專利名稱：：多年生黑麥草上三種腥黑粉菌近似種的檢測方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及使用PCR技術檢測寄生于禾本科草種多年生黑麥草(Z^'畫網(wǎng)re朋eL.)上小麥矮腥黑穗菌(37〃油'aco"的w^aKtihn,TCK)、黑麥草腥黑粉菌(T./?！?')和r.v朋y^'的方法，屬于禾本科草種腥黑粉菌檢測領域。技術背景多年生黑麥草(ZoZ/wm/^rem^L.)是世界上最重要的禾本科栽培牧草之一，原產(chǎn)于歐洲，1972年開始引入我國，已成為我國春秋季節(jié)主要的栽培牧草，廣泛栽培于我國各地。多年生黑麥草屬冷季型叢生禾草，具有旺盛的幼苗活力，生活力強；抗病抗逆性強，能夠抵抗多種病蟲害，耐旱，耐高溫；營養(yǎng)生長期長，分蘗多，形成茂盛的草叢，伺料質量佳。該牧草成功地解決了我國畜牧業(yè)冬春季節(jié)青綠飼料不足的弊端，生長快、成熟早、效益高且穩(wěn)定。多年生黑麥草也是一種優(yōu)良的草坪草，葉色深綠，生長低矮，具快速的草坪建植特性，耐低修剪，耐踐踏，適于草坪建植。草坪建植過程中，常與旱地早熟禾、高羊茅等草種混合栽培，用作綠化材料。同時多年生黑麥草能抗二氧化硫等有害氣體，起到凈化空氣的作用(王棟原著，任繼周等修訂.牧草學各論，新一版，江蘇科學技術出版社，1989,153-154.)。腥黑粉菌是黑麥草上非常重要的真菌病害，巳經(jīng)成為黑麥草生產(chǎn)的嚴重威脅，致使草坪景觀受到破壞，產(chǎn)量和品質嚴重降低甚至死亡(趙美琦，孫明，王慧敏，王琦主編.草坪病害,中國林業(yè)出版社，1999,230-232.)。根據(jù)Lindeberg(LindebergB.1959.UstilaginalesofSweden.t^wa/.16:67-75.)、Duran&Fischer(DuranR,FischerGW.1961.TheGenus7)7/e"<x/W/腿w船流"gtow5>她L/w'vem'(y尸潛&)、Vlnky(Vdnky.1994.Europeansmutfungi.GustavFisherVerlag;Stuttgart.)禾口Mordue(MordueJE.1984.D'〃e"fl/o/z)'.CM/Destr/;^o形/，*"m/6""m'",804.)的研究，寄生于黑麥草的腥黑粉菌有兩種，即小麥矮腥黑穗菌TCK和黑麥草腥黑粉菌7:/o///。1999年Castlebury和Carris從形態(tài)學、細胞學、分子生物學多方面進行研究，將從多年生黑麥草中發(fā)現(xiàn)的一種與小麥印腥黑粉菌(T^miia)相似的腥黑粉菌定名為新種黑麥草粒腥黑粉菌(r.而/fe")(Castlebury,LA&CarrisLM.1999.77〃e/iaHY/Aer/,anewspecieson丄o/z'w附mw/ny/orwmand丄.Afyco/og/a，91:121-131.)。2002年、2003年、2005年天津出入境檢驗檢疫局在來自澳大利亞和德國的多年生黑麥草中發(fā)現(xiàn)一種擔孢子無"H"結合的腥黑粉菌，冬孢子形態(tài)與TCK及r6raw/非常相似，于2007年和美國黑粉菌專家LoriCarris、LisaCastlebury共同發(fā)表新種r.v朋A^'(CarrisLM,CastleburyLA,GuomingHuang,a/.Tif//eriava"^y/,anewspeciesofreticulate-sporedbuntfunguswithnon-conjugatingbasidiosporesinfectingspeciesofFeWwcaand丄o/Zww.A^>co/og/ca/iesearc/z2007，111(12):1386-1398.)。至此，寄生在黑麥草上的腥黑粉菌共發(fā)現(xiàn)四種，它們是TCK、r.亂r.wfl/teh和r.wmAy/，其中r.而/fen'冬孢子具疣狀突起，與其他三種黑粉菌易于區(qū)分，tck、r./0///、r.ra"w冬孢子胞壁紋飾均為網(wǎng)狀，從形態(tài)上難以鑒定區(qū)分[章正.關于小麥矮腥病菌某些近似種的探討.植物病理學報，1980,10:89-94;章正，章桂明，朱連.黑麥草粒腥黑粉病菌與黑麥草的檢疫問題.植物檢疫，2005,19(6):362-367;IngoldCT.Thebasidiumof77〃幼》andit，sevolution.A^co/og/W,1997,11(3》98-100.]。腥黑粉菌屬主要依據(jù)形態(tài)學、萌發(fā)生理、細胞學諸方面的特性以及寄主專一性這些傳統(tǒng)方法進行分類。腥黑粉菌冬孢子萌發(fā)生理差異可以作為區(qū)分鑒定的依據(jù)之一(羅加鳳，黃國明，崔鐵軍，劉躍庭，廖芳.中華人民共和國國家出入境檢驗檢疫行業(yè)標準一禾草腥黑穗病菌、剪股穎腥黑穗病菌、黑麥草腥黑穗病菌檢疫鑒定方法，SN/T1812-2006.)，但萌發(fā)是否成功受材料保存時間、材料來源、培養(yǎng)條件等諸多因素的制約，而且TCK培養(yǎng)時間最長達三個月，不適宜于口岸的快速檢疫，TCK作為我國對外頒布的重要檢疫性有害生物，一直是我國進境麥類和禾本科草種病害檢疫的中心問題，r./0//z、r.ww^r主要在美洲、歐洲和大洋洲發(fā)生，目前在我國尚無發(fā)生，快速準確地區(qū)分這三種腥黑粉菌對口岸進境草種檢疫具有十分重要的意義。目前尚未有黑麥草上TCK、r./0///、r.wm^y/分子檢測方法的報道。近年來隨著分子生物學技術的飛速發(fā)展，分子生物學方法在腥黑粉菌的檢測鑒定上得到了廣泛的應用，諸如PCR、實時熒光PCR、RAPD、RFLP、AFLP，以及基因序列分析方法等，用到的基因序列包括ITS、IGS、mtDNA、延長因子基因、微管蛋白基因、肌動蛋白基因、細胞色素氧化酶基因、黑色素合成酶基因、交配型基因和磷酸甘油酸合成酶基因等[高強，吳品珊，朱水芳等.實時熒光PCR技術對小麥矮腥黑穗病菌的檢測.微生物學通報,2005,32(6):74-77]。尤其是在印度腥黑粉菌和近似種T.w"/fen'的檢測鑒定上，許多人作了大量研究，確立了新種r.w"/fen'，解決了困擾小麥和草種的國際貿(mào)易難題[程穎惠，章桂明，王穎等.小麥印度腥黑穗病PCR檢測.植物檢疫，2001,15(6):321-325;CastleburyLA,CardsLM.7H/"/a麗/fe"—,anewspecieson丄0//"附附"^;/70^附肌(1￡.;^^朋￡.顯:^0/(^/"，1999,91(1):121-131;易建平，陶庭典，沈禹飛等.進境黑麥草種子中黑麥草腥黑粉菌的鑒定.南京農(nóng)業(yè)大學學報,2002,25(2):52-56.]。近年來，隨著我國農(nóng)牧業(yè)以及城市擴大草坪綠地美化環(huán)境的需要，境外的草種大量引入，作為優(yōu)良的牧草和草坪草，多年生黑麥草作為重要經(jīng)濟價值的栽培品種被大量引進，并在各地廣泛栽培。隨著草業(yè)國際化引種頻繁，tck、r./o肌、；r.v""^,'通過口岸傳入我國的風險越來越大。腥黑粉菌的檢疫鑒定是該草種真菌檢疫的重要工作之一，為了保護我國的牧草生產(chǎn)和城市綠化，有必要在口岸建立小麥矮腥黑粉菌tck、r./o///和r.v朋^/的快速準確的分子檢測方法。
發(fā)明內(nèi)容針對上述情況，本發(fā)明建立了快速簡便、特異性強、靈敏度高、準確可靠的黑麥草上小麥矮腥黑粉菌(77〃W"c朋加vera"Ktihn，簡稱TCK)、黑麥草腥黑粉菌(7:/o〃/)禾卩7:ra"^,'的三重PCR分子檢測方法，并能將這這三種黑粉菌區(qū)別開來。該方法不僅能夠檢測菌絲基因組DNA，而且可以利用冬孢子三重套式擴增實現(xiàn)對三種腥黑粉菌冬孢子的檢測，節(jié)約了試劑和時間，檢測快速、可靠，整個過程在一個工作日內(nèi)完成，可在口岸檢測中推廣應用。本發(fā)明中收集了7〃^a屬的3種近似種共計ll個菌株(表l，菌絲和冬孢子)，來源于天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心植檢實驗室，LMC353、V767、LMC94、V21-711-l等為交流的冬孢子，其它的實驗材料為本室近年所收集的冬孢子。其中LMC353、LMC94、Xia5、Lpl、Lp2、LpG、V21-711-l使用培養(yǎng)的菌絲體，不能培養(yǎng)出菌絲的V767和TCK2、TCK4、TCK7以及LMC353、LMC94、Lpl、Lp2、LpG、V21-711-1等作為套式三重PCR檢測方法中的冬孢子材料。供試材料的相關信息見表l。具體技術方案如下本發(fā)明目的是提供一種利用PCR引物對多年生黑麥草上的TCK、7:和7:iw^y/進行檢測的方法，這些引物既可以對這三種腥黑粉菌進行檢測，又可以將它們區(qū)分開來，引物的序列和用途如下(1)腥黑粉菌屬(77//幼'a)通用引物，引物序列如下通用外套引物IGSUF1:GGATGCATTCTGGGGACGTIGSUR1:GTAGCCTTGTTGCTACGATCTG通用內(nèi)套引物NIGSUF1:CACCGCCCAAGCACGTACNIGSUR1:GACCTTTTGGGGTCAAACTTCTC通用外套引物用于菌絲基因組DNA或冬孢子套式擴增，擴增片段約為900bp，通用內(nèi)套引物用于冬孢子的套式擴增，擴增片段約為700bp，這兩套引物用于TCK、I和Iv朋一的檢測；(2)TCK、7:/o仿、rv朋^'各自的特異引物和7>朋一的外套引物，引物序列如下TCK的外套引物IGSUF1/IGSUR1TCK的特異引物LSKF:GAAGTTTCCTTCGCCLSKR:ACTTCTCTCGGAACATCACTGT特異引物的擴增片段約為800bp,這兩套引物用于TCK的菌絲基因組DNA特異PCR擴增和冬孢子套式PCR的擴增，7:/o〃/的外套引物IGSUF1/IGSUR17:/o〃/的特異引物LSLF:GGTGGACTGACATTCGTCLSLR:CGCATGTCCGTCGGACCG特異引物的擴增片段約為250bp，這兩套引物用于7:/0///的菌絲基因組DNA特異PCR擴增和冬孢子套式PCR的擴增，Iv""^y/外套引物unF:AACTGTATGGATCATCCAGAGCunR:GTAATGCCAGAGGATTGTCCT7:wmAyi特異引物LSNF:CTCTGTGAGGATATGCCALSNR:GAGAATAACTGTTGTATGATGCCA特異引物的擴增片段約為550bp，這兩套引物用于Iraw^/的菌絲基因組DNA特異PCR擴增和冬孢子套式PCR的擴增；TCK、Z/o///、rv""一三者的特異引物，用于菌絲基因組DNA三重特異性PCR擴增，特異性檢測這三種菌絲體，各自的外套引物與特異引物的三重套式PCR擴增，用于特異性檢測這三種真菌的冬孢子。本發(fā)明的另一個目的是檢測多年生黑麥草上小麥矮腥黑穗菌和黑麥草腥黑粉菌的方法以及12條引物在檢測這三種腥黑粉菌近似種方面提供應用。具體操作歩驟如下(1)實驗材料冬孢子的萌發(fā)和菌絲的培養(yǎng)；(2)菌絲基因組DNA的提取；(3)冬孢子的挑取與破碎；(4)菌絲基因組DNA三重PCR檢測方法的建立；(5)冬孢子三重套式PCR檢測方法的建立。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明建立了快速簡便、特異性強、靈敏度高、準確可靠的黑麥草上TCK、r./o肌、T.ra^^三重PCR分子檢測方法，能將黑麥草上腥黑粉菌近似種TCK、r.to肌、r.wmAyZ區(qū)別開來。采用通用引物實現(xiàn)對實驗過程的檢測，避免了假陰性。該方法不僅能夠檢測菌絲基因組DNA，而且可以利用冬孢子三重套式擴增實現(xiàn)對三種腥黑粉菌冬孢子的同時檢測，節(jié)約了試劑和時間，檢測快速、可靠，整個過程在一個工作R內(nèi)完成，可有效在口岸檢測中推廣應用，特別是冬孢子三重套式擴增實現(xiàn)對TCK、r./o/"、r.wm^y/冬孢子的同時檢測，為直接應用于國內(nèi)外對黑麥草傳帶TCK、r./0///、r.v朋^y/的檢測創(chuàng)造了技術條件。下面結合附圖與具體實施方式對本發(fā)明作進一步詳細描述。圖1:菌絲基因組DNA通用外套引物擴增和特異引物的三重擴增圖2:冬孢子通用引物套式PCR擴增圖3:冬孢子特異弓I物三重套式PCR擴增具體實施方式實施例l:實驗材料冬孢子的萌發(fā)和菌絲的培養(yǎng)實驗涉及的材料包括"7/^"屬的3種近似種共計11個菌株(為菌絲和冬孢子)來源于天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心植檢實驗室，LMC353、V767、LMC94、V21-711-l等為交流的冬孢子，其它的實驗材料為本室近年所收集的冬孢子，其中LMC353、LMC94、Xia5、Lpl、Lp2、LpG、V21-711-l使用培養(yǎng)的菌絲體，不能培養(yǎng)出菌絲的V767和TCK2、TCK4、TCK7以及LMC353、LMC94、Lpl、Lp2、LpG、V21-711-1等作為套式三重PCR檢測方法中的冬孢子材料。相關信息見表l。_表l供試材料_序號真菌名稱#1H備注0.5mLEppendorf離心管中加入適量0.25%的次氯酸鈉溶液，挑取一定數(shù)量的冬孢子放入，用渦旋振蕩器混和，消毒50秒后，以3000轉/分鐘離心l分鐘，立即用微量加樣器吸去上清液，混和與離心處理時間不超過3分鐘，加無菌水離心清洗兩次，將冬孢子沉淀物轉至3%瓊脂平板上，在各自的最適溫度下光照培養(yǎng)。培養(yǎng)20天的菌落，用無菌水沖洗至PDA(馬鈴薯培養(yǎng)基)上，繼續(xù)培養(yǎng)30-45天后，收集大量菌絲供DNA提取。實施例2:菌絲基因組DNA的提取采用上海生工基因組DNA純化試劑盒(編號SK1252)提取菌絲DNA。提取的基因組DNA溶于70pLlxTE中，其余菌絲置-70。C下備用。實施例3:冬孢子的挑取<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>菌菌菌冬冬冬菌菌菌菌冬載玻片上放置lmm見方的蓋玻片，其上滴約0.5^L10xPCR緩沖液(10mmol/LTris-HCl,50mmol/LKCl,1.5mmol/LMgCl2,pH8.3)，用解剖針剌破菌癭，挑取3-10個左右冬孢子置10xPCR緩沖液中，蓋上近似大小的蓋玻片，用鑷子輕輕摩擦蓋玻片，顯微鏡下確認孢子破裂后將疊合的兩片蓋玻片一起放入含4.5pL10xPCR緩沖液的PCR管底部，蓋上管蓋，以不添加冬孢子僅含PCR緩沖液作為陰性對照。實施例4:菌絲基因組DNA三重PCR檢測方法的建立PCR擴增試劑為大連寶生物(TaKaRa)工程公司產(chǎn)品。4.1菌絲基因組DNA通用引物的PCR擴增4丄1反應混合液的配制反應體系為20)aL:10x緩沖液2.0^L(其中含有終濃度為1.5mmol/L的MgCl2)，濃度各為2.5mmol/L的四種dNTP共0.化L，濃度為20pmol/L的引物(IGSUF1/IGSUR1)各為0.2pL，0.2pLTaqDNA聚合酶(5U/pL)，0.5pL模板DNA(約為40ng)，加無菌水至20pL，以陽性質粒作為陽性對照，以添加無菌水為模板作為陰性對照。4丄2PCR反應程序94'C預變性5分鐘；94'C變性30秒，63"C復性30秒，72'C延伸1分鐘，35個循環(huán)；72。C延伸7分鐘。4丄3結果分析對7個菌株的菌絲基因組DNA進行屬通用引物IGSUF1/IGSUR1的擴增，以陽性質粒作為陽性對照，以添加無菌水為模板作為陰性對照。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后均能觀察到特定大小的目的帶，外套通用引物擴增的片段應為900bp，陽性質控和所有的菌絲基因組DNA均能得到特定大小的目的片段，表明該通用引物可以用于三種腥黑粉菌菌絲體的檢測。見圖1。圖1中的18個泳道從左到右分別用1、2、3、4、5、6、7、8、9、M、10、11、12、13、14、15、16、17表示。陰性對照無相應產(chǎn)物，見泳道18，其中1為陽性質粒，28分別為LMC353、LMC94、Xia5、Lpl、Lp2、LpG、V21-711-1,9為陰性對照，M為2000bpDNA分子量標準。4.2菌絲基因組DNA特異引物的三重PCR擴增4.2.1反應混合液的配制多重PCR反應體系為20^L:10x緩沖液2.0i^L(其中含有終濃度為1.5mmol/L的MgCl2)，濃度各為2.5mmol/L的四種dNTP共0.5^L，濃度為20mmol/L的6條引物(LSKF/LSKR、LSLF/LSLR和LSNF/LSNR)各為0.2pL，0.2pLTaqDNA聚合酶(5U/pL)，0.5pL模板DNA(約為40ng)，加無菌水至2(VL，不設置陽性對照。94.2.2PCR反應程序94。C預變性5分鐘；94t:變性20秒，6rC復性20秒，72。C延伸50秒，35個循環(huán)；72'C延伸7分鐘。4.2.3結果分析對7個菌株的菌絲基因組DNA進行三對特異引物(LSKF/LSKR、LSLF/LSLR禾口LSNF/LSNR)的三重PCR擴增，以添加無菌水為模板作為陰性對照。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后均能觀察到特定大小的目的帶。TCK特異引物擴增的片段應為800bp，只有LMC353、Xia5和LMC94顯示800bp的帶(圖1中10~12)。71.va"y^的擴增片段應為550bp，只有Lpl、Lp2、LpG、V21-711-l顯示550bp的目的帶(圖1中13~16)，陰性對照無相應產(chǎn)物(圖1中17)，M為DNA分子量標準(2000bp,1000bp,750bp,500bp)。這一結果表明通過三重PCR擴增可以把TCK、Z/o"/和r.ra"/^/的菌絲體區(qū)別開來。實施例5:冬孢子三重套式PCR檢測方法的建立5.1反應混合液的配制第一輪的反應體系為50pL:濃度各為2.5mmol/L的四種dNTPs共0.5pL，濃度為20pmol/L的引物(IGSUFl/IGSURl和unF/unR)每條各為0.5pL，0.5pLTaqDNA聚合酶(5U/pL)，模板和PCR緩沖液共5pL，加無菌水至50pL，采用陽性質粒作為陽性對照，只添加PCR緩沖液為陰性對照。第二輪的反應體系為20(iL:弓1物NIGSUF1/NIGSUR1的擴增反應體系同實施例4中的4丄1，模板為lpL第一輪擴增產(chǎn)物，設置陽性對照和陰性對照；引物LSKF/LSKR、LSLF/LSLR和LSNF/LSNR三重擴增的反應體系同實施例4中的4丄1，模板為1pL第一輪擴增產(chǎn)物，不設置陽性對照，設置陰性對照。5.2PCR反應程序第一輪PCR的反應程序為94。C預變性5分鐘；94。C變性30秒，56'C復性30秒，72。C延伸l分鐘，25個循環(huán)；72。C延伸7分鐘。第二輪NIGSUF1/NIGSUR1引物的反應程序為94'C預變性5分鐘；94"變性15秒，60'C復性15秒，72"延伸1分鐘，35個循環(huán)；72匸延伸7分鐘。第二輪的三重PCR反應程序為94'C預變性4分鐘；94'C變性5秒，6rC復性2秒，72'C延伸50秒，35個循環(huán)；72"C延伸7分鐘。5.3結果分析挑取10個菌株的3到數(shù)個冬孢子進行兩對外套通用引物的第一輪擴增，然后進行內(nèi)套通用引物和TCK、7Wo///、r.raw^y/特異引物三重套式第二輪擴增，采用陽性質粒作為陽性對照，以不添加冬孢子僅含PCR緩沖液作為陰性對照，擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳和EB染色后均能觀察到特定目的大小帶。內(nèi)套通用引物擴增的片段應為700bp，陽性質控和所有菌株冬孢子經(jīng)兩輪套式擴增均能得到特定大小的目的片段(見圖2)。圖2中的13個泳道從左到右分別用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、M表示。陰性對照無相應產(chǎn)物(圖2，其中l(wèi)為陽性質粒，211分別為LMC353、LMC94、TCK2、TCK4、TCK7、Lpl、Lp2、LpG、V21-711-l、V767，12為陰性對照)，M為DNA分子量標準(2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp)。這一結果表明兩輪套式PCR擴增可以用于三種腥黑粉菌冬孢子的檢測。TCK特異引物擴增的片段應為800bp，只有LMC353、LMC94和TCK2、TCK4、TCK7顯示800bp的目的帶(見圖3)。圖3中的12個泳道從左到右分別用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、M表示。圖3中15泳道分別為LMC353、LMC94、TCK2、TCK4、TCK7，7:v"""'/的擴增片段約為550bp，只有Lpl、Lp2、LpG、V21-711-l顯示出特定大小的目的帶(見圖3中69泳道，69泳道分別為Lpl、Lp2、LpG、V21-711-l)，V767的擴增片段約為250bp，只有V767顯示出特定大小的目的帶(見圖3中10泳道)，以及陰性對照無相應產(chǎn)物(見圖3中11泳道)，M為DNA分子量標準(2000bp,1000bp,750bp，500bp)。這一結果表明通過外套通用引物和三重套式PCR擴增可以把TCK、r.wm^y/和7:/0///的冬孢子區(qū)別丌來。序列列表SEQUENCELISTING<110〉天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心<120>多年生黑麥草上三種腥黑粉菌近似種的檢測方法<130>20080528<160>12<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>1ggatgcattctggggacgt<210>2<211〉22<212>DNA<213>人工合成<400>2gtagccttgttgctacgatctg<210>3<211>18<212>DNA<213>人工合成<400>3caccgcccaagcscgtac<210>4<211>23<212>DNA<213>人工合成<400>4gaccttttggggtcaaacttetc<210>5<211>15<212>DNA19221823<213>人工合成<400>5gaagtttccttcgcc<210>6<211>22<212>DNA<213>人工合成<400>6acttctctcggaacatcactgt<210>7<211>18<212>DNA<213>人工合成<400>7ggtggactgacattcgtc<210〉8<211>18<212>DNA<213>人工合成<400>8cgcatgtccgtcggaccg<210>9<211>22<212>DNA<213〉人工合成<400>9aactgtatggatcatccagagc<210>10<211>21<212>DNA<213>人工合成<400>10gtaatgccagaggattgtcct<210>11<211>18<212>DNA<213>人工合成<400>11說明書第10/11頁1522181822ctctgtgaggatatgcca18<210〉12<211>24<212>DNA<213>人工合成<400>12gagaataactgttgtatgatgcca2權利要求1.一種利用PCR引物對多年生黑麥草(LoliumperenneL.)上的小麥矮腥黑穗菌(TilletiacontroversaKühn，簡稱TCK)、黑麥草腥黑粉菌(T.lolli)和T.vankyi進行檢測的方法，這些引物既可以對這三種腥黑粉菌進行檢測，又可以將它們區(qū)分開來，其特征在于，引物的序列和用途如下(1)腥黑粉菌屬(Tilletia)通用引物，引物序列如下通用外套引物IGSUF1GGATGCATTCTGGGGACGTIGSUR1GTAGCCTTGTTGCTACGATCTG通用內(nèi)套引物NIGSUF1CACCGCCCAAGCACGTACNIGSUR1GACCTTTTGGGGTCAAACTTCTC通用外套引物用于菌絲基因組DNA或冬孢子套式擴增，擴增片段約為900bp，通用內(nèi)套引物用于冬孢子的套式擴增，擴增片段約為700bp，這兩套引物用于TCK、T.lolli和T.vankyi的檢測；(2)TCK、T.lolli、T.vankyi各自的特異引物和T.vankyi的外套引物，引物序列如下TCK的外套引物IGSUF1/IGSUR1TCK的特異引物LSKFGAAGTTTCCTTCGCCLSKRACTTCTCTCGGAACATCACTGT特異引物的擴增片段約為800bp，這兩套引物用于TCK的菌絲基因組DNA特異PCR擴增和冬孢子套式PCR的擴增，T.lolli的外套引物IGSUF1/IGSUR1T.lolli的特異引物LSLFGGTGGACTGACATTCGTCLSLRCGCATGTCCGTCGGACCG特異引物的擴增片段約為250bp，這兩套引物用于T.lolli的菌絲基因組DNA特異PCR擴增和冬孢子套式PCR的擴增，T.vankyi外套引物unFAACTGTATGGATCATCCAGAGCunRGTAATGCCAGAGGATTGTCCTT.vankyi特異引物LSNFCTCTGTGAGGATATGCCALSNRGAGAATAACTGTTGTATGATGCCA特異引物的擴增片段約為550bp，這兩套引物用于T.vankyi的菌絲基因組DNA特異PCR擴增和冬孢子套式PCR的擴增；TCK、T.lolli、T.vankyi三者的特異引物，用于菌絲基因組DNA三重特異性PCR擴增，特異性檢測這三種菌絲體，各自的外套引物與特異引物的三重套式PCR擴增，用于特異性檢測這三種真菌的冬孢子。2.根據(jù)權利要求1所述的一種利用PCR引物對多年生黑麥草ao/Z謂網(wǎng)re朋eL.)上的小麥矮腥黑穗菌(7H/etocoWraw"aKiihn，簡稱TCK)、黑麥草腥黑粉菌(7!和Ira"^y/進行檢測的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)實驗材料冬孢子的萌發(fā)和菌絲的培養(yǎng)；(2)菌絲基因組DNA的提取；(3)冬孢子的挑取與破碎；(4)菌絲基因組DNA三重PCR檢測方法的建立；(5)冬孢子三重套式PCR檢測方法的建立。3.權利要求1所述的一種檢測多年生黑麥草上小麥矮腥黑穗菌、黑麥草腥黑粉菌和Z的方法以及12條引物在檢測這三種腥黑粉菌近似種方面的應用。全文摘要本發(fā)明涉及使用PCR引物檢測禾本科草種多年生黑麥草(LoliumperenneL.)上小麥矮腥黑穗菌(TilletiacontroversaKühn，簡稱TCK)、黑麥草腥黑粉菌(T.lolli)和T.vankyi的方法，屬于禾本科草種腥黑粉菌檢測領域。本發(fā)明自行設計了6套PCR引物，包括通用外套引物、內(nèi)套引物、TCK和T.lolli特異引物以及T.vankyi的外套引物和特異引物。通用外套和內(nèi)套引物用于TCK、T.lolli和T.vankyi基因組DNA或冬孢子套式擴增，進行質量檢測，避免假陰性結果。TCK、T.lolli、T.vankyi各自的特異引物用于菌絲基因組DNA三重特異PCR擴增，可以將三者區(qū)別開來。TCK、T.lolli和T.vankyi各自的外套引物與特異引物三重套式PCR，可以特異性檢測這三種冬孢子。本方法檢測快速，結果可靠，整個檢測過程可在一個工作日內(nèi)完成。文檔編號C12N15/11GK101328496SQ20081005381公開日2008年12月24日申請日期2008年7月11日優(yōu)先權日2008年7月11日發(fā)明者勇劉,劉躍庭,崔鐵軍,芳廖,羅加鳳,黃國明申請人:天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心