專利名稱：真菌Xylaria sp.FDYS-1及其制備的生物制劑與在防治松材線蟲中的應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于生物農(nóng)藥領域，具體涉及一株真菌^^n'a sp. FDYS-1 及其制備的生物制劑與在防治松材線蟲中的應用。
技術(shù)背景松材線蟲病是松樹的一種毀滅性病害。該病通常來勢兇猛，染病 松樹死亡率極高，被稱為"森林的癌癥"和"無煙的森林火災"。我 國自1982年在南京中山陵首次發(fā)現(xiàn)該病，現(xiàn)已蔓延至江蘇、浙江、安 徽、山東、湖北、廣東、江西、重慶、貴州等12個省份的113個縣(區(qū))， 發(fā)生面積超過73hm2，死亡松樹200萬株，造成林業(yè)經(jīng)濟、森林生態(tài)的 巨大損失和自然景觀的嚴重破壞，并對我國廣大適生區(qū)的松林構(gòu)成嚴 重威脅。目前對松材線蟲病的防治主要針對其傳媒昆蟲和松材線蟲本身， 而當前研究的松材線蟲控制因子主要包括產(chǎn)毒真菌、抗生素和殺蟲植 物等。在產(chǎn)毒真菌方面，孫建華報道總狀共頭霉(&"c印^/o^^m racemo ^)對松材線蟲有極強的殺線蟲活性。向紅瓊等發(fā)現(xiàn)用乙酸 乙酯從粗皮側(cè)耳麥粒培養(yǎng)物中提取的粗毒素，對松材線蟲有較強的毒 性。李國紅等發(fā)現(xiàn)一種側(cè)耳屬(尸/wra加sp.)真菌，12h內(nèi)對松材線 蟲的致病率可達90%以上，且其活性組分存在于發(fā)酵液中，不需誘導能穩(wěn)定生成，水溶性，對熱不敏感。張克勤等發(fā)現(xiàn)/^^fo/^/o恥C加'fl^ZveraaWa ZD1菌株通過液體和麥粒固體培養(yǎng)后，可從代謝產(chǎn)物中提 取有效的水溶和脂溶性物質(zhì)制備成殺線蟲生物毒素；Q^yowora ca仿cwpa ZD2菌株通過液體和固體發(fā)酵后，可制備成對松材線蟲具 毒殺活性的生物制劑。董錦艷等發(fā)現(xiàn)粉紅粘帚霉(G/k/a^謂ro^訓) Gr87菌株采用常規(guī)固體發(fā)酵及提取分離的方法，可以獲得6種對松材 線蟲有毒殺活性的化合物，這些化合物可單獨或組合制備殺線蟲生物 農(nóng)藥。可見，尋找對松材線蟲有毒性作用的真菌已經(jīng)逐漸成為研究的熱點。使君子是傳統(tǒng)的殺蟲藥用植物，自身能產(chǎn)生殺蟲成分，基于植物 內(nèi)生真菌能產(chǎn)生與其宿主相同或相似的活性成分這一觀點，如果以使 君子植物內(nèi)生真菌為篩選對象，應該可以獲得對松材線蟲有毒殺活性 的菌株，從而為線蟲的生物防治奠定基礎，目前尚未有相關報道。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種具殺線蟲活性 的真菌ly/an'a sp. FDYS-1 。本發(fā)明的另一個目的在于提供由上述真菌X;^nb sp. FDYS-1的 代謝產(chǎn)物制備而得的生物制劑，該生物制劑具有較高的松材線蟲致死 活性。本發(fā)明的另一個目的在于提供上述生物制劑的制備方法。 本發(fā)明的另一個目的在于提供上述真菌Xy/"n'a sp. FDYS-1及其代謝產(chǎn)物在松材線蟲防治中的應用。本發(fā)明的上述目的是通過如下方案予以實現(xiàn)的真菌J^/an'fl sp. FDYS-1分離自廣州華南植物園栽培的使君子 (gw'WMa//""&caL.)健康葉片，該菌為子囊菌中炭角菌屬Q(mào)^/aWa sp.)的菌株FDYS-1，在PDA培養(yǎng)基上菌落為純白色，輻射狀，表 面稍有褶疊，未見產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，菌株的ITS序列與GenBank中登陸號 為EF423534.1的Xylaria sp.同源性達99%，菌株X少/an'a sp. FDYS-1 己于2008年1月25日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號為 CCTCCNO: M 208025。一種生物制劑，是由殺線蟲活性菌株^^n'a sp. FDYS-1經(jīng)液體 發(fā)酵后提取制備而得，其制備方法為將X少/an^sp. FDYS-1接種至 pH為5 8的液體培養(yǎng)基，于26。C 29。C無光照條件下120 r/min振 蕩培養(yǎng)3~5天，將含菌絲的發(fā)酵液放入離心管中，離心過濾除去菌絲， 收集濾液即得。上述液體培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PD)或馬鈴薯蔗 糖液體培養(yǎng)基(PS)。實驗證明上述生物制劑對松材線蟲有毒殺活性，對線蟲的致死 率可達99%，且經(jīng)12rC處理20min也不失活；真菌Xy/an'a sp. FDYS-1 產(chǎn)生毒殺松材線蟲的活性物質(zhì)的能力基本保持遺傳穩(wěn)定，連續(xù)繼代6 代后對線蟲的致死率仍達90.43%。因此，本發(fā)明的真菌^;/fln'asp. FDYS-1及其代謝產(chǎn)物(如上述 的由發(fā)酵培養(yǎng)液制備的生物制劑)可用于松材線蟲的防治。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果l.本發(fā)明的生物制劑對松材線蟲具有高致死活性，熱穩(wěn)定性好，經(jīng)12rC處理20min也 不失活，而且該生物制劑來源環(huán)保無毒性，選擇性強，對人畜安全， 對生態(tài)環(huán)境影響?。?.本發(fā)明采用的々/anb sp. FDYS-1菌株，其培 養(yǎng)條件要求低，且產(chǎn)生活性物質(zhì)的能力基本保持遺傳穩(wěn)定，連續(xù)繼代 6代后對線蟲的致死率仍高達卯.43%，具有很好的開發(fā)應用前景。


圖1為Xy/fln'a sp. FDYS-1在PDA培養(yǎng)基上的菌落正面圖； 圖2為X少/an'a sp. FDYS-1在PDA培養(yǎng)基上的菌落背面圖； 圖3為義>^;女sp. FDYS-1經(jīng)不同培養(yǎng)液培養(yǎng)后濾液的殺線蟲活性；圖4為^/an'a sp. FDYS-1在不同培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)后濾液的殺線 蟲活性；圖5為J^/aWa sp. FDYS-1在不同初始pH值下培養(yǎng)后濾液的殺 線蟲活性；圖6為Xy/anh sp. FDYS-1在不同培養(yǎng)代數(shù)后濾液的殺線蟲活性。
具體實施方式
各種培養(yǎng)基配方PDA培養(yǎng)基稱取200g馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加水1000ml 煮沸半個小時，紗布過濾，再加20g葡萄糖和17 20g瓊脂，充分溶 解后趁熱紗布過濾，12rC滅菌20分鐘后，冷卻后貯存?zhèn)溆谩?PD培養(yǎng)液馬鈴薯200g，葡萄糖20g，水1000ml。 PS培養(yǎng)液馬鈴薯200g，蔗糖20g，水1000ml。PC培養(yǎng)液馬鈴薯200g，胡蘿卜100克，水1000ml。 馬丁氏培養(yǎng)液蛋白胨5g,葡萄糖10g， MgS04*7H20 0.5g，KH2P04lg，水1000ml。Czapek培養(yǎng)液蔗糖30g， NaN03 2g， K2HP04 1 g， MgS04'7H200.5g， KC10.5g， FeSO40.01g，水lOOOml。改良Fries 3號培養(yǎng)液蔗糖20g，酒石酸銨5g， NHtNOslg,KH2P04lg， MgS04.7H20 0.5g， NaClO.lg， CaCl2'2H20 0.13g，玉米漿lg，水lOOOml。實施例1 Xj^/nVi sp. FDYS-1的分離及其對松材線蟲的活性 采集廣州華南植物園使君子植物的健康葉片，自來水沖洗干凈，晾干水分后剪成約1.5x1.5cm的小塊，進行表面消毒，其具體步驟如 下先用70%酒精漂洗30s，再用0.1%升汞漂洗lmin，接著再用70% 酒精漂洗30s后，無菌水沖洗4次，在無菌濾紙上吸干水分即可。采用漂洗液檢驗法和組織印跡法檢驗表面消毒效果漂洗液檢驗 法即吸取最后一次無菌水沖洗的沖洗液0.2mL，涂布于PDA平板上； 組織印跡法即用滅過菌的鑷子將經(jīng)上述表面消毒的材料移植至PDA 平板上，接觸5min后取出。處理后的PDA平板于于26士rC無光照 條件下培養(yǎng)7d后，若發(fā)現(xiàn)皿中無菌落出現(xiàn)，證明材料表面消毒徹底； 否則，需重新分離。將上述表面消毒處理過的材料在無菌狀態(tài)下剪切成0.5x0.5cm的 小塊(剪去0.5cm的邊緣)，并移植于含鏈霉素(0.05mg/ml)的PDA 培養(yǎng)基上，于26土rC無光照條件下培養(yǎng)，待組織塊邊緣有菌絲長出后，及時挑取菌絲尖端轉(zhuǎn)入PDA平板上獲得純培養(yǎng)。經(jīng)多次分離，得到多株純菌，純菌經(jīng)過接種至PD培養(yǎng)液中，于25。C無光照條件下120r/min振蕩培養(yǎng)5d，過濾除去菌絲，獲得培養(yǎng) 濾液。采用觸殺法檢測濾液對松材線蟲的致死活性取2mL濾液加入 小培養(yǎng)皿(d=3cm)中，然后用膠頭滴管加入供試松材線蟲30~50條， 置25。C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于24h和48h后，用連續(xù)變倍體視顯微 鏡檢査線蟲死亡情況，并將處理后僵直不動的蟲體轉(zhuǎn)入清水中，如 4h后線蟲不能恢復活動，則記為死亡。經(jīng)比較篩選，最后得到一株 對松材線蟲具有高致死活性的菌株FDYS-1 ，該菌在PDA培養(yǎng)基上的 菌落為純白色(如圖1、 2所示)，輻射狀，表面稍有褶疊，未見產(chǎn)孢 結(jié)構(gòu)，其培養(yǎng)濾液對松材線蟲的致死活性可達99%，該菌經(jīng)ITS序列 分析鑒定，其ITS序列與GenBank中登陸號為EF423534.1的Xy/an'a sp.同源性達99%。因此，本實施例分離得到的一株對松材線蟲具有高致死活性的菌 株FDYS-1屬于炭角菌屬(JT，/n'a sp.)，命名為J^/an'a sp. FDYS-1 ， 并于2008年1月25日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號為 CCTCCNO: M 208025。實施例2培養(yǎng)條件對J^/flWfl sp. FDYS-1活性物質(zhì)產(chǎn)生的影響1、培養(yǎng)液的選擇將^^Wa sp. FDYS-1分別接種至馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液(PD)、馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)液(PS)、馬丁氏培養(yǎng)液、Czapek培養(yǎng)液、含20%馬鈴薯汁的Czapek培養(yǎng)液和改良Fries 3 號培養(yǎng)液等7種液體培養(yǎng)基中，于25'C黑暗條件下120r/min振蕩培 養(yǎng)5d，制備培養(yǎng)濾液并以觸殺法檢測濾液對松材線蟲的致死活性。結(jié)論如圖3所示，Zy/an'a sp. FDYS-1在7種液體培養(yǎng)基中均 能生長和產(chǎn)生殺線活性物質(zhì)，但不同培養(yǎng)基得到的培養(yǎng)濾液，其殺線 蟲活性強弱差異明顯，PD和PS的培養(yǎng)濾液的殺線蟲活性最強，分別 達95.67%和95.29%;菌株在PD和PS中生長也最好，培養(yǎng)5d后菌 絲干重分別達7.556 g/L和7.533 g/L。2、 培養(yǎng)溫度的選擇以PD培養(yǎng)液為供試培養(yǎng)基，接種J^/an'" sp. FDYS-1后分別于 20°C、 23°C、 26°C、 29°C、 32。C黑暗條件下120r/min振蕩培養(yǎng)5d， 制備培養(yǎng)濾液并以觸殺法檢測濾液對松材線蟲的致死活性。結(jié)論如圖4所示，Zy/ar/a sp. FDYS-1在20。C 32。C條件下可以 產(chǎn)生殺線蟲活性物質(zhì)，但產(chǎn)毒的最適溫度為26。C 29t:，在此溫度范 圍內(nèi)培養(yǎng)，菌株培養(yǎng)濾液的殺線蟲活性可達93.35%~96.41%。3、 培養(yǎng)基pH的選擇以PD培養(yǎng)液為供試培養(yǎng)基，用lmol/L HCL和lmol/LNaOH將 其初始pH值分別調(diào)為3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11，以培養(yǎng)基自 然pH值(6.4)為對照，接種后于26。C黑暗條件下120r/min振蕩培 養(yǎng)5d，制備培養(yǎng)濾液并以觸殺法檢測濾液對松材線蟲的致死活性。結(jié)論如圖5所示，初始pH值為5~8時有利于Z;^n'a sp. FDYS-1菌株產(chǎn)生殺線蟲活性物質(zhì)，初始pH值過高或過低均不利于活性物質(zhì) 的產(chǎn)生，當pH為ll時，菌株不能生長。根據(jù)本實施例可得出由Zy/^^ sp. FDYS-1菌株制備毒殺松材線 蟲生物制劑的方法為將Xj^W" sp. FDYS-1接種至馬鈴薯葡萄糖液 體培養(yǎng)基(PD)或馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基(PS)中，培養(yǎng)基的pH為 5 8，于26。C 29。C無光照條件下120r/min振蕩培養(yǎng)5d，將含菌絲 的發(fā)酵液放入離心管中，離心過濾除去菌絲，收集濾液即為毒殺松材 線蟲的生物制劑。實施例3 J^/wVi sp. FDYS-1產(chǎn)殺線蟲活性物質(zhì)的遺傳穩(wěn)定性 及活性物質(zhì)的熱穩(wěn)定性將X少/^7'a sp. FDYS-1連續(xù)繼代培養(yǎng)6代，再制備培養(yǎng)濾液及檢 測其對松材線蟲的致死活性。結(jié)論由圖6所示，sp. FDYS-1連續(xù)繼代培養(yǎng)6代后， 其培養(yǎng)濾液的殺線蟲活性基本保持不變，對松材線蟲的致死率仍高達 90.43%。將J^/an'a sp. FDYS-1培養(yǎng)濾液分別于60、 70、 80、 90、 100°C 水浴中處理20、 30、 40、 50、 60min以及121。C高壓滅菌處理20 min， 用無菌蒸餾水補足損失水分后，檢測殺線活性。測定結(jié)果表明，菌株 ^;/an'asp. FDYS-1培養(yǎng)濾液殺線蟲活性的熱穩(wěn)定性較好，經(jīng)121。C處 理20min也不失活。綜上所述可以看出，^^nh sp. FDYS-1菌株產(chǎn)生活性物質(zhì)的能力基本保持遺傳穩(wěn)定，且培養(yǎng)濾液經(jīng)12rC處理20min也不失活，熱 穩(wěn)定性好，X少/an'a sp. FDYS-1是一株具有較好開發(fā)應用前景的殺線 蟲活性菌株。
權(quán)利要求
1. 一種真菌Xylaria sp.FDYS-1，該菌株屬于炭角菌屬，于2008年2月25日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCCNOM 208025。
2、 權(quán)利要求1所述真菌制備的生物制劑，其特征在于該生物制 劑是由真菌X乂"W"sp. FDYS-1經(jīng)液體發(fā)酵培養(yǎng)后提取制備而得。
3、 權(quán)利要求2所述生物制劑的制備方法，其特征在于包括如下 步驟將J^/腦'asp.FDYS-l接種至液體培養(yǎng)基中，無光照條件下培 養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后，將含菌絲的發(fā)酵液離心過濾除去菌絲，收集濾液即 得。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述液體培養(yǎng) 基為馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基或馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述培養(yǎng)基的 pH為5 8，培養(yǎng)溫度為26°C 29°C。
6、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述振蕩培養(yǎng) 的頻率為120r/min。
7、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述培養(yǎng)時間 為3 5天。
8、 權(quán)利要求1所述真菌Xy/an'a sp. FDYS-1或其代謝產(chǎn)物在防治 松材線蟲中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開一株真菌Xylaria sp.FDYS-1及其制備的生物制劑與在防治松材線蟲中的應用。真菌Xylaria sp.FDYS-1，于2008年2月25日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC NOM208025。本發(fā)明將Xylaria sp.FDYS-1接種至馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基或馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基的pH為5～8，培養(yǎng)溫度為26℃～29℃，無光照條件下培養(yǎng)3～5天后，將培養(yǎng)液離心過濾，收集濾液即得生物制劑，該生物制劑對于松材線蟲具有高致死活性，且熱穩(wěn)定性好，來源環(huán)保無毒性，選擇性強，對生態(tài)環(huán)境影響小。本發(fā)明的菌株Xylaria sp.FDYS-1的培養(yǎng)條件要求低，產(chǎn)生活性物質(zhì)的能力基本保持遺傳穩(wěn)定，具有很好的開發(fā)應用前景。
文檔編號C12R1/645GK101260370SQ200810027690
公開日2008年9月10日 申請日期2008年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月25日
發(fā)明者向梅梅, 姜子德, 袁永平 申請人:仲愷農(nóng)業(yè)技術(shù)學院