專利名稱：一種牛乳中過(guò)氧化物酶含量的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分析檢測(cè)乳中蛋白的方法，特別是一種檢測(cè)牛乳 中乳過(guò)氧化物酶含量的方法。屬于檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
目前，國(guó)內(nèi)沒(méi)有乳過(guò)氧化物酶含量的檢測(cè)方法的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。國(guó)內(nèi)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)有已作廢標(biāo)準(zhǔn)和GB/T15550-1995活化乳中乳過(guò)氧 化物酶體系保存生鮮牛乳實(shí)施規(guī)范。國(guó)外，相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)有 DIN-10483-l-2002牛奶乳過(guò)氧化物酶活性測(cè)定.第l部分光度測(cè)量法 (參照法)、DIN-10483-2-2002牛奶乳過(guò)氧化物酶活性測(cè)定.第2部分 反射計(jì)法。常用乳過(guò)氧化物酶的檢測(cè)方法是酶標(biāo)儀法。該方法雖步驟 簡(jiǎn)單，但檢測(cè)到出結(jié)果時(shí)間較長(zhǎng)，約2h。本專利發(fā)明了將使用毛細(xì)管 電泳儀快速檢測(cè)乳過(guò)氧化物酶含量的方法。毛細(xì)管電泳儀是一類包括電泳、色譜及其交叉內(nèi)容的液相微分離 技術(shù)。它能快速精確檢測(cè)出牛奶中的剩叚成分、抗生素、添加的功能 性因子、乳清蛋白、免疫球蛋白、酶、糖、添加劑和其他小分子的含 量。該方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，檢測(cè)到出結(jié)果時(shí)間僅為lh左右。目前，毛細(xì)管電泳儀的應(yīng)用前景非常廣泛。許多國(guó)際官方權(quán)威機(jī)構(gòu)，如FDA、 U. S.P、 CBER、 CDER等均已認(rèn)可毛細(xì)管電泳方法。權(quán)威 機(jī)構(gòu)歐洲藥典中認(rèn)可勒沃卡-貝斯庭鹽酸鹽中雜質(zhì)的CE測(cè)定；歐洲藥 典中還認(rèn)可促紅細(xì)胞生成素(EP0)的毛細(xì)管電泳儀測(cè)定等。毛細(xì)管 電泳儀已成為化學(xué)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)、生物工程、藥學(xué)等眾多領(lǐng)域的一個(gè) 常規(guī)科研工具。目前，國(guó)內(nèi)毛細(xì)管電泳儀檢測(cè)技術(shù)逐漸應(yīng)用到乳品領(lǐng)域里，如產(chǎn) 品開(kāi)發(fā)和控制質(zhì)量問(wèn)題等領(lǐng)域中。但毛細(xì)管電泳技術(shù)尚未開(kāi)發(fā)檢測(cè)乳 過(guò)氧化物酶的方法。本發(fā)明成功彌補(bǔ)了乳品領(lǐng)域中的缺點(diǎn)，能準(zhǔn)確測(cè) 定乳過(guò)氧化物酶的含量，從而有利于產(chǎn)品開(kāi)發(fā)和質(zhì)量控制當(dāng)中。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的 一種牛乳中乳過(guò)氧化物酶含量的才企測(cè)方法。 本發(fā)明的一種檢測(cè)乳過(guò)氧化物酶含量的檢測(cè)方法，其中，包括如 下步驟1)將乳過(guò)氧化物酶溶于樣品緩沖液，制備得到多個(gè)不同含 量乳過(guò)氧化物酶的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并對(duì)多個(gè)溶液分別;f全測(cè)后得到乳過(guò)氧化 物酶含量與檢測(cè)結(jié)果之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線；2)對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，并得到 檢測(cè)結(jié)果；3)將所述的檢測(cè)結(jié)果與所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線比對(duì)，得到樣品 中乳過(guò)氧化物酶的含量；其中，檢測(cè)樣品的設(shè)備是高壓毛細(xì)管電泳分 析儀。上述步驟l)中標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定的方法如下配制乳過(guò)氧化物酶 標(biāo)準(zhǔn)溶液，在樣品緩沖液中溶解乳過(guò)氧化物酶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制成分別為 lmg/ml 、 0. 5mg/ml、 0. 25mg/ml、 0. lmg/ml、 0. 05mg/ml,制備4尋到標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻后使用高壓毛細(xì)管電泳分析，得到檢測(cè)結(jié)果，即得到乳過(guò)氧化物酶含量與平均校正因子的關(guān)系曲線；其中，所述的檢測(cè)結(jié) 果按照如下方法計(jì)算按峰面積計(jì)算出平均校正因子。上述的標(biāo)準(zhǔn)溶液或待檢測(cè)樣品的處理方法為把標(biāo)準(zhǔn)溶液或待檢 測(cè)樣品裝入離心管中，在2000-4000r/min離心條件下離心5-15min, 將樣品與緩沖液按照l(shuí): 4-10的比例加入凍存管，并搖勻，精確提取 40ul處理樣品加入樣品管中，放置于超聲波清洗機(jī)1 10min,使用 毛細(xì)管電泳4義測(cè)定。上述的樣品緩沖液為能夠使蛋白質(zhì)分散的緩沖液，優(yōu)選如下緩 沖液160 m mol/L三曱基氨基曱烷緩沖液中加40 m mol/L 3-嗎啉代 丙烷磺酸，60mmol/L乙二胺四乙酸二鈉，6 mol/L尿素，處理樣品時(shí) 添加5ul/ml的巰基乙醇,曱基羥乙基纖維素0. 5%, pH值為8. 5上述的搖勻步驟采用漩渦混合器。上述高壓毛細(xì)管電泳分析的使用4企測(cè)參數(shù)如下毛細(xì)管電泳檢測(cè) 檢測(cè)的溫度控制在30 4(TC之間，毛細(xì)管柱直徑50~75um、長(zhǎng)度 20~ 600 mm, DAD (或紫外光)檢測(cè)器，壓力進(jìn)樣(或電動(dòng)進(jìn)樣)，壓 力為0 lpsi，進(jìn)樣時(shí)間為ls 20s,分離溫度為20~40°C,工作電 壓為15~30 kV。上述的毛細(xì)管柱為石英毛細(xì)管柱，包括涂層和未涂層。 上述的高壓毛細(xì)管電泳分析的檢測(cè)時(shí)電泳模式為區(qū)帶電泳，其電 泳緩沖液為pH3. 0~8. 0,主要成分為無(wú)機(jī)鹽緩沖液，優(yōu)選磷酸鹽、硼酸或檸檬酸。上述的檢測(cè)結(jié)果的處理方法如下檢測(cè)結(jié)果為樣品分離的圖譜， 運(yùn)用毛細(xì)管電泳儀所帶的分析軟件，積分各峰的面積，計(jì)算出試樣濃 度，再乘稀釋倍數(shù)，即得實(shí)際濃度。常乳里乳過(guò)氧化物酶的含量10mg ~ 30mg/L，質(zhì)量百分比為 0. 001%-0. 003%,其分子量為77500。毛細(xì)管電泳儀檢測(cè)最低濃度能達(dá) 到10-^10—8mol/L。所以毛細(xì)管電泳儀能檢測(cè)出其含量。使用毛細(xì)管 電泳儀開(kāi)發(fā)檢測(cè)乳過(guò)氧化物酶含量的方法包括樣品性質(zhì)的了解、分離 模式、建立緩沖體系、優(yōu)化緩沖體系和換分離模式等步驟。開(kāi)發(fā)出的 方法能應(yīng)用于產(chǎn)品開(kāi)發(fā)、質(zhì)量控制和分析4企測(cè)領(lǐng)域中。本發(fā)明主要使用毛細(xì)管電泳儀能準(zhǔn)確測(cè)定乳過(guò)氧化物酶的含量， 從而應(yīng)用于產(chǎn)品開(kāi)發(fā)、質(zhì)量控制和分析檢測(cè)領(lǐng)域中。本發(fā)明在在傳統(tǒng)的電泳和色譜的原理的基礎(chǔ)上，使用高壓毛細(xì)管 電泳儀檢測(cè)乳過(guò)氧化物酶的含量，達(dá)到準(zhǔn)確檢測(cè)出乳制品中乳過(guò)氧化 物酶的含量。通過(guò)試驗(yàn)，最終確定檢測(cè)方法的最佳參數(shù)條件。具體如 下檢測(cè)乳過(guò)氧化物酶含量的檢測(cè)方法，包括樣品前處理、上樣檢 觀'J,還包括校準(zhǔn)讀數(shù)等步驟。毛細(xì)管電泳檢測(cè)檢測(cè)的溫度控制在 20 40。C之間，毛細(xì)管柱直徑50~75um、長(zhǎng)度50 600隱的石英 毛細(xì)管柱，DAD (或紫外光)檢測(cè)器，壓力進(jìn)樣，壓力為0.5psi， 進(jìn)樣時(shí)間為5s 10s，分離溫度為20~40°C,工作電壓為25 kV。校準(zhǔn)曲線的制定配制乳過(guò)氧化物酶標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度分別為2mg/ml、 lmg/ml、 0. 5mg/ml、 0. 25mg/ml、 0. lmg/ml。搖勻后使用 高壓毛細(xì)管電泳分析，按峰高計(jì)算出平均校正因子。 檢測(cè)步驟為把原料奶樣品裝入15ml的離心管中，在3000r/min離心條件下 離心10min。準(zhǔn)確^是取樣品100ul置入凍存管。提取400ul樣品緩 沖液加入凍存管(或其他容器)，并使用旋渦混合器混勻。精確提取 40ul處理樣品加入樣品管中，放置于超聲波清洗機(jī)3min，使用毛細(xì) 管電泳儀測(cè)定。樣品定量讀數(shù):根據(jù)樣品分離的圖譜，運(yùn)用毛細(xì)管電泳儀所帶的 分析軟件，積分各峰高(或峰面積)，計(jì)算出試樣濃度，再乘稀釋倍 數(shù)，即得實(shí)際濃度。 有益效果本發(fā)明方法現(xiàn)行回歸方程相關(guān)系數(shù)〉0.98,其線性范圍在 0. Olmg/ml ~2mg/ml，最低檢出線為0. 15ng以上，最低4全出濃度為 0. 005mg/ml。精確度達(dá)90%以上，柱子回收率達(dá)到90%以上，樣品回 收率達(dá)70%以上。能有效檢測(cè)出樣品中的乳過(guò)氧化物酶的含量。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 一種牛乳中乳過(guò)氧化物酶含量的^r測(cè)方法毛細(xì)管電泳溫度控制在40°C,使用直徑為50iim、長(zhǎng)度為20 mm 的石英毛細(xì)管柱，DAD4企測(cè)器，進(jìn)樣壓力為0. 5psi,進(jìn)樣時(shí)間為10s， 工作電壓為25 kV。校準(zhǔn)曲線的制定利用乳過(guò)氧化物酶標(biāo)準(zhǔn)品配制濃度分別為2mg/ml lmg/ml、 0. 5mg/ml、 0-25mg/ral、 0. lmg/ml的才示準(zhǔn)溶液。4吝 勻后使用高壓毛細(xì)管電泳分析，積分后的峰高分別為5782、 2741、 1451、 634、 220 ，利用軟件得出標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸相關(guān)系數(shù)為 0. 9992,最低4企出線為0. lug,最低檢出含量為0. 001mg/ml,標(biāo)準(zhǔn) 樣品回收率達(dá)91%。處理樣品緩沖液配置方法160 m mol/L三曱基氨基甲烷緩沖 液中加40 m mol/L 3-嗎啉代丙烷磺酸，60mmol/L乙二胺四乙酸二 鈉，6mol/L尿素，處理樣品時(shí)添力。5ul/ml的3-巰基乙醇，曱基幾 乙基纖維素0. 5%, pH值為8. 5。電泳緩沖液的配置方法0. 32 mol/L檸檬酸，20 m mol/L檸檬 酸三鈉，7 mol/L尿素，羥丙基曱基纖維素0. 5%。檢測(cè)步驟為把奶樣品加入15ml的離心管中，在200r/min離 心條件下離心10min。準(zhǔn)確提取樣品100ul置入凍存管(或其他容 器)。提取400ul樣品緩沖液加入凍存管(或其他容器)，并使用漩 渦混合器混勻。精確提取40ul處理樣品加入樣品管中，放置于超聲 波清洗機(jī)3min,之后使用毛細(xì)管電泳儀測(cè)定。樣品定量讀數(shù):根據(jù)樣品分離的圖語(yǔ),運(yùn)用毛細(xì)管電泳儀所帶的 分析軟件，積分乳過(guò)氧化物酶的峰高為7,利用分析軟件自動(dòng)套入標(biāo) 準(zhǔn)曲線方程內(nèi)計(jì)算出試樣濃度為0. 0021mg/ml,再乘稀釋倍數(shù)5，即 得實(shí)際濃度為0. 0105mg/ml,所以該奶樣含有的乳過(guò)氧化物酶濃度 為0. 0105g/L。 實(shí)施例2 —種牛乳中乳過(guò)氧化物酶含量的檢測(cè)方法毛細(xì)管電泳溫度控制在25。C，使用直徑為75um、長(zhǎng)度為600 mm 的石英毛細(xì)管柱，DAD檢測(cè)器，進(jìn)樣壓力為0. 5psi,進(jìn)樣時(shí)間為5s, 工作電壓為25 kV。校準(zhǔn)曲線的制定利用乳過(guò)氧化物酶標(biāo)準(zhǔn)品配制濃度分別為 2mg/ml、 lmg/ml、 0. 5mg/ml、 0. 25mg/ml、 0. lmg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。 搖勻后使用高壓毛細(xì)管電泳分析，積分后的峰高分別為5982、 2790、 1370、 584、 268，利用軟件得出標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸相關(guān)系數(shù)為 0. 998，最低檢出線為0. 2ug,最低檢出含量為0. 001mg/ml，標(biāo)準(zhǔn)樣 品 回收率達(dá)90%。處理樣品緩沖液配置方法160 m mol/L三甲基氨基甲烷緩沖 液中加40 m mol/L 3-嗎啉代丙烷磺酸，60mmol/L乙二胺四乙酸，6 mol/L尿素，處理樣品時(shí)添加5ul/ml的P-巰基乙醇，曱基羥乙基纖 維素0. 4%。使用0. 1M氫氧化鈉調(diào)至pH值為8. 5。電泳緩沖液的配置方法0. 32 mol/L檸檬酸，20 m mol/L檸檬 酸三鈉，6 mol/L尿素，鞋丙基曱基纖維素0. 4%。檢測(cè)步驟為把奶樣品加入15ml的離心管中，在4000r/min 離心條件下離心10min。準(zhǔn)確提取樣品100ul置入凍存管(或其他 容器)。提取400ul樣品緩沖液加入凍存管(或其他容器)，并使用 漩渦混合器混勻。精確提取40ul處理樣品加入樣品管中，放置于超 聲波清洗機(jī)3min，之后使用毛細(xì)管電泳儀測(cè)定。樣品定量讀數(shù):才艮據(jù)樣品分離的圖i普，運(yùn)用毛細(xì)管電泳儀所帶的 分析軟件，積分乳過(guò)氧化物酶的峰高為11，利用分析軟件自動(dòng)套入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程內(nèi)計(jì)算出試樣濃度為0. 004mg/ml,再乘稀釋倍數(shù)5， 即得實(shí)際濃度為0. 02mg/ml，所以該奶樣含有的乳過(guò)氧化物酶濃度 為0. 02g/L。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)乳過(guò)氧化物酶含量的檢測(cè)方法，其特征在于包括如下步驟1)將乳過(guò)氧化物酶溶于樣品緩沖液，制備得到多個(gè)不同含量乳過(guò)氧化物酶的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并對(duì)多個(gè)溶液分別檢測(cè)后得到乳過(guò)氧化物酶含量與檢測(cè)結(jié)果之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線；2)對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，并得到檢測(cè)結(jié)果；3)將所述的檢測(cè)結(jié)果與所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線比對(duì)，得到樣品中乳過(guò)氧化物酶的含量；其中，檢測(cè)樣品的設(shè)備是高壓毛細(xì)管電泳分析儀。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述步驟l)中 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定的方法如下配制乳過(guò)氧化物酶標(biāo)準(zhǔn)溶液，在樣 品緩沖液中溶解乳過(guò)氧化物酶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制成分別為lmg/ml 、 0. 5mg/ml、 0. 25mg/ml、 0. lmg/ml、 0. 05mg/ml，制備得到標(biāo)準(zhǔn)溶 液，搖勻后使用高壓毛細(xì)管電泳分析，得到檢測(cè)結(jié)果，即得到乳 過(guò)氧化物酶含量與平均校正因子的關(guān)系曲線；其中，所述的檢測(cè) 結(jié)果按照如下方法計(jì)算按峰面積計(jì)算出平均校正因子。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述的標(biāo)準(zhǔn)溶 液或待檢測(cè)樣品的處理方法為把標(biāo)準(zhǔn)溶液或待檢測(cè)樣品裝入離 心管中，在2000-4000r/min離心條件下離心5-15min，將樣品 與緩沖液按照1: 4-10的比例加入凍存管，并搖勻，精確提取 40ul處理樣品加入樣品管中，放置于超聲波清洗機(jī)1 ~ 10min, 使用毛細(xì)管電泳yf義測(cè)定。
4. 如權(quán)利要求2或3所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述的樣品緩 沖液為能夠使蛋白質(zhì)分散的緩沖液，優(yōu)選如下緩沖液160 m mol/L三曱基氨基曱烷緩沖液中加40 m mol/L 3-嗎啉代 丙烷磺酸，60mmol/L乙二胺四乙酸二鈉，6mol/L尿素，處理樣 品時(shí)添加5ul/ml的3-巰基乙醇，曱基羥乙基纖維素0. 5%, pH 值為8.5。
5. 如權(quán)利要求2或3所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述的搖勻步 驟釆用旋渦混合器。
6. 如權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述高壓毛細(xì) 管電泳分析的使用斥企測(cè)參數(shù)如下毛細(xì)管電泳4企測(cè)斥企測(cè)的溫度控 制在20 40。C之間，毛細(xì)管柱直徑50 75um、長(zhǎng)度20 600 mm, DAD (或紫外光)檢測(cè)器，壓力進(jìn)樣(或電動(dòng)進(jìn)樣)，壓力為0~ lpsi,進(jìn)樣時(shí)間為ls 20s，分離溫度為20~40°C，工作電壓為 15-30 kV。
7. 如權(quán)利要求6所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述的毛細(xì)管柱為 石英毛細(xì)管柱，包括涂層和未涂層。
8. 如權(quán)利要求1或2所述的4全測(cè)方法，其特征在于所述的高壓毛 細(xì)管電泳分析的檢測(cè)時(shí)電泳模式為區(qū)帶電泳，其電泳緩沖液為 pH3. 0~8. 0，主要成分為無(wú)機(jī)鹽緩沖液，優(yōu)選磷酸鹽、硼酸或 檸檬酸。
9. 根據(jù)權(quán)利要求2中所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述的檢測(cè)結(jié) 果的處理方法如下檢測(cè)結(jié)果為樣品分離的圖譜，運(yùn)用毛細(xì)管電泳儀所帶的分析軟件，積分各峰的面積，計(jì)算出試樣濃度，再乘稀 釋倍數(shù)，即得實(shí)際濃度。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)乳中成分的方法，特別是一種檢測(cè)乳過(guò)氧化物酶含量的檢測(cè)方法。屬于檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明毛細(xì)管電泳儀檢測(cè)乳過(guò)氧化物酶含量的檢測(cè)方法，包括樣品前處理、上樣檢測(cè)，還包括校準(zhǔn)讀數(shù)，編輯報(bào)告等步驟。本發(fā)明是樣品在毛細(xì)管電泳儀上跑電泳，從而毛細(xì)管色譜系統(tǒng)檢測(cè)出樣品的吸光值，以圖譜的形式表達(dá)出來(lái)，從而能準(zhǔn)確檢測(cè)出乳過(guò)氧化物酶的含量，為產(chǎn)品研發(fā)、質(zhì)量控制和分析成分提供技術(shù)支持。
文檔編號(hào)C12Q1/28GK101256168SQ200810093699
公開(kāi)日2008年9月3日 申請(qǐng)日期2008年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月22日
發(fā)明者劉衛(wèi)星, 孫國(guó)慶, 康小紅, 胡新宇 申請(qǐng)人:內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)(集團(tuán))股份有限公司