專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種用農(nóng)桿菌生產(chǎn)瓜類(lèi)轉(zhuǎn)基因植物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于植物轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域，具體的講，就是在用農(nóng)桿菌侵染瓜類(lèi)作物的外植體的時(shí)候如何防止在以后培養(yǎng)過(guò)程中農(nóng)桿菌菌株污染這些外植體的方法。
背景技術(shù)：
：用農(nóng)桿菌菌株在一定條件下侵染受傷植物組織，通過(guò)改造的農(nóng)桿菌菌株能把自身的T-DNA或其它外源基因插入到目標(biāo)植物組織中的基因組中，從而產(chǎn)生新的再生植株，這項(xiàng)技術(shù)在植物基因工程中被大量運(yùn)用。但是，川農(nóng)桿菌菌株和植物組織共培養(yǎng)后，必然要經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)而分化出愈傷組織及轉(zhuǎn)基因小苗，在浸染后的抗性芽篩選培養(yǎng)過(guò)程中，農(nóng)桿菌污染是影響植物基因轉(zhuǎn)化成功率的一個(gè)重要方面。農(nóng)桿菌污染不僅影響植物組織的生長(zhǎng)，甚至導(dǎo)致抗性轉(zhuǎn)基因苗的死亡，同時(shí)不斷的繼代培養(yǎng)也增加工作量，加劇了真菌污染的機(jī)會(huì)。本發(fā)明提供一種新的方法，可以有效防止或減少在以后農(nóng)桿菌菌株和植物組織共培養(yǎng)中造成對(duì)植物組織的污染而使轉(zhuǎn)基因獲得成功。
發(fā)明內(nèi)容為了解決現(xiàn)有的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種新的方法，可以減少農(nóng)桿菌在共培養(yǎng)或侵染培養(yǎng)后的污染，從而大大提高轉(zhuǎn)化效率和成功率。本發(fā)明提供的方法包括讓農(nóng)桿菌在10-3(TC下與瓜類(lèi)植物外植體侵染培養(yǎng)5-30分鐘后再進(jìn)行共培養(yǎng)和分化培養(yǎng)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，農(nóng)桿菌與瓜類(lèi)的子葉侵染培養(yǎng)的溫度為10-20°C，時(shí)間為10-15分鐘。在此溫度下的讓農(nóng)桿菌侵染瓜類(lèi)植物的子葉可以大大降低對(duì)外植體的污染，提高轉(zhuǎn)化效率，增加成活率。較優(yōu)的，侵染培養(yǎng)的溫度為10-15°C。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，植物組織為西瓜子葉，或部分子葉組織，這^子葉最好是先經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的預(yù)培養(yǎng)，然后再把帶有傷口的子葉與農(nóng)桿菌一起進(jìn)行侵染培養(yǎng)。較優(yōu)選的，農(nóng)桿菌的濃度為OD=0.5-0.8,較優(yōu)的，農(nóng)桿菌的濃度為OD=0.5。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，侵染培養(yǎng)的時(shí)間為10-15分鐘，農(nóng)桿菌為懸浮狀溶液，與西瓜子葉或部分子葉處于運(yùn)動(dòng)狀態(tài)中，在進(jìn)行侵染培養(yǎng)后，除去子葉表面附著的農(nóng)桿菌菌液。除去的方法可以使用濾紙吸干表面的液體。農(nóng)桿菌是產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物有效的載體工具之一，通過(guò)增加或減少一些基因片斷構(gòu)建不同功能的質(zhì)粒，并把質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中去。一般本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員都可以根據(jù)不同的要求來(lái)構(gòu)建含有特殊基因片段的農(nóng)桿菌菌株。許多構(gòu)建成功的質(zhì)粒己經(jīng)商品化或在學(xué)術(shù)交流中無(wú)償通用。關(guān)于如何把質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中去以及如何構(gòu)建質(zhì)粒不是本發(fā)明的重點(diǎn)，該技術(shù)為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員公知的技術(shù)。外植體是指由活植物體上切取下來(lái)以進(jìn)行培養(yǎng)的那部分組織或器官，可以是子葉，根，花等等。有益效果本發(fā)明所提供的方法可以有效減少農(nóng)桿菌對(duì)瓜類(lèi)植物外植體在侵染后培養(yǎng)過(guò)程中的污染，從而減少外外植體在后續(xù)培養(yǎng)或轉(zhuǎn)化過(guò)程的死亡，增加獲得轉(zhuǎn)基因植物的機(jī)會(huì)，降低生產(chǎn)成本，提高轉(zhuǎn)化效率。圖1，本發(fā)明實(shí)驗(yàn)所用農(nóng)桿菌菌株EHA105所含雙元載體PBI121質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)。具體實(shí)施方式實(shí)驗(yàn)為了進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的效果和實(shí)施方式，現(xiàn)以實(shí)驗(yàn)加以說(shuō)明。這些具體的實(shí)施例子僅僅是在不違背本發(fā)明精神下的有限列舉，并不排除本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員把現(xiàn)有技術(shù)和本發(fā)明結(jié)合而產(chǎn)生的其他具體的實(shí)施方實(shí)驗(yàn)一用農(nóng)桿菌侵染西瓜子葉(l(TC)一，材料培養(yǎng)基配方按照下表配置MS基本固體培養(yǎng)基(表一)。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>MS基本液體培養(yǎng)基。與固體培養(yǎng)基相比，液體培養(yǎng)基不含有瓊脂。YEB基本培養(yǎng)基的準(zhǔn)備。分別稱(chēng)取牛肉浸膏(Beefextract)5g，酵母提取物(Yeastextract)lg,多聚蛋白胨(Polypeptone)5g，蔗糖5g，瓊脂5g，加水定容至1000mL，調(diào)pH至7.2，滅菌后待用。使用時(shí)再加1MMgS04'7H202mL/L。兩瓜品種早佳農(nóng)桿菌菌株EHA105如圖1所示為本實(shí)驗(yàn)所使用的農(nóng)桿菌菌株EHA105，它含有雙元載體PBI21質(zhì)粒，包含植物抗性選擇標(biāo)記新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因NptII，和報(bào)fr基閔e-葡糖苷(gusA)。.:，方法1)西瓜種子消毒并培養(yǎng)無(wú)菌苗取籽粒飽滿(mǎn)的種子去殼后用70%的酒精消毒1min，用無(wú)菌水洗3次，再用20%的次氯酸鈉消毒10-15min，無(wú)菌水洗3次，然后在無(wú)菌水里25。C振蕩l一2h。消毒后的種子在MS(蔗糖的濃度為2%)培養(yǎng)基上25。C黑暗培養(yǎng)2-3天，待90%露白后，放入16/8光照/黑暗2000lx的光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)2天左右直到子葉變成淡綠色。2)預(yù)培養(yǎng)(啟動(dòng)培養(yǎng))取出無(wú)菌苗切取其子葉，切除小部分葉頂，子葉較大時(shí)也可切除子葉葉緣，制造傷口，然后沿子葉柄縱切成兩半，用刀尖在葉片上制造適量傷口，葉背朝下放在預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS+6-BA1.0mg/L)上黑暗培養(yǎng)2天，葉片變黃綠色，柄部及傷口處膨大時(shí)，準(zhǔn)備待用。3)農(nóng)桿菌的培養(yǎng).-70°。冷凍保存的農(nóng)桿菌￡^105:^81121活化后，在試管中加入含有50mg/L卡那霉素(Km)，50mg/L鏈霉素的YEB培養(yǎng)基5ml，28'C進(jìn)行少量搖菌，至OD600二0.8-1.0，然后吸取1ml菌液加入不含抗生素的YEB培養(yǎng)基上大量培養(yǎng)至OD600=0.5。取10ml的菌液1000rpm離心10min，棄上清，用液體MS培養(yǎng)基(除了無(wú)瓊脂外，其它配方與表一的MS配方相同，)清洗沉淀2次，再用等體積的液體MS培養(yǎng)基懸浮沉淀，加入乙酰丁香酮(AS)至終濃度為200Ug/L。待用。勺轉(zhuǎn)化步驟侵染培養(yǎng)預(yù)培養(yǎng)后外植體與含有AS的農(nóng)桿菌懸浮液混合，在搖床上(轉(zhuǎn)速為120r/min)l(TC振蕩培養(yǎng)10min，棄多余農(nóng)桿菌，用無(wú)菌濾紙吸干外植體上多余菌液，共培養(yǎng)然后放入固體共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS+6陽(yáng)BA1.0mg/L+AS200ug/L)，28r黑暗培養(yǎng)2-3天，然后轉(zhuǎn)入芽篩選培養(yǎng)基(MS+BA3.0mg/L-[IAAO.lmg/L+Km100mg/L)誘導(dǎo)抗性叢芽。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA(6-芐氨基嘌呤)，IAA(3-吲哚乙酸)5)抗性叢芽和生根把經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)的外植體放入芽篩選培養(yǎng)基中，25i:培養(yǎng)16/8光照/黑暗2000lx。培養(yǎng)2周后繼代培養(yǎng)，每繼代一次減少培養(yǎng)基中6-BA含量1.0mg/L，減少芽的玻璃化，并統(tǒng)計(jì)產(chǎn)生芽的個(gè)數(shù)。產(chǎn)生多個(gè)小芽后可轉(zhuǎn)入芽卞長(zhǎng)培養(yǎng)基中(MS+BAl.Omg/L+IAAO.lmg/L+Km100mg/L)，促進(jìn)芽的生長(zhǎng)。當(dāng)芽長(zhǎng)約l-3cm時(shí)，從基部切下l-3個(gè)芽，基部插入生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根(1/2MS+IAA0.4mg/L)。西瓜子葉外植體轉(zhuǎn)入抗性芽篩選培養(yǎng)基后l-2d開(kāi)始觀(guān)察農(nóng)桿菌的污染情況。污染的外植體周?chē)饾u長(zhǎng)出一圈渾濁的細(xì)菌圈。實(shí)驗(yàn)二，與實(shí)驗(yàn)一相比，除了轉(zhuǎn)化步驟中，搖床上培養(yǎng)的溫度為15°C之外，所用子葉個(gè)數(shù)不相同外，其他條件都相同。8實(shí)驗(yàn)三，與實(shí)驗(yàn)一相比，除了轉(zhuǎn)化步驟中，搖床上侵染培養(yǎng)的溫度為2(TC之外，所用子葉個(gè)數(shù)不相同外，其他條件都相同。實(shí)驗(yàn)四，與實(shí)驗(yàn)一相比，除了轉(zhuǎn)化步驟中，搖床上侵染培養(yǎng)的溫度為25X:之外，所用子葉個(gè)數(shù)不相同外，其他條件都相同。實(shí)驗(yàn)五，與實(shí)驗(yàn)一相比，除了轉(zhuǎn)化步驟中，搖床上侵染培養(yǎng)的溫度為3crc之外，所用子葉個(gè)數(shù)不相同外，其他條件都相同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實(shí)驗(yàn)結(jié)論從上表可以看出，隨著侵染溫度的升高，污染率逐漸增高。侵染溫度從10升高到30°C，污染率從0增加到37.2%。但是轉(zhuǎn)化率卻在15'C的時(shí)候最高，同時(shí)污染率比較底。所以，在本實(shí)驗(yàn)中，侵染溫度保持在10-15。C之間，可以有效防止農(nóng)桿菌污染西瓜子葉，同時(shí)保持較高的轉(zhuǎn)化率。實(shí)驗(yàn)六用農(nóng)桿菌侵染甜瓜子葉(l(TC)。與實(shí)驗(yàn)一相比，除了所用的材料為甜瓜外，所用子葉個(gè)數(shù)不相同外，其它的條件都相同。實(shí)驗(yàn)七與實(shí)驗(yàn)六相比，除了在侵染培養(yǎng)中溫度為15'C外，所用子葉個(gè)數(shù)不相同外，其它條件都相同。實(shí)驗(yàn)八與實(shí)驗(yàn)六相比，除了在侵染培養(yǎng)中溫度為2(TC外，所用子葉個(gè)數(shù)不相同外，其它條件都相同。實(shí)驗(yàn)九與實(shí)驗(yàn)六相比，除了在侵染培養(yǎng)中溫度為25-C外，所用子葉個(gè)數(shù)不相同外，其它條件都相同。實(shí)驗(yàn)十與實(shí)驗(yàn)六相比，除了在侵染培養(yǎng)中溫度為3(TC外，所用子葉個(gè)數(shù)不相同外，其它條件都相同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果侵染溫度rc)子葉個(gè)數(shù)污染個(gè)數(shù)轉(zhuǎn)化率(％)裕憤《實(shí)驗(yàn)六1012520.81.6實(shí)驗(yàn)七1511939.72.5實(shí)驗(yàn)八20121176.214實(shí)驗(yàn)九25120423.335實(shí)驗(yàn)十30121551.545.4本實(shí)驗(yàn)六到十所用的甜瓜種子來(lái)源于市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的晴網(wǎng)品種。實(shí)驗(yàn)結(jié)論從上表可以看出，隨著侵染溫度的升高，污染率逐漸增高。侵染溫度從10升高到30°C，污染率從1.6增加到45.4%。但是轉(zhuǎn)化率卻在15-C的時(shí)候最高，同時(shí)污染率比較底。所以，在本實(shí)驗(yàn)中，侵染溫度保持在10-15。C之間，可以有效防止農(nóng)桿菌污染西瓜子葉，同時(shí)保持較高的轉(zhuǎn)化率。權(quán)利要求1.一種用農(nóng)桿菌生產(chǎn)瓜類(lèi)轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征在于，它包括讓農(nóng)桿菌在10-30℃下與瓜類(lèi)植物外植體浸染培養(yǎng)5-30分鐘。2.如權(quán)利要求1所術(shù)的方法，其特征在于，所述的瓜類(lèi)植物外植體為西瓜子葉或甜瓜子葉。3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的農(nóng)桿菌的濃度為OD=0.5-0.8。4.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，該方法還包括侵染培養(yǎng)后的共培養(yǎng)。5.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，該方法還包括在侵染培養(yǎng)后除去外植體表面多余的農(nóng)桿菌。6.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的培養(yǎng)溫度為l(TC、15。C或20。C。7.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的侵染培養(yǎng)的時(shí)間為10-15分鐘。8.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的農(nóng)桿菌處于懸浮狀態(tài)，并且與所述的瓜類(lèi)植物外植體處于運(yùn)動(dòng)狀態(tài)。9.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的西瓜或甜瓜子葉在被農(nóng)桿菌侵染前先經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)。全文摘要本發(fā)明提供一種用農(nóng)桿菌生產(chǎn)瓜類(lèi)轉(zhuǎn)基因植物的方法，它包括讓農(nóng)桿菌在10-30℃下與瓜類(lèi)植物外植體侵染培養(yǎng)5-30分鐘。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，侵染溫度為10-15℃之間，培養(yǎng)時(shí)間為10-15分鐘。利用該方法可以有效防止在后續(xù)培養(yǎng)中農(nóng)桿菌對(duì)植物外植體所造成的污染，縮短獲得轉(zhuǎn)基因植物的周期，提高獲得轉(zhuǎn)基因植物的幾率，降低生產(chǎn)成本。文檔編號(hào)C12N15/82GK101260410SQ20081006027公開(kāi)日2008年9月10日申請(qǐng)日期2008年4月14日優(yōu)先權(quán)日2008年4月14日發(fā)明者任海英,麗方,王漢榮,王連平,茹水江申請(qǐng)人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院