專利名稱：一種植物重組表達載體及其包含該載體的轉(zhuǎn)化體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種植物重組表達載體及其包含該載體 的轉(zhuǎn)化體。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)錄因子(transcriptionfactor, TF)又稱反式作用因子，是一群能與真核基因啟動子 區(qū)域中的順式作用元件發(fā)生特異性結(jié)合，從而保證目的基因以特定的強度、在特定的 時間與空間表達的蛋自質(zhì)分子。當(dāng)植物感受外界干旱、高鹽、激素、病害時，通過一 系列信號傳遞，激發(fā)轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)錄因子與相應(yīng)的順式作用元件結(jié)合后，激活RNA聚 合酶II轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，從而啟動特定基因的轉(zhuǎn)錄表達，最后通過基因產(chǎn)物的作用對內(nèi)、 外界信號做出的調(diào)節(jié)反應(yīng)。植物許多基因的表達都是由特定的轉(zhuǎn)錄因子與特定的順式 作用元件相互作用調(diào)控的。
在植物代謝研究中，通過對特定轉(zhuǎn)錄因子的表達或者抑制的調(diào)控，可以同時調(diào)控 代謝途徑上多個對轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)的關(guān)鍵酶基因，打破代謝物代謝途徑上的瓶頸，從而 達到對整個代謝途徑進行調(diào)控的目的。目前對轉(zhuǎn)錄因子的研究表明，轉(zhuǎn)錄因子對植物 代謝的調(diào)節(jié)是通過合成與基因啟動子上相應(yīng)的順式作用元件結(jié)合的蛋白而實現(xiàn)的。由 于轉(zhuǎn)錄因子對于代謝途徑上的關(guān)鍵酶的調(diào)控具有特異性，所以構(gòu)建只包含轉(zhuǎn)錄因子的 載體有時不能夠達到同時調(diào)控代謝途徑上所有關(guān)鍵酶基因的目的，而構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子加
關(guān)鍵酶基因的載體又存在啟動子沖突的問題。因此，通過構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子加關(guān)鍵酵基因 的載體，并對關(guān)鍵酶進行啟動子修飾是解決這一問題的最佳策略。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種植物重組表達載體。
本發(fā)明所提供的植物重組表達載體，包含轉(zhuǎn)錄因子、啟動子和關(guān)鍵酶基因的的融 合序列，所述的啟動子為包含對轉(zhuǎn)錄因子特異響應(yīng)元件的啟動子。所述啟動子可為組成型、誘導(dǎo)型或組織特異性表達啟動子，優(yōu)選為帶有jere元件 的啟動子，最優(yōu)選為tdc啟動子。
所述轉(zhuǎn)錄激活因子可為orca2、 orca3、 PAP1、 PAP2、 0SB1、 TTG1、 anl、 an2、 anll、 jafl3、 del、 antl、 Lc、 TT16、 B、 Sn、 Hopi、 Cl、 Pl、 ANL2、 TTG2、 ttl、 tt2、 CPRF、 Ntliml、 MybA中之一。
在一些實施方案里，所述轉(zhuǎn)錄激活因子優(yōu)選為具有與orca3相同或相似功能的所 有具有DNA結(jié)合蛋白區(qū)AP2結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄激活因子如winl， orca2,erfl等，以及其它具有相似轉(zhuǎn)錄激活活性功能的基因；尤其優(yōu)選為orca3。
所述關(guān)鍵酶基因可包括一個目的基因或多個相同或不同的目的基因。
所述關(guān)鍵酶基因可以是任何可以利用的基因，如gl0h基因。gl0h基因具有SEQ ID NO. l所述的序列。
所述植物重組表達載體可含有篩選標(biāo)記。所述篩選標(biāo)記可為潮霉素(hygroraycin) 和卡鈉霉素(kan呵cin)。
本發(fā)明的第二個目的是提供包含上述植物重組表達載體的轉(zhuǎn)化體。
本發(fā)明所述轉(zhuǎn)化體的制備方法，包括以下步驟
制備植物重組表達載體；
轉(zhuǎn)化植物材料；
篩選轉(zhuǎn)基因植物材料。
本發(fā)明的優(yōu)點或有益效果本發(fā)明通過構(gòu)建新型植物重組表達載體可以同時調(diào)節(jié)植 物代謝途徑上的多個關(guān)鍵酶基因的表達，不僅包含對轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)的關(guān)鍵酶基因，也 包括對轉(zhuǎn)錄因子不響應(yīng)的關(guān)鍵酶基因，從而達到打通代謝流，調(diào)控目標(biāo)代謝產(chǎn)物含量 的目的。


圖1. rolB、 rolC和hpt基因的PCR電泳圖。
圖2.關(guān)鍵酶gl0h及轉(zhuǎn)錄因子orca3的PCR電泳圖。
具體實施例方式
下面對本發(fā)明進行更加詳細(xì)的描述
本發(fā)明中對植物代謝產(chǎn)物的調(diào)節(jié)可以包括提高有活性成分的含量或者降低毒性成 分的含量等，在本發(fā)明中"轉(zhuǎn)錄因子"的選擇不特定于某個轉(zhuǎn)錄因子，只要對于植物 代謝途徑有調(diào)控作用的"轉(zhuǎn)錄因子"均可以用來進行代謝調(diào)控研究，"特異啟動子" 必須為包含對"轉(zhuǎn)錄因子"特異響應(yīng)元件的啟動子，并不特定于某一啟動子，"關(guān)鍵 酶基因"可以是單個基因或者多個基因，為目標(biāo)代謝物合成途徑上的限速酶基因且自 然狀態(tài)下對轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控不響應(yīng)。
構(gòu)建包含"轉(zhuǎn)錄因子""特異啟動子""關(guān)鍵酶基因"的植物表達載體可以包括 一個或多個關(guān)鍵酶基因但最好只包含一個"關(guān)鍵酶基因"，這樣易于構(gòu)建植物表達載 體。在進行遺傳轉(zhuǎn)化植物材料時，所選用的植物材料沒有特別要求，可以是植物葉片， 懸浮細(xì)胞系等。所采用的遺傳轉(zhuǎn)化方法無特殊要求，可以采用發(fā)根農(nóng)桿菌浸染法、基 因槍等方法。轉(zhuǎn)基因材料的擴大培養(yǎng)可以根據(jù)相應(yīng)遺傳轉(zhuǎn)化方法及材料進行選擇。對 轉(zhuǎn)基因材料中目標(biāo)代謝產(chǎn)物的檢測可采用多種方法，如高效液相色譜法、氣相色譜法 等方法能達到檢測到目標(biāo)代謝產(chǎn)物即可。對于轉(zhuǎn)基因材料中位于代謝途徑上和目標(biāo)代 謝產(chǎn)物相關(guān)的基因表達的測定可采用多種方法，如PCR和熒光定量PCR等方法達到 檢測目的即可。
下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook 等分子克隆實驗室手冊(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所 述的條件，或按照制造廠商所建議的條件，實驗所用的試劑為常用試劑。
實施例1.采用基因克隆方法獲得長春花中轉(zhuǎn)錄因子orca3、特異啟動子tdc啟動 子及關(guān)鍵酶基因gl0h。 1.組織分離(Isolation)
將長春花種子用75%乙醇浸泡1 min，再用2%NaCl浸泡10min，無菌水沖洗3-4 次，用無菌吸水紙吸干表面水分，接種于無激素的MS(MurashigeandSkoog， 1962) 固體培養(yǎng)基中，25'C、 12h/12h光照培養(yǎng)，即可獲得長春花無菌苗，待苗長至5cm左 右后，切取葉片和莖段用于RNA提取。2. RNA的分離(RNA isolation)
稱取0.5g所述的長春花無菌試管苗，用液氮速凍后，迅速用研缽研碎，加入盛有 1 mL TRIzol (TRIzol Reagents, GIBCO BRL, USA)的1.5 mL Eppendorf管中，充分振 蕩后，于室溫下放置5min,加200ML氯仿，用力振蕩15sec，室溫放置2-3 min后， 于4°C 、 12，000g離心15 min;將上清液(約600 ML)吸入干凈的1.5 mL E卯endorf管中， 加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫下放置10min后，于4'C、12，000g離心10min; 棄上清，加1 mL 75%乙醇清洗，振蕩后，于4°C、 7，500g離心5 min;室溫干燥15-20 min后溶于適量(30-50 PL) RNAase-free水中；用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量， 然后在分光光度計上測定RNA含量。
3. 基因克隆(Cloning of the gene) 3丄第一鏈cDNA的合成
3.2.1關(guān)鍵酶glOh基因編碼區(qū)的PCR擴增
根據(jù)所述關(guān)鍵酶gl0h的編碼序列(SEQIDNO. 1)，設(shè)計擴增出完整編碼框的上 下游引物，(FglOh 5、-AGATCTATGGATTAVVTAVVTATTATTTAAVT-3、， RglOh 5、-GGTGACTTAAAGGGTGCTTGGTACAGCAC-3、)并在上游和下游引物上分別引 入限制性內(nèi)切酶位點(這可視選用的載體而定)，以便構(gòu)建表達載體。以所述的第一 鏈cDNA為模板，經(jīng)PCR擴增后進行測序。DNA序列測定由上海博亞或晶泰生物技 術(shù)服務(wù)有限公司采用3730自動測序儀完成。測序結(jié)果表明，所克隆的序列與GenBank 中所報道的長春花glOh基因(SEQIDNO. 1)編碼序列一致。
3.2.2轉(zhuǎn)錄因子orca3基因編碼區(qū)的PCR擴增
根據(jù)所述轉(zhuǎn)錄因子orca3的編碼序列(SEQIDNO. 2)，設(shè)計擴增出完整編碼框 的上下游引物(Forca3 5、- ATGTCCGAAGAA ATCATTTCCG TCTC陽3、， Rorca3 5、- TT AATATCGTCTCTTCTTCCTTCCTCC-3、)，并在上游和下游引物上分別引入限制性內(nèi) 切酶位點(這可視選用的載體而定)，以便構(gòu)建表達載體。以所述的第一鏈cDNA 為模板，經(jīng)PCR擴增后進行測序。DNA序列測定由上海博亞或晶泰生物技術(shù)服務(wù)有 限公司采用3730自動測序儀完成。測序結(jié)果表明，所克隆的序列與GenBank中所報 道的長春花的轉(zhuǎn)錄因子orca3基因(SEQIDNO. 2)編碼序列一致。
3.2.3 tdc啟動子基因編碼區(qū)的PCR擴增根據(jù)所述特異啟動子(帶有jere元件的tdc啟動子)的編碼序列(SEQ ID NO. 3)， 設(shè)計擴增出完整編碼框的上下游引物(Ftdc 5 、-AAGCTTAAATACATTAAATCTTAATTTCAC-3', Rtdc
5 、 - AGATVTTCTGCTGCTTTTCTGT A AAACC AGT A-3 、)，并在上游和下游引物上分別 引入限制性內(nèi)切酶位點(這可視選用的載體而定)，以便構(gòu)建表達載體。以所述的第 一鏈cDNA為模板，經(jīng)PCR擴增后進行測序。DNA序列測定由上海博亞或晶泰生物 技術(shù)服務(wù)有限公司采用3730自動測序儀完成。測序結(jié)果表明，所克隆的序列與 GenBank中所報道的長春花的轉(zhuǎn)錄因子特異響應(yīng)啟動子(帶有jere元件的tdc啟動子) 基因(SEQIDNO.3)編碼序列一致。
實施例2.包含構(gòu)建包含orca3 (轉(zhuǎn)錄因子)、tdc (特異啟動子)、gl0h (關(guān)鍵酶 基因)的植物表達載體的構(gòu)建。
1. 中間載體pCAMBIA1304+的構(gòu)建
選用pBI121和pCAMBIA1304為基本元件，構(gòu)建雙元植物表達載體 pCAMBIA1304+。
其構(gòu)建流程如下ffindIII和EcoRI雙酶切pBI121和pCAMBIA1304;回收pBI121 GUS表達盒，回收pCAMBIA1304大片段；連接這兩個回收產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化DH5 a ,在 LB/kan+平板上篩選得到單克隆，再抽提質(zhì)粒，酶切驗證(Hindni和EcoRI雙酶切)， 即構(gòu)建成功中間載體pCAMBIA1304+。
2. 包含轉(zhuǎn)錄因子orca3的中間載體pCAMBIA1304+-O的構(gòu)建 選用轉(zhuǎn)錄因子orca3和pCAMBIA1304+為基本元件，構(gòu)建雙元植物表達載體
pCAMBIA1304十-O。
其構(gòu)建流程如下Sacl和Xbal雙酶切pCAMBIA1304+和含有orca3基因的pGEM T-easy vector;回收orca3基因，回收pCAMBIA1304+大片段；連接這兩個回收產(chǎn)物， 轉(zhuǎn)化DH5 a ，在LB/kan+平板上篩選得到單克隆，再抽提質(zhì)粒，酶切驗證(SacI和Xbal 雙酶切)，即構(gòu)建成功中間載體pCAMBIA1304+-O。3. 包含轉(zhuǎn)錄因子orca3及tdc啟動子的中間載體pCAMBIA1304-的構(gòu)建 選用特異啟動子(tdc啟動子)和？€八1^181八1304+-0為基本元件，構(gòu)建中間載體
pCAMBIA1304*。
其構(gòu)建流程如下HindIII和BgHI雙酶切pCAMBIA1304+-O和含有tdc啟動子基 因的pGEMT-easy vector;回收tdc啟動子基因，回收pCAMBIA1304+-O大片段；連 接這兩個回收產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化DH5a，在LB/kan+平板上篩選得到單克隆，再抽提質(zhì)粒， 酶切驗證(HindIII和BglII雙酶切)，即構(gòu)建成功中間載體pCAMBIA1304*。
4. 植物表達載體PCAMBIA1304*+gl0h的構(gòu)建
以所述的pCAMBIA130^為表達載體，用實施例1中關(guān)鍵酶glOh替換其上的 gfp+gus基因，從而獲得含轉(zhuǎn)錄因子orca3及特異啟動子(tdc啟動子)及關(guān)鍵酶gl0h 的植物表達載體pCAMBIA1304*+gl0h。
其構(gòu)建流程如下BstEII和BglII雙酶切pCAMBIA130"和含有g(shù)lOh基因的pGEM T-easy vector;回收gl0h基因，回收pCAMBIA130"大片段；連接這兩個回收產(chǎn)物， 轉(zhuǎn)化DH5a，在LB/kan+平板上篩選得到單克隆，再抽提質(zhì)粒，酶切驗證(Bs伍II和 BglII雙酶切)，即構(gòu)建成功植物表達載體pCAMBIA1304*+gl0h。
實施例3.發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)構(gòu)建包含orca3(轉(zhuǎn)錄因子)、tdc(特異啟動子)、gl0h (關(guān)鍵酶基因)的植物表達載體遺傳轉(zhuǎn)化長春花獲得轉(zhuǎn)基因毛狀根
1. 含轉(zhuǎn)錄因子orca3、 tdc啟動子及關(guān)鍵酶glOh的植物表達載體發(fā)根農(nóng)桿菌工程 菌的獲得
將實施例2中含轉(zhuǎn)錄因子orca3、 tdc啟動子及關(guān)鍵酶glOh的植物表達載體轉(zhuǎn)入發(fā) 根農(nóng)桿菌C58C1。
2. 發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子orca3、 tdc啟動子及關(guān)鍵酶glOh轉(zhuǎn)化長春花 2丄外植體的預(yù)培養(yǎng)
剪取實施例1中長春花無菌苗葉片(0.5 cm x 0.5 cm)和莖段(0.5 cm)外植體，接種到 預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS + AS 100 Wnol/L)上，25。C暗培養(yǎng)2 d。 2.2.農(nóng)桿菌與外植體的共培養(yǎng)
8將所述的預(yù)培養(yǎng)長春花葉片和莖段外植體，放入含活化好的所述發(fā)根農(nóng)桿菌工程 菌的1/2MS懸液中浸泡5min (輕輕搖動使外植體與菌液充分接觸)后，倒出懸液， 用無菌吸水紙吸干表面余菌，轉(zhuǎn)到共培養(yǎng)培養(yǎng)基(1/2MS+AS 100 Wnol/L)中，暗 培養(yǎng)2 d。以浸泡在不帶有發(fā)根農(nóng)桿菌的1/2 MS液體培養(yǎng)基中的葉片和莖段外植體為 對照。
2.3.毛狀根的誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)
將所述的共培養(yǎng)2 d的長春花外植體轉(zhuǎn)入到脫菌固體培養(yǎng)基(1/2 MS + Cef 250 mg/L)上于25"C、 16h/8h光照培養(yǎng)20天左右，可從外植體邊緣切口處長出毛狀根。 剪取毛狀根(大約2-3 cm)，將起源于一個單細(xì)胞的每條根作為一個無性系，接種于脫 菌培養(yǎng)基(1/2MS + Cef250mg/L)中暗培養(yǎng)兩周，選擇生長快、分枝好的毛狀根轉(zhuǎn) 入脫菌培養(yǎng)基(1/2MS + Cef250mg/L)中繼代篩選，每兩周繼代培養(yǎng)一次，經(jīng)過5-6 次繼代后即可完全脫菌。再將生長良好的長春花毛狀根轉(zhuǎn)入無抗生素的1/2MS培養(yǎng) 基上繼續(xù)暗培養(yǎng)20d左右，轉(zhuǎn)基因毛狀根生長迅速、根毛和分枝逐漸增多、向地性 喪失并可以在無植物激素的培養(yǎng)基上快速生長，具有典型的毛狀根特征。獲得無性系 GK G2、 G3、 G4、 G5、 G6、 G7、 G8、 G9。
3.轉(zhuǎn)基因長春花毛狀根的PCR檢測
設(shè)計Ri質(zhì)粒T-DNA區(qū)rol基因特異性引物，用PCR方法對所述毛狀根進行分子 檢測。由于目的基因glOh在植物表達載體上與潮霉素抗性基因(hpt)在同一個邊界內(nèi)， 檢測hpt基因以確認(rèn)轉(zhuǎn)基因毛狀根。根據(jù)目的基因gl0h序列、orca3序列(SEQ ID NO. 1)設(shè)計引物對目的基因進行檢測。結(jié)果圖1.M: DNA分子量標(biāo)記；1 9依此代 表無性系G1、 G2、 G3、 G4、 G5、 G6、 G7、 G8、 G9; +表示陽性對照； 一表示 陰性對照；這表明，利用rolB、 rolC和hpt基因的PCR特異引物，能分別擴增出423 bp、 622 bp和812 bp的特異DNA片段，而以非轉(zhuǎn)化長春花普通根基因組DNA (NC) 為模板時，沒有擴增出任何片段。圖2: M: DNA分子量標(biāo)記；G1 G9依此代表無 性系G1、 G2、 G3、 G4、 G5、 G6、 G7、 G8、 G9; PC表示陽性對照；NC表示陰 性對照；這表明用關(guān)鍵酶gl0h及轉(zhuǎn)錄因子orca3的PCR引物擴增轉(zhuǎn)基因長春花毛狀 根DNA，能擴增出與預(yù)期結(jié)果一致的特異目的片段。這說明誘導(dǎo)毛狀根形成的rolB、 rolC基因和T-DNA區(qū)的hpt和gl0h及orca3基因已經(jīng)整合到長春花基因組中。實施例4.熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)基因長春花毛狀根中TIAs生物合成基因的表達
1. 引物的設(shè)計和合成
根據(jù)長春花中TIAs生物合成代謝途徑基因(orca3、 gl0h、 dxs、 ggpps、 as a 、 cpr、 tdc、 tdc、 sgd、 d4h和dat，共ll個)和看家基因18SrRNA全序列設(shè)計引物。引物 擴增基因片段長度在150-400 bp之間。所用引物由上海生工生物工程公司合成。
2. RNA的提取、標(biāo)準(zhǔn)品的制備和標(biāo)準(zhǔn)工作曲線
參照實施例1中所述方法，從長春花毛狀根中提取RNA，用DNaseI除去RNA中 基因組DNA，用反轉(zhuǎn)錄酶XL(AMV)進行第一鏈cDNA的合成，再以第一鏈cDNA 為模板，分別用ll對引物進行PCR擴增獲得相應(yīng)的U條基因的擴增條帶。
PCR產(chǎn)物電泳回收，用紫外分光光度計測定所有目的基因原液的濃度和純度。標(biāo) 準(zhǔn)品用IO倍梯度稀釋法得到系列濃度的目的基因標(biāo)準(zhǔn)品。每個標(biāo)準(zhǔn)品用熒光定量 PCR方法測定，得到Ct值。以每個標(biāo)準(zhǔn)濃度的對數(shù)對它們的Ct值作圖，得到滿意的 ll個基因標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。得到的ll個基因相關(guān)系數(shù)(斜率-3.3左右，相關(guān)系數(shù)大于 0.95)表明初始模板濃度的對數(shù)與循環(huán)閾值Ct之間存在著極強的線性關(guān)系，這為定量 的準(zhǔn)確性提供了基礎(chǔ)。標(biāo)準(zhǔn)曲線同時顯示，熒光定量PCR (FQ-PCR)反應(yīng)線性范圍 極寬，可達5個log值的范圍(10-9-10-5 Hg"L),敏感度高，起始濃度在10-9 fig爾L 也可獲得良好的定量效果。參照標(biāo)準(zhǔn)品工作曲線，可以準(zhǔn)確地得到樣品中起始模板的 濃度。
3. 熒光定量PCR檢測看家基因18SrRNA基因的表達
為調(diào)整各樣品間在RNA抽提和逆轉(zhuǎn)錄過程中反應(yīng)效率的差異，檢測目的基因表達 量的同時需檢測看家基因18SrRNA基因的表達。檢測18S rRNA和目的基因的熒光
定量PCR的反應(yīng)體系如下 _
2 x QuantiTectTM SYBR Green Master Mix 10 PL
GSP1 0.2 ML
GSP2 0.2叱
50XcDNA 5叱 ddH20 4.6叱總體積_20叱
PCR反應(yīng)條件熱啟動和變性94'C 15min, 50個循環(huán)(94匸變性15 sec， 55'C退 火30sec， 72'C延伸30sec并檢測熒光，80^20 sec并檢測熒光)。
4. 熔解曲線分析和熒光定量PCR產(chǎn)物的檢測
所有PCR產(chǎn)物經(jīng)50個循環(huán)完成以后，以0.2°C/SeC的速度使溫度從72X:緩慢上升 到95'C。擴增產(chǎn)物雙鏈DNA隨溫度的升高逐漸變性解鏈為單鏈，SYBRGreenI染料 逐漸釋放出來，熒光信號逐漸減弱，儀器每升高0.2'C檢測一次反應(yīng)管內(nèi)熒光強度的 變化，最后得到擴增產(chǎn)物熒光信號強度對溫度變化的熔解曲線(Melting curve),定量 PCR儀自動以dF/dT對溫度T作圖。根據(jù)熔解曲線的形狀和峰值對反應(yīng)管中的擴增 產(chǎn)物進行鑒定。為消除引物二聚體對Ct的影響，將每個循環(huán)中的讀板溫度調(diào)高到 80'C,在這一溫度下雙鏈的引物二聚體變性，釋放出結(jié)合的SYBR-Green染料，從而 消除了引物二聚體產(chǎn)生的熒光信號。
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出各待測樣品cDNA中各目的基因的原始濃度，然后以每份 cDNA中目的基因濃度除以每份cDNA中的看家基因18SrRNA的濃度對每個樣品中 目的基因的濃度進行校正。每份樣品目的基因的校正濃度除以非轉(zhuǎn)化對照根中該目的 基因的校正濃度，則表示樣品對非轉(zhuǎn)化對照根的相對表達量，非轉(zhuǎn)化對照根的表達量 即為1。
通過研究，本發(fā)明中提供了一種實時熒光定量PCR測定長春花TIAs生物合成基 因表達量的方法。應(yīng)用本發(fā)明的方法，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、擴增污染小等優(yōu) 點，同時，同一樣本可同時分析TIAs生物合成途徑中多個目的基因的表達，大大節(jié) 約了成本。
5. 熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)基因長春花毛狀根中轉(zhuǎn)錄因子orca3及關(guān)鍵酶glOh的表
達
選取實施例3轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄因子orca3及關(guān)鍵酶gl0h的長春花毛狀根中無性系，用非轉(zhuǎn) 化普通根作對照，用熒光定量PCR測定轉(zhuǎn)錄因子orca3及關(guān)鍵酶gl0h的表達量。轉(zhuǎn) 錄因子orca3和關(guān)鍵酶gl0h的表達量和TIAs含量比較，結(jié)果表明，非轉(zhuǎn)化對照根 glOh基因的表達量最低，TIAs含量最高的無性系G8中g(shù)l0h基因的表達量最高，是 空白轉(zhuǎn)化對照發(fā)根的15.5倍。TIAs含量低的無性系G2中g(shù)l0h基因表達量是空白轉(zhuǎn)對照發(fā)根的1.8倍。glOh基因的表達量與TIAs含量之間具有顯著的相關(guān)性 (y=3.39x-1.84，r2=0.95)。
Realtime-PCR result
g的6CKG1G2G3G6G8
orca33731.6757220768.9465.8
g10h17.267.929.7156130267
6.熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)基因長春花毛狀根中12個基因的表達 用熒光定量PCR技術(shù)測定實施例3轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄因子orca3及關(guān)鍵酶gl0h的長春花毛狀 根中TIAs生物合成基因的表達情況，結(jié)果表明，orca3基因及gl0h基因?qū)腴L春花 毛狀根可誘導(dǎo)初級代謝中g(shù)gpps的表達，還可誘導(dǎo)次級代謝中g(shù)l0h、 tdc、 tdc、 sgd 和dat的表達。
本實施例采用熒光定量PCR技術(shù)測定轉(zhuǎn)基因長春花毛狀根中TIAs生物合成相關(guān) 基因的表達，通過基因表達量的高低可以初步篩選出TIAs高產(chǎn)的長春花毛狀根。
實施例5.利用HPLC測定轉(zhuǎn)基因長春花毛狀根中TIAs含量
1. 毛狀根液體培養(yǎng)
選取實施例3中生長迅速的長春花毛狀根無性系，在超凈工作臺上取出毛狀根培 養(yǎng)物，無菌水沖洗掉瓊脂后，用無菌濾紙吸干表面水分，將毛狀根切成約5cm長的 根段，放入裝有30mLl/2MS液體培養(yǎng)基的150mL三角瓶中，起始接種量為0.5-1.0 g鮮重/瓶。將培養(yǎng)瓶置于轉(zhuǎn)速為120rpm的旋轉(zhuǎn)式搖床上，于25'C黑暗下振蕩培養(yǎng)。 每隔3d隨機抽取毛狀根培養(yǎng)物5瓶，用濾紙吸干毛狀根表面水分后，稱取鮮重，并 計算毛狀根培養(yǎng)物的鮮重增值倍數(shù)。
2. 色譜條件及系統(tǒng)適用性以及標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
色譜柱C-18反相硅膠柱(Di咖onsilC18， 5 pm， 250x4.6 mm， DIKMA)。長春堿、 長春質(zhì)堿的洗脫劑為乙腈5mMNa2HP04緩沖液(用H3PO調(diào)節(jié)pH至6)。流動項 條件為:0-20min梯度洗脫60:40(v/v)到50:50(v/v);20-33min常液洗 脫，50:50(v/v);33-45min常液洗脫，60:40(v/v)。檢測波長210腿。柱溫35"C,流速1.0 mL/min，進樣量10 jiL，靈敏度(AUFS-l.O)，理論塔板數(shù)按長春堿、長春質(zhì)堿計算不低于2000。
阿嗎堿的的洗脫劑為水(用H3PO調(diào)節(jié)pH至2.03):乙腈。流動項條件為0-10min 梯度洗脫95:5(v/v)到80: 20(v/v)，0-40min常液洗脫80:20(v/v);45-55min常液洗脫95: 5(v/v)。檢測波長238nm。柱溫35'C,流速1.0mL/mm,進樣量10 ^L，靈敏度 (AUFS-l.O)，理論塔板數(shù)按阿嗎堿峰計算不低于2000。
3.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
將所述對照品溶液分別稀釋1、 2、 5、 10倍，在相應(yīng)色譜條件下進樣，記錄圖譜 及色譜參數(shù)，分別以峰面積(Y)對標(biāo)準(zhǔn)品濃度(X，mg/L)進行回歸分析。通過研究，本 發(fā)明中長春堿在2.5-25 mg/L、長春質(zhì)堿在2.5-25 mg/L、阿嗎堿在2.5-25 mg/L范圍 內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。長春堿、長春質(zhì)堿和阿嗎堿對照品的線性回歸方程分別為-
Yvinblastine=44.278X-30.322r=0.9972
Ycatharanthine=40.649X+24.094r=0.9974
Yajmalicine=44.262X-29.476r=0.9971
4.樣品的制備和TIAs含量的測定
收集所述液體培養(yǎng)30d的長春花轉(zhuǎn)基因毛狀根，用濾紙吸干表面培養(yǎng)基，稱取鮮 重，于6(TC烘干48h至恒重，稱其干重。將毛狀根放入研缽中，加入少量石英砂， 研磨，加入95%乙醇(1:5, W/V)， 50'C超聲提取30min，冷卻至室溫，對提取液離 心(12，000rpm) 10min，吸取上清液，于12,000 rpm再離心10 min，吸取上清液， 用HPLC法測量TIAs含量。
在本發(fā)明中轉(zhuǎn)orca3基因和glOh基因顯著提高長春花毛狀根TIAs含量。轉(zhuǎn)orca3 基因及glOh基因的長春花毛狀根中長春堿、長春質(zhì)堿和阿嗎堿的平均含量分別為 1.324mg/gDW、 0.196mg/gDW和0.872mg/g DW，是空白轉(zhuǎn)化發(fā)根的4.01倍、0.7倍 和3.75倍(0.329mg/g DW長春堿、0.249 mg/g DW長春質(zhì)堿和0.233 mg/g DW阿嗎堿)。 轉(zhuǎn)orca3基因及glOh基因毛狀根總TIAs含量為2.392mg/g DW，是空白轉(zhuǎn)化發(fā)根的 2.9倍(0.812 mg/g DW)。在所測試的轉(zhuǎn)orca3基因及glOh長春花毛狀根無性系中， G8中TIAs含量最高(4.315 mg/g DW)。
本實施例采用HPLC法測定了轉(zhuǎn)基因長春花毛狀根TIAs含量，采用轉(zhuǎn)orca3基因及glOh基因的代謝工程策略獲得了 TIAs高產(chǎn)的長春花毛狀根，證明了本發(fā)明的可 行性，為利用生物工程技術(shù)調(diào)節(jié)植物代謝產(chǎn)物含量提供了一種新的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的范圍不受所述具體實施方案的限制，所述實施方案只欲作為闡明本發(fā)明 各個方面的單個例子，本發(fā)明范圍內(nèi)還包括功能等同的方法和組分。實際上，除了本 文所述的內(nèi)容外，本領(lǐng)域技術(shù)人員參照上文的描述和附圖可以容易地掌握對本發(fā)明的 多種改進。所述改進也落入所附權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。序列表
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<120> —種植物重組表達載體及其包含該載體的轉(zhuǎn)化體 <140>
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<170> Patentln version 3.1
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<213> 長春花(Catharanthus roseus)
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1權(quán)利要求
1.一種植物重組表達載體，包含轉(zhuǎn)錄因子、啟動子和關(guān)鍵酶基因的的融合序列，所述的啟動子為包含對轉(zhuǎn)錄因子特異響應(yīng)元件的啟動子。
2. 如權(quán)利要求1所述的植物重組表達載體，其特征在于所述啟動子可為 組成型、誘導(dǎo)型或組織特異性表達啟動子。
3. 如權(quán)利要求1所述的植物重組表達載體，其特征在于所述啟動子為帶 有jere元件的啟動子。
4. 如權(quán)利要求3所述的植物重組表達載體，其特征在于所述啟動子為tdc 啟動子。
5. 如權(quán)利要求1所述的植物重組表達載體，其特征在于所述轉(zhuǎn)錄激活因 子可為orca2、 orca3、 PAP1、 PAP2、 0SB1、 TTG1、 anl、 an2、 anll、 jafl3、 del、 antl、 Lc、 TT16、 B、 Sn、 Hopi、 Cl、 Pl、 ANL2、 TTG2、 ttl、 tt2、 CPRF、 Ntliml、 MybA中之一。
6. 如權(quán)利要求1所述的植物重組表達載體，其特征在于所述轉(zhuǎn)錄激活因 子為具有與orca3相同或相似功能的所有具有DNA結(jié)合蛋白區(qū)AP2結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄激活因子。
7. 如權(quán)利要求6所述的植物重組表達載體，其特征在于所述轉(zhuǎn)錄激活因 子為orca3。
8. 如權(quán)利要求l所述的植物重組表達載體，其特征在于所述關(guān)鍵酶基因 可包括一個目的基因或多個相同或不同的目的基因。
9. 如權(quán)利要求1所述的植物重組表達載體，其特征在于所述關(guān)鍵酶基因 為gl0h基因，該基因具有SEQ1DNO. 1所述的序列。
10. 如權(quán)利要求l所述的植物重組表達載體，其特征在于所述植物重組 表達載體可含有篩選標(biāo)記。
11. 如權(quán)利要求l所述的植物重組表達載體，其特征在于所述篩選標(biāo)記 為潮霉素(hygromicin)和卡鈉霉素(kanamycin)。
12. —種包含1-ll任一項所述植物重組表達載體的轉(zhuǎn)化體。
全文摘要
一種植物重組表達載體，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，其特征在于，所提供的植物重組表達載體，包含轉(zhuǎn)錄因子、啟動子和關(guān)鍵酶基因的的融合序列，所述的啟動子為包含對轉(zhuǎn)錄因子特異響應(yīng)元件的啟動子。所述啟動子可為組成型、誘導(dǎo)型或組織特異性表達啟動子，優(yōu)選為帶有jere元件的啟動子，最優(yōu)選為tdc啟動子。提供包含上述植物重組表達載體的轉(zhuǎn)化體。其中轉(zhuǎn)化體的制備方法，包括以下步驟制備植物重組表達載體；轉(zhuǎn)化植物材料；篩選轉(zhuǎn)基因植物材料。
文檔編號C12N15/82GK101613713SQ200810039590
公開日2009年12月30日 申請日期2008年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月26日
發(fā)明者唐克軒, 宇 孫, 磊 張, 平 方, 瑩 肖, 鵬 邸, 陳軍峰, 龔一富 申請人:上海海泰藥業(yè)有限公司;中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)