一種融合基因usp45-egl3及其所編碼的蛋白和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于應(yīng)用工業(yè)微生物領(lǐng)域，涉及一種纖維素水解酶β-M-葡聚糖內(nèi)切酶融 合基因及其所編碼的蛋白和應(yīng)用。生產(chǎn)的酶制劑安全，能夠有效利用纖維素，可用于食品、 能源、醫(yī)藥、飼料、紡織、洗滌等工業(yè)，具有可觀的經(jīng)濟(jì)效益。
【背景技術(shù)】
[0002] 纖維素是高等植物細(xì)胞壁的主要成分，占植物干重的30 %~50%，是地球上分布 最廣、再生性最佳的結(jié)構(gòu)性碳水化合物，占地球總生物量的40%。農(nóng)作物秸桿纖維素含量 高，但尚未被良好利用。據(jù)報(bào)道，全國秸桿總產(chǎn)量已達(dá)8億噸，采用燃燒、還田、加工成飼料的 方法尚不能有效利用如此規(guī)模的秸桿。另外，當(dāng)前一斤秸桿收購價(jià)通常不超過兩毛錢，而勞 動(dòng)力成本卻高于一斤秸桿的收購價(jià)，導(dǎo)致部分農(nóng)民出售秸桿的積極性不高。秸桿自身密度 小且易腐爛，收集和運(yùn)輸較為困難，提高秸桿的價(jià)值成為秸桿有效利用的新途徑。
[0003] 纖維素酶是分解纖維素的一類酶。瑞氏木霉是高效產(chǎn)纖維素酶的真菌，其產(chǎn)生的 纖維素酶具有酶系完全，活性高，能分泌到細(xì)胞外，便于分離提純等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于能 源、食品、醫(yī)藥、飼料和化工等工業(yè)領(lǐng)域。根據(jù)催化反應(yīng)功能的不同，纖維素酶可分為內(nèi)切葡 聚糖酶、外切葡聚糖酶和葡聚糖苷酶。內(nèi)切葡聚糖酶中的β-l，4-葡聚糖內(nèi)切酶，可在纖維 素長鏈內(nèi)部隨機(jī)切割，使纖維素結(jié)構(gòu)松散，同時(shí)又能水解產(chǎn)生一定量的纖維二糖和葡萄糖。 瑞氏木霉分泌的β-1，4-葡聚糖內(nèi)切酶約占其胞外蛋白總量的10%，編碼該蛋白的基因有 %11、％12、％13、％14和％15，其中對(duì)叫11、％12和％13基因的研究較多。目前，我國構(gòu)建出 的egll和egl2基因工程大腸桿菌表達(dá)的β-1，4-葡聚糖內(nèi)切酶的效果差，尚未構(gòu)建出能分泌 活性β-l，4-葡聚糖內(nèi)切酶的egl3基因工程大腸桿菌。因此，構(gòu)建出能分泌β-l，4-葡聚糖內(nèi) 切酶的基因工程大腸桿菌，提高β-1，4-葡聚糖內(nèi)切酶的產(chǎn)量和質(zhì)量，以期更好地開發(fā)利用 纖維素物質(zhì)資源，實(shí)現(xiàn)纖維素物質(zhì)資源的價(jià)值提升，對(duì)人類的可持續(xù)發(fā)展具有重要的應(yīng)用 前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是利用乳酸乳球菌分泌蛋白基因 usp45部分序列和瑞氏木霉β-1，4_ 葡聚糖內(nèi)切酶基因 egl3中編碼成熟蛋白的核苷酸序列形成一種融合基因 usp45-egl3,利用 該基因構(gòu)建的工程菌株能高效分泌表達(dá)β_1，4-葡聚糖內(nèi)切酶，屬于應(yīng)用工業(yè)微生物。生產(chǎn) 的酶制劑安全，能夠有效利用纖維素，可用于食品、能源、醫(yī)藥、飼料、紡織、洗滌等工業(yè)，具 有可觀的經(jīng)濟(jì)效益。
[0005] 本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0006] -種融合基因 usp45-egl3,它包含乳酸乳球菌分泌蛋白基因 usp45的基因片段和 瑞氏木霉β-1，4_葡聚糖內(nèi)切酶基因 egl3中編碼成熟蛋白的核苷酸序列，其核苷酸序列為 SEQ ID No.l，全長為738bp。
[0007]上述的融合基因 usp45_egl3核苷酸序列同源性大于50 %的核苷酸序列。
[0008]上述的融合基因 Usp45-egl3核苷酸序列的互補(bǔ)序列。
[0009]上述的融合基因 Usp45-egl3在表達(dá)β-1,4-葡聚糖內(nèi)切酶中的應(yīng)用。
[0010] 上述的融合基因 uSp45-egl3所編碼的融合蛋白，其氨基酸序列為SEQIDN0.2，全 長為245個(gè)氨基酸。
[0011] 同上述融合蛋白的氨基酸序列同源性大于40 %的氨基酸序列。
[0012] 含有上述融合基因 Usp45-egl3的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或轉(zhuǎn)基因 重組菌。
[0013] 上述的重組表達(dá)載體為將所述的融合基因 usp45-egl3亞克隆至pMG36e原核表達(dá) 載體中，構(gòu)建出的重組載體pMG36e-uSp45-egl3。其詳細(xì)的構(gòu)建流程為:采用重疊延伸PCR合 成技術(shù)合成正向帶有Sma I，反向帶有Xba I酶切位點(diǎn)的usp45-egl3融合基因；將經(jīng)Sma I和 Xba I雙酶切后的usp45-egl3融合基因和同樣用這兩種酶切好的克隆載體pGHn質(zhì)粒在DNA 連接酶作用下進(jìn)行連接，獲得質(zhì)粒pGHn-usp45-egl3;將質(zhì)粒pGHn-usp45-egl3克隆到ToplO 大腸桿菌并獲取陽性克隆，提取陽性克隆的質(zhì)粒并經(jīng)Sma I和Xba I雙酶切回收正確的 usp45-egl3融合基因，亞克隆至pMG36e原核表達(dá)載體中，構(gòu)建出重組載體pMG36e-usp45-egl3〇
[0014] 含上述的重組表達(dá)載體pMG36e-usp45_egl3的轉(zhuǎn)基因重組菌E.coli DH5a/ pMG36e-usp45_egl3〇
[0015] 上述轉(zhuǎn)基因重組菌E.coli DH5a/pMG36e-usp45-egl3的構(gòu)建流程如下：采用重疊 延伸PCR合成技術(shù)合成正向帶有Sma I，反向帶有Xba I酶切位點(diǎn)的usp45-egl3融合基因；將 經(jīng)Sma I和Xba I雙酶切后的usp45-egl3融合基因和同樣用這兩種酶切好的克隆載體pGHn 質(zhì)粒在DNA連接酶作用下進(jìn)行連接，獲得質(zhì)粒pGHn-usp45-egl3;將質(zhì)粒pGHn-usp45-egl3克 隆到ToplO大腸桿菌并獲取陽性克隆，提取陽性克隆的質(zhì)粒并酶切回收正確的u Sp45-egl3 融合基因，亞克隆至pMG36e原核表達(dá)載體中，構(gòu)建出重組載體pMG36e-uSp45- egl3,采用熱 激法轉(zhuǎn)化至DH5a構(gòu)建重組大腸桿菌E.coli DH5a/pMG36e-usp45_egl3。
[0016] 上述的融合基因 uSP45-cbh2及含有該基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞 系或轉(zhuǎn)基因重組菌在制備β-1，4_葡聚糖內(nèi)切酶及水解纖維素中的應(yīng)用。
[0017] 上述的轉(zhuǎn)基因重組菌E.coli DH5a/pMG36e-usp45-egl3在分泌表達(dá)β-1，4-葡聚糖 內(nèi)切酶蛋白質(zhì)中的應(yīng)用。
[0018] 采用重疊延伸PCR合成技術(shù)合成正向帶有Sma I，反向帶有Xba I酶切位點(diǎn)的 usp45-egl3融合基因；將經(jīng)Sma I和Xba I雙酶切后的usp45-egl3融合基因和同樣用這兩種 酶切好的克隆載體pGHn質(zhì)粒在DNA連接酶作用下進(jìn)行連接，獲得質(zhì)粒pGHn-usp45-egl3;將 質(zhì)粒pGHn-u Sp45-egl3克隆到ToplO大腸桿菌并獲取陽性克隆。提取陽性克隆的質(zhì)粒并采用 Sma I和Xba I雙酶切回收正確的usp45-egl3融合基因，該正確的usp45-egl3融合基因核苷 酸序列為SEQIDN0.l，全長(從起始密碼子到終止密碼子)為738bp，G+C含量為53.12%，編 碼的245個(gè)氨基酸，其編碼的氨基酸序列為:SEQ ID如.2。然后將正確的11叩45-叫13融合基 因亞克隆至pMG36e原核表達(dá)載體中，構(gòu)建出重組載體pMG36e-usp45-egl3,采用熱激法轉(zhuǎn)化 至DH5a構(gòu)建重組大腸桿菌E. coli DH5a/pMG36e-usp45-egl3;轉(zhuǎn)接到含有質(zhì)量體積比0.5% 羧甲基纖維素鈉、250yg/mL紅霉素的平板，37°C培養(yǎng)36h后經(jīng)0.1%剛果紅溶液染色2〇11^11和 1M NaCl溶液脫色20min，挑取能產(chǎn)生透明水解圈的陽性轉(zhuǎn)化子，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證基因序列無誤 后，用40 % (V/V)甘油水溶液保存。
[0019] 上述的Usp45-egl3融合基因和所生產(chǎn)的β-1，4-葡聚糖內(nèi)切酶可以在食品、能源、 醫(yī)藥、飼料、紡織、洗滌等工業(yè)中應(yīng)用。
[0020] 本發(fā)明所涉及的試驗(yàn)材料出特別說明外均可以通過市場(chǎng)購買獲得，本發(fā)明所述的 室溫為25±5°C。
[0021] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0022] 開創(chuàng)了egl3基因的原核表達(dá)，獲得了基因重組大腸桿菌E.coli DH5a/pMG36e-usp45_egl3〇
[0023] 基因重組大腸桿菌E.coli DH5a/pMG36e-usp45-egl3能夠高效分泌表達(dá)β_1，4-葡 聚糖內(nèi)切酶，產(chǎn)酶活性為226mU/ml，生產(chǎn)的β-l，4-葡聚糖內(nèi)切酶可以在食品、能源、醫(yī)藥、飼 料、紡織、洗滌等工業(yè)中應(yīng)用。
【附圖說明】
[0024] 圖 1 為pMG36e-usp45_egl3 的酶切鑒定
[0025] 注:]/[，]\^1^1';1，父匕&1酶切；2,31]1&1和父匕&1酶切
[0026] 圖2為克隆的usp45-egl3基因序列與文獻(xiàn)基因的相似性
[0027] 圖3為β-l，4_葡聚糖內(nèi)切酶在羧甲基纖維素鈉 -LB培養(yǎng)基上的表達(dá)效果
[0028] 注：左C，未成功表達(dá)的 E.coli DH5a/pMG36e-Usp45-egl3;右C, E.coli DH5a/ pMG36e; 2 和4，成功表達(dá)的 DH5a/pMG36e-Usp45-egl3
[0029] 圖4為重組大腸桿菌在不同培養(yǎng)時(shí)間分泌到細(xì)胞外的β-1，4_葡聚糖內(nèi)切酶降解羧 甲基纖維素鈉生成還原糖的速率
[0030] 圖5為重組大腸桿菌表達(dá)蛋白的SDS-PAGE分析
[0031] 注:M，Maker;l，E.coli DH5a/pMG36e-usp45-egl3的胞外蛋白；2,對(duì)照E.coli DH5 a/pMG36e的胞外蛋白；3，E·coli DH5a/pMG36e-usp45_egl3的細(xì)胞破碎沉淀;4，對(duì)照E·coli DH5a/pMG36e的細(xì)胞破碎沉淀。
[0032]圖6為usp45-egl3融合基因克隆的策略圖
[0033] 圖7為β-l，4-葡聚糖內(nèi)切酶在E · coli DH5a/pMG36e-usp45-egl3中高效表達(dá)的實(shí) 驗(yàn)方案
【具體實(shí)施方式】
[0034] I、usp45-egl3融合基因的合成
[0035] 根據(jù)GenBank乳酸乳球菌usp45基因編碼(基因收錄號(hào):M60178)部分序列和瑞氏木 霉的egl3基因（基因收錄號(hào):AB003694)中編碼成熟蛋白的序列，采用重疊延伸PCR合成技術(shù) 合成上游帶有Sma頂每切位點(diǎn)、下游帶有Xba頂每切位點(diǎn)的usp45-egl3融合基因。該帶有酶 切位點(diǎn)的融合基因交由上海捷瑞生物工程有限公司采用重疊延伸PCR合成。重疊延伸PCR合 成usp45-egl3的步驟是:根據(jù)usp45-egl3的序列設(shè)計(jì)20-30bp的寡核苷酸引物并合成，溶解 于PCR Assembly體系（PCR Buffer 5χ 10μ1，10πιΜ dNTPs ΙμL,Primer Mix 2μ1，2υ/μ lPolymerase 0 · 5μ1，補(bǔ)助超純水至50μ1)，并進(jìn)行連接(98°C30s; 16~25個(gè)循環(huán)98°C10s，55 ~65°C20~30s，72°C15~30s/kb;72°C5min延伸）。采用PCR擴(kuò)增體系（PCR Buffer5x 10μ1, 1〇1111(11^1：)8]^1，？1'；[11161卩（首引物）和？1'；[1116『1?(尾引物）各]^1，21]八 11?〇15〇116瓜86〇.541， 模板為PCR A