專利名稱：一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)d-核糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及發(fā)酵生產(chǎn)D-核糖的方法。
背景技術(shù)：
D-核糖(D-ribose)作為遺傳物質(zhì)核糖核酸的組成成份，存在于所有的 動物、植物、微生物細(xì)胞之中，是一種具有重要生理意義的戊糖。在食品、 醫(yī)藥、化學(xué)工業(yè)中具有廣泛應(yīng)用。D-核糖可以從天然物中提取，也可以從 D-葡萄糖等物質(zhì)化學(xué)轉(zhuǎn)化合成，而微生物發(fā)酵法制備D-核糖產(chǎn)量大，造價 低，最適合工業(yè)化生產(chǎn)。
80年代，Kishimoto等在專利JP 01/157,369中報(bào)道利用短小芽孢桿菌 轉(zhuǎn)酮酶缺陷型菌株，在添加芳香族氨基酸的情況下?lián)u瓶培養(yǎng)55hr， D-核糖 的積累量可達(dá)92.1g/L， 1995年，Hoshino等選育得到耐受高濃度的D-核糖
且葡萄糖脫氫酶及葡萄糖酸激酶高的轉(zhuǎn)酮酶缺陷型短小芽孢桿菌，搖瓶發(fā) 酵D-核糖的積累量高達(dá)120.0g/L。 De Wulf等在乂 所oe"g.， 82，
1-7， 1996文獻(xiàn)中報(bào)道使用一株轉(zhuǎn)酮酶缺陷型枯草芽孢桿菌，使得D-核糖產(chǎn) 量達(dá)到60.0g/L，并在此基礎(chǔ)上深入地研究了 D-核糖的代謝關(guān)鍵酶系與發(fā)酵 條件。江蘇微生物研究所鄧崇亮等于1997年利用紫外光線和化學(xué)誘變枯草 芽孢桿菌SM-18，選育得到莽草酸缺陷型菌株JSIM-1018高產(chǎn)菌，搖瓶發(fā) 酵D-核糖最高產(chǎn)量可達(dá)92.0g/L，發(fā)酵罐中平均產(chǎn)量為64.0g/L。
為了提高D-核糖的產(chǎn)量，目前關(guān)于發(fā)酵法生產(chǎn)D-核糖的研究主要集中 于高產(chǎn)菌株的改造，通過傳統(tǒng)的物理、化學(xué)誘變與生物馴化或先進(jìn)的基因工程手段，得到轉(zhuǎn)酮酶缺陷型的高產(chǎn)菌株。
現(xiàn)有國內(nèi)外報(bào)道中均完全或部分依靠碳酸鈣維持菌體胞外的pH值，不 能完全替換掉碳酸鈣。因?yàn)槭褂锰妓徕}，在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生大量二氧化 碳，而且在發(fā)酵液處理時需要將鈣離子除去的同時也會產(chǎn)生大量二氧化碳， 增加尾氣排放量。還有因?yàn)橛袣埩舻奶妓徕}，發(fā)酵液中殘留的菌體不能方 便地用于生產(chǎn)飼料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就在于提供一種微生物發(fā)酵法生產(chǎn)D-核糖的方法，以克 服以上技術(shù)存在的上述缺陷。
本發(fā)明的微生物發(fā)酵法生產(chǎn)D-核糖的方法包括如下步驟
以葡萄糖為原料，在發(fā)酵培養(yǎng)基中，不添加碳酸鈣的情況下通過微生 物發(fā)酵生產(chǎn)D-核糖。
具體的，包括如下步驟
(1) 種子培養(yǎng)將活化好的菌種接入種子液培養(yǎng)基中，36.0~37.0°C 培養(yǎng)12 16hr，獲得成熟的種子；
所說的菌種選自枯草芽孢桿菌(SadZ/^w^'to)為本領(lǐng)域公知的菌種， 在US3970522中已有報(bào)道；
所說的活化好的菌種指的是，采用？ ？文獻(xiàn)報(bào)道的方法，對所述的菌 種在斜面培養(yǎng)基中進(jìn)行活化；
(2) 發(fā)酵培養(yǎng)將步驟(1)成熟的種子按體積比為5.0~10.0%的接種
量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，通入空氣進(jìn)行有氧培養(yǎng)；發(fā)酵條件如下 發(fā)酵溫度為35.5 37.5。C;
發(fā)酵培養(yǎng)時間38 45hr; 發(fā)酵壓力為0.02 0.08Mpa; 攪拌轉(zhuǎn)速為300~700r/min;
并在不同的階段控制不同的合適pH值與溶氧，在控制pH時開始補(bǔ)加 葡萄糖；
優(yōu)選的，pH值、最佳溶氧范圍與發(fā)酵培養(yǎng)時間為
0 16小時，pH值為6.5 7.5，最佳溶氧范圍為45~50%;
16 45小時，pH值為5.5 6.5，最佳溶氧范圍為50~60%;
所述方法中，所說的溶氧指的是通過梅特勒溶氧電極所測得的溶氧相 對值，即用亞硫酸鈉校正零點(diǎn)，在發(fā)酵初始校正滿度后，發(fā)酵過程中溶氧 電極所顯示的數(shù)值。
所述方法中，在不同的階段控制不同的合適pH值是通過流加堿性物質(zhì) 的水溶液來實(shí)現(xiàn)的；
所說的堿性物質(zhì)包括但不限于重量濃度為1 25%的氫氧化鈉、氫氧化 鉀或氫氧化銨溶液；
所述方法中，補(bǔ)加葡萄糖的速度為10.0 20.0mL/hr，補(bǔ)加的葡萄糖濃度 為50.0~80.0% (g/g);
所說的斜面培養(yǎng)基為含有如下配比物質(zhì)的水溶液
山梨醇5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，酵母膏20.0g/L， K2HP04: 2.0g/L， KH2P04: 1.0g/L， NaCl: 2.0g/L，瓊脂20.0g/L， PH自然；所說的種子培養(yǎng)基為含有如下配比物質(zhì)的水溶液
葡萄糖20.0g/L，酵母膏2.0g/L， K2HP04: 3.0g/L， KH2P04: 1.0g/L，
PH: 7.0;
所說的發(fā)酵培養(yǎng)基為含有如下配比物質(zhì)的水溶液
葡萄糖140.0~180.0g/L;玉米槳10.0 30.0 g/L ;酵母粉1.0 10.0
g/L ; KH2P04: 1.0 10.0g/L ; K2HP04: L0 10.0g/L; (NH4)2S04- 1.0 10.0 g/L; MnS04: 0 0.5g/L ; MgS04: 0~0.5 g/L ; 聚醚類消泡劑0.01 10.0 g/L;
所說的聚醚類消泡劑選自聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚(GPE)或聚氧乙烯 聚氧丙烯季戊四醇醚(PPE)。
本發(fā)明的方法通過徹底解決了發(fā)酵過程中為維持菌體胞外pH而對碳 酸鈣的依賴，并結(jié)合補(bǔ)糖技術(shù)使D-核糖產(chǎn)量提高到80.0g/L以上，發(fā)酵周 期縮短至38 45hr，對糖重量轉(zhuǎn)化率達(dá)到45.0%以上。由于發(fā)酵液中不添加 碳酸鈣，發(fā)酵液中的菌體可以回收用于生產(chǎn)詞料，進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合具體實(shí)例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述。需要指出，以下實(shí)例僅用于 描述本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1
將活化好的枯草芽孢桿菌(5""7/船^&/^)斜面菌種接種至種子搖瓶 中，種子搖瓶的裝液量為100/500mL，回轉(zhuǎn)式搖床36.5"C培養(yǎng)15hr。
種子培養(yǎng)基的組成為葡萄糖20.0g/L，酵母膏2.0g/L, K2HP04 3.0g/L， KH2P04 1.0g/L。按照10.0%的體積比接種量，將成熟的種子液接入裝有3.2L發(fā)酵液的 7L發(fā)酵罐中發(fā)酵。
發(fā)酵液的組成為葡萄糖(含一分子結(jié)晶水)150.0 g/L;玉米漿26.0
g/L ;酵母粉3.0 g/L ; KH2P04: 1.0g/L ; K2HP04: 3.0g/L ; (NH4)2S04: 7.0g/L ; MnS04: 0.05 g/L ; MgS04: 0.05 g/L ;聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚 (GPE): 1.0g/L， pH7.8。
發(fā)酵過程中控制溫度為36.0±0.5°C;發(fā)酵罐的罐壓0.04MPa。攪拌起 始轉(zhuǎn)速為300r/min。
保持菌體生長期(0 16hr)溶氧為50%;產(chǎn)D-核糖期(16hr后)60%， 用重量濃度為10Y。的氫氧化鈉溶液控制pH，保持菌體生長期(0~16hr) pH 為6.5;產(chǎn)D-核糖期(16hr后)pH為6.3，溶氧為50%，在控制pH的同時 開始流加補(bǔ)糖，重量濃度為72.0%的葡萄糖的流加速度為10.0mL/hr，補(bǔ)糖 總量為200.0mL。發(fā)酵培養(yǎng)40hr結(jié)束，用苔黑酚法測D-核糖含量為81.3g/L， 重量轉(zhuǎn)化率為45.2%。
實(shí)施例2
同實(shí)施例1，其中聚醚類消泡劑為聚氧乙烯聚氧丙烯季戊四醇醚(PPE)， 并且.-
流加重量濃度為5%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值，保持菌體生長期 (0 16hr) pH為6.4，溶氧45%;菌體產(chǎn)D-核糖期(16hr后)pH為6.2， 溶氧為50%，其它條件同實(shí)施例l，發(fā)酵培養(yǎng)時間為42hr，用苔黑酚法測 D-核糖含量為78.6 g/L，重量轉(zhuǎn)化率為43.6%。實(shí)施例3
同實(shí)施例l，其中
流加重量濃度為10%的氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH值，保持菌體生長期
((M6hr) pH為6.6，溶氧45%;菌體產(chǎn)D-核糖期(16hr后)pH為6.2， 溶氧為50%，其它條件同實(shí)施例l，發(fā)酵培養(yǎng)時間為38hr，用苔黑酚法測 D-核糖含量為84.5 g/L，重量轉(zhuǎn)化率為46.9%。
實(shí)施例4
同實(shí)施例1，其中
流加重量濃度為1%的氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH值，保持菌體生長期 (0 16hr) pH為6.6，溶氧45%;菌體產(chǎn)D-核糖期(16hr后)pH為6,2， 溶氧為50%，其它條件同實(shí)施例l，發(fā)酵培養(yǎng)時間為38hr，用苔黑酚法測 D-核糖含量為71.7 g/L，重量轉(zhuǎn)化率為39.8%。
實(shí)施例5
同實(shí)施例1，其中
流加飽和的氫氧化銨溶液調(diào)節(jié)pH值，在菌體生長前期(0 16hr)控制 pH6.5，菌體產(chǎn)D-核糖期(16hr后)控制pH6.25，直至pH值有上升趨勢 時停止流加。調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速控制菌體生長期溶氧為50%;菌體產(chǎn)D-核糖期(16hr 后)溶氧為60%，其它條件同實(shí)施例l，發(fā)酵培養(yǎng)44hr，用苔黑酚法測D-核糖含量為86.9 g/L，重量轉(zhuǎn)化率為48.3%。
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權(quán)利要求
1. 一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)D-核糖的方法，其特征在于，包括如下步驟以葡萄糖為原料，在發(fā)酵培養(yǎng)基中，不添加碳酸鈣的情況下通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)D-核糖。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步驟(1) 種子培養(yǎng)將活化好的菌種接入種子液培養(yǎng)基中，36.0 37.0°C 培養(yǎng)12 16hr，獲得成熟的種子；所說的菌種選自枯草芽孢桿菌(Bac///^ w^7/s);(2) 發(fā)酵培養(yǎng)將步驟(1)成熟的種子按體積比為5.0 10.0%的接種 量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，通入空氣進(jìn)行有氧培養(yǎng)；并在不同的階段控制不同的合適pH值與溶氧，在控制pH時開始補(bǔ)加葡萄糖。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，發(fā)酵條件如下 發(fā)酵溫度為35.5 37.5。C;發(fā)酵培養(yǎng)時間38 45hr; 發(fā)酵壓力為0.02 0.08Mpa; 攪拌轉(zhuǎn)速為300~700r/min。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所說的斜面培養(yǎng)基為含 有如下配比物質(zhì)的水溶液山梨醇5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，酵母膏20.0g/L， K2HP04: 2.0g/L， KH2P04: 1.0g/L， NaCl: 2.0g/L，瓊脂20.0g/L， PH自然； 所說的種子培養(yǎng)基為含有如下配比物質(zhì)的水溶液葡萄糖20.0g/L，酵母膏2.0g/L， K2HP04: 3.0g/L， KH2P04: 1.0g/L， PH: 7.0;所說的發(fā)酵培養(yǎng)基為含有如下配比物質(zhì)的水溶液-葡萄糖140.0 l訓(xùn)g/L;玉米漿10.0 30.0 g/L ;酵母粉1.0 10.0g/L ; KH2P04: 1.0~10.0g/L ; K2HP04: 1.0~10.0g/L; (NH4)2S04: 1.0 10.0 g/L; MnS04: 0~0.5g/L ; MgS04: 0 0.5 g/L ; 聚醚類消泡劑0.01~10.0 g/L;所說的聚醚類消泡劑選自聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚(GPE)或聚氧乙烯 聚氧丙烯季戊四醇醚(PPE)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的在不同的階段控 制不同的合適pH值是通過流加堿性物質(zhì)的水溶液來實(shí)現(xiàn)的。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所說的堿性物質(zhì)包括但 不限于重量濃度為1% 25%的氫氧化鈉、氫氧化鉀或氫氧化銨水溶液。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，補(bǔ)加葡萄糖的速度為 10.0 20.0mL/hr，補(bǔ)加的葡萄糖濃度為50.0~80.0% (g/g)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，發(fā)酵的不同階段的pH 和溶氧為0 16小時，pH值為6.5 7.5，溶氧為45 50%; 16 45小時， pH值為5.5 6.5，溶氧為50 60%。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)D-核糖的方法，包括如下步驟以葡萄糖為原料，在發(fā)酵培養(yǎng)基中，不添加碳酸鈣的情況下通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)D-核糖。本發(fā)明的方法通過徹底解決了發(fā)酵過程中為維持菌體胞外pH而對碳酸鈣的依賴，并結(jié)合補(bǔ)糖技術(shù)使D-核糖產(chǎn)量提高到80.0g/L以上，發(fā)酵周期縮短至38～45hr，對糖重量轉(zhuǎn)化率達(dá)到45.0％以上。由于發(fā)酵液中不添加碳酸鈣，發(fā)酵液中的菌體可以回收用于生產(chǎn)飼料，進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本。
文檔編號C12P19/02GK101475971SQ20081003228
公開日2009年7月8日 申請日期2008年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月4日
發(fā)明者唐如星, 李金亮 申請人:上海迪賽諾醫(yī)藥發(fā)展有限公司