯示了環(huán)繞細胞的厚細胞壁(圖3小圖C)。這些單細胞在振蕩培養(yǎng)物中是能復原的，因為沒有由于果膠的缺乏和大細胞的存在而死亡的細胞，如在活體染色測試中所看到的(圖5)?？吹椒浅８甙俜直鹊幕畹慕】导毎?，如在此小圖中所看到的。因此，有可能在振蕩培養(yǎng)物中或微孔板中使用這些細胞作為具有精確細胞數(shù)目的接種物。
圖3在來自BY2和Xanthi煙草懸浮液的細胞聚集體懸浮液的培養(yǎng)基中，自7天秋水仙素處理誘導單細胞懸浮液。
A正常的BY2懸浮聚集體(經(jīng)Calcafluor染色的)；B在1mM秋水仙素中達7天的單細胞BY2懸浮液；C與B相同，但擴大的，以顯示具有完整壁的單細胞；DXanthi的懸浮聚集體；E在0.5mM秋水仙素中處理7天的Xanthi懸浮聚集體。注意0.5mM中單細胞的部分釋放；和F1mM秋水仙素中所分離的Xanthi單細胞。
圖4在秋水仙素處理中自BY2和Xanthi煙草懸浮聚集體釋放具有完整細胞壁的單細胞。
A正常的BY2懸浮聚集體；B在1mM秋水仙素中達7天的單細胞BY2懸浮液；C和D除去秋水仙素后細胞恢復成聚集體(以1個秋水仙素處理培養(yǎng)周期進行傳代培養(yǎng)后4天)；EXanthi的懸浮聚集體；F在1mM秋水仙素中處理7天的Xanthi懸浮聚集體。注意BY2和Xanthi培養(yǎng)物中所釋放的單細胞和完整細胞壁的存在，如在存在熒光增白劑Calcafluor的情況中所看到的。(用0.1％Calcafluor處理所有樣品，并在Leica熒光顯微鏡下檢查)。
圖5在秋水仙素處理中自BY2變體煙草(在EP 12％蔗糖培養(yǎng)基中適應的)和曼陀羅懸浮聚集體釋放具有完整細胞壁的活的單細胞。
A正常的BY2-V懸浮聚集體；B未處理聚集體的更近視圖；C、D和E單細胞BY2懸浮液在1mM秋水仙素中誘導7天(10X、20X和40X放大率下的細胞)；F在1mM秋水仙素處理中達7天，曼陀羅懸浮液中的單細胞誘導。用FDA和PI處理所有樣品，并在Leica熒光顯微鏡下檢查。注意這里在FDA染色劑中看到的細胞的高生存力且在PI中具有非常少的染紅細胞。
實施例5——含有甘油作為唯一碳源的培養(yǎng)基中單細胞的產生和DAS-PMTI-1的影響 本實施例提供了關于新的甘油生長培養(yǎng)基和DAS-PMTI-1低濃度效應及生長特征的另一個討論。本結果是非常有意義的，因為文獻中有如下在先報道，即甘油減輕秋水仙素在破壞大豆微管中的影響；如此，本領域教導反對在用于本應用的培養(yǎng)基中使用甘油。參見例如Hayashi和Yoshida，85PNAS2618-22(1988)。另外，本甘油數(shù)據(jù)對于植物細胞是新的，而且此類結果先前尚未有報道。使用3％甘油作為唯一碳源，3種不同基因型的煙草快速培養(yǎng)物已經(jīng)成功生長數(shù)月。
此實施例還提供了描繪兩種不同DAS-PMTI-1濃度中的培養(yǎng)行為的生長曲線圖，并將其與空處理進行比較。
破壞微管的數(shù)種類型的化合物產生單細胞。所述化合物包括微管破壞劑或抑制劑(α和β微管蛋白結合化合物)，其分類到以下各項之下(i)二硝基苯胺類，秋水仙素、黃草消(Oryzalin)、氟樂靈(Trifluaralin，Trifluralin)、Chloralin；(ii)N-苯基氨基甲酸酯類，諸如苯甲酰胺、拿草特(pronamide)、磷酰胺(phosphoric amide)、甲基胺草磷(amiprophosmethyl)(Morejohn和Foskett，1986；Akashi等，1988)，以及抗真菌劑，苯甲酰胺氯菌胺(zarilamide)(Young，1991)；(iii)抗癌藥，帕利他塞(paclitaxel)(Morejohn和Foskett，1986)、長春新堿(vincristin)、長春堿(vinblastin)；和(iv)破壞微管和/或壁特性二者的其它化合物諸如纖維素合成抑制劑和細胞骨架抑制劑，諸如鋁和香豆素，還對它們測試它們產生沒有微核形成或具有低微核形成的單細胞的能力。皮層微管和有絲分裂微管具有不同敏感性，并且來自上文所列不同類型或來自所述類型之一的化合物的組合選擇性破壞小管，其程度不影響細胞分裂，但是細胞粘附特性會受到有效的破壞，以達到和維持處于單細胞階段中的細胞，其具有低基因組不穩(wěn)定性或沒有基因組不穩(wěn)定性。
檢查微管抑制劑(MTI)對懸浮培養(yǎng)中的煙草細胞生長的影響。將第7天穩(wěn)定期細胞(1ml)轉移至250ml搖瓶中含有不同濃度(25-1000nM)MTI的培養(yǎng)基(50ml)(Bokros等，1993)，并在黑暗中于25℃在培養(yǎng)物中培養(yǎng)7天。對照和含MTI的燒瓶兩者都含有終濃度0.5-0.1％(v/v)的DMSO。在EP12培養(yǎng)基中對BY2細胞評估與這些化學品一起的生長，而在NT1B培養(yǎng)基中對BTI-NT1細胞評估與這些化學品一起的生長，其中用3％甘油替換碳源。將這些細胞的響應與對相同培養(yǎng)基組成但以3％蔗糖作為碳源的響應進行比較。使用甘油培養(yǎng)基，因為已知甘油是微管穩(wěn)定劑，而且3％甘油中適應的煙草細胞在壓力下未顯示酚類。
在1天的間隔，通過在配衡的離心管中短暫離心來沉降一式三份細胞樣品(0.5ml)，并測定鮮重。圖6中所示結果顯示了2天滯后期之后，對照細胞快速地生長4天，并在第6天進入穩(wěn)定期。與25nM DAS-PMTI-1一起培養(yǎng)的煙草細胞顯示了與對照培養(yǎng)物中的那些類似的生長動力學。然而，穩(wěn)定期期間，這些培養(yǎng)物的鮮重比對照的鮮重略微大些，這提示用50nM DAS-PMTI-1促進生長。在熒光顯微鏡下檢查經(jīng)FDA和碘化丙錠處理的細胞時，與0.5-1.0mMDAS-PMTI-1一起培養(yǎng)的細胞在培養(yǎng)啟動3天之內表現(xiàn)出完全的抑制和細胞死亡。數(shù)據(jù)表明煙草細胞生長在50nM閾值附近時受到抑制，但是超過100nM濃度引起對有絲分裂的抑制和細胞死亡。
不像秋水仙素(秋水仙素是用于產生單細胞的低效力的二硝基苯胺，其中0.25-0.5mM濃度是有效的)，DAS-PMTI-1即使在存在甘油作為NT1和BY2細胞兩者的總碳源的情況中在低至5-25nM的濃度也是非常有效的。25nM濃度范圍不僅有效釋放單細胞，而且在10天時間段里在不降低細胞生長率方面也是非常有效的(圖6)。事實上，在生長的穩(wěn)定期有生物量的略微增強，這是由于這些單細胞經(jīng)歷擴展的實情。然而，顯微鏡觀察未顯示這些單細胞中存在微核。
圖6DAS-PMTI-1對NT1煙草細胞生長的影響。在不存在或存在25nM或50nM的DAS-PMTI-1的情況中在含有3％甘油作為唯一碳源的NT1B培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。所有鮮重值表示來自重復樣品的均值±0.18。
在共焦顯微鏡下分析經(jīng)由DAS-PMTI-1產生的細胞的單細胞狀態(tài)，并且清楚地證實它們是單細胞，因為未發(fā)現(xiàn)細胞是附著的。
實施例6——轉基因懸浮系和克隆系生成的去褶合(deconvolution) 煙草懸浮液通常含有聚集體或小簇中的細胞，而且它們是高度異質的。培養(yǎng)中的細胞可能在遺傳方面是相同的(同質群體)或可能顯示一些遺傳變異(異質群體)。自單一親本細胞衍生的細胞的同質群體稱為克隆。因此，克隆群體內的所有細胞在遺傳方面是相同的，而且在細胞特征方面是高度同質的。BY2和NT1煙草細胞懸浮液在許多實驗室中常規(guī)用作模式系統(tǒng)。
除去細胞壁后，這些細胞容易被轉化(Mathur和Koncz，1998)，這直接經(jīng)由微粒轟擊或與根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)共培養(yǎng)來實現(xiàn)(An，1985；Klein等，1988；Rempel和Nelson，1995)。雖然根癌土壤桿菌介導的BY-2轉化在許多實驗室中常規(guī)地進行，我們發(fā)現(xiàn)獲得轉基因胼胝體的效率在各實驗間有所變化，并且主要取決于BY-2細胞培養(yǎng)物的品質。同步化。處于M期和G1早期的BY-2細胞比駐留于G2的細胞對穩(wěn)定根癌土壤桿菌介導的轉化易感10倍。另外，組成型表達virG基因的土壤桿菌菌株LBA4404(van der Fits等，2000)在產生轉基因胼胝體方面有效2-5倍。通常，自4mL與此土壤桿菌菌株共培養(yǎng)的BY-2細胞可獲得約500個轉基因胼胝體，容許進行表型篩選程序。然而，經(jīng)轉化懸浮系的簇或聚集體表現(xiàn)出具有異質的多種轉基因事件。因此，在各批次培養(yǎng)之間有不一致的表達水平。采用單細胞方法來使簇中細胞的嵌合混合物去褶合，并將它們分離為單獨的細胞以鑒定克隆事件。自用PAT選擇標志基因轉化的嵌合轉基因懸浮NT1煙草系(GAD1762-034)產生單細胞(圖7和8)。
圖7來自DAS GAD1762-034懸浮系的單細胞和集落生成。圖8A、8B和8C來自DAS GAD1762-034單細胞的集落的2-6周生長。
隨機挑選約20個離散的集落，并在新鮮的選擇培養(yǎng)基上進一步擴大。從這些集落產生懸浮系，并各經(jīng)過6輪7天的傳代培養(yǎng)周期而獲得快速生長系。這些集落的生物量產量在這些系和供進一步蛋白質分析用的19種高級系之間是相當一致的。
在7天和13天收集樣品達超過4輪傳代培養(yǎng)周期，并實施表達分析。將所獲得的表達數(shù)據(jù)繪圖(圖9)。
自數(shù)據(jù)分析清楚的是，在與對照懸浮聚集體系#34進行比較時可獲得在數(shù)輪傳代培養(yǎng)周期里有緊密表達的數(shù)種克隆系。另外，亞系17在表達水平上勝過對照系，指明此過程會挑選出群體中的克隆良種系，并且進一步的改良去褶合可有助于獲得均一表達的良種系。
實施例7——單細胞懸浮培養(yǎng)物的轉化 材料和方法 植物細胞材料的制備轉化前3-4天，通過將2ml NT1或BY2培養(yǎng)物轉移入250mL燒瓶中的40ml NT1B或LSBY2培養(yǎng)基中來將1周齡懸浮培養(yǎng)物傳代培養(yǎng)至新鮮的培養(yǎng)基。如上文所述的那樣使用微管抑制劑(MTI)的濃度以產生單細胞。MTI處理后4天或7天收集單細胞。
圖10使用DAS-PMTI-1(DAS專賣的甲基吲哚衍生物和有效力的微管抑制劑除草劑)來分離的BY2細胞的單細胞。使用20-50nM濃度來在傳代培養(yǎng)5天后產生單細胞。注意細胞是單細胞(一對具有交疊的邊緣)，并在附接有共焦成像系統(tǒng)的微差干涉相差顯微鏡下拍攝照片。
在經(jīng)由Beckman流式細胞儀處理BY2單細胞時，有658250個活細胞/ml培養(yǎng)基，活細胞具有10.43um的直徑均值和593.8um3的體積。
土壤桿菌制備在-80℃在50％甘油中貯存含有YFP基因(pDAB4613)構建體的根癌土壤桿菌菌株LBA4404。使用20-500μl等分試樣的含有表達載體的儲用培養(yǎng)物來啟動液體培養(yǎng)基，其直接通過將20-500μl添加至30ml YEP液體培養(yǎng)基來實現(xiàn)，所述YEP液體培養(yǎng)基含有10g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、5g/L NaCl、10g/L蔗糖和50mg/L壯觀霉素。在黑暗中于28℃和以150-200rpm溫育18-20小時后，直至培養(yǎng)物達到OD600約為1.5的密度。
為了核轉化的單細胞共培養(yǎng)轉化時，將1.0ml土壤桿菌懸浮液添加至裝有40ml 4或7天齡煙草單細胞懸浮液(在培養(yǎng)基中預先清洗以除去任何MTI)的燒瓶，并通過使用10ml寬口移液器上下吹吸5次來混合。然后以250μl等分試樣將均一的懸浮液轉移入24孔板中，包裹在石蠟膜中，并在黑暗中于25℃在不進行搖動的情況中培養(yǎng)3天。如下測試約50μl懸浮液的等分試樣，即將其放置在顯微鏡載玻片上，并尋找黃色熒光蛋白(YFP)瞬時表達。
為了核轉化的單細胞PEG/DNA處理在啟動傳代培養(yǎng)時用1mM終濃度的在NT1B培養(yǎng)基中的秋水仙素(Fluka)處理JT-NT1細胞聚集體懸浮液，并在定軌搖床上以125rpm培養(yǎng)7天。于25℃培養(yǎng)懸浮液。第7天結束時，從燒瓶中收集1ml(0.6OD600)單細胞，并分配至14ml無菌管中。添加10ml MaMg培養(yǎng)基(關于組分，參見下表1)，并以約1000rpm旋轉5分鐘。

倒掉液體，將細胞重懸于300μl MaMg中，并添加約50μg質粒DNA。向此單細胞和DNA混合物緩慢添加300μl PEG 3350(40％PEG 3350w/v、0.4M甘露醇、0.1M Ca(NO3)2，最終pH 5-6)，并將其溫和地混合。將單細胞、DNA和PEG混合物于室溫溫育20分鐘，然而添加10ml W5(清洗培養(yǎng)基)，并以約1000rpm旋轉5分鐘。倒掉液體，添加2ml基礎液體培養(yǎng)基(NT1B)，并將細胞懸浮液轉移到多孔板中。如此可將數(shù)個重復轉移入24孔板的孔中。在20-24小時時如下測定YFP瞬時表達，即將50μl體積的細胞懸浮液移至顯微鏡載玻片上，然后在具有合適濾光器(激發(fā)500/20nm，二鉻(diachrome)，發(fā)射535/30nm)的熒光顯微鏡下檢查它們。
為了質體轉化的單細胞生物射彈轟擊在EP 12％培養(yǎng)基中的20-50nMDAS-PMTI-1中處理BY2細胞以增加質體數(shù)目，并且其中或是沒有2，4-D或是添加BAP以增加質體的大小，其進行7天。在第7天結束時，收集單細胞，并將2ml懸浮液轉移至濾紙。將細胞保持在LS BY2凝膠培養(yǎng)基上達2小時以進行干燥。射擊來自2，4-D缺陷型單細胞系和經(jīng)BAP處理的細胞系的各5塊平板。用50nM DAS-PMTI-1處理這些細胞達2周，而在第3周，它們處于20nmDAS-PMTI-1中。細胞是良好的，而且相對健康。
使用生物射彈槍(biolistic gun，BioRad)，遵循標準方案用0.6μm金顆粒上的pDAB3969轟擊細胞。在不含選擇劑的培養(yǎng)基上恢復2天后，將它們轉移至LS-BY212％蔗糖+100mg/L卡那霉素選擇。
結果和討論 核轉化成果對PEG(圖11)和Agro轉化(圖3)的嘗試清楚地顯示了彼此類似的表達頻率。在所分析的50μl細胞等分試樣中，有2-3個YFP表達細胞。如此，一批約每10970個單細胞中才有一個經(jīng)轉化的細胞，指明所述過程可能不是非常有效的。有可能的是，細胞沒有除去殘余的秋水仙素，并且在平行實驗中，細胞以較高的集落頻率更快且更健康地恢復成集落。這指明在優(yōu)化實驗中清洗步驟增加轉化頻率。若僅會自單細胞挑出一個事件，則在這兩種轉化方法中在微孔板中每ml單細胞會有至少50-60個經(jīng)轉化的細胞。然而，可進一步優(yōu)化轉化條件，并且可分離額外的、穩(wěn)定轉化的集落。
圖11PEG處理72小時后的YFP表達(Ubi10-YFP質粒)。焦平面中小的子(分裂)細胞之一顯示GFP表達，指明表達可以是穩(wěn)定的。
質體轉化培養(yǎng)6周后，在選擇培養(yǎng)基上鑒定出5個活躍生長的集落。然而，在100mg/L卡那霉素選擇中殺死了對照未處理的細胞(圖12)。對活躍生長的集落進行取樣，并通過PCR進行分析以測定質粒的整合。5個集落中的2個顯示了清楚的PCR產物，指明質體中整合了轉基因。
圖12左，由100mg/L卡那霉素抑制的未處理對照組織；右，選擇培養(yǎng)基上生長的單細胞衍生的推定轉質體分離群。
正在實施進一步的實驗以進一步開發(fā)高通量核和質體轉化方案。
正在實施進一步的轉化實驗來優(yōu)化方案，以便為新的生物加工研究和開發(fā)進一步開發(fā)HTP和無主鏈(使用片段純化的質粒)轉化方案。
實施例8——懸浮培養(yǎng)物在甘油培養(yǎng)基中的適應 材料和方法 為了同步化的培養(yǎng)物條件化。為了改善同步化，將所有的培養(yǎng)物繼續(xù)2周而不進行傳代培養(yǎng)，接著在50ml新鮮培養(yǎng)基中稀釋1ml舊培養(yǎng)物。該傳代培養(yǎng)后2天對未分化的且分裂中的細胞進行計數(shù)(觀察到高至40％的無絲分裂指數(shù))，而在培養(yǎng)后10天觀察到分化的非分裂細胞。對整個制片規(guī)程使用0.5ml懸浮液樣品。
細胞培養(yǎng)物 長期嫩黃-2(BY-2)培養(yǎng)于LSGS-BY2培養(yǎng)基(附錄1)中，而NT1細胞和短期Petite哈瓦那(PHL)煙草懸浮細胞培養(yǎng)于LSG-BY-2培養(yǎng)基(附錄II)或G-NT1培養(yǎng)基(附錄III)中。在生長培養(yǎng)基中，所有的培養(yǎng)基都具有甘油，作為替代蔗糖的碳源，例外是在常規(guī)BY2培養(yǎng)物的情況中，其中培養(yǎng)基在甘油之外還具有1％蔗糖。在250ml Erlenmeyer瓶中以一周間隔稀釋懸浮培養(yǎng)物(50ml新鮮培養(yǎng)基中的1ml舊培養(yǎng)物)。在旋轉式搖床上以100rpm攪動細胞懸浮液，并于25℃和在黑暗中維持。Vos等，“Microtubules become more dynamicbut not shorter during preprophase band formationa possible‘Search-and-Capture’mechanism for Microtubule translocation，”Cell MotilCytoskeleton 57246-258，2004。
甘油培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)物的特征 所有培養(yǎng)物的總體生長在與糖培養(yǎng)的對照培養(yǎng)物相比時是下降的。然而，在培養(yǎng)接種物的起始水平提高時，獲得正常的生長速率。細胞是健康的，而且有可能在沒有糖對照培養(yǎng)物中觀察到的典型細胞褐變的情況中將它們在培養(yǎng)物中繼續(xù)培養(yǎng)長至2周。甘油培養(yǎng)物中培養(yǎng)的細胞在與其糖培養(yǎng)的對應物進行比較時在懸浮單元中具有更高的細胞聚集。在實驗中使用這些細胞以測試MTI化合物破壞聚集的亞單元的細胞粘附特性，因為甘油減輕膜的穩(wěn)定性。
附錄I LSGS-BY2培養(yǎng)基組成如下Murashige和Skoog大量和微量鹽類(macroand micro-salts)(Murashige和Skoog 1962)，補充有30ml甘油(v/v)和10g蔗糖(w/v)、100mg/l肌肉肌醇、200mg/l KH2PO4、1mg/l硫胺素和0.2μg/l 2，4-二氯苯氧基乙酸。將培養(yǎng)基調節(jié)至pH 5.8，之后高壓滅菌。
附錄II LSG-BY2培養(yǎng)基組成如下Murashige和Skoog大量和微量鹽類(Murashige和Skoog 1962)，補充有30ml甘油(v/v)、100mg/l肌肉肌醇、200mg/lKH2PO4、1mg/l硫胺素和0.2μg/l 2，4-二氯苯氧基乙酸。將培養(yǎng)基調節(jié)至pH 5.8，之后高壓滅菌。
附錄III G-NT1培養(yǎng)基組成如下Murashige和Skoog大量和微量鹽類(Murashige和Skoog 1962)，補充有30ml甘油(v/v)、100mg/l肌肉肌醇、180mg/l KH2PO4、1mg/l硫胺素和2mg/l 2，4-二氯苯氧基乙酸。將培養(yǎng)基調節(jié)至pH 5.8，之后高壓滅菌。
實施例9——自雙子葉植物(煙草(BY2、NT1、Petite哈瓦那、Xanthi))，胡蘿卜(Daucus carota L.ssp.sativus cv Sativa)的懸浮培養(yǎng)物產生單細胞 胡蘿卜懸浮培養(yǎng)物 已經(jīng)自體外維持的胡蘿卜(Daucus carota L.ssp.sativus cv Sativa)植株啟動胡蘿卜胼胝體培養(yǎng)物。在半固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)分離的葉柄外植體(Mashayekhi-Nezamabadi，2000)。通過將50mg易碎的胼胝體轉移到24微孔板中的1.5ml LSBY2培養(yǎng)基(附錄I)中來從胼胝體啟動懸浮培養(yǎng)物。然后將生長最快的懸浮液的1ml懸浮液轉移至燒瓶中的35ml LSBY2液體培養(yǎng)基。在7天傳代培養(yǎng)周期中在漫射光中維持培養(yǎng)物。這些培養(yǎng)物是可再生的，并且懸浮單元是成塊的，具有緊密排列的細胞。在傳代培養(yǎng)的懸浮液啟動階段用0.5mM-1mM秋水仙素或用25nM-0.5mM DAS-PMTI-1(4-氯-1，5-二苯基-1H-吡唑-3-基氧)-乙酸乙酯)處理時，來自所述單元的細胞在培養(yǎng)啟動的第3天內分離，并釋放入培養(yǎng)基中。細胞培養(yǎng)物在秋水仙素處理中顯示單細胞的同質產生，而在DAS-PMTI-1中顯示單細胞產生，但具有各種各樣的細胞形狀而不是球形的。細胞具有完整的細胞壁，如在熒光顯微鏡下通過Calcafluor染色劑所分析的。
胡蘿卜單細胞懸浮液的克隆系產生 使用LSBY2新鮮培養(yǎng)基將處于生長穩(wěn)定期(0.5M秋水仙素處理中培養(yǎng)啟動后7天)的單細胞懸浮液稀釋至0.6OD660。將1.5ml經(jīng)稀釋的單細胞培養(yǎng)物鋪板于15X100Petri板中的M培養(yǎng)基(附錄II)上，并使用接種環(huán)來展開。未處理的胡蘿卜懸浮聚集體也稀釋至相同的密度，并類似地鋪板以比較這些培養(yǎng)物之間的生長應答。在黑暗中生長4周后，具有單細胞的平板產生數(shù)個離散的集落，指明自這些細胞能獲得克隆系。然而，未處理的懸浮液顯示了平板表面上胼胝體的胞苔生長(圖13)。如此，可能顯示了，分離的胡蘿卜細胞能產生自單個細胞衍生的集落以產生克隆系。
圖13自胡蘿卜單細胞懸浮液產生克隆系。用未處理的懸浮聚集體鋪板的M培養(yǎng)基上的胞苔生長(小圖A)。用單細胞鋪板的培養(yǎng)基上的離散集落生長(小圖B)。
實施例10——自單子葉植物(玉米、稻(T309)、野茅(Orchard grass)、小麥(Anza))的懸浮培養(yǎng)物產生單細胞 全能的含葉綠素的玉米細胞培養(yǎng)物 啟動玉米光合自養(yǎng)培養(yǎng)物，并以7天培養(yǎng)周期維持(Jayakumar等2005)。傳代培養(yǎng)時用25nM-0.5mM DAS-PMTI-1(4-氯-1，5-二苯基-1H-吡唑-3-基氧)-乙酸乙酯)或10nM-0.5mM氟樂靈處理培養(yǎng)物以自聚集體分離單細胞。秋水仙素僅在0.5mM以上至1mM的范圍的濃度是有活性的并釋放單細胞(圖14)。玉米懸浮單元在與所分析的雙子葉植物細胞進行比較時緊密擠壓成堅實的細胞聚集體。然而，綠色玉米細胞懸浮液具有最堅實的懸浮單元，并且處理顯示了7天中高至50％的活的單細胞釋放，其可通過以100rpm的短暫旋轉或流經(jīng)具有直徑范圍75-100um的孔的篩子過濾來分離。
圖14啟動傳代培養(yǎng)后第14天(第2輪傳代培養(yǎng)周期結束時)所分析的培養(yǎng)物和液體培養(yǎng)基中的0.5-1mM秋水仙素處理。A自簇釋放單細胞；B用FDA活體染色劑染色的緊密擠壓的細胞聚集體；C和D過濾懸浮液(使用具有100um孔徑的濾器)后，經(jīng)FDA染色的分別在1mM和0.5mM處理中釋放的單細胞；E和F來自D的單細胞的更近視圖。
野茅和稻(T309)懸浮培養(yǎng) 在半固體培養(yǎng)基上自成熟的種子(DAS種子保藏中心)啟動野茅和T309胼胝體。使用Fauquet等，1996所述方案，自此種子衍生的胼胝體啟動懸浮培養(yǎng)物。以7天傳代培養(yǎng)周期在黑暗中在搖瓶中以150rpm維持懸浮細胞培養(yǎng)物。以類似的濃度范圍使用與那些針對玉米(上文)所述的類似的MTI化合物。啟動培養(yǎng)后3-5天釋放野茅和稻單細胞。
小麥(Anza栽培變種)懸浮培養(yǎng) 在半固體MS2-D小麥培養(yǎng)基(附錄III)上自小盾片(scultellum)組織啟動Anza小麥胼胝體。自經(jīng)過滅菌和浸泡的組織分離小盾片組織，并將自不同組織誘導的胼胝體轉移至液體MS-2D小麥培養(yǎng)基(附錄III)。分離到一種快速生長的細胞懸浮系，并以7天傳代培養(yǎng)周期在MS2D液體培養(yǎng)基上進一步傳代培養(yǎng)7年，并長期(7年)維持。為了產生單細胞，首先在NB麥草畏(dicamba)液體培養(yǎng)基(附錄IV)中培養(yǎng)物使適應?？蓪nza小麥培養(yǎng)物進行條件化以在此培養(yǎng)基中產生具有一致大小的細胞聚集體單元的精細懸浮液。在傳代培養(yǎng)啟動階段將秋水仙素、氟樂靈或DAS-PMTI-1添加至接種物，以25nM-1mM濃度范圍加入培養(yǎng)基中。從啟動培養(yǎng)后3天起，懸浮液釋放單細胞入培養(yǎng)基中。單細胞是小且均一的。
附錄I LSBY2培養(yǎng)基組成如下Murashige和Skoog大量和微量鹽類(Murashige和Skoog 1962)，補充有30g蔗糖(w/v)、100mg/l肌肉肌醇、200mg/l KH2PO4、1mg/l硫胺素和0.2μg/l 2，4-二氯苯氧基乙酸。將培養(yǎng)基調節(jié)至pH 5.8，之后于120℃高壓滅菌。使用培養(yǎng)第7天(處于穩(wěn)定期)的懸浮體積來啟動培養(yǎng)物。將1ml體積的胡蘿卜懸浮接種物轉移入50ml LSBY2培養(yǎng)基中，然后在黑暗中在28℃以150rpm將培養(yǎng)物放置在搖床上。在培養(yǎng)啟動周期將所使用的MTI化合物連同新鮮培養(yǎng)基一起添加。
附錄II M培養(yǎng)基組成如下LS基礎鹽類和B5維生素、30g葡萄糖、各1uM 2，4-D和細胞分裂素(Kinetin)，并將培養(yǎng)基調節(jié)至pH 5.8，之后將8gm/L Noble瓊脂添加至培養(yǎng)基。然后將培養(yǎng)基進行高溫滅菌，并倒入15X100 Petri板中。
附錄III MS2D培養(yǎng)基組成如下MS鹽類(Murashige和Skoog 1962)和Eriksson氏維生素，補充有2mg 2，4-D、0.5mg硫胺素、30g蔗糖、400mg肌肉肌醇、400mg酪蛋白水解物(ECH)。將培養(yǎng)基pH調節(jié)至5.8之后，將培養(yǎng)基進行高溫滅菌。以7天間隔例行地對懸浮培養(yǎng)物進行傳代培養(yǎng)(54ml新鮮培養(yǎng)基中6ml所使用懸浮液的起始接種物)，并在以150rpm搖動的情況中在黑暗中于28℃培養(yǎng)。在這些條件下，細胞群體在接種后2天和6天之間總是處于指數(shù)生長。對于從成熟的種子小盾片誘導胼胝體的凝膠培養(yǎng)基，MS2D培養(yǎng)基含有額外成分2.5g/L Gelrite，其在調節(jié)pH之后添加。
附錄IV. NB麥草畏培養(yǎng)基組成如下NB基礎鹽類、蔗糖30g/L、肌肉-肌醇100mg/L、ECH酪蛋白水解物(ECH)300mg/L、L-脯氨酸(2.5M)1.7ml/L、L-谷氨酰胺500mg/L和6.6mg/L麥草畏。將培養(yǎng)基調節(jié)至pH5.8，之后過濾滅菌。
實施例11——胡蘿卜單細胞產生和Si-C晶須介導的胡蘿卜單細胞懸浮培養(yǎng)物的遺傳轉化 胡蘿卜單細胞懸浮液的啟動 將可再生的胡蘿卜冷凍保存系(D2-40-018)融化，并在Linsmeier-Skoog(LS)培養(yǎng)基(Nagata，T.，Nemoto，Y.和Hasezawa，S.(1992)Int.Rev.Cyto 132，1-30)中培養(yǎng)。培養(yǎng)基鹽購自PhytoTechnology Laboratories，產品目錄編號L689。在一周內建立活躍生長的懸浮系，并通過將2ml PCV轉移至58ml LSBY2懸浮培養(yǎng)基來在28℃在定軌搖床(Innova-3300)上以125rpm在漫射光下以7天培養(yǎng)周期對維持系進行傳代培養(yǎng)。為了單細胞產生，將1ml PCV的處于穩(wěn)定期的胡蘿卜懸浮液添加入30ml具有1mM秋水仙素(Sigma，產品目錄編號C3915)的LS懸浮培養(yǎng)基中，并培養(yǎng)7天。自3-7天培養(yǎng)物產生單細胞，并為轉化實驗做好了準備?？扇缦聦⒑}卜的單細胞維持在穩(wěn)定期長至28天，即通過添加60ml新鮮的LS BY2液體培養(yǎng)基來在14天時稀釋培養(yǎng)物。
WHISKERSTM介導的胡蘿卜單細胞的遺傳轉化 啟動培養(yǎng)后4天和11天時觀察到具有1mM秋水仙素的LSBY2培養(yǎng)基中所產生的單細胞。單細胞是非常有活性的而且是活的，如通過熒光素二乙酸酯染色劑所測定的。在草銨膦(glufosinate ammonium)平板上選擇后10天和25天，自單細胞衍生的集落觀察到表達黃色熒光蛋白的胼胝體事件。
遺傳轉化胡蘿卜單細胞 在轉化實驗中使用改良的WHISKERSTM轉化方案[Petolino，Welter和Cai(2003)Molecular Methods of Plant Analysis，卷23，147-158，章9，GeneticTransformation of Plants，ISBN 3540002928]。如下啟動實驗，即單細胞處理和培養(yǎng)啟動后第4天和第11天將25ml單細胞胡蘿卜懸浮液轉移入無菌的250ml IEC-離心瓶(Fisher Scientific產品目錄編號05-433B)中。通過添加8.1ml新鮮制備的5％晶須懸浮液(Silar SC-9，Advanced Composit Materilas Corp，Greer，SC)和170ug pDAB3831來實施轉化，其中pDAB3831含有驅動PAT基因的AtUbi10啟動子和驅動YFP基因的CSVMS啟動子。每次轉化由一個瓶子組成，所述瓶子放置在改良的涂料混合器(Red Devil Equipment Co，Minneapolis，MN)中，并在高處攪動10秒，之后將細胞返回至500ml回收燒瓶，并添加100ml新鮮的LSBY2液體培養(yǎng)基。容許細胞在旋轉式搖床上以125rpm和于28℃恢復1小時。
恢復之后，將3ml細胞懸浮液的等分試樣均勻地分配至擱在布氏漏斗上的無菌55mm 4號濾紙片(Whatman International Ltd.)上，并吸去液體培養(yǎng)基。然后將具有細胞的濾紙放置在裝有含15mg/l草銨膦和作為膠凝劑的0.8％TC瓊脂的半固體LSBY2-B15培養(yǎng)基的60 x 20mm培養(yǎng)皿上。將平板在黑暗中于28℃溫育。10天后，取出濾紙上表達GFP的事件，并放置在單獨的LSBY2-B15半固體平板上。將剩余的濾紙和細胞轉移至新鮮的半固體LSBY2-B15培養(yǎng)基，并在黑暗中于28℃溫育。
單細胞集落事件的分析 使用“EnviroLogix

PAT/pat平板試劑盒”，經(jīng)由靈敏ELISA測定法來對推定的轉基因事件分析功能性PAT選擇標志蛋白，所述推定的轉基因事件為在啟動轉化實驗后25天在Leica倒置熒光顯微鏡下均勻地發(fā)熒光。EnviroLogix

PAT/pat平板試劑盒是“三明治式”酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)。將胼胝體組織放置在微量離心管中，并添加250ul提取緩沖液。提取緩沖液是PBS(Fisher產品目錄編號BP665-1)和0.05％Tween-20(Sigma-Aldrich產品目錄編號P1379)。在微量離心管中用小的手提式研杵來研磨所述組織。以11,000rcf離心樣品提取物達1分鐘，并以下列稀釋度在ELISA中使用上清液1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32和1∶64。如Envirologix試劑盒產品編號AP014中所述的那樣遵循ELISA方法。在此測試中，將樣品提取物添加至經(jīng)針對來自pat基因的PAT制備的抗體包被的測試孔。樣品提取物中所存在的任何剩余物結合抗體，然后通過添加經(jīng)酶(辣根過氧化物酶)標記的PAT/pat抗體來檢測。簡單的清洗步驟后，用顯色步驟來顯現(xiàn)測定法的結果；顯色與樣品提取物中的PAT/pat濃度成正比。
結果顯示樣品比率143mg/250ul提取緩沖液的陰性對照組織在PATELISA中不產生數(shù)值。樣品比率63mg/250ul的事件001B確實產生83ng/ml的ELISA數(shù)值，其等于每mg胼胝體有330pg PAT，如此指明明亮地發(fā)熒光的事件確實被在預期范圍中發(fā)熒光的兩種PhiYFP并還被PAT選擇標志基因轉化了。
實施例12——微管抑制劑的化學類別和植物單細胞產生 微管和微原纖維(microfibril)之間的平行進化代表對未知極化原理的相關應答而非因果關系(Emons等，1992)。這由數(shù)個例子所支持，其中受到水壓力(water-stressed)的玉米(玉蜀黍(Zea mays))根成熟區(qū)中的大多數(shù)細胞具有右手螺旋的微管排列，但左手螺旋的微原纖維(Baskin等，1999)。類似地，擬南芥屬(Arabidopsis)(擬南芥(Arabidopsis thaliana))突變體即微管組構1(morl)具有異常的微管排列，但具有明顯未改變的微原纖維排列(Himmelspach等，2003；Sugimoto等，2003)。我們的實驗中的單細胞懸浮液顯示了與對照的生長應答類似的生長應答，其中干重在細胞傳代培養(yǎng)周期里增加，指明細胞在較低濃度的微管蛋白抑制劑(MTI)中進行分裂，盡管有如下實情，即它們具有顯示各向同性生長且放射狀擴展的細胞。另外，通過改變培養(yǎng)基組成，有可能在此類具有拍攝到的各向同性生長的單細胞中看到細胞板，這進一步支持如下實情，即這些細胞確實在低水平的MTI濃度中進行分裂。如此，用低濃度的微管抑制劑處理并在培養(yǎng)基中在最佳水平中維持的植物細胞能使皮層微管的實質性群體保持不改變。這會容許單細胞繼續(xù)正常的細胞壁建造過程(包括成膜體建造)，其對于細胞分裂是重要的先決條件。
為了部分抑制微管功能并選擇在低水平中選擇性破壞它們的化合物，篩選不同類別的化合物。MTI與植物微管蛋白的相互作用已經(jīng)受到充分表征(Hugdahl和Morejohn，1993)。然而，用任何抑制劑，都有非特異性效應(Vaughn和Lehnen，1991)。因此，在此實施例中，評估具有不同化學性質的微管抑制劑類別的比較以鑒定能維持單細胞生長而沒有非特異性效應的化合物。存在有如下化合物諸如氯苯胺靈(clorpropham)，已知它們以低于刺激放射狀擴展所需的濃度抑制延伸，因為它們對有絲分裂微管的影響比對皮層微管的影響更活躍(Hoffman和Vaughn，1994)。如此，此工作的目的是選擇如下化合物，其在低的最佳濃度中會保留足夠的皮層微管，以實施正常的細胞功能同時維持各向同性生長，但同時具有低的非特異性抑制效應或沒有非特異性抑制效應。
秋水仙素是草酚酮(tropolone)衍生物，其立體化學結構和作用模式是完善建立的(Keats和Mason，1981；Margolis和Wilson，1977；Raugh和Wilson，1980；Murgulis，1974)，并且其阻止從微管蛋白二聚體形成微管。拿草特(Propyzamide)及其它苯甲酰胺作用于植物細胞中的核紡錘體(Akashi等，1988；Bartels PG和Hilton JL.，1973；Carlson等，1975)，并被開發(fā)為萌前除草劑，其對一年生禾本科植物和闊葉草是有效的(Aya等，1975)。磷酰胺的用途與二硝基苯胺除草劑(包括黃草消(Surflan)和氟樂靈(Treflan))的那些用途類似(Ashton和Crafts，1981)。氟樂靈是二硝基苯胺除草劑家族的眾所周知的代表之一；其破壞植物微管，但在動物細胞中是無效的(Hess和Bayer，1974；Hess和Bayer，1977)。吡啶具有苯環(huán)，其中碳之一被氮替換。有數(shù)種作為除草劑使用的經(jīng)取代的吡啶。在此組中有氟硫草定(dithiopyr，

)和噻氟啶草(thiazopyr，

)。氟硫草定是選擇性的萌前和萌后材料，其僅在草皮上使用以控制極其多種禾本科雜草。它常常與其它除草劑一起配制，并在肥料上配制。噻氟啶草是選擇性的萌前化合物，其良好地針對實際上所有的禾本科雜草起作用，而且對極其多種作物(包括柑桔、棉、玉米、花生、大豆和馬鈴薯)起作用。如此，吡啶表現(xiàn)為功能上的微管裝配抑制劑。
材料和方法 JTNT1煙草懸浮培養(yǎng)物。通過將1ml充實細胞體積(PCV)傳代培養(yǎng)入20ml煙草培養(yǎng)基(MS鹽類、肌肉-肌醇、鹽酸硫胺素(1mg/ml)、磷酸氫二鉀(無水的)、MES、2，4-D(10mg/ml)和3％甘油(NT1B培養(yǎng)基)中來維持JTNT1煙草細胞懸浮培養(yǎng)物。每7天對細胞系進行傳代培養(yǎng)，并根據(jù)測試需要而放大。1M蔗糖抑制紫杉醇誘導的植物微管蛋白聚合的速率和程度兩者(Bokros等，1993)。存在1M蔗糖的情況中植物微管蛋白聚合的調查(APM(甲基胺草磷)和黃草消兩者)產生植物微管長度的濃度依賴性縮短(Morejohn和Fosket，1984；Morejohn等，1987)。此外，蔗糖使預成型微管穩(wěn)定，使MTI對預成型微管的效應的檢查不能實行。另外，蔗糖實質性增加溶液粘度，而且至少部分地通過減緩二聚體和多聚體擴散速率來改變微管蛋白聚合。如此，產生單細胞的培養(yǎng)基中具有低的蔗糖或沒有蔗糖是重要的。如此，為此研究開發(fā)甘油中適應的新JTNT1系。
對于處理，用1ml在20ml培養(yǎng)基中的PCV制備懸浮系，同時頻繁地漩渦以容許良好的細胞分布(因為懸浮聚集體趨于沉降)，然后轉移入24孔微量滴定板的孔中。24孔中的每孔裝有1ml JTNT1懸浮液。將24孔板保持在Innova4900多環(huán)境搖床(Multi Environmental Shaker)上，其具有專用夾具和挽具以容許堆積平板高至6塊平板。以130rpm的速度和于25℃在黑暗中旋轉平板。
單細胞產生。將每種化合物溶解于二甲基亞砜(DMSO)中以提供0.5摩爾儲液。將1ml JTNT1懸浮液(1ml PCV/20ml煙草培養(yǎng)基)添加至24孔板的每孔。向每孔添加單獨的化學品以達到想要的濃度(1μM、3μM和10μM)。容許培養(yǎng)物在Innova搖床上生長7天。使用SpectraMax M2e通過分子裝置(設置在600吸光度，每孔取得5次讀數(shù))對每孔取得每天濁度測量。在第7天，使用Leica 5000倒置共焦顯微鏡來對細胞觀察單細胞形成和細胞生存力。

甲基胺草磷(amiprophosmethyl)(APM)
氟硫草定(dithiopyr)
(±)-4S，5R-4-硝基-5-(2，3，4-三甲氧苯基)環(huán)己烯(三甲氧苯基環(huán)己烯) 經(jīng)由LSBY2甘油培養(yǎng)基中的BY2單細胞的克隆胼胝體事件產生。經(jīng)由Shaul等，1996所述改良的方案由pDAB1590轉化煙草BY-2細胞(Nagata等，1992)，并在共培養(yǎng)4天后在LSBY15上進行選擇?；厥毡磉_綠色熒光蛋白的胼胝體事件，并將胼胝體維持在LSBY2B15培養(yǎng)基上。一個月內，胼胝體事件生長至數(shù)厘米直徑，并將小的但明亮地發(fā)熒光的塊(約2-5mm2團塊)轉移至新鮮的固體培養(yǎng)基，以便保持給細胞提供新鮮選擇劑中的營養(yǎng)物，并選擇同質表達GFR的胼胝體。將500mg胼胝體塊轉移至250ml搖瓶中的50mlLSBY2-Gly-B15(具有作為碳源的3％甘油和1％蔗糖的改良LSBY2液體培養(yǎng)基)(130rpm，25℃，在黑暗中)。每周使用0.5ml充實細胞體積(PCV)的細胞來開始懸浮培養(yǎng)。如此，分別以每月周期和7天周期維持表達綠色熒光蛋白(GFP)的胼胝體和懸浮聚集體。
表達GFP的單細胞的產生。如下產生單細胞，即在啟動7天培養(yǎng)周期期間在LSBY2-Gly-B15培養(yǎng)基中添加1uM濃度的化合物DDP(二苯基吡唑)，連同添加0.5ml充實細胞體積(PCV)的處于穩(wěn)定期的表達GFP的懸浮聚集體?；蛘撸缦聦?5ml懸浮聚集體轉移至25ml新鮮的LSBY2-Gly-B15懸浮培養(yǎng)基，即添加50ul 1M二苯基吡唑儲液(在DMSO中溶解)以在懸浮液中提供1uM終濃度。如此，可在僅3.5天的短得多的周期中產生單細胞。LSBY215培養(yǎng)基始終含有供選擇用的15mg/l草銨膦。
整個3.5或7天培養(yǎng)周期，GFP在單細胞中作為嵌合蛋白表達，并駐留在亞細胞位置中，因為使用Leica顯微鏡并還使用Zeiss Axiovision共焦激光掃描顯微鏡使用常規(guī)的表面熒光(epifluorescence)在活細胞中觀察到嵌合構建體的GFP表達。在許多亞細胞區(qū)室(包括細胞核和胞質絲)中看到表達。
結果和討論 細胞在含有甘油的煙草培養(yǎng)基中是非常健康的，而且細胞簇是非常明顯的。細胞在7天期間里顯示良好的生物量增加，雖然與含糖的對照相比有約50％的生物量減少。對照培養(yǎng)物也具有0.1％DMSO，以便確保沒有DMSO誘導的效應。1uM 4-氯-1，5-二苯基-1H-吡唑-3-基氧)-乙酸乙酯(二苯基吡唑)向蔗糖或甘油培養(yǎng)基的添加沒有自相應的對照顯著減少細胞生物量，指明在存在二苯基吡唑的情況中有與對照類似的單細胞活躍生長。通過2個子周期或3.5天，取出培養(yǎng)物時生長曲率是類似的。與對照相比，甘油培養(yǎng)物中的單細胞產生也顯示非常高的活細胞。
已經(jīng)對數(shù)種其它化合物(包括氟樂靈、黃草消和微管蛋白穩(wěn)定劑類化合物，諸如紫杉醇)研究了它們從具有作為唯一碳源的3％甘油的NT1B培養(yǎng)基中培養(yǎng)的煙草JTNT1懸浮培養(yǎng)物產生單細胞的效率。這些是秋水仙素、N-(1，1-二甲基丙炔基)3-氯苯甲酰胺、拿草特和氟樂靈。在這些研究中，所述化合物在其單細胞產生效率及在劑量-響應曲線的陡度方面有差異。黃草消(像所測試的其它化合物一樣)增加單細胞直徑至少4倍，而且具有約10倍閾值的飽和濃度。秋水仙素增加直徑5倍，而且具有較陡的劑量-響應曲線，這表明這兩種化合物可能優(yōu)選在高劑量工作。
產生單細胞所必需的濃度，對秋水仙素而言為介于50uM和2mM之間的范圍內，而對于拿草特，N-(1，1-二甲基丙炔基)3-氯苯甲酰胺而言為介于10nM和100uM之間。然而，黃草消和氟樂靈用于最佳單細胞產生的濃度在100nM-1mM的范圍。然而，在高濃度中的這些化合物增加所處理細胞中發(fā)生的蛋白質合成、質體和線粒體分裂，導致形成大至300uM直徑且具有核多倍性的巨大細胞，如培養(yǎng)21天的胡蘿卜細胞中所看到的。這些結果提示有絲分裂抑制是這些化合物在所研究高濃度時的基本效應。如此，似乎重要的是，不僅保持MTI的最佳濃度，而且保持該化合物的化學性質(其對細管會具有非常選擇性的功能而沒有與細胞分裂功能類似的非選擇性功能)。和目標一致，下文描述了其它化合物，除較早所述二苯基吡唑之外。
觀察到BY2懸浮聚集體在LSBY2糖培養(yǎng)基中；1uM二苯基吡唑中產生的正在分裂的BY2單細胞在改良的LSBY2培養(yǎng)基中顯示細胞板；去褶合的BY2GFP轉基因細胞和LSBY2-15凝膠培養(yǎng)基上的單克隆集落事件。
LSBY2甘油培養(yǎng)基中的煙草BY2單細胞產生的匯總。在1uM二苯基吡唑中自聚集體懸浮液產生的單細胞在培養(yǎng)3.5天時在90％的細胞中顯示具有一個或兩個核仁的單個細胞核?？蓪⑦@些細胞鋪板于具有0.8％TC瓊脂和15mg/l作為選擇劑的草銨膦的LSBY2凝膠平板上，因為轉化聚集體懸浮液所使用的pDAB 1590質粒具有作為選擇標志的PAT。以1∶4稀釋在液體培養(yǎng)基中稀釋細胞，鋪板于凝膠培養(yǎng)基上，并在鋪板后21天中選擇克隆事件。
關于甲基胺草磷(APM)，在添加至JTNT1懸浮液后，在1-10μM濃度中形成單細胞；在更高的濃度有顯著的生長減少和細胞分裂抑制。與僅具有DMSO的對照相比，可在1μM和3μM APM的照片中看到球形的分開的細胞。在存在1μM和3μMAPM的情況中，JTNT1煙草細胞是健康的黃色，并且良好地生長。細胞生存力(如通過熒光素二乙酸酯和碘化丙錠染色劑所測量的)顯示了高至70％的生存力。
再次觀察到甘油培養(yǎng)基中APM誘導的JTNT1煙草細胞的單細胞產生。在具有甘油和0.1％DMSO的培養(yǎng)基中觀察到JTNT1對照懸浮聚集體；在具有1、3和10uM APM的NT1B甘油培養(yǎng)基中觀察到JTNT1單細胞。
氟硫草定屬于破壞微管的經(jīng)取代吡啶除草劑的類別。在以1μM、3μM和10μM的濃度添加至JTNT1懸浮物時，使用1μM和3μM濃度(照片E和F)時形成了單細胞，但是10μM濃度具有單細胞(并且細胞濃度是低的)。在所測試的所有濃度使用氟硫草定時，煙草細胞是健康的，正在生長，且是黃色的。用1μM和3μM氟硫草定處理后的細胞生存力在70-80％之間，指明較高的生存力。
在JTNT1煙草培養(yǎng)物中對秋水仙素模擬物(Evans等，2003)(±)-4S，5R-4-硝基-5-(2，3，4-三甲氧苯基)環(huán)己烯(三甲氧苯基環(huán)己烯)測試其單細胞產生效率。雖然細胞(它們是略微暗黃色的)中有輕微的脫色，但是細胞在平板上非常良好地生長。在1μM、3μM和10μM時，此化學品促進單細胞的形成。細胞是球形的，而且所有水平間的細胞生存力在80-90％的范圍。細胞生長抑制在所測試的濃度間是相當類似的，并且細胞是健康的，具有高的生存力和較小的細胞毒性。
如此，在用10uM濃度的三甲氧苯基環(huán)己烯誘導時在甘油培養(yǎng)基中觀察到JTNT1煙草細胞的誘導的單細胞產生。
超級單細胞(super single cell)。可將胡蘿卜懸浮聚集體培養(yǎng)在60ml含1mM秋水仙素的LSBY2液體培養(yǎng)基中，并維持在相同的培養(yǎng)基中達長至28天。第2輪傳代培養(yǎng)后的生長在14天后下降，但細胞保持生長以形成超級單細胞，其是活的而且是健康的(但是顯示廣泛的葉狀細胞核，指明核多倍性的發(fā)生)。在具有LSBY2培養(yǎng)基中連續(xù)1mM秋水仙堿的21日齡細胞中觀察到具有數(shù)個細胞核的胡蘿卜超級單細胞。
結論 通過目視觀察、干重(僅在第7天取得的)和濁度讀數(shù)來觀察這些測試水平中的細胞生長。圖15描繪了7天期間內取得的濁度讀數(shù)。濁度讀數(shù)關于僅含有培養(yǎng)基(具有3％甘油)和1μM、3μM和10μM濃度的微管抑制劑的平板。雖然對照具有最好的生長模式(如預期的)，但是在1μM和3μM的比率，沒有一種所測試的化學品引起細胞系死亡。在所有的處理中的細胞大約在相同時間點(第3天)經(jīng)歷生長速率增加，而細胞體積在第7天時仍然增加。這顯示經(jīng)化學方法處理的細胞保持能存活的達至少7天。
實施例12參考文獻 1.Akashi等(1988).Plant Cell Physiol 29(6)1053-1062 2.Aya等(1975).Fifth Asian-Pacific Weed Science Society Conference，pp138-141 3.Bartels PG和Hilton JL(1973).Pestic Biochem Physiol 3462-472 4.Carlson等(1975).Weed Sci 23155-161 5.Emons等(1992).Physiol Plant 84486-493 6.Evans等(2003).Tetrahedron 592223-2229 7.Hess FD和Bayer DE(1974).Acala 4-42″).J Cell Sci 15429-441 8.Hess FD和Bayer DE(1977).J Cell Sci 24351-360 9.Himmelspach等(2003).Plant J 36565-575 10.Hoffman JC，Vaughn KC(1994).Protoplasma 17916-25 11.Hugdahl JD，Morejohn LC(1993).Plant Physiol 102725-740 12.Keates RAB和Mason GB(1981).Can J Biochem 59361-370 13.Margolis RL和Wilson L(1977).Proc Natl Acad Sci USA 743466-3470 14.Murthy，J.等(1994).Plant Physiology 105309-320 15.Margulis TN(1974).J Am Chem Soc 96899-901 16.Nagata，T.，Nemoto，Y.和Hasezawa，S.(1992).Int.Rev.Cytol.1321-30 17.Rauch CT和Wilson L(1980).Biochemistry 195550-5557 18.Shaul O，Mironov V，Burssens S，Van Montagu M，InzéD(1996).Proc NatlAcad Sci USA 934868-4872 19.Sugimoto K.等(2003).Plant Cell 151414-1429 20.Vaughn，K.(2006).Pesticide Biochemistry and Physiology，84(2)63-71 21.Vaughn KC，Lehnen LP Jr(1991).Weed Sci 39450-457 實施例13——對MTI產生的單細胞亞細胞結構、細胞發(fā)生和分子基因組不穩(wěn)定性評估的比較調查 已經(jīng)在數(shù)種植物物種中在細胞發(fā)生水平研究了組織培養(yǎng)衍生的植株中的總基因組穩(wěn)定性(Shoyama等1995；Zoriniants等2003)。關于embling衍生的植株的穩(wěn)定性，細胞發(fā)生研究已經(jīng)揭示了對比觀察。Odake等(1993)報道了分別在自Gellan Gum固化培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基獲得的石刁柏(Asparagusofficinalis L.)的66.7％和100％embling中的染色體加倍(自二倍體至四倍體)。相比之下，Mamiya等(2001)報道了石刁柏中體細胞胚發(fā)生期間沒有倍性變化。已經(jīng)有報道，培養(yǎng)基中所使用的合成生長素(諸如2，4-D(2，4-二氯苯氧基乙酸)和NAA(萘乙酸)與體細胞克隆變異有聯(lián)系(Karp 1989；Phillips等1994)。確實，在已經(jīng)使用了2，4-D的胡蘿卜(Ronchi等1992)和楊樹(Rugh等1993)體細胞胚發(fā)生系統(tǒng)兩者中報道了倍性降低。微管蛋白抑制劑(MTI)也增加植物細胞中的倍性。然而，濃度和MTI化合物類別決定倍性的性質或倍性的缺乏。例如，黃草消誘導TBY2細胞中的核多倍性，但類似濃度的戊炔草胺(propazamide)則不然(Ehsan等，1999)。類似地，在較高濃度的秋水仙素中，胡蘿卜懸浮細胞的長期暴露誘導核多倍性。胡蘿卜懸浮細胞在來自14-21天連續(xù)處理的1mM秋水仙素培養(yǎng)的單細胞中顯示核多倍性。然而，此類倍性水平的頻率在長至14天的培養(yǎng)物中是小得多的，并小于1％，這與對生長素培養(yǎng)的對照懸浮液報道的對照類似(Karp 1989；Phillips等1994)。然而，在此研究中所測試的化合物中，4-氯-1，5-二苯基-1H-吡唑-3-基氧)-乙酸乙酯和4S，5R-4-硝基-5-(2，3，4-三甲氧苯基)環(huán)己烯在14天連續(xù)處理中顯示具有低核倍性百分比或沒有核倍性百分比的有效單細胞產生。
在任何情況中，使用此類低細胞毒性MTI自細胞聚集體誘導單細胞的過程仍可改變具有不同基因表達序型的單細胞的現(xiàn)有基因表達樣式。公知的是，DNA甲基化觸發(fā)不想要的后果，導致體外體細胞克隆變異。另外，MTI誘導可導致分子變異或不穩(wěn)定性的變化。在彎葉畫眉草(Eragrostis curvula)的四倍體中在秋水仙素誘導的染色體加倍中報道了1.09％的多態(tài)性百分比(Mecchia等2007)。處理彎葉畫眉草種子所使用的秋水仙素濃度水平是0.05％。本研究的目的是評估1uM 4-氯-1，5-二苯基-1H-吡唑-3-基氧基)-乙酸乙酯中產生的JTNT1單細胞中的基因組穩(wěn)定性。
已經(jīng)嘗試了多種分子方法(諸如AFLP、RAPD(快速擴增多態(tài)DNA)、RFLP(限制性片段長度多態(tài)性))來鑒定和測量組織培養(yǎng)衍生的植株中的體細胞克隆變異水平(Devarumath等2002；Martins等2004；Sanchez-Teyer等2003；Hale和Miller 2005)。然而，不管所使用的方法，僅可測定非常小的百分比(比1％小得多)的基因組，無論技術如何豐富(就取樣的基因座數(shù)目而言)?？色@得的多種技術之中，AFLP是最高度多重的，通常每個引物對測定50-100個基因座。認為這些基因座在整個基因組中或多或少隨機分散，如此AFLP為檢測組織培養(yǎng)誘導的變化提供最好的機會。此外，AFLP還是供栽培變種鑒定和變異性分析用的較有力分子技術之一(Hale和Miller 2005)。如此，選擇此評估方法以在此研究中使用。
材料和方法 JTNT1煙草單細胞啟動和樣品收集 在3.5天培養(yǎng)周期中在兩種不同培養(yǎng)基即具有3％蔗糖的NT1B(NT1B-Suc)和具有3％甘油的NT1B(NT1B-Gly)中啟動JTNT1煙草單細胞。通過添加12.5ml維持在相應培養(yǎng)基中的處于穩(wěn)定期培養(yǎng)的懸浮聚集體來開始培養(yǎng)，并轉移至125ml搖瓶中12.5ml含有1uM 4-氯-1，5-二苯基-1H-吡唑-3-基氧)-乙酸乙酯(二苯基吡唑)的新鮮培養(yǎng)基。用泡沫塞子封閉燒瓶，并在定軌搖床上以130rpm在黑暗中于25-28℃培養(yǎng)。每3.5天對培養(yǎng)物進行傳代培養(yǎng)長至14天的時間段。通過以3000rpm旋轉懸浮液達5分鐘來每3.5天收獲4份培養(yǎng)物樣品(Suc/Gly培養(yǎng)的細胞和具有0.2％DMSO的Suc/Gly培養(yǎng)基中的對照培養(yǎng)物)。立即凍干樣品以防止任何細胞氧化，以便使對收獲后所引入的對樣品的任何有害效應最小化。用Hoechst核染色劑對單細胞進行染色達1小時，并在顯微鏡下觀察任何核異常達長至兩個培養(yǎng)周期。
單細胞的細胞學表征 細胞生存力和細胞壁。使用建立的JTNT1單細胞來用FUN1(F-7030，Molecular Probes，Invitrogen Inc)細胞染色劑進行染色，所述FUN1細胞染色劑用于酵母中的生存力測試，而且這含有兩種顏色熒光探針。使用第3種熒光探針Calcafluor白色M2R(其對細胞壁進行染色)來對細胞進行染色。對于JTNT1單細胞，添加20μm FUN1染色劑，并于室溫溫育培養(yǎng)物達20分鐘。添加1mL新鮮的培養(yǎng)基以清洗過量的染色劑，并以3000rpm離心；倒去上清液。在Zeiss ApoTome顯微鏡上檢查細胞并成像。
質膜。將JTNT1細胞與5μM FM4-64(苯乙烯基染料)一起溫育達5分鐘，并用新鮮的培養(yǎng)基清洗。以3000rpm離心培養(yǎng)物，并添加新鮮的培養(yǎng)基。在Zeiss ApoTome顯微鏡上顯現(xiàn)細胞。
細胞核。用Hoechst核染色劑對單細胞進行染色達1小時，并在Zeiss ApoTome上觀察任何核異常達長至兩個培養(yǎng)周期。也使用結晶紫染色劑作為活體核染色劑以觀察核結構，用于倍性表征。
細胞骨架。毒蕈肽結合肌動蛋白絲。使用Alex Fluor 488鬼筆環(huán)肽(A12379，Invtrogen Inc)來對單細胞染色。將6.6uMAlex Fluor添加至單細胞，溫育30分鐘，并在顯微鏡上成像。
對基因組不穩(wěn)定性的分子評估 DNA提取。自3.5、7、10.5和14天收獲來自代表性樣品的基因組DNA。使用CTAB方案(參見附錄-實施例12)來提取連同對照一起的Suc和Gly培養(yǎng)物(10份樣品)。使用來自Molecular Probes，Inc.(Eugene，Oregon)的

染料來對DNA進行定量。微量滴定板的每孔含有與10μl 40x稀釋的DNA樣品或λDNA標準品(0、2.5、5和10ng/μl)組合的90μl 200倍PicoGreen。使用標準的搖板儀來短暫地搖動平板，并使用來自Molecular Devices(Sunnyvale，California)的Spectra Max GeminiXS熒光計來讀取熒光(激發(fā)約480nm，發(fā)射約520nm)。一式三份對每個樣品進行定量，并使用3次結果的平均數(shù)來進行隨后的稀釋。用無菌水將DNA樣品濃度稀釋至91ng/μl的工作濃度。
AFLP分析。使用Vos等(1995)的方案的改良來進行擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)測定法，如Bryan等(2002)中所述的。聯(lián)用切割6-bp的限制酶EcoRI和切割4-bp的限制酶MseI。自Applied Biosystems(Foster City，CA)定購EcoR1經(jīng)熒光標記的和MseI未標記的AFLP引物。經(jīng)由具有一處改良的選擇性擴增反應，使用Applied Biosystems的AFLP植物作圖方案來實施AFLP分析。所述改良是消化/連接反應于37℃溫育過夜。在經(jīng)過滅菌的去離子水中將選擇性擴增產物稀釋2倍。將0.5ul稀釋的產物與5ul加載緩沖液(與500ul ABI HiDi甲酰胺混合的5ulGeneScan 500bp LIZ大小標準品)組合。在具有G5-RCT譜矩陣的AB3730XL DNA分析儀上使用標準條件來分析樣品。然后將數(shù)據(jù)輸入4.0版

(Applied Biosystems，2005)中。依照PCR片段大小，給等位基因指定數(shù)值。
結果和討論. 單細胞的細胞學及其它亞細胞評估 細胞壁和細胞分裂。細胞培養(yǎng)過程中，發(fā)生生長和分化，并且細胞的形狀和結構依賴于細胞壁。單細胞顯示具有3-10倍大小增加的各向同性生長，顯示典型的圓形細胞。為了理解細胞壁結構，使用Calcafluor(具有對纖維素的結合親和力的增白劑)。在單細胞中，觀察到獨特的圓形壁。細胞壁是動態(tài)的結構，其在決定細胞形狀中發(fā)揮重要的作用，并與環(huán)境因素相互作用。雖然所觀察的大多數(shù)單細胞顯示了球形細胞，有可能看到具有細胞板的正在分裂的細胞。干重的增加是另一個指征，即這些單細胞中正在發(fā)生細胞分裂。在MTI中培養(yǎng)14天后，若將單細胞轉移至無MTI的培養(yǎng)基，則細胞重新組成聚集體懸浮液，顯示各向異性生長的可逆性。
質膜。質膜是重要的細胞成分之一，其圍住所有的細胞內容物。它展示細胞壁的輪廓，并在細胞內部和環(huán)境之間提供最終的過濾器。兩親性FM苯乙烯基染料對于研究活的真核細胞中的細胞器組構和小泡運輸是有用的(Bolte等，2004)。最初，F(xiàn)M染料定位于質膜(PM)，然后胞吞入液泡和小泡中，然后至內體中。FM4-64(膜選擇性熒光染料)對質膜進行染色，然后內在化至細胞中的其它細胞器(Ueda等，2001)。染色5分鐘后，在質膜上觀察到單細胞熒光，并且沒有結構缺陷。在使用100nM Isoxeben來除去纖維素網(wǎng)絡的單一樣品中，F(xiàn)M4-64顯示了表面上廣泛的小泡。膜在5分鐘內顯示活躍的胞吞。
細胞核。據(jù)報道經(jīng)MTI處理的植物細胞中的核組構是復雜的，而且顯示核多倍性在較高的濃度中是普遍的。在1uM濃度的二苯基吡唑和三甲氧苯基環(huán)己烯中對樣品檢查長至7天。通過使用多種染色劑(Hoechst3325)來分析核胞器結構。在JTNT1中，單細胞在1uM濃度的二苯基吡唑和三甲氧苯基環(huán)己烯中在3.5天培養(yǎng)物中含有具有一個細胞核或兩個核仁的單一細胞核。然而，高濃度的這些化合物導致形成大至150-300uM直徑且具有核多倍性的巨大細胞，如培養(yǎng)21天的胡蘿卜細胞中所看到的。這些結果提示有絲分裂抑制是這些化合物在所研究高濃度的基本效應。如此，重要的是，不僅保持MTI的最佳濃度，而且保持該化合物的化學性質，所述化合物對細管會具有非常選擇性的功能而沒有與細胞分裂功能類似的非選擇性功能。
細胞骨架。細胞骨架由細胞結構的結構完整性中所牽涉的數(shù)種結構蛋白(諸如F-肌動蛋白和微管蛋白)組成。使用綠色熒光Alexa Flour 488肌動蛋白偶聯(lián)物(A12373)(其是較亮的，而且pH依賴性較小)來研究細胞骨架體內動力學。微管和肌動蛋白絲對為了其生長和分化及植物細胞生存而維持植物細胞中的細胞骨架結構是必需的結構(Kost等，2002)。用鬼筆環(huán)肽染色的單細胞顯示了肌動蛋白絲細胞骨架，并且所述絲沒有有缺陷的定位，因為細胞結構是正常的。
分子分析?；贓coRI(對甲基化不敏感的限制酶)的應用，AFLP分析牽涉10對引物組合。引物對中的兩對沒能擴增(p6和p10)，而引物對中的兩對沒有顯示任何片段上的差異(3p和8p)。引物對1p、2p、3p、4p、5p、7p、8p、9p的明顯分離片段的數(shù)目分別是47、39、31、42、47、32、7和46。在用對甲基化不敏感的(即EcoRI-MseI)引物組合處理的所有樣品中都沒有檢測到AFLP多態(tài)性，14天甘油培養(yǎng)的JTNT1樣品(第4輪傳代培養(yǎng)周期)除外。相比之下，對于甘油培養(yǎng)的樣品，在所有的其它樣品中沒有鑒定出多態(tài)性片段。經(jīng)蔗糖處理的樣品對所測試的任何引物組合都沒有顯示任何片段的多態(tài)性。如預期的，單細胞樣品中至少3輪傳代培養(yǎng)周期沒有差異。然而，在由缺乏蔗糖而強加的壓力(其似乎已經(jīng)觸發(fā)了不穩(wěn)定性)之外，甘油培養(yǎng)物中的第4輪傳代培養(yǎng)周期多態(tài)性可能是由于化合物的連續(xù)存在。未顯示多態(tài)性的JTNT1單細胞培養(yǎng)物的差異提示簡單碳源甘油(雖然已知穩(wěn)定微管)可能不能支持許多細胞功能，尤其在微管蛋白抑制劑(MTI)延長存在的情況中。在任何情況中，可在用二苯基吡唑測試的濃度范圍內成功地準備單細胞處理達至少4輪傳代培養(yǎng)周期而沒有基因組不穩(wěn)定性問題。
拍攝針對引物5p的2多態(tài)性的快照。傳代培養(yǎng)4具有130bp片段插入和131bp片段刪除。
測定AFLP序型，其牽涉對甲基化不敏感的酶EcoRI和MseI及引物對組合的應用。第4輪傳代培養(yǎng)周期的所有樣品是單態(tài)的，而第4輪傳代培養(yǎng)周期的甘油序型在多個基因座是多態(tài)的。
表2提供了所使用的AFLP引物組合的詳情和觀察到的條帶的相應數(shù)目。Suc-X，NT1B-蔗糖培養(yǎng)基中的單細胞；Gly-X，NT1B-甘油培養(yǎng)基中的單細胞；Cont-Suc，蔗糖中的對照JTNT1懸浮聚集體；Cont-Gly，甘油中的對照JTNT1懸浮聚集體
對一致性的分子遺傳評估。在此研究中看到AFLP多態(tài)性(對于所使用的10個引物組合中的9個引物組合，第4輪傳代培養(yǎng)周期的甘油培養(yǎng)單細胞懸浮液之中)。所有觀察到的變異性屬于使用EcoRI/MseI所產生的片段。與豌豆的葉(Smulders等1995)和組織培養(yǎng)再生物相比，先前已經(jīng)對番茄胼胝體報道了組織培養(yǎng)過程中甲基化狀態(tài)的提高(Cecchini等1992)。如此，為了進一步評估基于甲基化的變異，可進行用對甲基化敏感的PstI/MseI組合進行的進一步評估。
附錄——實施例13 自煙草細胞懸浮液/胼胝體組織的CTAB DNA提取 1.稱出約25mg凍干的組織至2ml Eppendorf管中。
2.將不銹鋼珠子放入具有組織的管中，并在Geno-研磨機或涂料搖床(paintshaker)上搖動約1分鐘。(Geno-研磨機設置在500擊/分鐘)。除去珠子，并溫和地輕拍管以減少組織聚塊。
3.添加1ml提取緩沖液，溫和地輕拍管以減少組織聚塊，并使得組織進入緩沖液中，于65℃溫育同時溫和地在其側面混合達2小時。冷卻至室溫(約10分鐘)。
提取緩沖液(250ml) Tris-HCl25ml NaCl29.2g Na EDTA 12.5ml CTAB6.25g PVP 3.75g 水 (添加直至終體積250ml) 4.將0.75ml 25∶24∶1酚/氯仿/異戊醇pH 8添加至提取緩沖液，并用手溫和地搖晃5分鐘。以10,000rpm離心5分鐘以分離各相。小心地將水相轉移入新管中。
5.使用24∶1氯仿/辛醇代替酚/氯仿/異戊醇混合物來重復步驟4。
6.以等體積將異丙醇添加至上清液，并于室溫放置1小時。
7.以10,000rpm對管進行離心達10分鐘，并倒掉上清液，同時小心地將沉淀物保持在管底中。
8.添加0.5ml 70％乙醇和RNA酶混合物以清洗DNA沉淀物，并以10,000rpm離心1分鐘(1∶1000RNA酶/乙醇)。
9.小心地倒掉上清液，并僅用70％乙醇重復清洗。通過于室溫放置3小時或對樣品進行旋轉蒸發(fā)達約5分鐘來使沉淀物完全干燥。
10.一旦沒有酒精液滴存在，則將沉淀物溶解于0.2ml已經(jīng)預加溫至65℃的1X Tris EDTA緩沖液中。于室溫將樣品放置過夜以充分重懸。
11.第二天早晨溫和地搖動管以進行混合。在瓊脂糖凝膠上運行樣品以檢查RNA的降解和存在，并進行定量。
實施例13參考文獻 1.Mecchia，M.A.，A.Ochogavia，J.P.Selva，N.Laspina，S.Felitti，L.G.Martelotto，G.Spangenberg，V.Echenique，S.C.Pessino，(2007).Genomepolymorphisms and gene differential expression in a‘back-and-forth’ploidy-altered series of weeping lovegrass(Eragrostis curvula)，J.PlantPhysiol.，1641051-1061. 2.Bryan GJ，McLean K，Bradshaw JE，Phillips M，Castelli L，De Jong WS，Waugh R(2002)Mapping QTL for resistance to the cyst nematodeGlobodera pallida derived from the wild potato species Solanum vernei.Theor Appl Genet 10568-77. 3.Devarumath RM，Nandy S，Rani V，Marimuthu S，Muraleedharan N，RainaSN(2002)RAPD，ISSR and RFLP fingerprints as useful markers to evaluategenetic integrity of micropropagated plants of three diploid and triploid elitetea clones representing Camellia sinensis(China type)and C.assamica ssp.assamica(Assam-India type).Plant Cell Rep 21166-173. 4.Ehsan，H.，Luc Roefa，Erwin Wittersa，Jean-Philippe Reichheldb，Dirk VanBockstaelec，Dirk Inzéb and Harry Van Onckelena(1999).Indomethacin-induced G1/S phase arrest of the plant cell cycle.FEBSLetters，458(3)349-353. 5.Hale AL，Miller JC(2005)Suitability of AFLP and microsatellite markeranalysis for discriminating intraclonal variants of the potato cultivar RussetNorkotah.J Am Soc Hortic Sci 130624-630. 6.Karp A(1989)Can genetic instability be controlled in plant tissue cultures？Int Assoc Plant Tiss Cult Newsl 582-11. 7.Mamiya K，Sakamoto Y，Ohnishi N，Hirosawa T(2001)Synthetic seeds ofAsparagus officinalis L.于Bhojwani SS，Soh W-Y(編)Current trends inthe embryology of angiosperms.Kluwer，Dordrecht，pp 337-352. 8.Martins M，Sarmento D，Oliveira MM(2004)Genetic stability ofmicropropagated almond plantlets，as assessed by RAPD and ISSR markers.Plant Cell Rep 23492-496. 9.Odake Y，Udagawa A，Saga H，Mii M(1993)Somatic embryogenesis oftetraploid plants from internodal segments of a diploid cultivar of Asparagusofficinalis L.grown in liquid culture.Plant Sci 94173-177. 10.Payne RW，Lane PW，Digby PGN，Harding SA，Leech PK，Morgan GW，Todd AD，Thompson R，Tunnicliffe Wilson G，Welham SJ，White RP(1993)Genstat 5 Release 3reference manual.Oxford University Press，Oxford. 11.Phillips RL，Kaeppler SM，Olhoft P(1994)Genetic instability of plant tissuecultures-breakdown of normal controls.Proc Natl Acad Sci USA915222-5226. 12.Ronchi VN，Giorgetti L，Tonelli M，Martini G(1992)Ploidy reduction andgenome segregation in cultured carrot cell lines.1.Prophase chromosomereduction.Plant Cell Tiss Org 30107-114. 13.Rugh CL，Parrott WA，Merkle SA(1993)Ploidy variation in embryogenicyellow poplar.于Proceedings of 22nd Southern Forest Tree ImprovementConference，pp 493. 14.Sanchez-Teyer LF，Quiroz-Figueroa F，Loyola-Vargas V，Infante D(2003)Culture induced variation in plants of Coffea arabica cv.Caturra rojo，regenerated by direct and indirect somatic embryogenesis.Mol Biotechnol23107-115. 15.Shoyama Y，Matsushita H，Zhu XX，Kishira H(1995)Somaticembryogenesis in ginseng(Panax species).于Bajaj YPS(編)Biotechnology in agriculture and forestry.Springer，Berlin，pp 344-356. 16.Smulders MJM，Rus-Kortekaas W，Vosman B(1995)Tissue culture inducedDNA methylation polymorphisms in repetitive DNA of tomato calli andregenerated plants.Theor Appl Genet 911257-1264. 17.Vos P，Hogers R，Bleeker M，Reijans M，Vandelee T，Hornes M，F(xiàn)rijters A，Pot J，Peleman J，Kuiper M，Zabeau M(1995)AFLP-a new technique forDNA fingerprinting.Nucleic Acids Res 234407-4414. 18.Zoriniants SE，Nosov AV，Monforte-Gonzalez M，Mendes-Zeel M，Loyola-Vargas VM(2003)Variation of nuclear DNA content during somaticembryogenesis and plant regeneration of Coffea arabica L.usingcytophotometry.Plant Sci 164141-146. 實施例14——煙草BY2單細胞的質體轉化 為質體轉化作準備的單細胞的啟動 將4ml煙草BY2懸浮液(以7天周期維持的處于穩(wěn)定期生長的)添加至由具有泡沫塞子的125mL搖瓶中所包含的26mL新鮮的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基由培養(yǎng)基A[LS鹽類(PhytoTechnology Laboratories，L689)、120g/L蔗糖、1mg/L煙酸、1mg/L鹽酸吡哆醇、10mg/L鹽酸硫胺素和20nM二苯基吡唑(DPP)]或培養(yǎng)基B[LS鹽類、120g/L蔗糖、1mg/L煙酸、1mg/L鹽酸吡哆醇、10mg/L鹽酸硫胺素、2.5mg/L芐氨基嘌呤(BAP)和20nM DPP]構成。以125rpm的速度在黑暗中于28℃將燒瓶放置在旋轉式搖床上達7天。
轉化實驗 通過用新鮮的培養(yǎng)基稀釋BY2懸浮培養(yǎng)物(如上文所述的那樣培養(yǎng)的)至OD650為1.0來啟動轉化實驗。對于每個轉化靶物，將1.5ml經(jīng)稀釋的懸浮液移液至無菌濾紙上，所述無菌濾紙已經(jīng)放置在真空過濾裝置的頂部。將懸浮細胞均勻地穿過濾紙表面而沉積。將濾紙和細胞轉移至轟擊培養(yǎng)基[MS基礎鹽類、B5維生素、18.2g/l甘露醇、18.2g/L山梨醇、30g/L蔗糖、1mg/L BAP、0.1mg/L 1-萘乙酸(NAA)、8g/L TC瓊脂(PhytoTechnology Laboratories，A175)]。
供單細胞質體轉化用的質粒構建體 在此實施例中所使用的DNA構建體稱為pDAB3969。構建體元件側翼有來自煙草葉綠體基因組的16S trnI和trnA序列。兩種基因aphA-6和nptII分別作為由Prrn加T7基因10和PpsbA啟動子驅動的選擇標志使用。T7基因10還驅動感興趣的基因TurboGFP。
BY2單細胞的生物射彈轟擊 轟擊之前將細胞保持在轟擊培養(yǎng)基上達4小時。使用Bio-RadPDS-1000/He投遞系統(tǒng)來轟擊制備好的靶物。制備金顆粒(0.4μm，Inbio GoldMelbourne，Australia)，并使用標準方法來將DNA沉淀在其表面上。
以1100psi對靶平板進行轟擊，連同28英寸汞真空，和離阻止網(wǎng)(stoppingscreen)9cm的距離。然后將平板擱置(set aside)達單日回收期。然后將濾紙加組織轉移至培養(yǎng)基C[LS鹽類、120g/L蔗糖、170mg/L無水磷酸二氫鉀，0.6mg/L鹽酸硫胺素、0.2mg/L 2，4-D、8g/L TC瓊脂和100mg/L卡那霉素]，并留在最初的選擇平板上，直至出現(xiàn)抗性集落。在抗性集落生長成4-5mm直徑時，將它們分離至含有凝膠培養(yǎng)基C的單獨平板上，并進行擴大，直至它們大到足以進行取樣以進行PCR分析。
結果和討論 將BY2懸浮系培養(yǎng)于培養(yǎng)基A和培養(yǎng)基B中達7天。自培養(yǎng)基A中培養(yǎng)的細胞制備5塊靶平板，并自培養(yǎng)基B中培養(yǎng)的細胞制備5塊別的平板。設計這兩種培養(yǎng)基以通過提高蔗糖含量、除去生長素2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)和在培養(yǎng)基B中通過添加細胞分裂素BAP來產生擴大的造粉體(1，2)。擴大的造粉體充當供生物射彈轉化用的較大靶物。兩種含有20nM DPP的培養(yǎng)基產生單細胞。經(jīng)轟擊的平板產生3個來自經(jīng)培養(yǎng)基A處理的細胞的卡那霉素抗性集落和2個來自經(jīng)培養(yǎng)基B處理的細胞的抗性集落。
對來自每個集落的樣品取樣以進行分子分析。使用DNasey方案來提取DNA，并通過使用下列引物組的PCR來分析等分試樣。
經(jīng)引物擴增的轉化構建體區(qū)段。引物MAS401位于天然煙草質體DNA中trnA側翼的末端之外83bp處，并證明進入質體基因組中的整合。
引物組2、3、4和5的PCR反應對所有的5種樣品產生陽性反應。來自野生型(非轉化的)BY2懸浮細胞或煙草植株對照的DNA沒有產生任何條帶。如此，PCR結果指明所有3種轉基因的存在和進入質體基因組中的整合。
權利要求
1.一種分離的植物單細胞，其包含完整細胞壁。
2.一種用于生產權利要求1的細胞的方法，其中所述方法包括在含有甘油和分離劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含完整細胞壁的植物細胞，所述分離劑選自由果膠降解酶和微管蛋白解聚化合物組成的組。
3.權利要求2的方法，其中所述培養(yǎng)基是液體培養(yǎng)基，且所述細胞處于懸浮液中。
4.權利要求2的方法，其中所述分離劑是微管蛋白解聚化合物。
5.權利要求4的方法，其中所述微管蛋白解聚化合物選自由秋水仙素和二硝基苯胺組成的組。
6.權利要求4的方法，其中所述微管蛋白解聚化合物符合如下通式
其中
X＝CO2R、CH2CO2R、CH2CH2CO2R、(CH2)3CO2R、OCH2CO2R、OCH(CH3)CO2R、OC(CH3)2CO2R、CH2OCH2CO2R、CH2CH(CO2CH2CH3)CO2R、或OCH(CO2CH2CH3)CO2R，
Y＝CN、Cl、Br、F、或NO2，
Ar1＝未取代的苯基、未取代的吡啶、1-3取代的苯基、1-3取代的吡啶或用鹵素或CN取代，
Ar2＝未取代的苯基、未取代的吡啶、1-3取代的苯基、1-3取代的吡啶或用鹵素或CN取代，且
R＝H或1-5個碳的直鏈或支鏈酯。
7.權利要求4的方法，其中所述微管蛋白解聚化合物是4-氯-1，5-二苯基-1H-吡唑-3-基氧)-乙酸乙酯。
8.權利要求4的方法，其中所述微管蛋白解聚化合物是
9.權利要求2的方法，其中所述分離劑是酶，其選自由果膠酶和果膠裂合酶組成的組。
10.權利要求1的細胞，其中所述分離的單細胞選自由藻類細胞、雙子葉植物細胞、單子葉植物細胞、低等維管細胞(lowever vascular cell)和非維管細胞組成的組。
11.一種用于轉化權利要求1的細胞的方法，所述方法包括用權利要求2的方法來制備分離的細胞，用異源多核苷酸轉化所述細胞，并選擇受到轉化的細胞。
12.權利要求11的方法，其中所述選擇步驟使用無標志物的選擇。
13.自權利要求1的細胞培養(yǎng)得到的細胞培養(yǎng)物，其中所述細胞是均一表達的。
14.權利要求1的細胞，其中所述細胞是轉基因的。
15.權利要求1的細胞，其中所述細胞是轉質體的。
16.權利要求2的方法，其中所述方法是高通量過程方法。
17.權利要求10的方法，其中所述轉化步驟是使用選自由聚乙二醇、電穿孔、生物射彈、和納米微粒組成的組的方法進行的。
18.權利要求1的細胞，其中所述分離的單細胞選自由煙草細胞、胡蘿卜細胞、玉米細胞、和曼陀羅細胞組成的組。
19.權利要求2的方法，其中所述培養(yǎng)基選自由凝膠和半固體培養(yǎng)基組成的組。
全文摘要
本發(fā)明提供了將懸浮細胞聚集體破碎成具有完整初生細胞壁的單細胞的簡單且一致的方法。本發(fā)明部分地涉及含有果膠降解酶或微管蛋白解聚化合物(包括秋水仙素)的培養(yǎng)基中所培養(yǎng)的懸浮細胞聚集體的細胞分離。本發(fā)明還涉及化合物用于此類目的的新用途。本發(fā)明的另一方面涉及目的物(即分離的細胞)的轉化。此類過程將基于單細胞的轉化和選擇過程簡化并整合入轉基因和轉質體事件產生的工作過程。本發(fā)明還消除了技術約束，并以高通量方式產生無標志物的且均一表達的轉基因系，以支持動物保健、生物制藥、及性狀和作物保護平臺的各種需要。
文檔編號C12N5/00GK101611138SQ200780051642
公開日2009年12月23日 申請日期2007年12月27日 優(yōu)先權日2006年12月29日
發(fā)明者龐·S·賈亞庫馬爾, 杰弗里·R·貝林格, 保羅·施米澤, 弗蘭克·伯勒斯, 羅比·加里森, 威廉·M·安利, 納拉西姆哈·C·桑伯朱 申請人:陶氏益農公司