專利名稱：：用于豬瘟病毒實時熒光定量rt-pcr檢測的探針、引物及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于豬瘟病毒實時熒光定量RT-PCR檢測的探針、引物序列，以及一種包括該探針和引物的試劑盒。
背景技術(shù)：
：豬瘟(CSF)是由豬瘟病毒(ClassicalswinefevervimsCSFV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，它的特點是發(fā)病快、流行范圍廣、死亡率高。不僅給養(yǎng)豬業(yè)造成極大的經(jīng)濟損失，而且嚴(yán)重阻礙豬及豬產(chǎn)品的國際貿(mào)易，OIE將其列為A類傳染病，F(xiàn)AO和各國政府也將其列為需要嚴(yán)密監(jiān)控和檢疫的主要動物傳染病之一。目前國內(nèi)傳統(tǒng)的CSFV實驗室檢驗方法主要包括(1)熒光抗體試驗，此方法敏感性不高，不能有效地檢測低病毒含量的臨床樣品和動物源性食品中CSFV的存在，同時受熒光抗體質(zhì)量及操作人員主觀意識影響較大；(2)抗原捕獲ELISA(AC-ELISA)，該方法具有快速、操作簡單等特點，但敏感性較低，同時特異性也不強，不能有效地區(qū)分BVDV、BDV、CSFV;(3)病毒分離，此方法具有敏感性高，特異性較強，但存在技術(shù)要求高、檢驗周期長、檢驗過程中生物安全隱患較大等缺點，并需要借助其它方法(如熒光抗體方法)才能進行判定；(4)熒光抗體病毒中和試驗，該方法為國際貿(mào)易指定的方法，主要用于樣品中CSFV抗體檢測，但不能有效地區(qū)分免疫豬群和感染豬群；(5)過氧化物酶聯(lián)中和試驗，這是國際貿(mào)易指定方法，該方法在抗體稀釋倍數(shù)較低時不能有效地區(qū)分BVDV、BDV、CSFV;(6)酶聯(lián)免疫吸附試驗，該方法檢驗速度快、操作簡單，但特異性和敏感性取決于試劑抗體的特異性。與此同時，后三種方法只適用于豬血清樣品中CSFV抗體檢測，不適用臨床組織樣品和動物源性食品中CSFV抗原檢測。動物源性食品(AnimalDerivedFood)是指全部可食用的動物組織以及蛋和奶，包括肉類及其制品(含動物臟器)、水生動物產(chǎn)品等。隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)在動物疫病實驗室檢驗工作的廣泛應(yīng)用，目前已經(jīng)建立了單管反轉(zhuǎn)錄套式RT-PCR、巢式PCR方法來替代抗原捕獲-ELISA和病毒分離技術(shù)，國內(nèi)外有關(guān)部門也相繼建立了CSFV實時熒光定量PCR檢測技術(shù)，該技術(shù)是根據(jù)CSFV基因組結(jié)構(gòu)特點，選擇5'非編碼區(qū)設(shè)計一對特異性引物和熒光探針，利用熒光定量PCR的原理，建立動物及動物源性食品中CSFVreal-timeRT-PCR方法。該方法主要由一條兩端標(biāo)記有熒光基團的探針和一對引物組成，在探針完整時，兩基團在空間結(jié)構(gòu)上互相靠近，5'報告基團產(chǎn)生的熒光基團為熒光共振能量而被3'端淬滅基團淬滅，因此體系中沒有熒光信號的產(chǎn)生，在PCR退火和延伸過程中，探針與模板特異性結(jié)合，隨著引物的延伸，TaqDNA聚合酶利用5'—3'外切活性對探針進行切割，釋放出報告基團，這樣破壞了兩基團之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移，報告基團所釋放的熒光可以被熒光PCR儀器內(nèi)的光學(xué)系統(tǒng)檢測出來，熒光量的增加與PCR的產(chǎn)物的積累量呈正比例關(guān)系。而PCR產(chǎn)物的積累與初始模板數(shù)成正線性關(guān)系，因此在PCR循環(huán)數(shù)相同的情況下，熒光量與初始模板數(shù)成正線性關(guān)系。因此可以推論出達到相同的熒光閾值(Ct)值與初始模板數(shù)的對數(shù)成負線性相關(guān)，這就是熒光定量PCR實現(xiàn)定量的原理。這種方法與傳統(tǒng)的檢測方法相比，熒光定量PCR方法特異性好，因為檢測過程中上下游引物與探針同時保證了檢測方法的特異性，而且探針與模板結(jié)合要求特異性更強。其中的熒光修飾基團有多種。CSFVreal-timeRT-PCR方法在實驗感染樣品、豬瘟疫苗弱毒株等樣品中得到了較好地應(yīng)用。所使用的PCR引物和探針是針對CSFV某一特定區(qū)域的基因組序列進行設(shè)計，能有效地區(qū)分被檢樣品中的BVDV、BDV、CSFV，但該技術(shù)并未在動物臨床樣品和動物源性食品中CSFV得到應(yīng)用，其敏感性和特異性也有待進一步提高。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種特異性、靈敏度高的用于豬瘟病毒實時熒光定量RT-PCR檢測的探針，其序列為5'-tgatgggggtacgacctgatagggt-3'。本發(fā)明還提供了與上述探針相應(yīng)的引物，其序列為5'—gacacaagcgcaggcaatag-3'和5-agtgggttccaggartacat-3'。本發(fā)明還提供一種豬瘟病毒實時熒光定量RT-PCR檢測的試劑盒，其中包括上述探針和引物，具體包括1)陽性對照陽性標(biāo)準(zhǔn)品采用人工合成的含有目的檢測基因的RNA作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，共4瓶，300W/瓶，-20'C冷凍保存；標(biāo)準(zhǔn)品l:107拷貝/5!4;標(biāo)準(zhǔn)品2:105拷貝/5)4;標(biāo)準(zhǔn)品3:103拷貝/5|^1;標(biāo)準(zhǔn)品4:10'拷貝/5W;2)陰性對照采用無豬瘟病毒感染豬組織，按1:5倍體積加入0.1。/。DEPC水，于組織勻漿器中充分研磨，然后3500rpm離心20min，取上清液提取RNA，溶解于DEPC水，分裝成300ri/瓶，-2(rc冷凍保存?zhèn)溆茫?)0.1。/。DEPC水在去離子水中加入0.1%焦碳酸二乙酯，室溫下過夜處理，15磅30分鐘，2X10ml/瓶；4)Trizol裂解液50ml/瓶，棕色瓶分裝，4'C保存?zhèn)溆茫?)RT-PCR反應(yīng)液每個反應(yīng)包括5XPCRbuffer5.0W、10誦oldNTPs0.5W、25腿o1MgCl2以及權(quán)利要求3所述的引物對各0.514，共8.514，50個反應(yīng)體系共計42514;6)反應(yīng)酶每個反應(yīng)體系包括ReverseTranscriptase0.214、TaqDNA聚合酶0.5Ml，含量為3UA4，共0.7W，50個反應(yīng)體系共計35rt，-20。C冷凍保存?zhèn)溆茫?)探針溶液探針采用5'-FAM和3'-TAMRA修飾，合成后采用0.1%DEPC水稀釋，濃度為10taiol/L，每個反應(yīng)體系0.5W，50個反應(yīng)體系共計25W，-20'C冷凍保存?zhèn)溆?。本發(fā)明也提供了一種利用上述試劑盒對豬瘟病毒進行實時熒光定量RT-PCR的檢測方法，具體的檢測過程為1)樣品的采集與前處理采樣過程中樣本不得交叉污染，采樣器具均采用高壓滅菌處理，采樣及樣品前處理過程中須戴一次性手套。a活豬的采樣方法采血取用肝素鈉處理的一次性采血針管，選取豬耳靜脈，按常規(guī)的采血方法采集抗凝血樣。b組織、臟器、鹽漬腸衣、腌肉、分割肉等樣品的采樣方法研缽的處理將洗凈的研缽用O.1%DEPCH20處理，高壓滅菌風(fēng)干后備用。石英砂的處理取適量的石英砂置于滅菌的玻璃瓶中，加入適量的O.P/。DEPCH20處理，高壓滅菌風(fēng)干后備用。用無菌的剪刀、鑷子取待檢樣品2.0g于研缽，剪碎后加入少量的石英砂，充分研磨，再加10ml0.1。/。DEPC水混勻，3000g離心10min后，上清液轉(zhuǎn)入滅菌處理的玻璃管備用。采集或處理的樣本在28'C條件下保存應(yīng)不超過24h，長期保存須在-70'C以下，但盡可能避免反復(fù)凍融。將采集的樣品密封并編號，以冷藏方式盡快送實驗室進行檢測，如暫不進行檢測，必須冷凍保存。血液樣品冷藏保存，保存時間一般不超過7天。2)CSFVRNA的制備樣品制備應(yīng)在生物潔凈工作室或生物安全柜內(nèi)進行。取n個1.5ml經(jīng)0.1%DEPC1120處理的Eppendor滑，其中n為待檢樣品數(shù)。a組織樣品RNA的提取每管加入800ulTrizol試劑，然后加入待測樣品上清液200ul，一份樣本換用一個吸頭，然后渦旋10s;再加入500iU氯仿，混勻器上渦旋5s，于4。C條件下，12000g離心15min。取與上述組織樣品相同數(shù)量的1.5ml經(jīng)DEPCH20處理的Eppendor滑，每個管做好相應(yīng)標(biāo)記，加入500iU異丙醇，再分別加入上述經(jīng)離心處理的上清液500yl(注意移液時不能接觸中間層)，顛倒混勻，置-20'C下靜止15min后，于4。C條件下12000g離心15min，輕輕傾倒上清液，倒置于吸水紙上，吸干液體，不同樣品須在吸水紙不同地方吸干。加入600ul75。/。乙醇，顛倒洗滌，于4。C條件下10000g離心5min。輕輕傾倒上清液，倒置于吸水紙上，沾干液體。5000g離心5s將管壁上的殘余液體甩到管底部，用微量加樣器將其吸干，一份樣本用一個吸頭，吸頭不能碰到沉淀物，室溫下干燥5min。每個樣本加入50iilDEPCH20，輕輕混勻，溶解管壁上的RNA，2000g離心5s，冰上保存?zhèn)溆?。b血液樣品RNA的提取取上述活豬樣品抗凝血，經(jīng)3000rpm離心處理15min，小心移取中間白細胞50y1，加入到950ulTrizol試劑中，再按組織樣品RNA提取方法，提取受檢樣品RNA。3)靶核酸的反轉(zhuǎn)錄和擴增a擴增試劑的準(zhǔn)備與配制從試劑盒中取出相應(yīng)的qRT-PCR反應(yīng)液、Taq酶，待反應(yīng)液室溫下融化后2000g離心5s。如果所需擴增的樣本為n，包括待檢樣品、陽性對照、陰性對照，則移取各液體的總量為以下各試液的n+l倍。qRT-PCR反應(yīng)體系如下5Xbuffer5鄭125mmol/LMgCl22,(MRnaseInhibitor0.5MlReverseTranscriptase0.2MllOmmol/LdNTPs0.51410Mmol/LPrimer10.5W10Mmol/LPrimer210taiol/LProbe0.5MlTaq酶0.5W(3畫)RNA5.(MDEPCH20_9.8M1總計25Wbreal-timeRT-PCR反應(yīng)，CSFV反應(yīng)參數(shù)為第一階段，反轉(zhuǎn)錄45'C/15min;第二階段，預(yù)變性95'C/5min;第三階段，94。C/30s，58°C/45s，40個循環(huán)。退火延伸時檢測熒光信號。4)結(jié)果判定結(jié)果分析條件設(shè)定閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照擴增曲線的最高點。Ct值《30，而且出現(xiàn)明顯的擴增曲線為陽性，表明樣品中存在CSFV;無Ct值，并且無擴增曲線為陰性，表明樣品中無CSFV。上述對于豬瘟病毒的實時熒光定量RT-PCR檢測，是對于動物和動物源性食品中的豬瘟病毒的實時熒光定量RT-PCR檢測。本發(fā)明的優(yōu)點本發(fā)明提供的動物及動物源性食品中豬瘟病毒診斷試劑盒及real-timeRT-PCR檢測方法具有特異性強、靈敏度高、重復(fù)性好、操作簡單、檢測速度快(從樣品處理開始4小時內(nèi)完成檢測)、不受操作人員主觀意識影響，同時檢測樣品通量大、生物安全風(fēng)險低，符合國際上動物疫病診斷方法發(fā)展趨勢，該方法的建立填補了國內(nèi)外動物及動物源性食品中CSFV檢測空白，具有廣闊的應(yīng)用前景。圖1是豬瘟疫苗和陰性組織樣本實時熒光RT-PCR的檢測曲線圖，其中曲線l一4分別為50、25、12.5、6.5iU疫苗液提取的RNA作為模板擴增到的曲線，曲線5—7為3個陰性對照擴增曲線；圖2是豬瘟病毒和另外6種病毒實時熒光RT-PCR的檢測曲線圖，其中，曲線l一2分別為20、10u1豬瘟病毒培養(yǎng)液檢測曲線，曲線3—8分別為BVDV、BDV、PRRSV、PRV、PPV、PCV-2病毒檢測曲線；圖3是臨床樣本不同稀釋度的實時熒光RT-PCR的檢測曲線圖，曲線l-4分別為組織樣本勻槳稀釋8倍、64倍、16倍及32倍時的檢測曲線；圖4是不同拷貝數(shù)模板的實時熒光RT-PCR的檢測曲線圖，曲線l一8分別為107、106、105、104、103、102、IO1、1()G拷貝數(shù)目的檢測基因的檢測曲線；圖5是3對引物和探針對不同稀釋度樣本的實時熒光RT-PCR的檢測曲線圖，其中，曲線1-3和6分別為本發(fā)明引物和探針對1:8、1:16、1:32及1:64稀釋度樣本的檢測曲線，曲線4:為第(1)組對照引物和探針對l:8稀釋度樣本的檢測曲線，曲線5:為第(2)組對照引物和探針對l:8稀釋度樣本的檢測曲線；圖6是第(1)組對照引物和探針對不同稀釋度RNA的實時熒光RT-PCR的檢測曲線圖，曲線1一4分別為RNA10—1、10—2、10—3、10"稀釋時的實時熒光RT-PCR的檢測曲線；圖7是本發(fā)明引物和探針對不同稀釋度RNA的實時熒光RT-PCR的檢測曲線圖，曲線1—5分別為RNA10—1、10—2、10—3、l(T4、10—5稀釋時的實時熒光RT-PCR的檢測曲線；圖8是不同樣本中豬瘟病毒的實時熒光RT-PCR檢測的擴增曲線圖，其中，曲線l和3-7分別為肉樣l、肉樣3、肉樣4、肉樣2、腸衣2及腌肉1豬瘟病毒的實時熒光RT-PCR檢測曲線，曲線2為陽性對照的檢測曲線。具體實施例方式實施例1陽性對照采用豬瘟兔化弱毒疫苗提取病毒RNA。陰性對照采用未感染CSFV豬組織，按1:IO體積加入DEPC水于組織勻槳器中研磨，3500rpm離心處理15min，取上清液提取樣品RNA。反應(yīng)體系5Xbuffer5.(M25mmol/LMgCl22.(MRnaseInhibitor0.5WReverseTranscriptase0.21410mmol/LdNTPs0.5W10Mmol/LPrimer10.5W10Wnol/LPrimer210Wnol/LProbe0.5WTaq酶0.5W(3畫)RNA5鄭1DEPCH20_總計25W反應(yīng)條件第一階段，反轉(zhuǎn)錄45'C/15min;第二階段，預(yù)變性95°C/5min;第三階段，94'C/30s，58。C/45s，40個循環(huán)。退火延伸時檢測熒光信號。陰性對照沒有特異性擴增曲線，豬瘟兔化弱毒疫苗液擴增到明顯的特性異"S"曲線，且Ct值為29-31(四條曲線分別代表50、25、12.5、6.5u1疫苗液提取的RNA作為模板擴增到的曲線)，結(jié)果見附圖l。實施例2特異性研究鑒于黃病毒科瘟病毒屬的BVDV、BDV、CSFV三種病毒基因組序列具有較高的同源性，以及我國集約化養(yǎng)豬場廣泛存在PRRSV、PRV、PPV、PCV-2等動物病毒感染，且這些疫病在流行病學(xué)、發(fā)病動物的臨床癥狀、病理表現(xiàn)、組織學(xué)變化等方面存在一定的相似性，因此本發(fā)明采用了CSFV、BVDV、BDV、PRRSV、PRV、PPV、PCV-2等病毒培養(yǎng)液進行比較研究，以確定本發(fā)明方法的特異性。實驗結(jié)果參見附圖2，其中兩條陽性"S"曲線分別代表以20ul、10ulCSFV培養(yǎng)液提取的RNA為模板，通過Real-timeRT-PCR擴增的結(jié)果，而其余六種病毒RNA均未擴增出"S"曲線，無Ct值，實驗結(jié)果均為陰性，具體Ct值和結(jié)果如表l:<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實施例3不同檢測方法的對比研究采用了RT-PCR、real-timeRT-PCR和AC-ELISA三種不同的檢測方法對同一樣品進行檢測，比較檢測結(jié)果，以確定該方法的敏感性。對268份臨床組織樣品、324份臨床血液樣品、122份鹽漬腸衣、96份分割肉、24份腌肉樣品進行檢測。分子生物學(xué)檢測方法是將被檢樣品制成勻漿，用滅菌生理鹽水按1:4、1:8、1:16、1:32、l:64的比例進行稀釋，提取樣品總RNA，再按本研究設(shè)計的方法進行CSFVRT-PCR和real-timeRT-PCR檢測，而不是采取樣品提取RNA后，對RNA進行稀釋再進行敏感性研究，這與現(xiàn)實工作中所需要進行檢測的樣品基本一致；對于AC-ELISA檢測方法采用稀釋后的勻漿樣品按試劑盒提供的檢測方法進行試驗。RT-PCR對于組織樣品勻漿的敏感性為1:8，real-timeRT-PCR的敏感性為1:64，明顯高于RT-PCR和AC-ELISA。具體結(jié)果見表2:<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例5定量檢測釆用構(gòu)建含有豬瘟病毒石門株基因組5'端非編碼區(qū)的重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒按每個real-timeRT-PCR反應(yīng)體系模板總量為107、106、105、104、103、102、101'l()O拷貝數(shù)加入反應(yīng)各反應(yīng)體系確立檢測方法最低檢測限量。(首先合成含目的片段的核苷酸序列(230bp)，兩端分別弓I入Apall和BamH酶切位點。雙酶切后連接到經(jīng)Apall和BamH雙酶切的pUC57的質(zhì)粒中，構(gòu)建重組質(zhì)粒并測序進行鑒定。序列為5'-tctaagtcctgagtacaggacagtcgtcagtagttcgacgtgagcagaagcccacctcgagatgctacgtggacgagggcatgcccaagacacaccttaaccctagcgggggtcgctagggtgaaatcacaccacgtgatgggagtacgacctgatagggcgctgcagaggcccactattaggctagtataaaaatctctgctgtacatggcacatggagttgaatcact-3')。實驗結(jié)果參見附圖4，通過定量檢測確立了本方法的最低檢測限量為1(^拷貝/反應(yīng)體系。具體實驗結(jié)果如表4。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實施例6相同方法不同引物、探針比較研究本研究過程中選取了兩組有文獻報道的對比引物和探針進行比較研究。第(1)組為primerl-F:5國CCATGCCCATAGTAGGACTAGCAAA-3,primer2-R:5-TCACGTCGAACTACTGACGACTGT-3，probe1:5-Fam-TAGCCGTAGTGGCGAGCTCCCTGGGTGGT-Tamra-3(武漢大學(xué)學(xué)報(理學(xué)版)，2004，50(6):746-750.)第(2)組為primer1—F:5-GAGCTCCCTGGGTGGTCTAAGT-3，primer2—R:5-CATGCCCTCGTCCACRTAGC-3，probe2:FAM5-ACGTCGAACTACTGACGACTGTCCTGTACTCA-Tamra-3(J.Virol.Methods,2007,139(2):203-207.)首先將陽性樣品勻漿用滅菌生理鹽水或DEPCH20按l:8、1:16、1:32、1:64比例稀釋，提取稀釋后樣品總RNA，采用本研究建立的檢測方法，結(jié)果為本方法當(dāng)1:8、1:16、1:32、l:64比例稀釋后均可擴增到特異性曲線，Ct值隨著樣品的稀釋逐漸增大，而對照的兩組引物和探針僅在樣品作1:8稀釋時擴增到特異性曲線，Ct值分別為31、32，而在樣品作1:16、1:32稀釋時檢測結(jié)果均為陰性，擴增曲線圖見附圖5,具體結(jié)果及Ct值見表5。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實施例7相同方法不同反應(yīng)條件比較研究本研究過程中采用了溫國慶等(武漢大學(xué)學(xué)報(理學(xué)版)，2004,50(6):746-750.)公布的的CSFV熒光定量PCR方法中反應(yīng)條件對兩種不同引物和探針進行比較研究，具體方法如下提取樣品RNA，用DEPCH20將RNA作10—1、10—2、l(T3、l(T4、10—5稀釋，按照反轉(zhuǎn)錄45°C/15min;95°C/10min;94。C4s，60°C/30s，40個循環(huán)。退火延伸時檢測熒光信號。采用參考文獻提供的反應(yīng)條件、引物和探針進行檢測的結(jié)果，104擴增出明顯曲線，10—5無擴增曲線，參見附圖6;采用參考文獻提供的反應(yīng)條件和發(fā)明提供的引物、探針進行檢測的結(jié)果，10—s仍能擴增出明顯曲線，參見附圖7。結(jié)果表明本發(fā)明提供的引物和探針檢測方法的敏感性能夠高出10倍。實施例8應(yīng)用范圍研究由于目前文獻資料報道的CSFV實驗室檢測方法主要集中在CSFV實驗感染樣品、混合感染樣品以及豬瘟病毒疫苗病毒等樣品中CSFV檢測，而對豬瘟病毒感染前期的臨床樣品、動物源性食品等低病毒含量樣品報道較少，本發(fā)明除了對CSFV感染豬淋巴結(jié)、肝、腎、脾、全血等臨床樣品進行檢測外，根據(jù)CSFV的理化特性，選取了12份鹽漬腸衣、腌肉、豬分割肉(各4份)等動物源性食品作為被檢材料，進行樣品中CSFV檢測，旨在擴大檢測方法的應(yīng)用范圍。陽性對照采用人工合成的含有目的檢測基因的RNA，含量為104拷貝/5^1。陰性對照采用無豬瘟病毒感染豬組織，按1:5倍體積加入0.P/。DEPC水，于組織勻漿器中充分研磨后，取上清液提取RNA，再用DEPC水溶解后供檢測。實驗結(jié)果參見附圖8，受檢樣品中有6份樣品擴增到特異性曲線，結(jié)果為陽性，6份樣品無特異性曲線，結(jié)果為陰性。具體結(jié)果見表6:<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>權(quán)利要求1.用于豬瘟病毒實時熒光定量RT-PCR檢測的探針，其序列為5’-tgatgggggtacgacctgatagggt-3’。2.根據(jù)權(quán)利要求1的所述的探針序列，其特征在于5'端和3'端分別采用熒光基團FAM和TAMRA進行修飾。3.用于豬瘟病毒實時熒光定量RT-PCR檢測的引物對，其序列為5—gacacaagcgcaggcaatag-3'禾口5一agtgggttccaggartacat-3'。4.一種用于豬瘟病毒實時熒光定量RT-PCR檢測的試劑盒，其特征在于該試劑盒是由權(quán)利要求1或2所述的探針、權(quán)利要求3所述的引物對以及對照品所組成1)陽性標(biāo)準(zhǔn)品采用人工合成的含有目的檢測基因的RNA作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，共4瓶，300W/瓶，-20匸冷凍保存，標(biāo)準(zhǔn)品l:107拷貝/5吋，標(biāo)準(zhǔn)品2:10S拷貝/5W，標(biāo)準(zhǔn)品3:103拷貝/5ri，標(biāo)準(zhǔn)品4:10'拷貝/5l^l;2)陰性對照采用無豬瘟病毒感染豬組織，按1:5倍體積加入0.P/。DEPC水，于組織勻漿器中充分研磨，然后3500rpm離心20min，取上清液提取RNA，溶解于DEPC水，分裝成30(M/瓶，-2(TC冷凍保存?zhèn)溆茫?)0.P/。DEPC水在去離子水中加入0.1%焦碳酸二乙酯，室溫下過夜處理，15磅30分鐘，2X10ml/瓶；4)Trizol裂解液50ml/瓶，棕色瓶分裝，4'C保存?zhèn)溆茫?)RT-PCR反應(yīng)液每個反應(yīng)包括5XPCRbuffer5.0W、10咖oldNTPs0.5W、25咖o1MgCl22.OW以及權(quán)利要求3所述的引物對各0.5W，共8.5W，50個反應(yīng)體系共計6)反應(yīng)酶每個反應(yīng)體系包括ReverseTranscriptase0.2Ml、TaqDNA聚合酶0.5W，含量為3UM1，共0.7W，50個反應(yīng)體系共計35W，-2(TC冷凍保存?zhèn)溆茫?)含有權(quán)利要求1所述的探針序列溶液:探針序列用0.1%DEPC水稀釋，濃度為10taiol/L，每個反應(yīng)體系0.514，50個反應(yīng)體系共計25W，-201:冷凍保存?zhèn)溆谩?.—種豬瘟病毒實時熒光定量RT-PCR檢測方法，其特征在于使用權(quán)利要求4所述的試劑顯o6.—種豬瘟病毒的實時熒光定量RT-PCR檢測方法，其特征在于是對于動物及動物源性食品中的豬瘟病毒的實時熒光定量RT-PCR檢測。全文摘要本發(fā)明提供了用于豬瘟病毒實時熒光定量RT-PCR檢測的探針和引物序列，以及一種包括該探針和引物序列的試劑盒。利用該試劑盒及熒光定量PCR的原理，建立了動物及動物源性食品中豬瘟病毒的實時熒光定量RT-PCR檢測方法，并從敏感性、特異性等方面進行了比較研究。此檢測方法具有特異性強、靈敏度高、重復(fù)性好、操作簡單、檢測速度快、不受操作人員主觀意識影響，同時檢測樣品通量大、生物安全風(fēng)險低等優(yōu)點。文檔編號C12Q1/70GK101348837SQ20081003182公開日2009年1月21日申請日期2008年7月18日優(yōu)先權(quán)日2008年7月18日發(fā)明者唐連飛,朱中武,胡宇東,魯杏華,萍黃,輝黃,黃志強,龍新平申請人:萍黃