專利名稱：一種真姬菇交配型基因的鑒別方法
技術(shù)領(lǐng)域：
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本發(fā)明涉及生物基因的技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是根據(jù)真姬菇擔(dān)孢 子單核體交配型基因的鑒別方法，可提高真姬菇單-單雜交育種中主 動(dòng)性和有效性。
背景技術(shù)：
真^5燕[ify/w7^yg2^ (Peck) Bigelow]， 又名蟹味燕、海
鮮菇、鴻喜菇、玉蕈、膠玉蘑，隸屬于擔(dān)子菌亞門、層菌綱、傘菌目、 白蘑科、離褶菌族、玉蕈屬，是一種質(zhì)地脆嫩，味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富， 具有多種保健功效的珍稀食用菌，深受廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)。
目前，我國(guó)與日本、韓國(guó)的一些大型食用菌企業(yè)己經(jīng)能夠通過(guò)控 制溫度、濕度、光照和空氣成分進(jìn)行工廠化栽培真姬菇，并且取得了 良好的經(jīng)濟(jì)效益，但是進(jìn)行工廠化生產(chǎn)用的菌種易退化，且已出現(xiàn)老 化現(xiàn)象，給工廠化生產(chǎn)帶來(lái)了不穩(wěn)定因素。因此通過(guò)雜交育種，選育 出既穩(wěn)定高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)又適合工廠化栽培的菌株是真姬菇工廠化生產(chǎn)亟 待解決的問(wèn)題。而在己開(kāi)展的雜交育種過(guò)程中，效率一般較低，效果 也不理想。其主要原因是真姬菇是標(biāo)準(zhǔn)四極性異宗結(jié)合的高等擔(dān)子 菌，其交配系統(tǒng)受A和B兩對(duì)交配型基因的控制。交配型基因的多型 性和對(duì)育性是其遺傳研究和菌種改良的基礎(chǔ)。而有關(guān)真姬燕交配型基 因的鑒別方法國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
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本發(fā)明的目的在于提供一種改進(jìn)的真姬范交配型基因的鑒別方 法，該方法可穩(wěn)定準(zhǔn)確快速的從真姬菇孢子群體中得到四種標(biāo)準(zhǔn)交配 型的單核體，提高真姬菇單-單雜交育種過(guò)程中主動(dòng)性和有效性。 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是 一種真姬菇交配型基因的 鑒別方法，其特征在于a、從不同真姬菇菌株分離得到擔(dān)孢子單核 菌株，選一真姬菇孢子單核菌株作為出發(fā)測(cè)試菌株，編號(hào)為Tl，與 所有擔(dān)孢子單核菌株進(jìn)行配對(duì)；b、若與T1配對(duì)親和，且出現(xiàn)鎖狀聯(lián) 合，則該擔(dān)孢子單核菌株與Tl菌株交配型基因的A、 B因子都不同； 若與Tl配對(duì)不親和，且出現(xiàn)平貼反應(yīng)，則該擔(dān)孢子單核菌株與Tl菌 株交配型基因的A因子相同B因子不同；若與T1配對(duì)不親和，且出 現(xiàn)柵欄反應(yīng)，則該擔(dān)孢子單核菌株與Tl菌株交配型基因A因子不同 B因子相同；若與Tl配對(duì)無(wú)上述三種現(xiàn)象，則該擔(dān)孢子單核菌株交 配型基因與T1菌株A、 B因子都相同。
本發(fā)明是將從不同真姬菇菌株分離得到擔(dān)孢子單核菌株，對(duì)其進(jìn)程中，特別是平貼皮應(yīng)、柵欄反應(yīng)的應(yīng) 用和移植的應(yīng)用，鑒別時(shí)間縮短5 10天，且可不借助其它儀器和設(shè) 備，較直觀快速的初步鑒別真姬菇交配型基因。本發(fā)明中利用了雙核 菌株生長(zhǎng)速度快于單核菌株的性質(zhì)，運(yùn)用移植的方法將這一性質(zhì)放 大，能在較短時(shí)間明顯的將四種交配情形加以區(qū)分。將此方法應(yīng)用于 雜交育種中，可方便的鑒別出真姬菇親本和子代菌株的交配型基因， 增強(qiáng)了雜交育種過(guò)程的目的性和有效性。采用本方法理論上可使菌株
對(duì)比篩選數(shù)量減少75%，提高可結(jié)實(shí)性，尤其在多菌株多次雜交育種 應(yīng)用中，更為方便高效。然后根據(jù)鑒別結(jié)果選擇親和的，出現(xiàn)鎖狀聯(lián) 合的孢子單核菌株進(jìn)行配對(duì)雜交，再根據(jù)生長(zhǎng)速度、生長(zhǎng)勢(shì)及農(nóng)藝性 狀指標(biāo)對(duì)雜交菌株進(jìn)行篩選，獲得穩(wěn)定高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)雜交菌株。


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圖1為本發(fā)明實(shí)施過(guò)程的工藝流程圖
圖2為本發(fā)明的鎖狀聯(lián)合過(guò)程示意圖
圖3為本發(fā)明的平貼反應(yīng)菌落照片
圖4為本發(fā)明的柵欄反應(yīng)菌落照片
圖5為本發(fā)明的兩個(gè)親和菌株的菌落照片
圖6為本發(fā)明的兩個(gè)交配型基因相同菌株菌落照片
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。
一種真姬菇交配型基因的鑒別方法，其與現(xiàn)有技術(shù)的區(qū)別在于
a、從不同真姬菇菌株分離得到擔(dān)孢子單核菌株，選一真姬菇孢子單 核菌株作為出發(fā)測(cè)試菌株，編號(hào)為Tl,與所有擔(dān)孢子單核菌株進(jìn)行 配對(duì)；b、若與T1配對(duì)親和，且出現(xiàn)鎖狀聯(lián)合，則該擔(dān)孢子單核菌株 與Tl菌株交配型基因的A、 B因子都不同；若與Tl配對(duì)不親和，且 出現(xiàn)平貼反應(yīng)，則該擔(dān)孢子單核菌株與Tl菌株交配型基因的A因子 相同B因子不同；若與T1配對(duì)不親和，且出現(xiàn)柵欄反應(yīng)，則該擔(dān)孢 子單核菌株與Tl菌株交配型基因A因子不同B因子相同；若與Tl 配對(duì)無(wú)上述三種現(xiàn)象，則該擔(dān)孢子單核菌株交配型基因與Tl菌株A、 B因子都相同。
a步驟中，真姬菇菌株分離得到擔(dān)孢子單核菌株配對(duì)包括如下步 驟a)、選成熟開(kāi)傘真姬菇的子實(shí)體，剪去菌柄，菌褶一面平貼在平 板上，置于25'C培養(yǎng)箱收集孢子；b)、用接種環(huán)蘸取少量擔(dān)孢子， 于無(wú)菌水中制備孢子懸浮液，稀釋至400倍顯微鏡下每個(gè)視野有8-12 個(gè)孢子；c)、取70pl懸浮液涂平板，25。C暗培養(yǎng)7天，在顯微鏡下 用接種針挑取已萌發(fā)的孢子連同一小塊培養(yǎng)基，并轉(zhuǎn)接到平板上，再 培養(yǎng)5天后鏡檢，確定無(wú)鎖狀聯(lián)合后保存?zhèn)溆?；d)、將兩配對(duì)供試單 核菌株接種于木屑浸汁培養(yǎng)基上對(duì)峙培養(yǎng)7 10天，溫度保持在25°C ， 沿與反應(yīng)區(qū)相垂直的方向穿過(guò)兩菌落切取長(zhǎng)3cm寬0.5cm的菌塊， 轉(zhuǎn)移至馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基上，在25。C的溫度下繼續(xù)培養(yǎng)5 10天。其中，木屑浸汁培養(yǎng)基是在200g木屑浸汁中，加入 瓊脂20g，再加蒸餾水至1000ml制得的，再轉(zhuǎn)接到馬鈴薯葡萄糖瓊 脂培養(yǎng)基(即PDA培養(yǎng)基)上進(jìn)行鑒別，這里的馬鈴薯葡萄糖瓊脂 培養(yǎng)基(即PDA培養(yǎng)基)是現(xiàn)有技術(shù)，直接可在市場(chǎng)上采購(gòu)，這里 就不再贅述其具體的配方了。
根據(jù)c歩驟所得出的鑒別結(jié)果選擇親和的擔(dān)孢子單核菌株配對(duì)雜 交，對(duì)雜交菌株菌絲體生長(zhǎng)速度和生長(zhǎng)勢(shì)及其農(nóng)藝性狀進(jìn)行測(cè)定，最 后進(jìn)行雜交菌株的篩選。選擇親和的擔(dān)孢子單核菌株配對(duì)雜交是指從 上述鑒別的擔(dān)孢子單核菌株中挑選出A、 B因子不同的進(jìn)行兩兩配對(duì) 雜交，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲有無(wú)鎖狀聯(lián)合，將有鎖狀聯(lián)合的雜交 菌株純化、編號(hào)。
特別要說(shuō)明的這里所使用的轉(zhuǎn)移過(guò)程對(duì)峙生長(zhǎng)的單核菌株先是 培養(yǎng)在木屑浸汁培養(yǎng)基上的，由于此培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)相對(duì)較低，菌株的氣
生菌絲一般較少，這對(duì)于觀察現(xiàn)象的形成是有利的；接下來(lái)將培養(yǎng)一
段時(shí)間的菌落移植到PDA培養(yǎng)基上，由于此培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)較豐富，原 先的現(xiàn)象在此被放大，較傳統(tǒng)方法縮短5 10天，且現(xiàn)象更為明顯，同 對(duì)，便于挑取雜交菌株。而過(guò)去其他食用菌中所采用的鑒別方法都是 在一種培養(yǎng)基上進(jìn)行。這樣不但要等菌落幾乎長(zhǎng)滿平板才可判別，而 且現(xiàn)象不是特別清晰。 實(shí)施例
下面結(jié)合圖l和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。
1、 親本菌株培養(yǎng)、擔(dān)孢子分離和雜交菌株培養(yǎng)用PDA培養(yǎng)基去皮 馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，蒸餾水1000ml， pH自然； 栽培培養(yǎng)基木屑40%，棉籽殼24%，麩皮35%，石膏1%，每瓶干 重240g，后補(bǔ)充含水量為60%-62%;
木屑浸汁培養(yǎng)基200g木屑浸汁，加瓊脂20g，加蒸餾水至1000ml。
2、 菌株材料
真姬菇SIEF2632和S正F3132由中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì), 農(nóng)業(yè)微生物中心上海食用菌分中心提供。
3、 擔(dān)孢子單核菌株的分離
選成熟開(kāi)傘真姬菇SIEF2632和S正F3132的子實(shí)體，剪去菌柄，菌 褶一面平貼在平板上，置于25T:培養(yǎng)箱收集孢子；用接種環(huán)蘸取少量 擔(dān)孢子，于無(wú)菌水中制備孢子懸浮液，稀釋至400倍顯微鏡下每個(gè)視 野有8-12個(gè)孢子；取7(^1懸浮液涂平板，25。C暗培養(yǎng)7天，在顯微鏡下 用接種針挑取已萌發(fā)的孢子連同一小塊培養(yǎng)基(約lmm2)，并轉(zhuǎn)接到平 板上，再培養(yǎng)5天后鏡檢，確定無(wú)鎖狀聯(lián)合后保存?zhèn)溆谩?br> 其中鎖狀聯(lián)合(clamp connection)為雙核菌絲的兩個(gè)核分裂之前 可以產(chǎn)生勾狀分枝的現(xiàn)象(過(guò)程示意圖，見(jiàn)圖2)。 3、交配型的確定
分別對(duì)真姬菇S正F2632和S正F3132菌株的孢子單核體菌株進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)選一真姬菇孢子單核菌株作'為出"發(fā)測(cè)'試菌株，編號(hào)為T1，
與所有孢子單核菌株進(jìn)行配對(duì)；將兩配對(duì)供試單核菌株接種于木屑浸
汁培養(yǎng)基上對(duì)峙培養(yǎng)7 10d，溫度保持在25。C，沿與反應(yīng)區(qū)相垂直的 方向穿過(guò)兩菌落切取長(zhǎng)3cm寬0.5cm的菌塊，轉(zhuǎn)移至PDA培養(yǎng)基上， 在25"C的溫度下繼續(xù)培養(yǎng)5 10d;若與T1配對(duì)親和，出現(xiàn)鎖狀聯(lián)合， 則該擔(dān)孢子單核菌株與T1菌株交配型基因的A、 B因子都不同；若與 Tl配對(duì)不親和，且出現(xiàn)平貼反應(yīng)，則該擔(dān)孢子單核菌株與T1菌株交 配型基因的A因子相同B因子不同；若與T1配對(duì)不親和，且出現(xiàn)柵欄 反應(yīng)，則該擔(dān)孢子單核菌株與T1菌株交配型基因A因子不同B因子相 同；若與T1配對(duì)無(wú)上述三種現(xiàn)象，則該擔(dān)孢子單核菌株交配型基因與 T1菌株A、 B因子都相同。
其中平貼反應(yīng)(flatreaction)為兩單核菌株的交配型A因子相同，B 因子不同，其現(xiàn)象為異核體很稀少，在老的菌絲體中形成凹陷而扭曲 的不規(guī)則的菌絲(圖3)。菌絲能融合，但核不能移動(dòng)，沒(méi)有鎖狀聯(lián)合現(xiàn) 象。柵欄反應(yīng)(barrage reaction)為兩單核菌株的交配型A因子不同，B 因子相同，其現(xiàn)象為交配菌落的菌絲相互排斥，在接近中心部位停止 生長(zhǎng)，形成一條柵欄帶將兩個(gè)菌落分開(kāi)(圖4)。兩單核菌株親和，交配 型基因的A、 B因子都不相同，成功雜交形成雙核體，由于雙核體菌 絲生長(zhǎng)速度明顯要快于單核體，菌落形態(tài)如圖5所示。兩單核菌株交 配型基因的A、 B因子都一樣，菌落形態(tài)則如圖6。
4、 親和孢子單核體菌株配對(duì)雜交
從上述鑒別了交配型的真姬菇S正F2632和SIEF3132單核體菌株 中挑選出A、 B因子不同的進(jìn)行兩兩配對(duì)雜交，在光學(xué)顯微鏡下觀察 菌絲有無(wú)鎖狀聯(lián)合，將有鎖狀聯(lián)合的雜交菌株純化、編號(hào)分別為m 到H16。
5、 雜交菌株菌絲生長(zhǎng)速度及生長(zhǎng)勢(shì)
用打孔器取直徑0.8cm的相同菌齡雜交菌株菌絲塊，接種于PDA 平板培養(yǎng)基中部，25。C暗培養(yǎng)7d。測(cè)量菌落直徑，記錄菌絲生長(zhǎng)勢(shì)， 計(jì)算菌絲生長(zhǎng)速度，每個(gè)處理設(shè)5次重復(fù)。篩選出生長(zhǎng)速度快的菌株 Hll。
6、 雜交菌株栽培試驗(yàn)及農(nóng)藝性狀的測(cè)定
采用850mL塑料瓶栽培，每瓶裝濕料600g(含水量60。/。-62。/(0， 12rC高壓滅菌2h。滅菌后放入冷卻室，待瓶體完全冷卻、中心料溫 低于25'C后，使用自動(dòng)接種機(jī)接種，接種量為3。/。(v/v)。然后置于室 溫24。C 25。C，相對(duì)濕度60% 65%、 (302濃度0.02% 0.025%條件下 培養(yǎng)88天后，搔菌出恭。使用ULTRA UM C GR(Computer for Mushroom Cultivation)計(jì)算機(jī)環(huán)境控制系統(tǒng)自動(dòng)控制出恭期溫度 (16°C)、相對(duì)濕度(95。/。-98X)和C02濃度(0.02 % 0.03、)。
在子實(shí)體菌蓋伸展但邊緣內(nèi)巻(約8分成熟)時(shí)采收，測(cè)定各菌株 的農(nóng)藝性狀，每個(gè)處理設(shè)5個(gè)重復(fù)。篩選出農(nóng)藝性狀優(yōu)良的菌株mi。7、雜交菌株穩(wěn)定性測(cè)定
經(jīng)過(guò)3次栽培試驗(yàn)雜交菌株H11其農(nóng)藝性狀穩(wěn)定，產(chǎn)量在210g/瓶， 較親本產(chǎn)量150g/瓶左右提高40。/c 。
本發(fā)明在國(guó)內(nèi)首次提出了真姬菇交配型基因的鑒別方法，并將其 應(yīng)用于單-單雜交育種，得到了很好的效果，說(shuō)明此方法鑒別真姬燕 交配型基因是有效的，且可大幅減小雜交過(guò)程的盲目性，縮短雜交育 種的時(shí)間。同時(shí)，經(jīng)過(guò)交配型基因的鑒別，可以跟蹤雜交過(guò)程，預(yù)測(cè) 新菌株特性，為大規(guī)模雜交選育提供了可能，減少了工作量，提高了 有效率。
權(quán)利要求
1、一種真姬菇交配型基因的鑒別方法，其特征在于a、從不同真姬菇菌株分離得到擔(dān)孢子單核菌株，選一真姬菇孢子單核菌株作為出發(fā)測(cè)試菌株，編號(hào)為T1，與所有擔(dān)孢子單核菌株進(jìn)行配對(duì)；b、若與T1配對(duì)親和，且出現(xiàn)鎖狀聯(lián)合，則該擔(dān)孢子單核菌株與T1菌株交配型基因的A、B因子都不同；若與T1配對(duì)不親和，且出現(xiàn)平貼反應(yīng)，則該擔(dān)孢子單核菌株與T1菌株交配型基因的A因子相同B因子不同；若與T1配對(duì)不親和，且出現(xiàn)柵欄反應(yīng)，則該擔(dān)孢子單核菌株與T1菌株交配型基因A因子不同B因子相同；若與T1配對(duì)無(wú)上述三種現(xiàn)象，則該擔(dān)孢子單核菌株交配型基因與T1菌株A、B因子都相同。
2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種真姬菇交配型基因的鑒別方法，其 特征在于a步驟中，真姬菇菌株分離得到擔(dān)孢子單核菌株包括如下 步驟a)、選成熟開(kāi)傘真姬菇的子實(shí)體，剪去菌柄，菌褶一面平貼在 平板上，置于25'C培養(yǎng)箱收集孢子；b)、用接種環(huán)蘸取少量擔(dān)孢子， 于無(wú)菌水中制備孢子懸浮液，稀釋至400倍顯微鏡下每個(gè)視野有8-12 個(gè)孢子；c)、取70pl懸浮液涂平板，25'C暗培養(yǎng)7天，在顯微鏡下 用接種針挑取己萌發(fā)的孢子連同一小塊培養(yǎng)基，并轉(zhuǎn)接到平板上，再 培養(yǎng)5天后鏡檢，確定無(wú)鎖狀聯(lián)合后保存?zhèn)溆?；d)將兩配對(duì)供試單 核菌株接種于木屑浸汁培養(yǎng)基上對(duì)峙培養(yǎng)7~10天，溫度保持在25°C ， 沿與反應(yīng)區(qū)相垂直的方向穿過(guò)兩菌落切取長(zhǎng)3cm寬0.5cm的菌塊， 轉(zhuǎn)移至馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，在25。C的溫度下繼續(xù)培養(yǎng)5~10 天。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種真姬菇交配型基因的鑒別方法， 其特征在于根據(jù)b步驟所得出的鑒別結(jié)果選擇親和的擔(dān)孢子單核菌 株配對(duì)雜交，對(duì)雜交菌株菌絲體生長(zhǎng)速度和生長(zhǎng)勢(shì)及其農(nóng)藝性狀進(jìn)行 測(cè)定，最后進(jìn)行雜交菌株的篩選。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種真姬燕交配型基因的鑒別方法， 其特征在于d步驟中，木屑浸汁培養(yǎng)基是在200g木屑浸汁中，加 入瓊脂20g，再加蒸餾水至1000ml制得的。
全文摘要
本發(fā)明是將從不同真姬菇菌株分離得到擔(dān)孢子單核菌株，對(duì)其進(jìn)行交配型基因鑒別。在鑒別過(guò)程中，特別是平貼反應(yīng)、柵欄反應(yīng)和移植的應(yīng)用，可不借助其它儀器和設(shè)備，較直觀快速的初步鑒別真姬菇交配型基因。將此方法應(yīng)用于雜交育種中，可方便的鑒別出真姬菇親本和子代菌株的交配型基因，增強(qiáng)了雜交育種過(guò)程的目的性和有效性。采用本方法在鑒別交配型基因時(shí)間縮短5～10天，雜交育種時(shí)理論上可使菌株對(duì)比篩選數(shù)量減少75％，提高可結(jié)實(shí)性，尤其在多菌株多次雜交育種應(yīng)用中，更為方便高效。然后根據(jù)鑒別結(jié)果選擇親和的，出現(xiàn)鎖狀聯(lián)合的擔(dān)孢子單核菌株進(jìn)行配對(duì)雜交，再根據(jù)生長(zhǎng)速度、生長(zhǎng)勢(shì)及農(nóng)藝性狀指標(biāo)對(duì)雜交菌株進(jìn)行篩選，獲得穩(wěn)定高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)雜交菌株。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK101608213SQ200810039088
公開(kāi)日2009年12月23日 申請(qǐng)日期2008年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月17日
發(fā)明者馮志勇, 劉明廣, 輝 陳, 陳明杰, 高君輝 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院