專利名稱：白菜雄性育性相關(guān)基因BcPW1及其分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及白菜雄性育性相關(guān)基因 萬c尸W及其分離方法。
背景技術(shù)：
植物雄性不育是指兩性花植物的花粉花藥異常導(dǎo)致花粉功能喪失的現(xiàn)象， 在被子植物中普遍存在。利用植物雄性不育特性來選育雄性不育系是作物雜種 優(yōu)勢利用中簡化制種程序、降低制種成本的重要手段。植物雄性不育產(chǎn)生的機(jī) 理極其復(fù)雜，至今仍不清楚。從發(fā)育分子生物學(xué)角度看，花粉敗育是植物雄性 不育發(fā)生的表型體現(xiàn)。而花粉發(fā)育是一個多步驟復(fù)雜的過程，涉及眾多基因的 表達(dá)調(diào)控。隨著實(shí)驗(yàn)方法的不斷改進(jìn)，近年來已經(jīng)分離鑒定了眾多花粉表達(dá)基 因(Becker et a7. ， 2003; Lee and Lee' 2003; Honys and Twell， 2003, 2004: Pina W s人2005)。然而，在日漸累積的已鑒別的花粉表達(dá)基因中，大部分是 功能未知的。例如在已經(jīng)精確定位的模式植物擬南芥的30 OOO個基因中，有50% 為功能未知，盡管其中任何一個都可能和與某個農(nóng)藝學(xué)性狀相關(guān)(Parkin 2005)，但功能未知即阻礙了其在生產(chǎn)中的應(yīng)用?；ǚ壑羞@些未知功能的基因可 能編碼新的在花粉和花藥發(fā)育中起作用的蛋白質(zhì)。因此，對這些新基因進(jìn)行進(jìn) 一步研究，不僅將豐富對花粉發(fā)育相關(guān)基因的認(rèn)識，有助于深入理解花粉發(fā)育 及雄性不育產(chǎn)生的分子機(jī)理，同時也為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中利用基因工程進(jìn)行育種實(shí) 踐奠定了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明提供了一種白菜雄性育性相關(guān)基因 ^:尸f7及其分離方法。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的 一種白菜雄性育性相關(guān)基因"c/T厶它包含SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列。
進(jìn)一步地，所述核苷酸序列還包括在SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列中添 加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸生成的突變體、等位基因和衍生物。
一種權(quán)利要求1所述的白菜雄性育性相關(guān)基因萬c尸W的分離方法，包括以
下步驟
(1) Be-A17T17片段的分離用A17/T17引物對白菜a力fi^ 7ca力97-W^5'的不育株系與可育株系花蕾基因表達(dá)差異進(jìn)行cDNA-AFLP分析，檢測 到在可育株系花蕾中特異表達(dá)的基因條帶Be-A7T17,用手術(shù)刀片割下聚丙烯 酰胺凝膠上的差異片段，溶于100化TE，并作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，條件與 cDNA-AFLP中的預(yù)擴(kuò)增相同；PCR產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)凝膠回收試 劑盒純化；回收產(chǎn)物連接到pGEM-T Easy Vector (Promega)并轉(zhuǎn)化到A co" DH5a感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選重組質(zhì)粒，測序，最后RT-PCR驗(yàn)證得到該
條帶的核苷酸序列；
(2) Be-A17T17片段相關(guān)的基因的cDNA的3，末端和5，末端擴(kuò)增根 據(jù)雙鏈cDNA合成試劑盒中接頭及引物特征設(shè)計(jì)3' RACE和5' RACE錨定引物 P3和P5;根據(jù)差異片段Be-A17T17設(shè)計(jì)正向特異引物Sl和反向特異引物Al， 正向特異引物SI與錨定引物P3擴(kuò)增3'末端，反向特異引物Al與錨定引物 P5擴(kuò)增5'末端；錨定引物P5的序列為5， -MGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3，； 錨定引物P3的序列為5， -GAGGCGGCCGACATGTTTTT-3，；正向特異引物Sl序 列為5， -GTTCTACTTCTACATCAGACTCC-3，；反向特異引物Al序列為5， -TTACTAGTTTGCCMCTTGGTGMG-3， ； PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA凝膠回收試劑盒回收，插入 pGEM-T Easy載體，轉(zhuǎn)化DH 5 a感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選陽性克隆，堿裂解法 抽提質(zhì)粒，酶切鑒定后，重組質(zhì)粒送上海博亞生物技術(shù)有限公司測序，得到 Be-A17T17片段相關(guān)的基因的cDNA的3'末端和5'末端；
(3) ^7,W基因的全長克隆根據(jù)兩端拼接的cDNA全長序列設(shè)計(jì)特異 引物Tl和T2，所述Tl序列為5， -GCGTCTAGAGAGGTCATTCAATTC-3，，和T2 序列為5' -A TAGGATCCATAGGTCGGTCAATA-3';常規(guī)PCR方法再次從花蕾cDNA 中擴(kuò)增Bc-A17T17片段相關(guān)基因的cDNA序列；用同一特異引物對在基因組DNA 中擴(kuò)增得到其DNA序列SEQ ID No. 2。
本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明采用cDNA-AFLP技術(shù)對 <矮腳黃'白菜核不 育兩用系的不育株系與可育株系花蕾基因表達(dá)差異進(jìn)行分析，同時配合RACE 技術(shù)分離獲得與花粉壁發(fā)育相關(guān)基因^c/T厶為進(jìn)一步弄清不育株系花粉敗育的原因，以及闡明植物花粉發(fā)育和雄性不育發(fā)生的分子機(jī)制提供研究基礎(chǔ)， 進(jìn)而為人工創(chuàng)建不育材料、培育優(yōu)良品種提供物質(zhì)條件。


圖1白菜5c/T7 cDNA和DNA全長序列的擴(kuò)增電泳圖； 圖2白菜BcPWl氨基酸序列結(jié)構(gòu)域分析示意圖； 圖3白菜"c/^7表達(dá)的原位雜交分析觀察圖； 圖4萬cPW RNAi表達(dá)載體示意圖5通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得轉(zhuǎn)^C尸訂干涉基因菜心植株觀察圖6轉(zhuǎn)5c尸/ 7干涉基因菜心的X-Gluc組織化學(xué)染色檢測圖； 圖7 Northern雜交檢測在轉(zhuǎn)基因菜心植株中的表達(dá)電泳圖； 圖8轉(zhuǎn)干涉基因菜心^^-力c/w7的花粉離體萌發(fā)觀察圖； 圖9轉(zhuǎn)萬c/T7干涉基因菜心^9-的花粉掃描電鏡觀察圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明通過基因表達(dá)差異分析從白菜W/^/5" Wcw:^/-^^/^的可育株 系花蕾中分離得到一個可育花蕾特異表達(dá)的基因^c/^厶序列比對表明該基因 為一個新的功能未知基因。原位雜交表明，萬c/T7在小孢子及絨氈層細(xì)胞中表達(dá)。 通過RNA干涉(RNAi)技術(shù)，將^c/^的干涉基因片段導(dǎo)入正?？捎陌撞思?xì) 胞，驗(yàn)證了該基因的功能。在內(nèi)源及，/^的表達(dá)受阻斷的轉(zhuǎn)基因植株中，花粉 的正常萌發(fā)受到嚴(yán)重影響，75%左右的花粉不能正常萌發(fā)，約15.6%的花粉能長 出花粉管，但花粉管長到一定長度時頂端爆裂，正常萌發(fā)率只有10.5%。根據(jù) ^:/^7預(yù)測蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征及其在早期絨氈層細(xì)胞和小孢子中共表達(dá)的特點(diǎn)， 認(rèn)為其可能作用于細(xì)胞壁發(fā)育過程中絨氈層與花粉的信號傳遞過程。的克 隆和功能鑒定，有助于闡明花粉發(fā)育和植物雄性不育產(chǎn)生的分子機(jī)理，對生產(chǎn) 上人為控制植物育性，利用基因工程手段培育優(yōu)良品種具有重要的實(shí)踐意義。 實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體技術(shù)步驟如下 1.白菜&/￥/基因的分離和序列分析
利用cDNA-AFLP技術(shù)分析白菜Wca力P7-^M/5'的不育株系與可 育株系花蕾基因表達(dá)差異，篩選到A17/T17引物擴(kuò)增得到的在可育株系花蕾中特異表達(dá)的基因片段Bc-A17T17，長259 bp，具體序列見SEQ ID No. 1。通 過RACE技術(shù)擴(kuò)增得到該片段相關(guān)基因的cDNA的5'末端(圖1A泳道l)和3， 末端(圖1A泳道2)，并經(jīng)克隆酶切鑒定(圖1B泳道1、 2分別為3， RACE產(chǎn) 物和單克隆酶切鑒定，泳道3、 4分別為5' RACE產(chǎn)物和單克隆酶切鑒定)。根 據(jù)兩端拼接的cDNA全長序列設(shè)計(jì)引物，常規(guī)PCR方法擴(kuò)增Bc-A17T17片段相 關(guān)基因的cDNA序列(圖1C泳道1)及其DNA序列(圖1C泳道4)，經(jīng)克隆和 酶切鑒定(圖1C泳道2、 3為cDNA不同單克隆酶切鑒定結(jié)果，泳道5為DNA 單克隆酶切鑒定結(jié)果)，測序結(jié)果表明cDNA全長1 609 bp， DNA序列全長2 021 bp，命名為j c/T厶具體序列見SEQIDNo. 2。利用生物信息學(xué)軟件分析5c尸訂， 發(fā)現(xiàn)該基因包含3個內(nèi)含子和4個外顯子，最大開放閱讀框?yàn)閘 305 bp，編碼 434個氨基酸。推導(dǎo)的氨基酸序列具有可能與細(xì)胞增殖、分化和程序性細(xì)胞死 亡(PCD)相關(guān)的蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)(圖2標(biāo)注5)，參與調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 相關(guān)的蛋白激酶的酪氨酸磷酸化位點(diǎn)(圖2標(biāo)注6)，及其它與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn) 導(dǎo)、蛋白定位以及黏附等過程有關(guān)的位點(diǎn)(圖2標(biāo)注廣4分別為氨基化合物 位點(diǎn)；N-糖基化位點(diǎn)；酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)；N-豆蔻酰化位點(diǎn))。通過 PredictProtein預(yù)測"c戶訂編碼蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，表明該蛋白含44. 5%的 a螺旋、11.1%的3折疊和44.5%的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。并在N端具有一段信號肽，推
測其為分泌蛋白。
2. Sc/T7的時空表達(dá)特點(diǎn)分析
利用原位雜交技術(shù)分析了在不同發(fā)育階段的花蕾中的表達(dá)情況。結(jié) 果顯示在剛分化的花粉母細(xì)胞和絨氈層細(xì)胞中即出現(xiàn)萬c尸W的表達(dá)信號(圖3A), 隨后在減數(shù)分裂時期的小孢子和絨氈層中表達(dá)量進(jìn)一步提高，且發(fā)現(xiàn)在絨氈層 中的表達(dá)比在小孢子中的表達(dá)稍強(qiáng)(圖3B)，在四分體時期(圖3C)、單核小孢 子時期(圖3D)的小孢子和絨氈層中繼續(xù)存在，但表達(dá)量有所降低，在花粉成 熟期已經(jīng)檢測不到及:/^/的表達(dá)信號(圖3E)。在所有被檢測的花蕾的萼片、花 瓣、中柱及雌蕊中沒有檢測到及^釘?shù)谋磉_(dá)。用正義探針進(jìn)行雜交的對照中亦 沒有檢測到表達(dá)信號(圖3F)。這些結(jié)果說明及^W在花粉花藥發(fā)育的早期就開 始表達(dá)，在花粉成熟晚期表達(dá)逐漸減弱并消失。
3. 利用RNAi技術(shù)驗(yàn)證Ac/W/的功能
構(gòu)建含白菜BcA9組織特異型啟動子的及^W干涉基因表達(dá)載體(圖4),通 過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入菜心(白菜的一個變種)植株，通過菜心無菌苗的培養(yǎng)(圖 5A)、菜心子葉-子葉柄外植體的預(yù)培養(yǎng)(圖5B)、共培養(yǎng)(圖5C)、分化培養(yǎng)(圖5D)誘導(dǎo)KaW苗的產(chǎn)生及在無菌瓶中生長擴(kuò)繁(圖5E)、生根培養(yǎng)(圖5F)、移 栽前煉苗(圖5G)、移栽誘導(dǎo)開花(圖5H)等一系列過程，獲得萬c尸釘基因的 轉(zhuǎn)基因植株T。代，命名為^^-Z^/ W。經(jīng)X-Gluc組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因菜心植 株^9-6"W的花藥被染成藍(lán)色(圖6A、 C、 E)、而非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓甑幕ㄋ幉?未有藍(lán)色斑點(diǎn)顯現(xiàn)(圖6 B、 D、 F)，同時，轉(zhuǎn)基因植株的葉片(圖6 G)和非 轉(zhuǎn)基因植株的葉片(圖6H)均未被染成藍(lán)色，說明報(bào)告基因6KS"在轉(zhuǎn)基因植株 的花藥中特異表達(dá)，同時預(yù)示及:/^/干涉基因片段也隨之在轉(zhuǎn)基因植株的花藥 中得到表達(dá)。PCR、 Southern雜交同時也表明萬c尸F(xiàn)7干涉基因已經(jīng)整合到轉(zhuǎn)基因 植株的染色體。進(jìn)一步的Northern雜交檢測發(fā)現(xiàn)，基因在轉(zhuǎn)基因植株中 的表達(dá)受到了明顯抑制，如圖7所示，與陽性對照植株可育株系'及，s^W7-W^ (B line)和空載體轉(zhuǎn)化植株(erap-tra)相比，在轉(zhuǎn)基因植株的花 (F)和花蕾(B)中；5c尸W基因的表達(dá)都受到了明顯抑制，與陰性對照不育系 7cajM7-W( (A line)不表達(dá)基因的情況類似。由此，我們獲得了 9個轉(zhuǎn)化芽系、63株轉(zhuǎn)化植株。同時獲得了空載體轉(zhuǎn)化植株，作為后期相關(guān)檢 測的對照。
內(nèi)源及^W的表達(dá)受阻斷的轉(zhuǎn)基因植株移栽后的生長狀況和形態(tài)觀察顯示， 轉(zhuǎn)基因植株j^-化p^營養(yǎng)生長正常，并且能正常開花，與空載體轉(zhuǎn)化植株和非 轉(zhuǎn)基因植株均沒有明顯差異，萼片、花瓣、雌蕊、雄蕊、蜜腺等花器官的發(fā)育 也與空載體轉(zhuǎn)化植株及非轉(zhuǎn)基因植株沒有明顯區(qū)別。但離體萌發(fā)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)75% 左右的花粉不能正常萌發(fā)，約15.6%的花粉能長出花粉管，但花粉管長到一定長 度時頂端爆裂(圖8B、 D),正常萌發(fā)率只有10.5% (圖8E)。說明萬c戶W表達(dá)受 抑制影響了花粉的正常萌發(fā)。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)^^-力cpr/花粉近10(m畸形。與 正常的橢圓形、網(wǎng)紋清晰、三條萌發(fā)溝均勻分布的非轉(zhuǎn)基因植株花粉(圖9 E、 F)相比，力9-的花粉不飽滿、形狀不規(guī)則，網(wǎng)紋淺、模糊，且萌發(fā)溝的數(shù) 目及分布沒有規(guī)律，呈現(xiàn)各種各樣的畸形(圖9A D)，造成花粉不能完成正常 的生物學(xué)功能。根據(jù)萬c尸釘預(yù)測蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征及其在早期絨氈層細(xì)胞和小 孢子中共表達(dá)的特點(diǎn)，認(rèn)為其可能作用于細(xì)胞壁發(fā)育過程中絨氈層與花粉的信 號傳遞過程，該基因的表達(dá)阻斷將引起植物雄性育性的顯著下降。
結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本
發(fā)明而不用于限制本發(fā)明范圍。 實(shí)施例l 5c/T7基因的分離和克隆
(1) Bc-A17T17片段的分離用A17/T17引物對白菜a^ OK1 Wc^iW/-W4/"的不育株系與可育株系花蕾基因表達(dá)差異進(jìn)行cDNA-AFLP分析，檢測 到在可育株系花蕾中特異表達(dá)的基因條帶Bc-A7T17，用手術(shù)刀片割下聚丙烯 酰胺凝膠上的差異片段，溶于100MLTE (10mmol.L-'Tris, pH 7. 5， 1 mmol丄-1 EDTA， pH8.0)，并作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，條件與cDNA-AFLP中的預(yù)擴(kuò)增相 同。PCR產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)凝膠回收試劑盒純化?；厥债a(chǎn)物連接 到pGEM-T Easy Vector (Promega)并轉(zhuǎn)化到f. DH 5 a感受態(tài)細(xì)胞，
經(jīng)藍(lán)白斑篩選重組質(zhì)粒，測序，最后RT-PCR驗(yàn)證得到該條帶的核苷酸序列。
(2) Bc-A17T17片段相關(guān)的基因的cDNA的3'末端和5，末端擴(kuò)增根 據(jù)雙鏈cDNA合成試劑盒(SMART PCR cDNA Synthesis Kit)中接頭及引物的 特征設(shè)計(jì)了 3' RACE和5' RACE錨定引物P3和P5;根據(jù)差異片段Bc_A17T17 設(shè)計(jì)正向特異引物S1，與錨定引物P3擴(kuò)增3'末端，反向引物A1與錨定引物 P5擴(kuò)增5'末端。錨定引物P5的序列為5' -MGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'; 錨定引物P3的序列為5， -GAGGCGGCCGACATGTTTTT-3，;正向特異引物S1序 列為5， -GTTCTACTTCTACATCAGACTCC-3，；反向特異引物Al序列為5， -TTACTAGTTTGCCMCTTGGTGMG-3， 。 PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA凝膠回收試劑盒回收，插入 pGEM-T Easy載體，轉(zhuǎn)化DH 5 a感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選陽性克隆，堿裂解法 抽提質(zhì)粒，酶切鑒定后，重組質(zhì)粒送上海博亞生物技術(shù)有限公司測序，得到 Bc-A17T17片段相關(guān)的基因的cDNA的3'末端和5'末端。
(3) ^:尸/T7基因的全長克隆根據(jù)兩端拼接的cDNA全長序列設(shè)計(jì)特異引 物T1 (序列為5' -GCGTCTAGAGAGGTCATTCAATTC-3，)和T2 (序列為5， -A TAGGATCCATAGGTCGGTCAATA-3')。常規(guī)PCR方法再次從花蕾cDNA中擴(kuò)增Bc-A17T17片段相關(guān)基因的cDNA序列；用同一特異引物對在基因組DNA中擴(kuò)增得 到其DNA序列。
實(shí)施例2利用RNAi技術(shù)驗(yàn)證及:/W/的功能
(1)正義及反義片段的分離根據(jù)5c/^/ DNA全長序列及植物雙元載體 pBI121的多克隆酶切位點(diǎn)，在及7/T2序列內(nèi)部第1個堿基至第583個堿基之間 設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增583 bp序列作為正義基因片段(包含一段外顯子序列和一段內(nèi) 含子序列)。PCR引物分別含有和S』I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(下劃線部分) 及三個保護(hù)堿基，Sc/W-iX5 : 5， ~GCGTCTAGAGAGGTCATTCAATTC-3 ，， ^:/T卜iB3I: 5， -ATAGGATCC GCCCAGTCAGGAGTATM-3'。在及:尸W序列內(nèi)部第1 個堿基至第426個堿基之間設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增426bp序列作為反義基因片段，PCR 引物分別含有5^3 I和萬』I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(下劃線部分)及三個保護(hù)堿基，^7尸F(xiàn)/-iS5 : 5' -ATACCCGGGGAGGTCATTCAATTCAT-3' ， "c/W/-iB3E : 5, -CTAGGATCCCCTTCCAATAGCAAA AGA-3 ，。陽性克隆質(zhì)粒分別命名為pTBcPWliS 和pTBcPWliA。
(2)干涉表達(dá)載體的構(gòu)建將陽性克隆質(zhì)粒pTBcPWliS和pTBcPWliA分別 進(jìn)行Aa I和^v7fi I、 5』I和5^a I雙酶切，PCR產(chǎn)物在1. 5%的瓊脂糖凝膠 中電泳分離后，回收目的片段。取上述制備好的的及^W正義和反義基因片段、 BcA9啟動子和經(jīng)歷; c/ III和萬a/zH I雙酶切的pBI121以摩爾比1 : 1 : 1 : 1混 合，用T4DNA連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌涂 于含Kan 50 mg'l/1的固體LB培養(yǎng)基平板上，37。C培養(yǎng)過夜。挑取單菌落，在5 mL含Kan 50 mg'L—1的液體LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)過夜，堿裂解法抽提其質(zhì)粒DNA， 采用PCR和限制性內(nèi)切酶酶切等方法鑒定陽性克隆。陽性克隆質(zhì)粒命名為 pBIBcA9-BcPWli。
(3)干涉表達(dá)載體對菜心的遺傳轉(zhuǎn)化將上述構(gòu)建好的植物表達(dá)載體 pBIBcA9-BcPWli質(zhì)粒通過凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404，菜心的遺傳轉(zhuǎn)化通過組 織培養(yǎng)途徑實(shí)現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)以子葉-子葉柄為外植體，把子葉柄插入預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基 中2 3 mm深，培養(yǎng)3 d，農(nóng)桿菌侵染后平放入共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2 d。 將共培養(yǎng)2 d后的菜心子葉-子葉柄外植體轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上，大約20 d左右， 待分化出的抗性芽長到一定大小，小心從基部將其切下轉(zhuǎn)入到新的分化培養(yǎng)基 上繼續(xù)生長。得到的抗性芽在分化培養(yǎng)基上繼代并篩選，每20d左右轉(zhuǎn)瓶一次， 去除其中的假陽性植株。待抗性植株長到2 3 cm時，將其從愈傷組織切下， 轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上。待抗性植株在生根培養(yǎng)基上長出大量白色的須狀根時，打 開瓶口煉苗2 3 d，小心去除根上的培養(yǎng)基，移入含水量為60%的培養(yǎng)土中， 保濕培養(yǎng)5 7天后，再轉(zhuǎn)到室外培養(yǎng)。
轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)PCR檢測、Southern及Northern印跡雜交檢測，篩選獲得 萬c尸W基因表達(dá)沉默和受抑制的轉(zhuǎn)基因植株^^-6c/7W。
(4)轉(zhuǎn)基因植株的形態(tài)和細(xì)胞學(xué)觀察體外檢測花粉萌發(fā)情況,用于花粉離 體萌發(fā)的半固體培養(yǎng)基組成為15%蔗糖+0.4mmol L-1硼酸+0.4mmol L-l CaM)3 + 0. 1%瓊脂。采集花朵的時間均為上午9:00左右，每株采5朵花藥剛裂開 的花，采后先將花粉抖落到硫酸紙上，充分混勻，將其點(diǎn)涂在載玻片上的培養(yǎng) 基中，不加蓋玻片，將載玻片置于鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，置于黑暗、20 ~ 25°C 恒溫條件下培養(yǎng)，4 6 h后在顯微鏡下觀察萌發(fā)率。掃描電鏡觀察花粉形態(tài)， 采剛開放的花朵，用鑷子夾持花藥將花粉輕輕地涂在貼有雙面膠的金屬載物臺-40型掃描電鏡下觀察花粉形狀、飽滿程度及表面網(wǎng)紋，拍照。
最后，還需注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的一個具體實(shí)施例。顯然， 本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本 發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。序列表
〈110〉浙江大學(xué)
〈120〉白菜雄性育性相關(guān)基因BcPWl及其分離方法
〈160> 2
〈170〉 Patentln version 3.1
〈210〉 1
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〈212〉 DNA
〈213〉 Brassica rapa
〈400〉 1
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〈400〉 2
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acatccaig犯gtga^tgeitteitttttgtggtg202權(quán)利要求
1、一種白菜雄性育性相關(guān)基因BcPW1，其特征在于它包含SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的白菜雄性育性相關(guān)基因及:尸W，其特征在于所 述核苷酸序列還包括在SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或 缺失一個或多個核苷酸生成的突變體、等位基因和衍生物。
3、 一種權(quán)利要求1所述的白菜雄性育性相關(guān)基因A:尸f7的分離方法，其特 征在于包括以下步驟(1) Be-A17T17片段的分離用A17/T17引物對白菜a力^51 Wcs^W7-W力/"'的不育株系與可育株系花蕾基因表達(dá)差異進(jìn)行cDNA-AFLP分析，檢測 到在可育株系花蕾中特異表達(dá)的基因條帶Bc-A7T17，用手術(shù)刀片割下聚丙烯 酰胺凝膠上的差異片段，溶于100ATE，并作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，條件與 cDNA-AFLP中的預(yù)擴(kuò)增相同；PCR產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)凝膠回收試 劑盒純化；回收產(chǎn)物連接到pGEM-T Easy Vector (Promega)并轉(zhuǎn)化到A co7j' DH5a感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選重組質(zhì)粒，測序，最后RT-PCR驗(yàn)證得到該 條帶的核苷酸序列。(2) Be-A17T17片段相關(guān)的基因的cDNA的3，末端和5，末端擴(kuò)增根 據(jù)雙鏈cDNA合成試劑盒中接頭及引物特征設(shè)計(jì)3' RACE和5' RACE錨定引物 P3和P5;根據(jù)差異片段Bc-A17T17設(shè)計(jì)正向特異引物Sl和反向特異引物Al， 正向特異引物Sl與錨定引物P3擴(kuò)增3'末端，反向特異引物Al與錨定引物 P5擴(kuò)增5'末端；錨定引物P5的序列為5' -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3，； 錨定引物P3的序列為5， -GAGGCGGCCGACATGTTTTT-3';正向特異引物S1序 列為5， -GTTCTACTTCTACATCAGACTCC-3，；反向特異引物Al序列為5，-TTACTAGTTTGCCAACTTGGTGMG-3， ； PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA凝膠回收試劑盒回收，插入 pGEM-T Easy載體，轉(zhuǎn)化DH 5 a感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選陽性克隆，堿裂解法 抽提質(zhì)粒，酶切鑒定后，重組質(zhì)粒送上海博亞生物技術(shù)有限公司測序，得到 Bc-A17T17片段相關(guān)的基因的cDNA的3'末端和5'末端。(3)及Wf7基因的全長克隆根據(jù)兩端拼接的cDNA全長序列設(shè)計(jì)特異引物 T1和T2，所述T1序列為5， -GCGTCTAGAGAGGTCATTCMTTC-3，，和T2序列為 5' -A TAGGATCCATAGGTCGGTCMTA-3，；常規(guī)PCR方法再次從花蕾cDNA中擴(kuò)增 Be- A17T17片段相關(guān)基因的cDNA序列；用同一特異引物對在基因組DNA中擴(kuò) 增得到其DNA序列SEQ ID No. 2。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種白菜雄性育性相關(guān)基因BcPW1及其分離方法。本發(fā)明還公開了含有BcPW1基因干涉片段的質(zhì)粒及獲得該質(zhì)粒的方法、一種BcA9組織特異型啟動子的含該質(zhì)粒的植物表達(dá)載體，以及利用此表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞獲得花粉發(fā)育異常、雄性育性降低的植物和對植物雄性育性進(jìn)行改造的方法。BcPW1基因可能作用于細(xì)胞壁發(fā)育過程中絨氈層與花粉的信號傳遞過程。該基因的分離克隆及功能驗(yàn)證，有助于闡明花粉發(fā)育和植物雄性不育產(chǎn)生的分子機(jī)理，對生產(chǎn)上人為控制植物育性，利用基因工程手段培育優(yōu)良品種具有重要的實(shí)踐意義。
文檔編號C12N15/29GK101319217SQ20081006057
公開日2008年12月10日 申請日期2008年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月28日
發(fā)明者葉意群, 張愛紅, 張?jiān)コ? 曹家樹, 鸝 黃 申請人:浙江大學(xué)