專利名稱：：具有新的底物特異性的laglidadg歸巢核酸內(nèi)切酶變體及其用途的制作方法具有新的底物特異性的LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶變體及其用途本發(fā)明涉及改造出具有新的底物特異性的LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶變體的方法。本發(fā)明還涉及可通過所述方法獲得的變體，編碼所述變體的載體，經(jīng)所述載體修飾的細胞、動物或植物，以及所述歸巢核酸內(nèi)切酶變體及衍生產(chǎn)品用于遺傳工程、基因組治療和抗病毒治療的用途。大范圍核酸酶(meganuclease)的定義是具有大(1245bp)切割位點的序列特異性核酸內(nèi)切酶，該酶可以在活細胞中的特定基因座處引起DNA雙鏈斷裂(double-strandbreak,DSB)(Thierry,A和DujonB.,NucleicAcidsRes.，1992,20,5625-5631)。大范圍核酸酶已用于在培養(yǎng)細胞和植物中在其乾序列附近引發(fā)同源重組(Rouet等，Mol.Cell.Biol.，1994，14,8096-8106;Choulika等，Mol.Cell.Biol"1995，15，1968-1973;Donoho等，Mol.Cell.Biol，1998，18,4070-4078;Elliott等，Mol.Cell.Biol"1998，18，93-101;Sargent等，Mol.Cell.Biol"1997,17,267-277;Puchta等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1996，93，5055-5060;Chiurazzi等，PlantCell,1996,8,2057-2066),這使得大范圍核酸酶所誘導(dǎo)的重組成為基因組工程中高效且有力的方法。長久以來，大范圍核酸酶所誘導(dǎo)重組的應(yīng)用受到天然大范圍核酸酶種類的限制，當(dāng)前技術(shù)的主要限制是需要在目標基因座中預(yù)先引入大范圍核酸酶切割位點。因此，改造出切割選定乾標的重新設(shè)計的大范圍核酸酶正在深入研究中。這樣的蛋白質(zhì)可用于切割天然染色體序列，并為基因組工程的廣泛應(yīng)用開辟了新的前景。例如，大范圍核酸酶可用于在染色體中敲除內(nèi)源基因或敲入外源序列。它還可用于在原位精確修正與單基因遺傳病相關(guān)的突變，從而避免由于當(dāng)前基因治療方法中使用的隨機插入轉(zhuǎn)基因所面臨的風(fēng)險(Hacein醒Bey-Abina等，Science,2003，302，415-419)。最近，將Cys2-扭s2型鋅指蛋白(ZFP)的鋅指DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與/^tl核酸內(nèi)切酶的催化結(jié)構(gòu)域融合，用以在多種細胞類型中誘導(dǎo)重組，所述細胞類型有哺乳動物培養(yǎng)細胞(包括人淋巴樣細胞)、植物和昆蟲細胞(Smith等，NucleicAcidsRes,1999，27,674-81;Pabo等，Annu.Rev,Biochem，2001，70，313-40;Porteus,M.H.和Baltimore,D.,Science,2003,300，763;Urnov等，Nature,2005，435，646-651;Bibikova等，Science,2003,300，764;Durai等，NucleicAcidsRes"2005，33，5978-59卯；PorteusM.H.，Mol.Ther.,2006，13,438-446)。ZFP的結(jié)合特異性相對易于操作，并且現(xiàn)在可得到能結(jié)合許多(g/a)nn(g/a)nn(g/a)nn序列的多種新型人工ZFP(Pabo等，前文引用；SegalD.J.和Barbas，C.F.,Curr.Opin.Biotechnol"2001，12，632-637;Isalan等，Nat.Biotechnol"2001，19，656-660)。然而，基因組工程應(yīng)用的一個主要問狄保留非常窄的特異性，而目前尚不清楚ZFP是否滿足治療性應(yīng)用中極其嚴格的要求。另外，這些融合蛋白已證實在果蠅(Bibikova等，Science,2003，300，764;Bibikova等，Genetics,2002,161，1169-1175)和哺乳動物NIHT3細胞(Alwin等，Mol.Ther.，2005，12，610-617;Porteus，M.H.和Baltimore,D.，Science,2003，300，763;Porteus，M.H.和Carroll,D.，Nat.Biotechnol.,2005，967-973)中具有高毒性，這是可能由于頻繁的異位切割(off-sitecleavage)所致的基因毒性效應(yīng)(Porteus,M.H"Mol.Ther.，2006,13，438-446)。在自然界中，大范圍核酸酶基本上以歸巢核酸內(nèi)切酶(homingendonuclease,HE)為代表，所述歸巢核酸內(nèi)切酶是由可移動遺傳元件編碼的核酸內(nèi)切酶家族，其功能是在稱作"歸巢"的過程中起始DNA雙鏈斷裂(DSB)所誘導(dǎo)的重組事件(Chevalier,B.S.和Stoddard,B丄.，NucleicAcidsRes"2001，29，3757-3774;Kostriken等，Cell;1983，35,167-174;Jacquier,A.和Dujon,B.，Cell,1985,41，383-394)。已在細菌、真核生物和古細菌中鑒定出數(shù)百種HE(Chevalier,B.S.和Stoddard,B丄.，NucleicAcidsRes.,2001，29,3757-3774);然而在選t基因中發(fā)現(xiàn)HE切割位點的概率卻極低。由于HE的生物學(xué)功能以及就效率和特異性而言出色的切割特性，HE提供了衍生出用于基因組工程的新核酸內(nèi)切酶的理想平臺。另外，除了其精巧的特異性以外，已顯示歸巢核酸內(nèi)切酶的毒性低于ZFP，這可能是由于更高的特異性導(dǎo)致(Alwin等，Mol.Ther.，2005，12，610-617;Porteus,M.H.和Baltimore,D.，Science,2003，300，763;Porteus,M.H.和Carroll,D.，Nat.Biotechnol.,2005，23，967-973)，上述兩個特征在治療性應(yīng)用中是必要的。過去十年中已積累了允許相對好地表征四個HE家族中最大的LAGLIDADG家族的數(shù)據(jù)(Chevalier,B.S.和Stoddard,B丄.，NucleicAcidsRes.，2001，29，3757-74)。LAGLIDADG是指在整個家族中事實上保守的唯一序列，并發(fā)現(xiàn)其在蛋白質(zhì)中以一個或兩個(更經(jīng)常)拷貝存在。具有單個基序的蛋白質(zhì)(如I-OeI)(Wang等，NucleicAcidsRes.，1997,25，3767-3776)形成同二聚體并切割回文或假回文DNA序列，而較大的雙基序蛋白質(zhì)(如Mcel)(Jacquier，A.和Dujon，B.，Cell"1985,41，383-394)或I國D附oI(Dalgaard等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1993，卯，5417-5417)是單體，并切割非回文靶標。已將九種不同的LAGLIDADG蛋白(結(jié)合或未結(jié)合DNA)結(jié)晶，它們的核心結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出非常顯著的保守性，這與其在一級序列水平缺少相似性相反(Heath等，NatureStruct.Biol.,1997，4,468-476;Duan等，Cell,1997，89，555-564;Silva等，J.Mol.Biol"2003，286,1123-1136;Chevalier等，Nat.Struct.Biol"2001，8，312-316;Jurica等，Mol.Cdl.，1998，2，469-476;Chevalier等，J.Mol.Biol"2003，329，253-269;Moure等，J.Mol.Biol"2003,334,685-695;Moure等，Nat.Struct.Biol"2002，9,764-770;Ichiyanagi等，J.Mol.Biol"2000，300，889-卯1;Gimble等.J.Biol.Chem.，1998，273,30524-30529;Bolduc等，GenesDev.2003，17，2875-2888;Silva等，J.Mol.Biol"1999，286，1123-1136;Nakayama等，J.Mol.Biol"Epub2006年9月29日；Spiegel等，Structure,2006，14，869-880)。與其結(jié)合DNA的結(jié)晶結(jié)構(gòu)(Jurica等，Mol.Cell"1998，2,469-476;Chevalier等，Nat.Struct.Biol"2001，8，312-316;Chevalier等，J.Mol.Biol.，2003，329，253-269)相反，未與DNA結(jié)合的I-Oel結(jié)構(gòu)(Heath等，NatureStruct.Biol.，1997,4,468-476)顯示在不對稱單元中只有一個單體。結(jié)構(gòu)比較表明，LAGLIDADG蛋白采用類似的活性構(gòu)象，并且其自我結(jié)合形成兩個堆積的a-螺旋，所述a-螺旋使兩個單體或表觀結(jié)構(gòu)域分隔開。在此核心結(jié)構(gòu)(圖1)中，兩個單體中或者雙LAGLIDAG蛋白的兩個結(jié)構(gòu)域中的兩個特征性appa即a折疊彼此相對，具有雙重對稱性(two-foldsymmetry)。在LAGLIDADGa-螺旋的任一側(cè)上，4條鏈的p片層形成DNA螺旋大溝上的鞍部(saddle)，這提供了使該蛋白質(zhì)與耙DNA序列之半位點相互作用的DNA結(jié)合界面(Chevalier等，Nat.Struct.Biol,2001，8,312-316;Jurica等，Mol.Cell,1998，2，469-476)。催化位點位于中央，由兩個單體中的螺旋形成。就在催化位點上方，兩個LAGLIDADGa-螺旋在二聚化界面也發(fā)揮關(guān)鍵作用。除了該核心結(jié)構(gòu)以外，還可發(fā)現(xiàn)其它結(jié)構(gòu)域，例如PU"I(—種內(nèi)含肽)，其具有蛋白質(zhì)剪接結(jié)構(gòu)域以及另外的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Moure等，Nat.Struct.Biol"2002，9，764-770;Pingoud等，Biochemistry,1998，37，8233-8243)。通過誘變和篩選/選擇來改變DNA結(jié)合蛋白的底物特異性是一項困難的任務(wù)(Lanio等,ProteinEng.,2000,13，275-281;Voziyanov等，J.Mol.Biol"2003，326，65-76;Santoro等，P.N.A.S"2002，99，4185-4190;Buchholz,F.和Stewart,A.F.,Nat.Biotechnol.,2001，19，1047-1052)。由于HE的主要特征是具有大的DNA識別位點，這項任務(wù)甚至更加困難。對I-Od/DNA晶體結(jié)構(gòu)的分析表明，在每個單體中，9個殘基(S32、Y33、Q38、N30、K28、Q26、Q44、R68和R70)與歸巢位點中的8個堿基(位于士3、4、5、6、7、9、10和11位)直接相互作用(Jurica等，Mol.Cell"1998，2，469-76;Chevalier等，J.Mol.Biol"2003，329，253-269)，其隨機化導(dǎo)致出現(xiàn)209種組合，該數(shù)目超出當(dāng)前任何篩選的能力。此外，總共28個(左側(cè)單體)或24個(右側(cè)單體)水分子介導(dǎo)了蛋白質(zhì)/DNA界面中核苷酸與蛋白質(zhì)側(cè)鏈的額外接觸(Chevalier等，J.Mol.Biol.,2003，329，253-269)。為此，幾個實驗室已依靠半推理性方法(semi-rationalapproach)(Chica等，Curr.Opin.Biotechnol.，2005,16,378-384)來限制4處理的突變體文庫的多樣性，根據(jù)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)來選擇一小部分相關(guān)氨基酸殘基。這一部分M酸一般由HE/DNA復(fù)合體結(jié)構(gòu)中4鏈p-片層中的M酸^l^組成，所述氨基酸殘基與歸巢位點中的核苷酸堿基直接接觸或由水介導(dǎo)接觸。這種半推理性方法用于局部改變Seligman等，Genetics,1997，147,1653-64;Seligman等，NucleicAcidsRes"2002，30，3870-3879;Sussman等,J.Mol.Biol"2004，342，31-41;Rosen等,NucleicAcidsRes.，2006,34，4791-4800;Arnould等，J.Mol.Biol"2006,355，443-458;國際PCT申請WO2006/097853和WO2006/097784;Smith等，NucleicAcidsRes"Epub2006年11月27日)、I國&el(Doyon等，J.Am.Chem.Soc,2006，128,2477-2484)、PI-SceI(Gimble等，J.Mol.Biol"2003，334，993-1008)和(Ashworth等，Nature,2006,441,656-659)蛋白的特異性。通過將所述半推理性方法和高通量篩選(HTS;Arnould等，J.Mol.Biol"2006,355，443-458;國際PCT申請WO2006/097853和WO2006/097784;Smith等，NucleicAcidsRes.，Epub2006年11月27日)結(jié)合，有可能獲得識別多種靶標的大量局部改變I-Oel大范圍核酸酶變體，并且有可能通過組合方法將它們組裝以獲得具有選定特異性的完全重新設(shè)計的突變體。然而，由于HEDNA結(jié)合界面非常緊密，而且負責(zé)幾乎所有堿基特異性相互作用的兩個不同PP發(fā)夾是單個折疊的一部分，所以該方法并不容易。因此，對鄰近位置的若干氨基酸進行突變可能會破壞結(jié)合界面的結(jié)構(gòu)，所述突變是與與其中若干位置已被突變的靶標結(jié)合所需的。為此，為了得到大量的序列，能夠在LAGLIDAG核酸內(nèi)切酶中鑒定可被改造而產(chǎn)生新底物特異性的其它區(qū)域是極其有價值的。此外，由于非常高劑量的歸巢核酸內(nèi)切酶有時可能是有害的(Gouble等，J.GeneMed.,2006，8，616-622)，因此改造出毒性較低的LAGLIDADG核酸內(nèi)切酶是極其有價值的。本發(fā)明人已經(jīng)解出了無DNA之I-Orl二聚體的結(jié)構(gòu)；其與結(jié)合DNA之晶體結(jié)構(gòu)(PDB編號lgz9;Chevalier等，Nat.Struct.Biol.，2001,8，312-316)的比較顯示，C端環(huán)和最后一個螺旋a6的構(gòu)象不同，這提示其參與DNA結(jié)合。對該區(qū)域的位點特異性誘變研究表明，盡管C端螺旋對于DNA結(jié)合來i兌是無關(guān)緊要的，然而最后一個C端環(huán)不M于結(jié)合和切割而且對于靶標特異性來說是4艮重要的，所述C端環(huán)在LAGLIDADG家族的同二聚體蛋白質(zhì)中高度保守(圖2),并且與DNA磷酸骨架形成許多非特異性接觸(Jurica等，Mol.Cell.,1998,2，469-76;Chevalier等，J.Mol.Biol"2003，329,253-269)。此外，與野生型I-OeI相比，所述C端環(huán)中的某些突變體具有顯著更低的毒性。該區(qū)域使得改造出具有新底物特異性的新歸巢核酸內(nèi)切酶(從而提高可被大范圍核酸酶靶向的DNA序列數(shù))有了新的可能。因此，可通過將先前鑒定的突變(如上所述)(Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458;國際PCT申請WO2006/097853，WO2006/097854和WO2006/097784;Smith等，NucleicAcidsRes.,Epub2006年11月27日)與最后一個C端環(huán)中的突變相組合，從而改造出切割目的基因中選定的基因組靶標的重新設(shè)計的大范圍核酸酶。此外，該區(qū)域還允許改造出毒性較低的歸巢核酸內(nèi)切酶?？赡艿膽?yīng)用包括基因工程、基因組工程、基因治療和抗病毒治療。本發(fā)明涉及改造出具有新底物特異性之LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶的方法，該方法包括至少以下的步驟(a)對親本LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶的最后一個C端環(huán)中的至少一個氨基酸殘基(除I-Od的140位蘇氨酸(T140)以夕卜)進行突變，以及(b)在來自步驟(a)的變體中選擇具有與親本LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶不同的DNA靶標切割模式的變體。定義-在本文中，多肽序列中的氨基酸殘基根據(jù)單字母代碼命名，其中，例如，Q表示Gln或谷氨酰胺殘基，R表示Arg或精氨酸殘基，D表示Asp或天冬氨酸殘基。-疏水氨基酸是指亮氨酸(L)、翔氨酸(V)、異亮氨酸(I)、丙氨酸(A)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。-核苷酸以如下方式命名使用單字母代碼來命名核苷中的堿基a是腺嘌呤，t是胸腺嘧啶，c是胞嘧啶，g是鳥嘌呤。對于簡并核苷酸而言，r代表g或a(嘌呤核苷酸)，k代表g或t，s代表g或c,w代表a或t,m代表a或c，y代表t或c(嘧咬核普酸)，d代表g、a或t,v代表g、a或c，b代表g、t或c，h代表a、t或c，n代表g、a、t或c。-"大范圍核酸酶"意指具有12~45pb的雙鏈DNA靶標序列的核酸內(nèi)切酶。-"親本LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶"意指野生型LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶或其功能性變體。所述親本LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶可以是單體、在功能性核酸內(nèi)切酶中包含相結(jié)合的兩個LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶核心結(jié)構(gòu)域的二聚體(同二聚體或異二聚體)，所述功能性核酸內(nèi)切酶能夠切割22~24bp的雙鏈DNA靶標。-"同二聚體LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶"意指具有單個LAGLIDADG基序并切割回文DNA乾序列的野生型同二聚體LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶，例如I-Oel或I-Msol或其功能性變體。-"LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶變體"或"變體"意指通過將LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶序列中的至少一個氨基酸替換為不同的氨基酸而獲得的蛋白質(zhì)。-"功能性變體"意指能夠切割DNA靶標的LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶變體，所述DNA耙標優(yōu)選為不被野生型LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶所切割的新DNA靶標。例如，這些變體在其與DNA乾序列接觸或者與所述DNA靶標直接或間接相互作用的位置上包含氨基酸變更?！?具有新特異性的歸巢核酸內(nèi)切酶變體"意指具有不同于親本歸巢核酸內(nèi)切酶之靶標切割模式(切割謙)的變體。所述變體可以比親本歸巢核酸內(nèi)切酶切割更少的靶標(限制型鐠)或更多的靶標。優(yōu)選地，所述變體能夠切割至少一個不被親本歸巢核酸內(nèi)切酶所切割的靶標。術(shù)語"新特異性"、"改變的特異性"、"新切割特異性"、"新底物特異性"是指所述變體對DNA乾序列中核苷酸的特異性，它們是等同的并且不加區(qū)別地j吏用。-"I-OgI"意指具有SWISSPROTP05725或pdb登錄號lg9y之序列的野生型I-Oel。-"結(jié)構(gòu)域"或"核心結(jié)構(gòu)域"意指"LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶核心結(jié)構(gòu)域"，其為LAGLIDADG家族歸巢核酸內(nèi)切酶的特征性o^^2a2(33l34a3折疊，對應(yīng)于約一百個氛基酸殘基的序列。所述結(jié)構(gòu)域包含折疊成反向平行P片層的4個P鏈(^、p2、p3、卩4)，所述P片層與DNA靶標的一半相互作用。該結(jié)構(gòu)域能夠與跟DNA靶標之另一半相互作用的另一LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶核心結(jié)構(gòu)域相結(jié)合，以形成能夠切割所述DNA靶標的功能性核酸內(nèi)切酶。例如，對于二聚體歸巢核酸內(nèi)切酶I-Od(163個M酸)的情形，LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶核心結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)于6至94位殘基。對于單體歸巢核酸內(nèi)切酶的情形，在該核酸內(nèi)切酶序列中存在兩個這樣的結(jié)構(gòu)域；例如在I-D附oI(194個氨基酸)中，第一結(jié)構(gòu)域(7至99位殘基)和第二結(jié)構(gòu)域(104至194位殘基敗短的連接子(linker)(100至103位殘基)所分隔。—"亞結(jié)構(gòu)域"意指LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶核心結(jié)構(gòu)域中與歸巢核酸內(nèi)切酶DNA靶標半位點的獨特部分發(fā)生相互作用的區(qū)域。兩個不同的亞結(jié)構(gòu)域獨立地起作用，并且在一個亞結(jié)構(gòu)域中的突變不改變另一亞結(jié)構(gòu)域的結(jié)合和切割特性。因此，兩個亞結(jié)構(gòu)域各自結(jié)合歸巢核酸內(nèi)切酶DNA靶標半位點中的不同部分?！?(3-發(fā)夾"意指LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶核心結(jié)構(gòu)域的反向平行P片層中通過環(huán)或者轉(zhuǎn)角相連的兩個連續(xù)P鏈(p^2或者p3p4)。-"DNA耙標"、"DNA乾序列"、"耙序列"、"乾位點"、"乾標"、"位點"、"識別位點"、"識別序列"、"歸巢識別位點"、"歸巢位點"、"切割位點"意指被LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶識別并切割的22~24bp雙鏈回文、部分回文(假回文)或者非回文多核苷酸序列。這些術(shù)語均指所述核酸內(nèi)切酶誘導(dǎo)雙鏈斷裂(切割)的獨特的DNA位置，優(yōu)選基因組位置。所述DNA靶標通過雙鏈多核苷酸中一務(wù)漣的5，至3，序列來定義。例如，圖8所示的被野生型I-Od切割的回文DNA乾序列定義為以下序列對DNA靶標的切割發(fā)生在+2和-2位(分別針對有義鏈和反義鏈)核普酸處。除非另有指明，發(fā)生I-Od大范圍核酸酶變體切割DNA乾標的位置均對應(yīng)于DNA靶標有義鏈中的切割位點。-"DNA乾標半位點"、"半切割位點"或"半位點"意指DNA靶標中與每個LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶核心結(jié)構(gòu)域結(jié)合的部分。-"嵌合DNA靶標"或"雜合DNA靶標"意指兩種親本大范圍核酸酶乾序列彼此不同之半序列的融合物。此外，所述靼標的至少一個半序列中可包含與各自亞結(jié)構(gòu)域結(jié)合的核香酸組合(組合DNA靶標)。-"載體"意指能夠運送與其相連的另一核酸的核酸分子?！?突變"意指對核酸/氨基酸序列中一個或多個核苷酸/氨基酸進行的替換、缺失和/或添加。-"同源的"意指序列與另一序列之間具有足以使所述序列發(fā)生同源重組的同一性，更特別地具有至少95%同一性，優(yōu)選地97%同一性以及更優(yōu)選地99%。_"同一性"是指兩個核酸分子或多肽之間的序列同一性?？赏ㄟ^比較每個序列中的位置來確定同一性，所述序列可為了比較的目的而進行比對。當(dāng)所比M列中的位置由相同a占據(jù)時，則所述分子在該位置是一致的。核酸或Jl^酸序列之間的相似性或同一性程度是在核酸序列共有位置上一致或匹配的核苷酸數(shù)目的函數(shù)?？墒褂枚喾N比對算法和/或程序來計算兩個序列之間的同一性，包括作為GCG序列分析軟件包(UniversityofWisconsin,Madison,Wis.)之一部分提供的FASTA或BLAST,其可使用例如默認i殳置。-"個體，，包括哺乳動物以及其它脊推動物(例如，鳥類、魚類和爬行類)。本文使用的術(shù)語"哺乳動物"是指任何哺乳喂養(yǎng)其幼仔的胎生(真獸亞綱(eutharian)或有胎盤哺乳動物)或者卵生(后獸亞綱(metatharian)或無胎盤哺乳動物)脊推動物，包括單孔目動物、有袋動物類和胎盤動物。哺乳動物物種的實例包括人類及其它靈長類(例如，猴子、黑猩猩)、嚙齒動物(例如，大鼠、小鼠、豚鼠)和反芻動物(例如，牛、豬、馬)。-"遺傳病"是指部分或完全、直接或間接地由于一個或幾個基因中的異常所導(dǎo)致的任何疾病。所述異?？梢允峭蛔?、插入或缺失。所述突變可以是點突變(punctualmutation)。所述異?？捎绊懟虻木幋a序列或其調(diào)節(jié)序列。所述異?？捎绊懟蚪M序列的結(jié)構(gòu)或者所編碼mRNA的結(jié)構(gòu)或穩(wěn)定性。所述遺傳病可以是隱性的或顯性的。這些遺傳病可以是(但不限于)嚢性纖維化、亨廷頓舞蹈癥、家族性高膽固醇血癥(LDL受體缺陷)、肝母細胞瘤、威爾遜病、先天性肝卟啉癥、肝代謝遺傳病、萊-尼綜合征、鐮狀細胞貧血、地中海貧血、著色性干皮病、范科尼貧血、視網(wǎng)膜色素變14性、毛細血管擴張性共濟失調(diào)、布盧姆綜合征、視網(wǎng)膜母細胞瘤、杜興氏肌營養(yǎng)不良癥以及f薩病。根據(jù)本發(fā)明，最后一個C端環(huán)的氨基酸對應(yīng)于氨基酸序列SEQIDNO:2或SwissprotP05725中的137至143位。了解中最后一個C端環(huán)的位置后，使用公知的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析軟件(例如Pymol)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地推出另一同二聚體LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶中的對應(yīng)位置。例如，對于I-M5d來說，最后一個C端環(huán)對應(yīng)于143至149位。根據(jù)所述方法的一個有利的實施方案，步驟(a)包括對最后一個C端環(huán)中的氨基酸殘基進行突變，所述最后一個C端環(huán)與親本LAGLIDADG核酸內(nèi)切酶DNA切割位點(野生型LAGLIDAG核酸內(nèi)切酶歸巢位點)中的磷酸骨架接觸。優(yōu)選地，所述殘基參與結(jié)合以及切割所述DNA切割位點。更優(yōu)選地，所述殘基位于138、139、142或143位，這是參考I-CVeI氨基酸序列(SEQIDNO:2;圖2)的編碼?？梢栽谝粋€變體中對兩個殘基進行突變，只要每個突變位于選自以下的不同殘基對中即可138和139位的殘基對，142和143位的殘基對。根據(jù)本發(fā)明的方法，所引入的突變改變了最后一個C端環(huán)中所述氨基酸與親本LAGLIDADG核酸內(nèi)切酶DNA切割位點之磷酸骨架的相互作用。根據(jù)所述方法的另一有利的實施方案，步驟(a)中的突變是將所述最后一個C端環(huán)中的至少一個氨基酸替換為不同的氨基酸。優(yōu)選地，138位或139位的殘基被替換為疏水氨基酸，以避免與DNA切割位點中的磷酸骨架形成氫鍵。例如，138位的殘基被替換為丙氨酸，或者139位的殘基被替換為甲硫氨酸。142位或143位的殘基有利地被小氨基酸(例如甘氨酸)替換，以降低這些氨基酸殘基的側(cè)鏈大小。根據(jù)本發(fā)明的方法，步驟(a)中的突變被引入野生型LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶或其功能性變體中。所述野生型LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶有利地是同二聚體。野生型同二聚體LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶的實例示于Lucas等,NucleicAcidsRes.,2001,29，960-969的表1中。所述野生型同二聚體LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶可以有利地選自I-Oel、I-Owl、I-Af^I和I-QflI，優(yōu)選I-OrI。所述功能性變體包含最后一個C端環(huán)以外的額外突變，其優(yōu)選位于與DNA靶標半位點相互作用的氨基酸殘基處。所述LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶中的DNA相互作用殘基是本領(lǐng)域公知的。所突變的殘基可與DNA骨架或與核苷酸堿基直接相互作用或者通過水分子發(fā)生相互作用。優(yōu)選地，所述突變改變了所述大范圍核酸酶的切割特異性，并得到能夠切割來自目的基因之DNA靶標的具有新特異性的大范圍核酸酶。更優(yōu)選地，所述突變是對第一功能性亞結(jié)構(gòu)域(對應(yīng)于I-Orl氨基酸序列的26至40位)中一個或多個氨基酸的替換(其改變了針對DNA靶標±8至10位之核苷酸的特異性)，和/或?qū)Φ诙δ苄詠喗Y(jié)構(gòu)域(對應(yīng)于I-Oel氨基酸序列的44至77位)的替換(其改變了針對DNA靶標±3至5位之核苷酸的特異性)，如先前所述(國際PCT申請WO2006/097784和WO2006/097853;Arnould等，J.Mol.Biol"2006,355,443-458;Smith等，NucleicAcidsRes.，2006)。所述替換有利地對應(yīng)于I-Oel氨基酸序列的26、28、30、32、33、38和/或40、44、68、70、75和/或77位。為了切割DNA靶標(其中n-4是t或者n+4是a)，所述變體有利地在44位具有谷氨酰胺(Q);為了切割DNA靶標(其中n_4是a或者n+4是t)，所述變體在44位具有丙氨酸(A)或天冬酰胺；為了切割DNA靶標(其中11_9是g或者11+9是c)，所述變體有利地在38位具有精氨酸(R)或賴氨酸(K)。才艮據(jù)所述方法的一個最優(yōu)選實施方案，所述親本LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶是在I-Oel的26至40位和44至77位中含有突變并且切割回文DNA序列的I-Oel變體，其中所述DNA序列的一半中至少+3至+5和+8至+10位或者-10至-8和-5至-3位的核普酸對應(yīng)于目的基因DNA乾標的一半中+3至+5和+8至+10位或者-10至-8和-5至-3位的核苷酸。根據(jù)本領(lǐng)域公知并以商品提供的標準誘變方法引入步驟(a)中的突變。如上所述，根據(jù)熟知的重疊PCR技術(shù)，可有利地通過擴增包含突變位點的重疊片段而產(chǎn)生所述突變?？筛鶕?jù)標準方法來產(chǎn)生在最后一個c端環(huán)中含有氨基酸變更之變體的文庫。步驟(a)可包括在與DNA靶序列接觸或者與所述DNA靶標直接或間接相互作用的其它位置處引入額外的突變，如上所述。該步驟可通過以下來實現(xiàn)產(chǎn)生組合文庫(如國際PCT申請WO2004/067736，Arnould等，J.Mol.Biol"2006，355,443-458以及Smith等，NucleicAcidsRes.，Epub2006年11月27日中所述)，并最終才艮據(jù)>^知的重疊PCR技術(shù)，通過擴增包含每個突變的重疊片段而在將所述突變在分子內(nèi)組合。另外，還可在整個變體或部分變體(特別是變體的C端一半，即I-Orf氨基酸序列SEQIDNO:2的80至163位)中引入隨機突變，從而改善該變體針對目的基因DNA靶標的結(jié)合和/或切割特性?？赏瑫r或依次引入所述最后一個C端環(huán)中的突變以及(隨機或定點的)額外的突變。此外，可在變體單體/結(jié)構(gòu)域的NH2端和/和COOH端插入一個或多個殘基。例如，在NH2端引入甲硫氨酸殘基，在NH2端和/和COOH端引入標簽(表位或多聚組氨酸序列)；所述標簽可用于檢測和/或純化所述大范圍核酸酶。步驟(b)中的選擇和/或篩選可通過在體外或體內(nèi)使用切割測定來進行，如國際PCT申請WO2004/067736中所述。根據(jù)所述方法的另一有利的實施方案，步驟(b)在體內(nèi)在一定條件下進行，其中在所述條件下該變體在突變DNA乾序列中產(chǎn)生雙鏈斷裂，這通過所述DNA雙鏈斷裂的重組介導(dǎo)修復(fù)而導(dǎo)致正選擇標記或報告基因的活化，或者負選擇標記或才艮告基因的失活。例如，本發(fā)明變體的切割活性可在酵母或哺乳動物細胞中使用報告載體通過同向重復(fù)重組測定進行測量，如PCT申請WO2004/067736;Epinat等，NucleicAcidsRes"2003,31，2952-2962;Chames等，NucleicAcidsRes"2005，33,e178以及Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458所述。所述報告載體包含報告基因的兩個截短的無功能拷貝(同向重復(fù))以及位于間插序列(interveningsequence)內(nèi)部的嵌合DNA乾序列，將它們克隆至酵母或哺乳動物表達載體中。所述DNA乾序列衍生自親本歸巢核酸內(nèi)切酶位點，其通過將至少一個核香酸替換為不同的核普酸來實現(xiàn)。優(yōu)選地，測試一組回文或非回文DNA靶標，其代表在DNA切割位點中一個或多個位置上4種堿基(g、a、c、t)的不同組合(對于n個突變位置來說為411種回文靶標)。所述變體的表達產(chǎn)生能夠切割所述DNA乾序列的功能性核酸內(nèi)切酶。這樣的切割誘導(dǎo)同向重復(fù)之間的同源重組，得到功能性報告基因，其表達可通過適當(dāng)?shù)臏y定進行監(jiān)測。根據(jù)所述方法的另一有利的實施方案，步驟(b)包括選擇和/或篩選來自步驟(a)的能夠切割至少一個不被親本LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶所切割的DNA靶序列的變體，所述DNA乾序列源自親本LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶切割位點，其用將所述切割位點之一半中的至少一個核苷酸替換為不同的核苷酸而得到。根據(jù)本發(fā)明的方法，所述親本DNA耙標可以是回文、非回文或假回文的。優(yōu)選地，所述DNA靶序列源自具有序列SEQIDNO:1的I-Od回文位點。更優(yōu)選地，所述DNA乾標在土1至2、±6至7、±8至10和/或±11至12位具有核苷酸突變，更加優(yōu)選在±1至2、±6至7和/或±11至12位具有核苷酸突變。根據(jù)所述方法的另一有利的實施方案，其包括表達步驟(b)中所得一個變體的再一個步驟(c),以允許形成同二聚體。所述同二聚體能夠切割回文或假回文的靶序列。根據(jù)所述方法的另一有利的實施方案，其包括再一個步驟(c，)，其中將步驟(b)中得到的一個變體與野生型LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶或其功能型變體共表達，以允許形成異二聚體。通過共表達兩種不同的LAGLIDADG核酸內(nèi)切酶單體來組裝功能性異二聚體已在先前有所描述Arnould等，J.Mol.Biol"2006，355,443-458;國際PCT申請WO2006/097853，WO2006/097854和WO2006/097784;Smith等，NucleicAcidsRes"Epub2006年11月27日。優(yōu)選地，共表ii^L步驟(b)中得到的兩種不同變體。所述異二聚體能夠切割非回文的嵌合靶標。例如，可利用編碼所述變體的一種或兩種重組表達載體來修飾宿主細胞。然后，在允許所述變體表達的條件下培養(yǎng)所述細胞，隨后從細胞培養(yǎng)18物中回收所形成的同二聚體/異二聚體。根據(jù)本發(fā)明的方法，可通過將步驟(b)中得到的一個變體與歸巢核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域/單體融合來構(gòu)建單鏈嵌合大范圍核酸酶。所述結(jié)構(gòu)域/單體可來自野生型LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶或其功能性變體。優(yōu)選地，所述兩個結(jié)構(gòu)^/單體通過肽連接子來連接。更優(yōu)選地，所述單鏈大范圍核酸酶包含步驟(b)中得到的兩種不同變體；所述單鏈大范圍核酸酶能夠切割非回文的嵌合乾標，所述嵌合乾標包含每種變體DNA耙標中不同的一半。構(gòu)建源自歸巢核酸內(nèi)切酶的單鏈嵌合大范圍核酸酶的方法是本領(lǐng)域熟知的(Epinat等，NucleicAcidsRes"2003，31,2952-62;Chevalier等，MolCell.,2002,10，895-卯5;Steuer等，Chembiochem.,2004，5，206-13;國際PCT申請WO03/078619和WO2004/031346)。可使用任意這些方法來構(gòu)建源自本發(fā)明所述之變體的單鏈嵌合大范圍核酸酶。本發(fā)明還涉及可通過上述方法得到的同二聚體或異二聚體的LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶變體，除了SEQIDNO:3和4的同二聚體變體以及包含SEQIDNO:5單體的同二聚體或異二聚體變體以外；本發(fā)明的LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶變體也稱作"變體"、"大范圍核酸酶變體"或"大范圍核酸酶"。根據(jù)所述變體的一個有利的實施方案，它是包含如下單體的異二聚體，所述單體來自可通過上述方法得到的兩種不同變體。根據(jù)所述變體的另一有利的實施方案，它是含有一個或兩個突變的I-Oel變體，其中每個突變來自選自以下的不同突變對S138A和K139M對，K142G和T143G對。這樣的變體的實例包括SEQIDNO:6至9。更優(yōu)選地，所述I-Od變體是異二聚體，其包含兩個單體，并且能夠切割目的基因的基因組DNA靶標，其中每個單體還包含I-Oel的26至40位和44至77位的不同突變。本發(fā)明的主題還包括源自上述變體的單鏈嵌合大范圍核酸酶；本發(fā)明的單鏈嵌合大范圍核酸酶也稱作"單鏈衍生物"、"單鏈大范圍核酸酶"、"單鏈大范圍核酸酶衍生物"或"大范圍核酸酶"。本發(fā)明的大范圍核酸酶包括大范圍核酸酶變體和單鏈大范圍核酸酶衍生物。本發(fā)明的主題還包括編碼上述變體或單鏈衍生物的多核普酸片段；所述多核苷酸可編碼同二聚體或異二聚體變體中的一個單體，或者單鏈衍生物中的兩個結(jié)構(gòu)域/單體。本發(fā)明的主題還包括用于表達本發(fā)明的變體或單鏈衍生物的重組栽體。所述重組載體包含至少一個編碼所述變體或單鏈大范圍核酸酶的多核苷酸片段。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述載體包含兩個不同的多核苷酸片段，其中每個片段編碼異源二聚變體的單體之一。本發(fā)明中可使用載體包括但不限于病毒載體、質(zhì)粒、RNA載體或者線性或環(huán)狀的DNA或RNA分子，其可由染色體的、非染色體的、半合成的或者合成的核酸組成。優(yōu)選的載體是能夠自我復(fù)制(附加型載體)和/或表達與其相連的核酸(表達載體)的那些。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知大量合適的市售載體。病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、細小病毒(例如船目關(guān)病毒)、冠狀病毒、負鏈RNA病毒如正粘病毒(例如流感病毒)、彈狀病毒(rhabdovirus)(例如狂犬病毒和皰滲性口腔炎病毒)、副粘病毒(例如麻滲病毒和仙臺病毒)、正鏈RNA病毒如小RNA病毒和甲病毒，以及雙鏈DNA病毒包括腺病毒、皰療病毒(例如1型和2型單純皰務(wù)病毒、EB病毒、巨細胞病毒)，以及痘病毒(例如痘苗病毒、禽痘病毒和金絲雀痘病毒)。其它病毒包括例如諾沃克病毒、披膜病毒、黃病毒、呼腸孤病毒、乳多空病毒、嗜肝DNA病毒和肝炎病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒的實例包括禽類造白細胞組織增生肉瘤病毒(avianleukosissarcoma)、哺乳動物C型、B型病毒、D型病毒、HTLV-BLV群、慢病毒、泡沫病毒(Coffin,J.M.，Retroviridae:Thevirusesandtheirreplication,InFundamentalVirology,第三版,B.N.Fields等編著,Lippincott國RavenPublishers,Philadelphia,1996)。優(yōu)選的栽體包括慢病毒載體，特別是自失活的慢病毒載體。栽體可包M擇標記，例如用于真核細胞培養(yǎng)的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶、組氨醇脫氫酶、二氫葉酸還原酶、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶、單純皰療病毒胸苦激酶、腺普脫氨酶、谷氨酰胺合成酶以及次黃嘌呤-鳥噪呤轉(zhuǎn)磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶；用于釀酒酵母"^vi's/"e)的TRP1;用于大腸桿菌(￡.的四環(huán)素、利福平或氨節(jié)青霉素抗性。優(yōu)選地，所述載體是表達載體，其中編碼本發(fā)明所述變體/單鏈衍生物的序列置于適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄和翻譯控制元件的控制下，從而允許產(chǎn)生或合成所述大范圍核酸酶。因此，所述多核普酸包含在表達盒內(nèi)。更具體地，所述載體包含復(fù)制起點、與所述編碼多核苷酸有效連接的啟動子、核糖體結(jié)合位點、RNA剪接位點(當(dāng)使用基因組DNA時)、多腺苷酸化位點以及轉(zhuǎn)錄終止位點。它還可包含增強子。啟動子的選擇將取決于表達該多肽的細胞。優(yōu)選地，當(dāng)所述變體為異二聚體時，編碼其中每個單體的兩個多核苷酸被包含在一個載體中，該載體能夠同時驅(qū)動兩個多核苷酸表達。合適的啟動子包括組織特異性和/或誘導(dǎo)型的啟動子。誘導(dǎo)型啟動子的實例包括由重金屬水平提高誘導(dǎo)的真核金屬疏蛋白啟動子、應(yīng)答于異丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)而被誘導(dǎo)的原核lacZ啟動子以及由溫度升高誘導(dǎo)的真核熱休克啟動子。組織特異性啟動子的實例是骨骼肌肌酸激酶、前列腺特異性抗原(PSA)、a-抗胰蛋白S^白酶、A^面活性蛋白(SP)A和B、P-酪蛋白和酸性乳清蛋白基因。根據(jù)所述栽體的另一有利的實施方案，其包括靶向構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含與上述基因組DNA靶標切割位點附近區(qū)域具有同源性的序列?；蛘?，編碼所述大范圍核酸酶的載體和包含所述耙向DNA構(gòu)建體的載體為不同的載體。更優(yōu)選地，所述靶向DNA構(gòu)建體包含(a)與上述基因組DNA切割位點附近區(qū)域具有同源性的序列，和(b)待引入序列，其側(cè)翼為a)中的序列。優(yōu)選地，使用至少50bp、優(yōu)選多于100bp以及更優(yōu)選多于200bp的同源序列。事實上，共有的DNA同源序列位于斷裂位點上游和下游側(cè)翼的區(qū)域，待引入的DNA序列應(yīng)位于所述兩臂之間。所述待引入的序列優(yōu)選為修復(fù)目的基因中的突變的序列(功能基因的基因修正或復(fù)原)，用于基因組治療的目的。或者，它可以是用于以某種特定方式改變?nèi)旧wDNA的任何其它序列，包括用于修飾特定基因的序列、用于弱化或激活內(nèi)源目的基因的序列、用于失活或缺失內(nèi)源性目的基因或其部分的序列、用于將突變引入目的位點的序列或者用于引入外源基因或其部分的序列。本發(fā)明還涉及經(jīng)上述多核苷酸或載體(優(yōu)選表達載體)^務(wù)飾的原核或真核宿主細胞。本發(fā)明還涉及非人轉(zhuǎn)基因動物或轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于它們的所有細胞或部分細胞經(jīng)上述多核香酸或載體修飾。本文使用的"細胞"是指原核細胞(例如細菌細胞)或真核細胞(例如動物、植物或酵母細胞)。本發(fā)明的主題還包括以下各項用于分子生物學(xué)、體內(nèi)或體外基因工程以及體內(nèi)或體外基因組工程的非治療性目的的用途如上定義的大范圍核酸酶(除SEQIDNO:5以外)、一種或兩種衍生的多核苷酸(優(yōu)選包含在表達載體中)、細胞、轉(zhuǎn)基因植物、非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物。非治療性目的包括例如(i)對包裝細胞系中特定基因座的基因靶向，用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)，(ii)對農(nóng)作物中特定基因座的基因靶向，用于品系改良和代謝工程，(iii)靶向重組，用于在經(jīng)遺傳修飾的農(nóng)作物中除去標記，(iv)靶向重組，用于在經(jīng)遺傳修飾的微生物菌林(例如用于生產(chǎn)抗生素的菌林)中除去標記。根據(jù)所述用途的一個有利的實施方案，其用于在包含DNA耙序列的目的位點處誘導(dǎo)雙鏈斷裂，從而誘導(dǎo)DNA重組事件、DNA丟失或細胞死亡。根據(jù)本發(fā)明，所述雙鏈斷裂用于修復(fù)特定的序列、修飾特定的序列、在原位將突變基因恢復(fù)為功能基因、削弱或激活目的內(nèi)源基因、將突變引入目的位點、引入外源基因或其部分、失活或檢測內(nèi)源基因或其部分、使染色體臂易位或者使DNA不被修復(fù)和降解。本發(fā)明的主題還包括遺傳工程方法，其特征在于它包括以下步驟通過將包含如前所述之DNA靶標的載體與前述大范圍核酸酶(除SEQIDNO:5以外)接觸而在所述載體上的目的位點處引起雙鏈核酸斷裂，從而誘導(dǎo)與另一栽體的同源重組，所述另一載體與所述大范圍核酸酶的切割位點附近的序列具有同源性。本發(fā)明的主題還包括基因組工程方法，其特征在于它包括以下步驟1)通過將大范圍核酸酶的至少一個DNA靶標與所述大范圍核酸酶(除SEQIDNO:5以外)接觸使包含所述靶標的基因座發(fā)生雙鏈斷裂；2)在適于與靶向DNA構(gòu)建體發(fā)生同源重組的條件下維持所述斷裂的基因座，所述靶向DNA構(gòu)建體包含待引入所述基因座的序列，所述序列的兩側(cè)是與乾基因座具有同源性的序列。本發(fā)明的主題還包括基因組工程方法，其特征在于它包括以下步驟1)使包含前述大范圍核酸酶的至少一個DNA耙標的基因座發(fā)生雙鏈斷裂，這通過將所述切割位點與所述大范圍核酸酶(除SEQIDNO:5以外)接觸來實現(xiàn)；2)在適于與染色體DNA發(fā)生同源重組的條件下維持所述斷裂的基因座，所述染色體DNA與該切割位點附近的區(qū)域具有同源性。本發(fā)明的主題還包括前述至少一種大范圍核酸酶(除SEQIDNO:5以外)、前述一種或兩種衍生多核普酸(優(yōu)選包含在表達載體中)用于制備藥物的用途，所述藥物用于在有此需要的個體中預(yù)防、改善或治療遺傳病，所述藥物旨在通過任意方式向所述個體施用。本發(fā)明的主題還包括用于在有此需要的個體中預(yù)防、改善或治療遺傳病的方法，所述方法包括通過任意方式向所述個體施用含有上述至少一種大范圍核酸酶的組合物的步驟。在這種情形中，上述大范圍核酸酶的使用包括至少以下步驟(a)在個體的體細胞組織中誘導(dǎo)基因中目的位點處的雙鏈切割，所述基因包含至少一個所述大范圍核酸酶的識別和切割位點，以及(b)將靶向DNA引入該個體，其中所述靶向DNA包含(1)與所述切割位點周圍的區(qū)域具有同源性的DNA，和(2)基于所述把向DNA與染色體DNA之間的重組來修復(fù)所述目的位點的DNA。所述耙向DNA在適于將靶向DNA引入目的位點的M下引入個體中。根據(jù)本發(fā)明，通過以下方式誘導(dǎo)所述雙鏈切割通過向個體施用所述大范圍核酸酶來整體(intoto)誘導(dǎo)；或者通過將所述大范圍核酸酶引入體細胞來離體誘導(dǎo)，所述體細胞從個體中取出并在修飾后返回該個體中。在所述用途的一個優(yōu)選實施方案中，所述大范圍核酸酶與靶向DNA構(gòu)建體組合，所述構(gòu)建體包含修復(fù)基因中突變的序列，所述序列的兩側(cè)是與上述大范圍核酸酶之基因組DNA切割位點周圍的基因區(qū)域具有同源性的序列。所述修復(fù)突變的序列是具有正確序列的基因片段或外顯子敲入構(gòu)建體。就修正基因而言，基因切割發(fā)生在突變附近，優(yōu)選地在突變的500bp范圍內(nèi)。靶向構(gòu)建體包含在基因組DNA切割位點兩側(cè)具有至少200bp之同源序列的基因片段(最小修復(fù)基質(zhì))用于修復(fù)所述切割，并包含所述基因的正確序列用于修復(fù)突變。因此，用于基因修正的耙向構(gòu)建體包含所述最小^修復(fù)基質(zhì)，或由其組成；其優(yōu)選為200pb至6000pb，更優(yōu)選為1000pb至2000pb。就恢復(fù)功能性基因而言，基因切割發(fā)生在突變的上游。優(yōu)選地，所述突變是該基因序列中已知的第一個突變，以使該基因中所有下游突變均可以同時被修正。所述靶向構(gòu)建體包含基因組DNA切割位點下游的框內(nèi)融合(像在cDNA中一樣)的外顯子，并且?guī)в卸嘞佘账峄稽c以在3，端終止轉(zhuǎn)錄。待引入序列(外顯子敲入構(gòu)建體)的兩側(cè)是所述切割位點周圍的內(nèi)含子或外顯子，從而使經(jīng)改造基因(外顯子敲入基因)轉(zhuǎn)錄成能夠編碼功能性蛋白質(zhì)的mRNA。例如，所述外顯子敲入構(gòu)建體的兩側(cè)是上游和下游序列。本發(fā)明的主題還包括如上所述的至少一種大范圍核酸酶(除SEQIDNO:5以外)、上述一種或兩種衍生多核苷酸(優(yōu)選包含在表達載體中)用于制備藥物的用途，所述藥物用于在有此需要的個體中預(yù)防、改善或治療由帶有DNA中間體(DNAintermediate)的傳染原所引起的疾病，所述藥物通過任意方式向所述個體施用。本發(fā)明的主題還包括用于在有此需要的個體中預(yù)防、改善或治療由帶有DNA中間體的傳染原所引起的疾病的方法，所述方法至少包括通過任意方式向所述個體施用上述組合物的步驟。本發(fā)明的主題還包括如上所述的至少一種大范圍核酸酶、上述一種或兩種多核苷酸(優(yōu)選包含在表達載體中)用于在體外在生物來源的產(chǎn)品或者旨在用于生物用途的產(chǎn)品中抑制帶有DNA中間體的傳染原增殖、使其失活或清除它們的用途，或者用于對物品消毒的用途。本發(fā)明的主題還包括用于從產(chǎn)品或材料中去除帶有DNA中間體的傳染原的方法，所述方法至少包括將生物來源的產(chǎn)品或者旨在用于生物學(xué)用途的產(chǎn)品或者物品與上述組合物接觸足以抑制所述傳染原增殖、使其失活或消除的時間。在一個具體的實施方案中，所述傳染原是病毒。例如，所述病毒是腺病毒(Adll、Ad21)、皰滲病毒(HSV、VZV、EBV、CMV、皰滲病毒6、7或8)、嗜肝DNA病毒(HBV)、乳多空病毒(HPV)、痘病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒(HTLV、HIV)。本發(fā)明的主題還包括組合物，其特征在于包含上述至少一種大范圍核酸酶(除SEQIDNO:5以外)、一種或兩種衍生多核苷酸(優(yōu)選包含在表達載體中)。在所述組合物的一個優(yōu)選實施方案中，其包含乾向DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含修復(fù)目的位點的序列，該序列兩側(cè)是與上述把基因座具有同源性的序列。優(yōu)選地，所述靶向DNA構(gòu)建體被包含在重組載體中，或者其被包含在含有編碼所述大范圍核酸酶之多核苷酸的表達載體中，如本發(fā)明中所述。本發(fā)明的主題還包括作為組合制劑用于同時、分別或依次用于預(yù)防或治療遺傳病的至少含有以下的產(chǎn)品上述大范圍核酸酶(除SEQIDNO:5以外)或者一種或兩種編碼所述大范圍核酸酶的表達載體，以及包含靶向構(gòu)建體的載體。就治療目的而言，以治療有效量來施用所述大范圍核酸酶和可藥用賦形劑。如果所施用的量有生理意義的話，則這樣的組合稱為是以"治療有效量"施用的。如果藥劑的存在導(dǎo)致受者生理上發(fā)生可檢測的變化，則該藥劑是有生理意義的。在本文中，如果藥劑的存在導(dǎo)致目標疾病的一種或多種癥狀的嚴重程度降低并導(dǎo)致該損傷或異常的基因組修正，則該藥劑是有生理意義的。在本發(fā)明之用途的一個實施方案中，所述大范圍核酸酶基本上是非免疫原性的，即不引起或幾乎不引起有害的免疫應(yīng)答?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明使用多種改善或消除此種有害免疫應(yīng)答的方法。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述大范圍核酸酶幾乎不含N-甲酰甲硫氨酸。另一避免不期望的免疫應(yīng)答的方法是將大范圍核酸酶與聚乙二醇("PEG")或聚丙二醇("PPG")(優(yōu)選平均分子量(MW)500至20，000道爾頓)綴合。例如Davis等(US4,179,337)所述，與PEG或PPG綴合可提供具有抗病毒活性的非免疫原性的、具有生理活性的水溶性核酸內(nèi)切酶綴合物。類似的方法還使用聚乙二醇-聚丙二醇共聚物，其描述于Saifer等(US5,006,333)中。所述大范圍核酸酶可作為多肽或作為編碼所述多肽的多核苷酸構(gòu)建體/載體來使用。通過本領(lǐng)域公知適用于特定細胞類型的任何方便的方法將其在體外、離體或在體內(nèi)(單獨地或與至少一種合適的栽體和/或與乾向DNA—起)引入細胞中。一旦進入細胞，所述大范圍核酸酶以及(如果存在的話)含有乾向DNA和/或編碼大范圍核酸酶之核酸的載體被細胞從胞質(zhì)輸入或轉(zhuǎn)移至核中的作用位點。所述大范圍核酸酶(多肽)可有利地與脂質(zhì)體、聚乙烯亞胺(PEI)和/或膜易位肽(membranetranslocatingpeptide)(Bonetta,TheScientist;2002，16,38;Ford等，GeneTher"2001，8，l隱4;Wadia和Dowdy，Curr.Opin.Biotechnol.，2002，13，52-56)聯(lián)合；在后一情形中，所述大范圍核酸酶的序列與膜易位肽的序列融合(融合蛋白)?？赏ㄟ^多種方法(例如，注射、直接攝入、生物射彈轟擊、脂質(zhì)體、電穿孔)將包含靶向DNA和/或編碼大范圍核酸酶之核酸的載體引入細胞。可使用表達載體在細胞中穩(wěn)定或瞬時表達大范圍核酸酶。在真核細胞中的表達技術(shù)是本領(lǐng)域公知的(參見CurrentProtocolsinHumanGenetics:第12章"VectorsForGeneTherapy"&第13章"DeliverySystemsforGeneTherapy")?？蛇x地，可優(yōu)選將核定位信號整合進重組蛋白質(zhì)中以確保其在核內(nèi)表達。本發(fā)明的大范圍核酸酶的用途以及使用所述大范圍核酸酶的方法還包括上述使用編碼所述大范圍核酸酶的多核苷酸、載體、細胞、轉(zhuǎn)基因植物或非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物。根據(jù)本發(fā)明的用途和方法的另一有利的實施方案，所述大范圍核酸酶、多核苷酸、載體、細胞、轉(zhuǎn)基因植物或非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物與上述耙向DNA構(gòu)建體聯(lián)合。優(yōu)選地，所述編碼大范圍核酸酶單體的栽體包含如上所述的靼向DNA構(gòu)建體。本發(fā)明還涉及用于改造出I-Od變體的第一種方法，所述變體能夠切割來自目的基因的基因組DNA靶序列，該方法包括至少以下步驟(aj構(gòu)建第一系列的變體，所述變體在LAGLIDADG核心結(jié)構(gòu)域的第一功能性亞結(jié)構(gòu)域(位于I-OeI的26至40位)中含有至少一個替換，(bj構(gòu)建第二系列的變體，所述變體在LAGLIDADG核心結(jié)構(gòu)域的第二功能性亞結(jié)構(gòu)域(位于I-Od的44至77位)中含有至少一個替換，(d)從步驟(aj的第一系列中選擇和/或篩選能夠切割突變體I-Oel位點的變體，其中(i)I-OeI位點中-lO至-8位的核苷酸三聯(lián)體已替換為所述基因組靶標中-10至-8位的核苷酸三聯(lián)體，并且(ii)+8至+10位的核香酸三聯(lián)體已替換為所述基因組靶標中-10至-8位所存在核苷酸三聯(lián)體的反向互補序列，(dj從步驟(bj的第二系列中選擇和/或篩選能夠切割突變體I-Od位點的變體，其中(i)I-Orl位點中-5至-3位的核苷酸三聯(lián)體已被替換為所述基因組靶標中-5至-3位所存在的核苷酸三聯(lián)體，并且(ii)+3至+5位的核苷酸三聯(lián)體已替換為所述基因組靶標中-5至-3位所存在核苷酸三聯(lián)體的反向互補序列，(ei)從步驟(ai)的第一系列選擇和/或篩選能夠切割突變體位點的變體，其中(i)I-Oel位點中+8至+10位的核普酸三聯(lián)體已被替換為所述基因組靶標中+8至+10位的核苷酸三聯(lián)體，以及(ii)-10至-8位的核苷酸三聯(lián)體已替換為所述基因組靶標中+8至+10位所存在核苷27酸三聯(lián)體的反向互補序列，(&)從步驟(b)的第二系列選擇和/或篩選能夠切割突變體位點的變體，其中(i)I-Orl位點中+3至+5位的核苷酸三聯(lián)體已被替換為所述基因組靶標中+3至+5位存在的核苷酸三聯(lián)體，以及(ii)-5至-3位的核苷酸三聯(lián)體已被替換為所述基因組靶標中存在的+3至+5位核苷酸三聯(lián)體的反向互補序列，(gi)在一個變體中組合來自步驟(Cl)和步驟(dj的兩種變體中26至40位和44至77位的突變，以得到切割如下序列的新的同二聚體I-CVeI變體，在所述序列中(i)-10至-8位的核苷酸三聯(lián)體與所述基因組靶標-10至-8位存在的核苷酸三聯(lián)體一致，(ii)+8至+10位的核普酸三聯(lián)體與所述基因組靶標中-10至-8位存在的核苷酸三聯(lián)體的反向互補序列一致，(m)-5至-3位的核苷酸三聯(lián)體與所述基因組靶標中-5至-3位存在的核苷酸三聯(lián)體一致，(iv)+3至+5位的核苷酸三聯(lián)體與所述基因組靶標中-5至-3位存在的核苷酸三聯(lián)體的反向互補序列一致，(hj在一個變體中組合來自步驟(ei)和步驟(fj的兩種變體中26至40位和44至77位的突變，以得到切割如下序列的新的同二聚體變體，在所述序列中(i)+3至+5位的核香酸三聯(lián)體與所述基因組靶標中+3至+5位存在的核苷酸三聯(lián)體一致，(ii)-5至-3位的核苷酸三聯(lián)體與所述基因組靶標中+3至+5位存在的核苷酸三聯(lián)體的反向互補序列一致，(iii)中+8至+10位的核香酸三聯(lián)體與所述基因組靶標中+8至+10位存在的核苷酸三聯(lián)體一致，(iv)-10至-8位的核苷酸三聯(lián)體與所述基因組靶標中+8至+10位存在的核普酸三聯(lián)體的反向互補序列一致，(ij在來自步驟(gl)和/或(h》的變體中在最后一個C端環(huán)中引入至少一個突變，優(yōu)選為如前所述的中138、139、142或143位的替換。(jj將步驟(gj、(hj和/或(h)中得到的變體相組合，以形成異二聚體，以及(kj選擇和/或篩選來自步驟(h)的能夠切割所述位于目的基因中的基因組DNA靶標的異二聚體。或者，可通過用于改造出I-Orf變體的第二種方法來獲得本發(fā)明的變體，所述變體能夠切割來自目的基因的基因組DNA靶序列，該方法包括至少以下步驟(a2)構(gòu)建第一系列的I-Oel變體，所述變體在LAGLIDADG核心結(jié)構(gòu)域的第一功能性亞結(jié)構(gòu)域(位于I-OeI的26至40位)中含有至少一個替換并在最后一個C端環(huán)中含有一個突變(如上所述，優(yōu)選I-OeI中138、139、142或143位的替換)，(b2)構(gòu)建第二系列的I-Oel變體，所述變體在LAGLIDADG核心結(jié)構(gòu)域的第二功能性亞結(jié)構(gòu)域(位于I-OeI的44至77位)中含有至少一個替換并在最后一個C端環(huán)中含有一個突變(如上所述，優(yōu)選I-C^1之138、139、142或143位的替換)，其條件是所述兩個系列的變體中至少一個系列在所述最后一個C端環(huán)中含有至少一個突變，(c2)從步驟(a2)的第一系列中選擇和/或篩選能夠切割突變的I-CVd位點的變體，在所述位點中(i)I-Orl位點中-10至-8位的核苷酸三聯(lián)體被替換為所述基因組靶標中-10至-8位存在的核苷酸三聯(lián)體，位點中-12至-11、-7至-6和/或-2至-1位中至少一處核苷酸二聯(lián)體最終被替換為所述基因組靶標中-12至-11、-7至-6和/或-2至-1位存在的核苷酸二聯(lián)體，(ii)+8至+10位的核苷酸三聯(lián)體替換為所述基因組靶標-10至-8位存在的核苷酸三聯(lián)體的反向互補序列，+1至+2、+6至+7和/或+11至+12位中至少一處核苷酸二聯(lián)體最終替換為所述基因組乾標中-12至-11、-7至-6和/或-2至-1位所存在核苷酸二聯(lián)體的反向互補序列，(d2)從步驟(b2)的第二系列選擇和/或篩選能夠切割突變的位點的變體，其中(i)位點中-5至-3位的核苷酸三聯(lián)體被替換為所述基因組靶標中-5至-3位存在的的核苷酸三聯(lián)體，并且I-Orl位點的-12至-11、-7至-6和/或-2至-1位中至少一處核苷酸二聯(lián)體最終被替換為所述基因組靶標中-12至-11、-7至-6和/或-2至-1位存在的核苷酸二聯(lián)體，(ii)+3至+5位的核苷酸三聯(lián)體已替換為所述基因組靶標-5至-3位存在的核苷酸三聯(lián)體的反向互補序列，并且+1至+2、+6至+7和/或+11至+12位中至少一處核苷酸二聯(lián)體最終被替換為所述基因組靶標-12至-11、-7至-6和/或-2至-1位中存在的核苷酸二聯(lián)體的反向互補序列，其條件是步驟(c)和(d)中兩個突變I-OeI位點中的至少一個在-12至-11、-7至-6和/或-2至-1位的至少一個核苷酸二聯(lián)體以及對應(yīng)于位點中+1至+2、+6至+7和/或+11至+12位的至少一個核苷酸二聯(lián)體處含有突變，(e2)從步驟(a2)的第一系列中選擇和/或篩選能夠切割突變的I-Oel位點的變體，在所述位點中(i)I-Oel位點中+8至+10位的核苷酸三聯(lián)體已替換為所述基因組靶標中+8至+10位存在的核苷酸三聯(lián)體，并且I-Oel位點中+l至+2、+6至+7和/或+11至+12位的至少一處核苷酸二聯(lián)體最終被替換為所述基因組靶標中+1至+2、+6至+7和/或+11至+12位存在的核苷酸二聯(lián)體，(ii)-10至-8位的核苷酸三聯(lián)體已替換為所述基因組靶標中+8至+10存在的核苷酸三聯(lián)體的反向互補序列，并且-12至-11、-7至-6和/或-2至-1位中至少一處核普酸二聯(lián)體最終被替換為所述基因組耙標中+1至+2、+6至+7和/或+11至+12位中存在的核苷酸二聯(lián)體的反向互補序列，(f2)從步驟(b2)的第二系列選擇和/或篩選能夠切割突變的位點的變體，在所述位點中(i)I-Od位點中+3至+5位的核苷酸三聯(lián)體已替換為所述基因組靶標中+3至+5位存在的核苷酸三聯(lián)體，并且I-Oel位點中+l至+2、+6至+7和/或+11至+12位中至少一處核普酸二聯(lián)體最終被替換為所述基因組靶標中+1至+2、+6至+7和/或+11至+12位存在的核苷酸二聯(lián)體，(ii)-5至-3位的核苷酸三聯(lián)體已替換為所述基因組靶標+3至+5位存在的核苷酸三聯(lián)體的反向互補序列，并且-12至-11、-7至-6和/或-2至-1位中至少一處核苷酸二聯(lián)體最終被替換為所述基因組靶標+1至+2、+6至+7和/或+11至+12位中存在的核苷酸二聯(lián)體的反向互補序列，其條件是步驟(e)和(f)中兩個突變I-OeI位點中的至少一個在+1至+2、+6至+7和/或+11至+12位的至少一個核普酸雙鏈體以及對應(yīng)于I-Oel位點中-12至-11、-7至-6和/或-2至-1位的至少一個核苷酸二聯(lián)體處含有突變，(g2)在一個變體中組合來自步驟(c2)和步驟(d2)的兩種變體中26至40和44至77位以及最后一個C端環(huán)中的突變，以得到切割如下序列的新的同二聚體I-Od變體，所述序列中(i)-10至-8位的核苷酸三聯(lián)體與所述基因組靶標-10至-8位存在的核苷酸三聯(lián)體一致，-12至-11、-7至-6和/或-2至-1位的核苷酸二聯(lián)體與所述基因組耙標-12至-11、-7至-6和/或-2至-1位存在的核苷酸二聯(lián)體一致，(ii)+8至+10位的核苷酸三聯(lián)體與所述基因組靶標中-10至-8位存在的核苷酸三聯(lián)體的反向互補序列一致，+1至+2、+6至+7和/或+11至+12位的核苷酸二聯(lián)體與所述基因組靶標中-12至-11、-7至-6和/或-2至-1位存在的核苷酸二聯(lián)體的反向互補序列一致，(iii)-5至-3位的核苷酸三聯(lián)體與所述基因組耙標中-5至-3位存在的核苷酸三聯(lián)體一致，(iv)+3至+5位的核苷酸三聯(lián)體與所述基因組乾標中-5至-3位存在的核苷酸三聯(lián)體的反向互補序列一致，(h2)在一個變體中組合來自步驟(e2)和步驟(f2)的兩種變體中26至40和44至77位以及最后一個C端環(huán)中的突變，以得到切割如下序列的新的同二聚體I-Od變體，所述序列中(i)+3至+5位的核苷酸三聯(lián)體與所述基因組靶標中+3至+5位存在的核苷酸三聯(lián)體一致，+1至+2、+6至+7和/或+11至+12位的核苷酸二聯(lián)體與所述基因組靶標中+1至+2、+6至+7和/或+11至+12位存在的核苷酸二聯(lián)體一致(ii)-5至-3位的核苷酸三聯(lián)體與所述基因組靶標+3至+5位存在的核苷酸三聯(lián)體的反向互補序列一致，-12至-11、-7至-6和/或-2至-1位的核苷酸二聯(lián)體與所述基因組靶標中+1至+2、+6至+7和/或+11至+12位存在的核苷酸二聯(lián)體的反向互補序列一致，(iii)中+8至+10位的核苷酸三聯(lián)體與所述基因組耙標+8至+10位存在的核苷酸三聯(lián)體一致，(iv)-10至-8位的核苷酸三聯(lián)體與所述基因組靶標中+8至+10位存在的核苷酸三聯(lián)體的反向互補序列一致，(i2)將步驟(g2)和(h2)中得到的變體相組合，以形成異二聚體，以及(h)選擇和/或篩選來自步驟U2)的能夠切割所述位于目的基因中的基因組DNA靶標的異二聚體。根據(jù)另一替代方案，可通過用于改造出I-Od變體的第三種方法來獲得本發(fā)明的變體，其中所述變體能夠切割來自目的基因的基因組DNA靼序列，該方法包括至少以下步驟31(a3)構(gòu)建第一系列的變體，所述變體在LAGLIDADG核心結(jié)構(gòu)域的第一功能性亞結(jié)構(gòu)域(位于I-Od的26至40位)中含有至少一個替換，(b3)構(gòu)建第二系列的變體，所述變體在LAGLIDADG核心結(jié)構(gòu)域的第二功能性亞結(jié)構(gòu)域(位于I-OeI的44至77位)中含有至少一個替換，(c3)構(gòu)建第三系列的變體，如上所述變體在所迷最后一個C端環(huán)中含有至少一個突變，優(yōu)選在I-OeI的138、139、142或143位含有替換，(d3)從步驟(a3)的第一系列中選擇和/或篩選能夠切割突變位點的變體，所述位點中(i)I-Oel位點中-10至-8位的核苷酸三聯(lián)體已替換為所述基因組靶標中-10至-8位的核苷酸三聯(lián)體，并且(ii)+8至+10位的核普酸三聯(lián)體已替換為所述基因組靶標中-10至-8位存在的核苷酸三聯(lián)體的反向互補序列，(e3)從步驟(b3)的第二系列中選擇和/或篩選能夠切割突變位點的變體，所述位點中(i)位點中-5至-3位的核苷酸三聯(lián)體已替換為所述基因組靶標中-5至-3位存在的核苷酸三聯(lián)體，并且(ii)+3至+5位的核苷酸三聯(lián)體已替換為所述基因組靶標中存在的-5至-3位核苷酸三聯(lián)體的反向互補序列，(f3)從步驟(c3)的第三系列中選擇和/或篩選能夠切割突變位點的變體，所述位點中(i)位點中-12至-11、-7至-6和/或-2至-1位的核苷酸二聯(lián)體已分別替換為所述基因組靶標中-12至-11、-7至-6和/或-2至-1位存在的核苷酸二聯(lián)體，并且(ii)+1至+2、+6至+7和/或+11至+12位的核苷酸二聯(lián)體已分別替換為所述基因組靶標中存在的-2至-1、-7至-6和/或-12至-11位核普酸二聯(lián)體的反向互補序列，(g3)從步驟(a3)的第一系列中選擇和/或篩選能夠切割突變位點的變體，所述位點中(i)I-Od位點中+8至+10位的核苷酸三聯(lián)體已替換為所述基因組靶標中+8至+10位的核苷酸三聯(lián)體，并且(ii)畫10至-8位的核苷酸三聯(lián)體已替換為所述基因組靶標+8至+10位存在的核32苷酸三聯(lián)體的反向互補序列，(h3)從步驟(b3)的第二系列中選擇和/或篩選能夠切割突變I-CVd位點的變體，所述位點中(0I-Od位點中+3至+5位的核苷酸三聯(lián)體已替換為所述基因組靶標中+3至+5位存在的核苷酸三聯(lián)體，并且(ii)-5至-3位的核苷酸三聯(lián)體已替換為所述基因組靶標中存在的+3至+5位核苷酸三聯(lián)體的反向互補序列，(i3)從步驟(c3)的第三系列中選擇和/或篩選能夠切割突變位點的變體，所述位點中(i)I-Orl位點中+l至+2、+6至+7和/或+11至+12位的核苷酸二聯(lián)體已分別替換為所述基因組靶標中+1至+2、+6至+7和/或+11至+12位存在的核苷酸二聯(lián)體，并且(ii)-12至-11、-7至-6和/或-2至-1位的核苷酸二聯(lián)體已分別替換為所述基因組靶標中存在的+11至+12、+6至+7和/或+1至+2位核苷酸二聯(lián)體的反向互補序列，(J3)在一個變體中組合來自步驟(d3)、(e3)和(f3)的三種變體中26至40、44至77位以及最后一個C端環(huán)中的突變，以得到切割如下序列的新同二聚體I-CVd變體，所述序列中(i)-10至-8位的核苷酸三聯(lián)體與所述基因組靶標中-10至-8位存在的核苷酸三聯(lián)體一致，(ii)+8至+10位的核普酸三聯(lián)體與所述基因組靶標中-10至-8位存在的核苷酸三聯(lián)體的反向互補序列一致，(m)-5至-3位的核苷酸三聯(lián)體與所述基因組耙標中-5至-3位存在的核苷酸三聯(lián)體一致，(iv)+3至+5位的核苷酸三聯(lián)體與所述基因組靶標中-5至-3位存在的核普酸三聯(lián)體的反向互補序列一致，(v)-12至-11、-7至-6和/或-2至-1位的核苷酸二聯(lián)體與所述基因組把標中-12至-11、-7至-6和/或-2至-1位存在的核香酸二聯(lián)體一致，(vi)+1至+2、+6至+7和/或+11至+12位的核苷酸二聯(lián)體分別與所述基因組靶標中-2至-1、-7至-6和/或-12至-11存在的核苷酸二聯(lián)體的反向互補序列一致，(k3)在一個變體中組合來自步驟(g3)、(h3)和(i3)的三種變體中26至40和44至77位以及最后一個C端環(huán)中的突變，以得到切割如下序列的新型同二聚體I-OeI變體，所述序列中(i)+3至+5位的核苷酸三聯(lián)體與所述基因組靶標中+3至+5位存在的核普酸三聯(lián)體一致，(ii)-5至-3位的核苦酸三聯(lián)體與所述基因組靶標中+3至+5位存在的核香酸三聯(lián)體的反向互補序列一致，(iii)中+8至+10位的核苷酸三聯(lián)體已替換為所述基因組靶標中+8至+10位存在的核苷酸三聯(lián)體，(iv)-10至-8位的核普酸三聯(lián)體與所述基因組靶標中+8至+10位存在的核苷酸三聯(lián)體的反向互補序列一致，(v)+l至+2、+6至+7和/或+11至+12位的核苷酸二聯(lián)體分別與所述基因組靶標中+1至+2、+6至+7和/或+11至+12位存在的核香酸二聯(lián)體一致，(vi)-12至-11、-7至-6和/或-2至-1位的核苷酸二聯(lián)體分別與所述基因組靶標中+11至+12、+6至+7和/或+1至+2存在的核苷酸二聯(lián)體的反向互補序列一致，(13)將步驟(J3)和(k3)中得到的變體相組合，以形成異二聚體，以及(mj選擇和/或篩選來自步驟(13)的能夠切割所述位于目的基因中的基因組DNA乾標的異二聚體。步驟(ai)、(a2)、(lh)、(b2)、(a3)、(b3)、(c3)、(gl)、(g2)、(hj、(h2)、(ij、(j3)和(k3)中可包括引入另外的突變從而改進突變體的結(jié)合和/或切割特性，尤其是在與DNA靶序列接觸或者與所述DNA靶標直接或間接相互作用的其它位置。這些步驟可通過形成組合文庫來實現(xiàn)，如國際PCT申請WOO2004/067736;Arnould等，J.Mol.Biol"2006，355，443-458以及Smith等，NucleicAcidsResearch,Epub2006年ll月27日中所述。步驟(gj、(g2)、(hj、(h2)、U)、(j3)和(k3)還可包括在整個變體上或部分變體中引入隨機突變，尤其是在變體的C端一半(80-163位)。這可通過根據(jù)本領(lǐng)域公知且市售的標準誘變方法形成基于大量變體的隨機誘變文庫來實現(xiàn)。步驟(h)還可包括選擇和/或篩選能夠切割如下序列的同二聚體，所述序列中+1至+2、+6至+7和/或+11至+12位的核苷酸二聯(lián)體分別與所述基因組乾標中+1至+2、+6至+7和/或+11至+12位存在的核普酸二聯(lián)體一致，并且-12至-11、-7至-6和/或-2至-1位的核苦酸二聯(lián)體分別與所述基因組耙標中存在的+11至+12、+6至+7和/或+1至+2位核普酸二聯(lián)體的反向互補序列一致。可通過擴增含有兩個亞結(jié)構(gòu)域中各一個的重疊片段而對步驟(gj、(g2)、(lh)、(h2)、(j3)和(k3)中的突變進行(分子內(nèi))組合，其才艮據(jù)眾所周知的重疊PCR技術(shù)來實現(xiàn)，如例如Smith等，NucleicAcidsRes.，Epub2006年11月27日中所述。通過將來自步驟(gl)、(g2)或(ij、(j3)的一種變體與來自步驟(lu)、(h2)或(h)、(k3)中的一種變體分別進行共表達而對步驟(h)、(12)和(13)中的變體進行(分子間)組合，從而形成異二聚體。例如，可利用編碼所述變體的一種或兩種重組表達栽體對宿主細胞進行修飾。然后，在允許表達所述變體的條件下培養(yǎng)所述細胞，從而在該宿主細胞中形成異二聚體，如先前在Arnould等，J.Mol.Biol.,2006，355，443-458;國際PCT申請WO2006/097853、WO2006/097854和WO2006/097784;Smith等，NucleicAcidsResearch,Epub2006年11月27日中所述。可通過使用體外或體內(nèi)的切割測定來實施選擇和/或篩選步驟，如上所述。優(yōu)選地在體內(nèi)在以下條件下進行，在所述條件下，所述變體產(chǎn)生的突變DNA耙序列中的雙鏈斷裂通過對所述DNA雙鏈斷裂的重組介導(dǎo)寸務(wù)復(fù)，而激活陽性選擇標記或報告基因，或者失活陰性選擇標記或才艮告基因，如上文所定義。本發(fā)明的主題還包括如上所述的至少一種大范圍核酸酶作為平臺用于制備其它大范圍核酸酶的用途。例如，可以制名^新型歸巢核酸內(nèi)切酶為目的對該變體進行另外多輪的誘變和選擇/篩選。本發(fā)明的主題還包括降低親本LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶的毒性的方法，該方法包括對所述親本LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶的最后一個C端環(huán)中至少一個氨基酸進行突變。根據(jù)所述方法的一個有利的實施方案，所述親本核酸內(nèi)切酶是I-Od或其功能性變體。優(yōu)選地，對K139和/或T143殘基進行突變。更優(yōu)選地，將K139突變成疏xl^i^酸例如甲硫氨酸(K139M)，和/或?qū)143突變成小氨基酸例如T143G(T143G)。本發(fā)明中所述的含有靶向DNA構(gòu)建體之序列或編碼大范圍核酸酶變體或單鏈大范圍核酸酶衍生物之序列的多核苷酸可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法來制備。例如，使用特異性引物通過聚合,式反應(yīng)將35其從DNA模板擴增。優(yōu)選地，將編碼大范圍核酸酶或單鏈大范圍核酸酶衍生物之cDNA中的密碼子選擇成有利于在期望的表達系統(tǒng)中表達該蛋白質(zhì)。可通過公知的重組DNA和遺傳工程技術(shù)獲得包含所述多核普酸的重組栽體并將其引入宿主細胞。通過表達如上所述的多肽來制備本發(fā)明中所述的大范圍核酸酶變體或單鏈大范圍核酸酶衍生物；優(yōu)選地，所述多肽在宿主細胞或轉(zhuǎn)基因動物/植物中在適于表達或共表達該多肽的條件下表達或共表達(僅在變體的情形中)，所述宿主細胞或轉(zhuǎn)基因動物/植物經(jīng)一種表達載體或兩種表達載體(僅在變體的情形中)所修飾，然后從宿主細胞培養(yǎng)物或者從所述轉(zhuǎn)基因動物/植物中回收大范圍核酸酶或單鏈大范圍核酸酶衍生物。除非另有指明，否則本發(fā)明的實施將應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)的細胞生物學(xué)、細胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)基因生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)技術(shù)。這些技術(shù)在文獻中均有詳盡解釋。參見，例如CurrentProtocolsinMolecularBiology(FrederickM.AUSUBEL,2000，WileyandsonInc,LibraryofCongress,USA);MolecularCloning:ALaboratoryManual,第三版，(Sambrook等,2001,ColdSpringHarbor,NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress);OligonucleotideSynthesis(M.J.Gaited.，1984);Mullis等，美國專利No.4,683,195;NucleicAcidHybridization(B.D.Harries&S.J.Higgins編著1984);TranscriptionAndTranslation(B.D.Hames&S.J.Higgins編著1984);CultureOfAnimalCells(R.I.Freshney,AlanR.Liss，Inc"1987);ImmobilizedCellsAndEnzymes(IRLPress,1986);B.Perbal，APracticalGuideToMolecularCloning(1984);theseries,MethodsInENZYMOLOGY(J.Abelson和M.Simon,eds.-in-chief,AcademicPress,Inc.,NewYork),特別是第154和155巻(Wu等編著)以及第185巻,"GeneExpressionTechnology"(D.Goeddel編著)；GeneTransferVectorsForMammalianCells(J.H.Miller和M.P.Calos編著,1987,ColdSpringHarborLaboratory);ImmunochemicalMethodsInCellAndMolecularBiology(Mayer和Walker編著,AcademicPress,London,1987);HandbookOfExperimentalImmunology,第I-IV巻(D.M.Weir和C.C.Blackwell編著,1986)以及ManipulatingtheMouseEmbryo,(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y"1986)。除了前述的特征以外，本發(fā)明還包含從以下說明以及附圖中得出的其它特征，所述說明參考展示本發(fā)明的I-Od大范圍核酸酶變體及其用途的實施例，其中-圖1表示I-Oel和I-O^I-DNA結(jié)構(gòu)中的Ca條帶的疊加圖。為清M見，省略了DNA。-圖2表示I-Oel家族成員(Lucas等，NucleicAcidsRes.，2001，29，960-969)的C端區(qū)域的序列比對。SKTRKTT基序中突變?nèi)只奈恢糜没疑切螛耸?http:〃espript.ibcp.fr/ESPript/cgi畫bin/ESPript.cgi)。-圖3表示S138、K139、K142和T143與DNA骨架接觸的詳細視圖(a)，以及結(jié)合與未結(jié)合DNA的結(jié)構(gòu)中S138、K139、K142和T143之位置的比較(b)。—圖4示意I-OdC端區(qū)域突變體的生物物理特征。a)圓二色性熱變性。b)—維H-HNMR鐠。-圖5示意通過分析型超速離心測量的I-OdC端區(qū)域突變體的二聚體形成。在20。C和42,000rpm下I-Oel蛋白(1mg/ml,在PBS緩沖液中)的沉降速度分布。小圖，在20。C和11,000rpm下I-Oel蛋白(4mg/ml，在PBS緩沖液中)的沉降平衡梯度。空心圓團代表實驗數(shù)據(jù)，兩條實線代表I-OeI單體(20,045)和二聚體(41,000)的理論梯度。-圖6表示C端截短、雙突變和單突變體在Mg"和Ca"存在下的電泳遷移率改變測定。-圖7是c端截短、雙突變和單突變體的:^體外切割測定的總結(jié)。-圖8示意用于對單突變體進行模式分析的體內(nèi)切割測定以及單突變體之IONNN一PDNA靶標切割模式。a)酵母篩選測定的原理。將包含編碼單突變體^^達栽體的菌林與包含報告質(zhì)粒的菌林^^。在所述報告質(zhì)粒中，LacZ報告基因被含有一個目的乾位點的插入片段打斷，所述插37入片段兩側(cè)是兩個同向重復(fù)。M后，大范圍核酸酶(灰色橢圓)在目的位點產(chǎn)生雙鏈斷裂，使得通過所述兩個兩側(cè)同向重復(fù)之間的單鏈退火(single-strandannealing,SSA)而'恢復(fù)成有功能的LacZ基因。通過藍染來顯現(xiàn)該有功能的LacZ基因。b)DNA靶標。C1221靶標(頂部)是被I-Orl切割的回文靶標。^Mf究中使用的所有靶標均為通過替換士8、±9和±10位的6個核苷酸而從C1221衍生而來的回文乾標(SEQIDNO:l和10至16)。顯示了幾個實例(下部)。10GGG—P靶標與C1221把標的不同在于-10、-9、-8位的GGG三聯(lián)體和+8、+9和+10位的CCC三聯(lián)體。c)突變體靶標的模式?；谝幌盗?4種回文把標(10NNN_P)，在酵母中對每種突變體進行模式分析。顯示了單突變體(K139M)i之I-OelD75N在酵母中的切割活性的實例。藍染指示切割。此外，顯示了所有單突變體與D75N和I-Od相比的10NNN—P切割模式。^JL水平反映了信號的強度。I-Orl在酵母中具有毒性，分^f由37'C改為30'C下進行。所有其他突變體均在37匸下進行研究。-圖9示意單突變體的5NNN一PDNA耙標切割模式。所述耙標(64)均為在±3至5位發(fā)生變化的回文把;示。-圖10示意單突變體的2NNDNA乾標切割模式。所述耙標(16x16)均為在±1至2位發(fā)生變化的回文靶標。-圖11示意單突變體的12NN—PDNA靶標(A)和7NN_PDNA耙標(B)切割模式。A(16)和B(16)中的靶標分別為在土11至12位和±6至7位發(fā)生變化的回文耙標。實施例1:結(jié)合與未結(jié)合DNA的之間的結(jié)構(gòu)差異1)材料和方法a)蛋白質(zhì)的表達、純化和結(jié)晶如Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458中所述進行蛋白質(zhì)表達和純化。在96孑U1中利用蒸汽擴散法對結(jié)晶條件進行初步篩選，其中利用Hampton晶體篩選，使用含有1pl蛋白質(zhì)溶液(7mg/ml，在20mMHEPES(pH7.5)中)和1pl沉淀溶液(其以50pl結(jié)晶液(reservoirsolution)在20。C進行平衡)的液滴。在若干條件(結(jié)晶篩38選1中的條件10、22、33、40、41以及結(jié)晶篩選2中的條件32)下獲得結(jié)晶。通過使用VDX板的懸滴蒸汽擴散法來形成結(jié)晶；優(yōu)化實驗得出以下用于結(jié)晶的條件1nl蛋白質(zhì)(7mg/ml，在20mMHEPES(pH7.5)中)和1jil沉淀溶液(含有20%PEG4000、0.1MHEPES(pH7.5)、10%異丙醇、10。/。乙二醇和0.01M乙酸鎂，其以500fil沉淀緩沖液在20'C進行平衡)。使棒狀結(jié)晶生長4-8天，并直接收集且冷凍在液氮中。b)數(shù)據(jù)收集、結(jié)構(gòu)解析、模型構(gòu)建和細化在低溫下以100K使用同步輻射收集所有數(shù)據(jù)。封裝(mount)結(jié)晶并進行防凍處理。采用ESRF(Grenoble)的ID14-4光束和SLS(Villigen)的PX光束，4吏用同步輻射收集數(shù)據(jù)組。利用ADSC-Q4或Mar225CCD檢測器(取決于光束)記錄衍射數(shù)據(jù)。使用HKL2000((MW"歸sA:/，Z和Af/wor，iVocessi"g</Jt"-niyD(^hi"iVwD她7VewIWA:)完成加工和定標。使用在MOLREP程序中實施的分子置換法(Vagin，A.和Teplyakov，A.ActaCrystallogr.DBiol.Crystallogr"2000,56Pt12，1622-1624)來解析結(jié)構(gòu)。2)結(jié)果利用分子置換來解析的結(jié)構(gòu)并細化到2.0A分辨率。使用A(p-1。和0.97A的波長收集最佳數(shù)據(jù)組(表I)。表I中匯總了晶體學(xué)數(shù)據(jù)的總結(jié)。檢索模型是基于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(ProteinDataBank)中PDBlgz9衍生而來的多丙氨酸骨架。在檢索模型中去掉了DNA的坐標。經(jīng)細化的2Fo-Fc圖顯示了蛋白骨架和許多側(cè)鏈的清楚連續(xù)的電子密度。應(yīng)用ARP/wARP和REFMAC5用于自動模型構(gòu)建并細化到2.0A(表I)。表I:數(shù)據(jù)收集和細化統(tǒng)計<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>無DNA的二聚體使得可以在與蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物(PDB代碼lgz9)進行比較之后觀察在DNA結(jié)合后的蛋白質(zhì)構(gòu)象改變(圖1)。最顯著的不同是C端區(qū)域的構(gòu)象。在與DNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)中C-螺旋和C-環(huán)與DNA貼合在一起，而在未結(jié)合的結(jié)構(gòu)中這兩個元件均位于DNA所結(jié)合的腔的頂部，這提示該環(huán)和C-螺旋可能作為開閉DNA結(jié)合溝的鎖鑰來起作用。該區(qū)域在先前在不對稱單元中僅含有一個單體的結(jié)構(gòu)中并未觀察到(Heath等，NatStructBiol，1997，4,468-476)。并且，I-Oel的C端結(jié)構(gòu)域在LAGLIDADG家族的同二聚體蛋白質(zhì)中非常保守(Lucas等，NucleicAcidsRes.,2001,29，960-969),這表明其在這一大范圍核酸酶家族的工作機理中發(fā)揮重要作用(圖2)。所述C端區(qū)域中蛋白質(zhì)-DNA相互作用的詳細視圖顯示，SKTRKTT基序中的Serl38、Lysl39、Lysl42和Thrl43參與與DNA骨架形成的氫鍵(圖3a)。這些殘基的位置與未結(jié)合DNA的狀態(tài)完全不同(圖3b),表明結(jié)合核酸需要構(gòu)象變化。盡管這些相互作用在之前已有描述(Chevalier等，J.Mol.Biol.，2003，329,253-269)并且所述氨基酸是保守的，但是有關(guān)它們在大范圍核酸酶作用中之作用的信息尚不清楚。實施例2:生物物理分析1)材料和方法a)I-Oel突變體的構(gòu)建利用PCR從野生型(I-O^ID75)cDNA模板上擴增I-Orf缺失突變體(A1和A2)，兩種突變體的正向引物均為5，gatataccatggccaataccaaatataac3，(SEQIDNO:18)，△1突變體的反向引物為ICreldeltaCter-R:5，ttatcagtcggccgcatcgttcagagctgcaatotgatccacccagg3,(SEQIDNO:19)，△2突變體的反向引物為Creh2:5，gagtgcggccgcagtggttttacgcgtcttagaatog3，(SEQIDNO:20)。使用Quickchange⑧試劑盒(STRATAGENE#200518)、合適的謙變寡聚物和作為模板的野生型I-Oel(I-OrlD75)cDNA，采用"round-the-world，，PCR來擴增I-Oel單突變體和雙突變體。b)圓二色熱分析使用Jasco810型圓二色光鐠儀獲得數(shù)據(jù)，其先前用d-10-樟腦磺酸校準，并配有JascoPeltier熱電溫度控制計CDF-426S型。實驗在PBS中以rC/分鐘的間隔進行。蛋白質(zhì)濃度為10nM。跟蹤在2mmHellma110-QS光池中從5至95匸在222nm下橢圓+。c)分析型超速離心在20°C,在配有UV-可見光光學(xué)元件的OptimaXL-A(Beckman-Coulter)分析型超速離心機中進行沉降平衡實驗，其使用An50Ti轉(zhuǎn)子以及Epon木炭(Eponcharcoal)的3mm雙扇形杯中心部件(doublesectorcenterpiece)。PBS緩沖液中的蛋白質(zhì)濃度為200pM。以先后三種速度(11,000、13,000和15,000)進行短柱(23pi)l氐速沉降平衡，當(dāng)先后的掃描發(fā)生重疊并在280nm波長處獲得平衡掃描時，認為該系統(tǒng)處于平衡狀態(tài)。在高速離心(5h，42，000rpm)之后測量基線信號。4吏用EQASSOC程序(Minton,A.P.,In:ModernAnalyticalUltracentrifugation,1994,BirkhauserBoston,Inc.,Cambridge,MA)得到蛋白質(zhì)的全光池表觀分子量。使用SEDNTERP程序(從RASMB服務(wù)器獲得；Laue，T.M.S.,B.D.,Ridgeway,T.M.，Pelletier，S丄.,In:Computer-aidedinterpretationofanalyticalsedimentationdataforproteins,1992，RoyalSocietyofChemistry,Cambridge,UK)由^J^酸纟且成計算出I-Orl在20。C下的部分比容為0.7436ml/g。使用An50Ti轉(zhuǎn)子和1.2mm雙扇形杯中心部件，在20。C下以42,000rpm在XL-A分析型超速離心機(Beckman-CoulterInc.)中進行沉降速度實驗。在280nm處檢效，J吸光度。蛋白質(zhì)在PBS中的濃度為50nM。利用以SEDFIT程序進行的連續(xù)分布c(s)Lamm平^^型(Schuck,P.,Biophys.J"2000,78,1606-1619)來計算沉降系數(shù)。使用SEDNTERP程序(Laue,T.M.S.，B.D.，Ridgeway,T.M.,Pelletier,S丄.，In:Computer-aidedinterpretationofanalyticalsedimentationdataforproteins,1992,RoyalSocietyofChemistry,Cambridge,UK)將這些實驗性沉降值修正為標準條件，以得到相應(yīng)的s20，w值。使用SEDFIT程序進行進一步的流體動力學(xué)分析(即計算摩擦系數(shù)比)以獲得dec(M)分布(Schuck，P.,Biophys.J"2000，78，1606-1619)。d)醒R數(shù)據(jù)獲取在25。C下，在配有超低溫探頭的BrukerAVANCE600分光光度計中記錄NMR鐠。蛋白質(zhì)樣品在PBS緩沖液(137mMNaCl,10mMNa2HP04-2H20，2.7mMKC152mMKH2P04,pH7.4)加5%2H20中為50042HM。使用DSS(2，2-二甲基-2-硅戊烷-5-磺酸鈉鹽)作為質(zhì)子化學(xué)位移的內(nèi)參。2)結(jié)果為了揭示的C端結(jié)構(gòu)域的作用，基于與DNA結(jié)合或未結(jié)合結(jié)構(gòu)之間的差異設(shè)計了一系列截短、雙突變體和單突變體。設(shè)計兩種截短突變體用以闡明C端區(qū)域的作用。Al(氨基酸編號1-137)缺少C環(huán)和C螺旋，而I-OdA2(氨基酸編號1-144)則包含C環(huán)?；赟KTRKTT基序中與DNA骨架的接觸，產(chǎn)生了雙突變體AM(S138A,K139M)和I-OrIGG(K142G，T143G),以及它們的單突變體I-OelS138A、I-OelK139M、I國OdK142G、T143G。為了證明對大范圍核酸酶活性的影響是由所述突變所致，研究了它們對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、結(jié)構(gòu)和寡聚狀態(tài)的影響。進行熱變性圓二色性以證實所有突變體均發(fā)生了折疊。確實，所有突變體均顯示出與野生型類似的S形曲線，Tm根據(jù)突變的不同而不同(圖4a)。此外，一維H-HNMR證實了熱變性實驗，在酰胺區(qū)域中的明顯的峰離M明所有突變體均發(fā)生了折疊(圖4b)。眾所周知，I-OeI家族大范圍核酸酶作為同二聚體與DNA結(jié)合，因此為了分析突變體的寡聚化狀態(tài)，對其進行分析型超速離心。實驗顯示，無論突變?yōu)楹?，所有突變體均以二聚體起作用，僅有與其分子量相應(yīng)的極小變化(圖5)。所有這些實驗表明，所述突變體都發(fā)生了折疊，并且使I-OrI骨架仍參與大范圍核酸酶活性。實施例3:C端突變體的DNA結(jié)合活性1)材料和方法條帶遷移測定M條帶遷移測定在室溫孵育1h的10mMTris-HCl(pH8)、50mMNaCl、10mMCaCl2ilMgCl2、1mMDTT中進行，使用5^M(0.0793ng/pl)6誦FAM二體(duplex)(SEQIDNO:21;參見圖6)和20^M(0.463嗎/pl)蛋白質(zhì)，并在15。/。丙烯酰胺-TBE凝膠中進行電泳。432)結(jié)果在Mg"和Ca"存在下使用電泳遷移率變動測定(EMSA)來分析DNA結(jié)合中C端突變體的表現(xiàn)(圖6)。雖然Ca"的存在使DNA結(jié)合發(fā)生，但Mg2+對于結(jié)合和切割DNA是不可缺少的(Chevalier等，Biochemistry,2004,43，14015-14026)?！?突變體中I-Orl的結(jié)合能力凈皮破壞，但A2突變體能夠結(jié)合經(jīng)標記的DNA探針，這表明C環(huán)對于DNA結(jié)合是必需的。此外，像在野生型中那樣在上述兩種陽離子存在下檢測結(jié)合。另一方面，無論所述陽離子存在與否，AM和GG雙突變體的DNA結(jié)合特性均受到嚴重影響，這表明Serl38、Lysl39、Lysl42和Thrl43與DNA骨架的接觸對于與核酸的結(jié)合是關(guān)鍵性的。因此，SKTRKTT基序中的這些殘基構(gòu)成了對于結(jié)合DNA所必需的兩個新的"熱點"。為了明確C環(huán)中每個位點的不同特性，在相同條件下利用EMSA測定所述單突變體。與雙突變體不同的是，所有單突變體均能夠結(jié)合經(jīng)標記的探針；然而，它們根據(jù)測定中存在的陽離子而表現(xiàn)出差異?？梢杂^察到Serl38-Lys139位點明顯依賴于Mg，而Lysl42-Thr143位點中的單突變體可結(jié)合DNA而與遷移測定中存在的陽離子無關(guān)。因此，破壞DNA結(jié)合需要同時突變每個位點中的兩個殘基，il^明每個熱點中兩個殘基之間的協(xié)同作用對于DNA結(jié)合來說是必需的。實施例4:C端突變體在體外的DNA切割活性1)材料和方法體外切割測定M在37。C下在10mMTris誦HCl(pH8)、50mMNaCl、10mMMgCl2(或CaCl2)和1mMDTT中進行切割測定。濃度為100ng被X附wl線性化的把標底物(pGEM-TEasyC1221GTC)，40-0.25ng的I-Oel和螺旋突變體蛋白的稀釋液，溶于最終體積25nl的反應(yīng)中。所述線性化的靶標質(zhì)粒為3kb，切割后產(chǎn)生兩個較小的條帶(2kb和1kb)。在1小時后通過加入5pi的45%甘油、95mMEDTA(pH8)、1.5%(重量/體積)SDS、1.5mg/ml蛋白酶K和0.048%(重量/體積)溴酚藍(6x終止緩沖液)來終止反應(yīng)，在37。C孵育30分鐘并在1%瓊脂糖凝膠中進行電泳。使用SYBRSafeDNA^J^染色(INVITROGEN)對片段進行定量。使用ImageJ軟件(http:〃rsb.info.iiih.ROv/ij/)來分析凝膠，以根據(jù)(2kb+lkb)/(3kb+2kb+lkb)x100的公式計算切割百分比。2)結(jié)果在DNA結(jié)合測定中對不同突變體進行的分析明確暗示了DNA的切割活性，因此，對它們進行了對野生型DNA序列的切割活性實驗。圖7顯示代^j"一定量HE的切割百分比的圖(帶有原始數(shù)據(jù)的皿可^^為支持信息)?？梢曰谂c野生型HE切割活性的比較而將突變體分成兩組；第一組由截短突變體I-OeIAl和I-OeI厶2以及雙突變體I-OeIAM和I-OeIGG組成，而單突變體I-OeIS138A、K139M、T142G和I-OdT143G構(gòu)成第二組。第一組中的成員顯示了與野生型I-Oel相比降低的切割活性。厶l和I-OelGG的切割活性被完全破壞，而I-Od厶2和I-CVelAM顯示出活性的降低，該活性在使用更高的HE量時被提高。然而，構(gòu)成第二組的單突變體的切割活性不僅與野生型相似，還在某些情形中增強(圖7)。這些結(jié)果表明，DNA活性被破壞或被嚴重影響的截短突變體和雙突變體不切割DNA，或者它們需要更大的HE量來切割質(zhì)粒。應(yīng)注意，在I-OeIA2(保留了C環(huán)中的野生型氨基酸但缺少a6螺旋的突變體)的情形中，雖然其切割活性受到影響，但其活性模式與野生型的更為相似。另一方面，所有單突變體與野生型相比活性均略微增強?；钚詼y定證實了DNA結(jié)合研究，表明雙突變體以協(xié)同方式起作用，然而這些突變的效果不僅影響核酸結(jié)合，而且還影響DNA切割，如我們已顯示的。實施例5:C端突變體在體內(nèi)的DNA切割活性1)材料和方法體內(nèi)切割測定(圖8a)先前已描述于PCT申請WO2004/067736;Epinat等，NucleicAcidsRes.，2003，31,2952-2962;Chames等,NucleicAcidsRes"2005，33，e178以及Arnould等，J.Mol.Biol"2006，355,443-458中。a)靶標克隆的構(gòu)建C122124bp乾序列(5，國tcaaaacgtcgtacgacgttttga—3，SEQIDNO:i)是天然I-Crel靶標(5,_tcaaaacgtcgtgagacagtttgg._3，SEQIDNO:17)半位點的回文序列。在酵母和哺乳動物細胞中，C1221與I-Crel的天然乾標在體外和離體情況下被同樣有效地切割。使用Gateway方法(Invitrogen)，如前所述(Arnould等，J.MoLBiol"2006，355,443-458)將衍生自C1221的回文靶標克隆入報告載體(酵母pFL39-ADH-LACURAZ和哺乳動物細胞載體pcDNA3.1-LACURAZ-AURA,這兩種載體先前均已描述過(Epinat等，NucleicAcidsRes.，2003,31，2952-2962))中，并包含1-5^1靶位點作為對照。將酵母報告栽體轉(zhuǎn)化進釀酒酵母(51.Omv/V^)菌林FYBL2國7B(M/4ra,ar3」S5J，"/7」63，/en2JJ,」202)中。b)在酵母中篩選篩選同二聚體突變體的方法先前已描述過(PCT申請WO2004/067736;Epinat等，NucleicAcidsRes.,2003，31,2952-2962;Chamesetal.，NucleicAcidsRes"2005,33，el78;Arnould等，J.Mol.Biol"2006，355，443-458)。c)在酵母中接合并篩選大范圍核酸酶表達克隆使用菌落網(wǎng)格(QpixII，Genetix)進行接合。將突變體在覆蓋在YPD培養(yǎng)板上的尼龍濾膜上劃格，其中使用高網(wǎng)格密度(大約20個點/cm2)。在同樣的濾膜上進行第二次劃格過程，以對每種變體點樣第二層，其是由64或75個不同的帶有報告基因的酵母菌林組成的。將膜放在固體瓊脂富含YPD培養(yǎng)基上，并在30。C孵育過夜，使之發(fā)生接合。然后，將濾膜轉(zhuǎn)移至缺乏亮氨酸和色氨酸并以半乳糖(2%)作為碳源的合成培養(yǎng)基中，在37。C孵育5天(I-Od為30"C),以選擇攜帶表達栽體和靶標栽體的二倍體。5天后，將濾膜放在固體瓊脂糖培養(yǎng)基上，46該培養(yǎng)基含有在0.5M磷酸鈉鹽緩沖液(pH7.0)、0.1%SDS、6%二曱基甲酰胺(dimethylformamide，DMF)、7mM卩-巰基乙醇、1%瓊脂糖中的0.02%X-Gal,并在37。C孵育，以監(jiān)測P-半乳糖苷酶活性。通過使用合適的軟件掃描并量化來分析結(jié)果。2)結(jié)果為了！Hi結(jié)果，對所有突變體以及I-OeI和I-OeID75N蛋白進行體內(nèi)切割測定，如前所述(Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355,443-458)。雙突變體或截短突變體(其結(jié)合和切割能力在體外受突變的影響)對任何靶標均不表現(xiàn)活性。給出了AM和GG作為例子(圖8c上圖)。相比之下，所有單突變體均顯示出對野生型靶標(C1221)的高活性。-10NNNP靶標模式分析(圖8c)所有單突變體均顯示出對野生型靶標(C1221)、IOAAG一P和10AAT_P的高活性。還可觀察到這四個突變體針對10TCG_P和IOAAC一P的較低水平的切割。另夕卜，K139M突變體還能夠切i〗另外7種耙3示(IOAGT一P、IOGAG一P、IOGAA一P、10GAT—P、10CAG—P、10CAA_P、10CAT—P)，如圖8c中所示。K139M突i體的模式i非f相似(但k有其毒性)，而另外三個單突變體與I-CVeID75N更為接近?！?NNNP模式分析(圖9)S138A和K139M的模式與D75N的模式相似，而K142G和T143G的模式比D75N的模式更受限制。—2NNP模式分析(圖10)K142G和S138A的模式比I-OID75N的模式更受限制。與D75N相比，T143G和K139M分別切割另外6種和10種靶標，其中6種是共有的。另外，與D75N相比，至少8種靶標被K139M更為高效地切割。5種粑標(2TT_2TG、2TG—2TT、2TA—2CT、2TC_2TC、2CT2CT)不被K139M切割；這些靶標^D75N切割，盡管效率低于I-Oel?！?2NNP模式分析(圖11A)K142G和S138A的模式比I-OeID75N的模式更受限制，其中S138A的模式比K142G的模式更受限制。T143G的模式與I-OelD75N的模式類似。K139M的模式與的模式類似，但不具有其毒性；與D75N相比，K139M可切割另外7種耙標。-7NNP模式(圖11B)K142G和S138A的模式與I-OrlD75N的模式類似。與D75N相比，K139M和T143G切割另外兩種耙標(7CG—P和7TT—P);但是K139M和T143G的模式比的模式更受限制。這些結(jié)果表明，的C端區(qū)域?qū)τ贖E活性是必需的。此外，SKTRKTT區(qū)域之兩側(cè)殘基中的突變表明，它們不但控制核酸結(jié)合，而且還控制靶標特異性。權(quán)利要求1.改造出具有新底物特異性的LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶變體的方法，其包括至少以下步驟(a)對親本LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶的最后一個C端環(huán)中的至少一個氨基酸殘基進行突變，I-CreI的140位蘇氨酸除外，以及(b)從步驟(a)中選擇和/或篩選出變體，所述變體具有與所述親本LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶不同的DNA靶標切割模式。2.權(quán)利要求l的方法，其中所述突變位于所述最后一個C端環(huán)中與所述親本LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶DNA切割位點的磷酸骨架相接觸的氨基酸殘基位置上。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述突變改變了最后一個C端環(huán)中所述氨基酸殘基與親本LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶DNA切割位點中磷酸骨架之間的相互作用。4.權(quán)利要求2或權(quán)利要求3的方法，其中參照I-Od氨基酸序列編號，所述突變位于138、139、142和/或143位。5.權(quán)利要求4的方法，其中138位和/或139位的殘基替換為疏水氨基酸，和/或，142位和/或143位的殘基替換為小氨基酸。6.權(quán)利要求5的方法，其中138位的殘基替換為丙氨酸，139位的殘基替換為甲硫氨酸，和/或142位和/或143位的殘基替換為甘氨酸。7.權(quán)利要求4至6中任一項的方法，其中步驟(a)包括對兩個殘基進行突變，其中每一個殘基各來自于選自138和139位殘基以及142和143位殘基的不同殘基對。8.權(quán)利要求1至7中任一項的方法，其中所述親本LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶是同二聚體LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶。9.權(quán)利要求8的方法，其中所述同二聚體LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶是I國OeI。10.權(quán)利要求8的方法，其中所述同二聚體LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶是在I-CVd的26至40位和44至77位中含有突變并且切割回文DNA序列的變體，其中所述DNA序列的一半中至少+3至+5和+8至+10位或者-10至-8和-5至-3位的核苷酸對應(yīng)于目的基因的基因組DNA耙標的一半中+3至+5和+8至+10位或者-10至-8和-5至-3位的核苷酸。11.權(quán)利要求I至IO中任一項的方法，其中步驟(a)包括同時或先后對第一功能性亞結(jié)構(gòu)域中至少一個氨基酸殘基進行突變和/或?qū)Φ诙δ苄詠喗Y(jié)構(gòu)域中至少一個氨基酸殘基進行突變，所述第一功能性亞結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)于位于I-Orf氨基酸序列中26至40位的亞結(jié)構(gòu)域，該亞結(jié)構(gòu)域中的突變改變了對DNA靶標中士8至10位核苷酸的特異性，所述第二功能性亞結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)于位于I-Oel氨基酸序列中44至77位的亞結(jié)構(gòu)域，該亞結(jié)構(gòu)域中的突變改變了對DNA靶標中土3至5位核苷酸的特異性。12.權(quán)利要求l至ll中任一項的方法，其中步驟(a)包括同時或先后對所述LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶/變體氨基酸序列的全部或C端一半進行隨機突變。13.權(quán)利要求1至12中任一項的方法，其中步驟(b)包括從步驟(a)中選擇和/或篩選出變體，所述變體能夠切割至少一個不被所述親本LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶所切割的DNA把序列，所述DNA耙序列來自于親本LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶切割位點，這通過將所述切割位點的一半中的至少一個核苷酸替換為不同核苷酸來實現(xiàn)。14.權(quán)利要求13的方法，其中所述DNA靶序列來自于具有序列SEQIDNO:1的回文位點。15.權(quán)利要求14的方法，其中所述DNA把標在土1至2、±6至7、士8至10和/或±11至12位的核苷酸中含有突變。16.權(quán)利要求11至15中任一項的方法，其中所述DNA靶序列是目的基因中存在的基因組序列。17.可通過權(quán)利要求1至16中任一項的方法獲得的同二聚體或異二聚體的LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶變體，SEQIDNO:3和4的同二聚體變體以及包含SEQIDNO:5單體的同二聚體和異二聚體變體除外。18.權(quán)利要求17的變體，所述變體是這樣的異二聚體，其包含可通過所述方法獲得的兩種不同變體中的單體。19.權(quán)利要求17或權(quán)利要求18的變體，所述變體是含有一個或兩個突變的I-OeI變體，其中每個突變各來自于選自S138A和K139M對以及K142G和T143G對的不同突變對。20.權(quán)利要求19的變體，所述變體具有SEQIDNO:6至9的序列。21.權(quán)利要求19或權(quán)利要求20的變體，所述變體是由兩個單體組成的異二聚體變體，其中每個單體還包含的26至40位和44至77位中的不同突變，所述變體能夠切割目的基因中的基因組DNA把標。22.單鏈嵌合大范圍核酸酶，其包含權(quán)利要求17至21中任一項所述一種或兩種變體的兩個單體或核心結(jié)構(gòu)域，或二者的組合。23.多核苷酸片段，其編碼權(quán)利要求17至21中任一項所述變體的一個單體或者權(quán)利要求22的單鏈大范圍核酸酶。24.重組栽體，其包含至少一個權(quán)利要求23所述多核苷酸片段。25.表達載體，其包含兩個多核苷酸片段，其中每個多核瞽酸片段各編碼權(quán)利要求17至21中任一項所述異二聚體變體的兩個單體之一，所述片段與調(diào)節(jié)序列有效連接，以允許產(chǎn)生所述兩種單體。26.表達載體，其包含編碼權(quán)利要求22所述單鏈大范圍核酸酶的多核苷酸片段，所述片段與調(diào)節(jié)序列有效連接，以允許產(chǎn)生所述單鏈大范圍核酸酶。27.權(quán)利要求25或權(quán)利要求26的載體，其包含耙向DNA構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含與權(quán)利要求10、16和21中任一項所定義的基因組DNA乾序列周圍的區(qū)域具有同源性的序列。28.權(quán)利要求27的載體，其中所述靶向DNA構(gòu)建體包含(a)與權(quán)利要求10、16和21中任一項所定義之基因組DNA耙序列周圍的區(qū)域具有同源性的序列，和(b)待引入序列，該待引A^列的側(cè)翼為a)的序列。29.宿主細胞，其包含如權(quán)利要求23或權(quán)利要求25中所定義的一種或兩種多核苷酸片段或者權(quán)利要求24至28中任一項的栽體。30.非人轉(zhuǎn)基因動物，其包含如權(quán)利要求23或權(quán)利要求25中所定義的一種或兩種多核苷酸片段。31.轉(zhuǎn)基因植物，其包含如權(quán)利要求23或權(quán)利要求25中所定義的一種或兩種多核苷酸片段。32.藥物組合物，其至少包含權(quán)利要求17至21中任一項的變體、權(quán)利要求22的單鏈大范圍核酸酶、如權(quán)利要求23或權(quán)利要求25所定義的一種或兩種多核苷酸片段、權(quán)利要求25至28中任一項的栽體。33.權(quán)利要求32的組合物，其還包含乾向DNA構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包^4務(wù)復(fù)目的基因組位點的序列，該序列的側(cè)翼是與耙基因座具有同源性的序列。34.權(quán)利要求17至21中任一項的變體、權(quán)利要求22的單鏈大范圍核酸酶、如權(quán)利要求23或權(quán)利要求25所定義的一種或兩種多核香酸片段、權(quán)利要求25至28中任一項的載體、權(quán)利要求29的宿主細胞、權(quán)利要求31的轉(zhuǎn)基因植物、權(quán)利要求30的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物中的至少之一用于分子生物學(xué)、體內(nèi)或體外基因工程以及體內(nèi)或體外基因組工程的非治療性目的的用途。35.權(quán)利要求17至21中任一項的變體、權(quán)利要求22的單鏈大范圍核酸酶、如權(quán)利要求23或權(quán)利要求25所定義的一種或兩種多核苦酸片段、權(quán)利要求25至28中任一項的栽體中的至少之一用于制備藥物的用途，所述藥物用于在有此需要的個體中預(yù)防、改善或治療遺傳病，所述藥物旨在通過任意方式向所述個體施用。36.權(quán)利要求17至21中任一項的變體、權(quán)利要求22的單鏈大范圍核酸酶、如權(quán)利要求23或權(quán)利要求25所定義的一種或兩種多核普酸片段、權(quán)利要求25至28中任一項的栽體中的至少之一用于制備藥物的用途，所述藥物用于在有此需要的個體中預(yù)防、改善或治療由帶有DNA中間體的傳染原引起的疾病，所述藥物旨在通過任意方式向所述個體施用。37.權(quán)利要求17至21中任一項的變體、權(quán)利要求22的單鏈大范圍核酸酶、如權(quán)利要求23或權(quán)利要求25所定義的一種或兩種多核苷酸片段、權(quán)利要求25至28中任一項的載體中的至少之一在體外用于在生物來源產(chǎn)品或者旨在用于生物用途的產(chǎn)品中抑制帶有DNA中間體之傳染原的增殖、使其失活或清除的用途，或者用于對物體進行消毒的用途。38.權(quán)利要求36或權(quán)利要求37的用途，其中所述傳染原是病毒。39.權(quán)利要求34至37中任一項的用途，其中所述變體、單鏈大范圍核酸酶、多核苷酸、載體、細胞、轉(zhuǎn)基因植物或非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物與權(quán)利要求27、28或33中所定義的靶向DNA構(gòu)建體相關(guān)聯(lián)。40.權(quán)利要求17至21中任一項的變體、權(quán)利要求22的單鏈大范圍核酸酶、如權(quán)利要求23或權(quán)利要求25所定義的一種或兩種多核苷酸片段、權(quán)利要求24至28中任一項的載體中的至少之一作為平臺用于^Ut出其它大范圍核酸酶的用途。41.降低親本LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶的毒性的方法，其包括對所述親本LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶的最后一個C端環(huán)中的至少一個M酸進行突變，正如權(quán)利要求1-7中任一項所定義。42.權(quán)利要求41的方法，其中所述親本LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶如權(quán)利要求8至10中任一項所定義。43.權(quán)利要求42的方法，其中所述突變是K139和/或T143G。全文摘要具有新的底物特異性的LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶變體，所述變體可通過包括以下步驟的方法來獲得(a)對親本LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶最后一個C端環(huán)中的至少一個氨基酸殘基(除I-CreI的140位蘇氨酸以外)進行突變；(b)在來自步驟(a)的變體中選擇和/或篩選具有與親本LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶不同的DNA靶標切割模式的變體。文檔編號C12N9/22GK101679959SQ200780051453公開日2010年3月24日申請日期2007年2月19日優(yōu)先權(quán)日2007年2月19日發(fā)明者吉列爾莫·蒙托亞,弗朗切斯科·布蘭科,赫蘇斯·普列托申請人:賽萊克蒂斯公司