專(zhuān)利名稱(chēng)：：結(jié)核分枝桿菌粘附素hbha在結(jié)核病診斷與治療中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明總體涉及結(jié)結(jié)核病的診斷、預(yù)防和治療，特別的，本發(fā)明涉及結(jié)核分枝桿菌粘附素HBHA在診斷、預(yù)防和治療結(jié)核病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌侵入體，引起的慢性傳染病。人體除了毛發(fā)，牙齒和指曱以外，其他任何部位都可以發(fā)生結(jié)核病，發(fā)生在不同器官的結(jié)核病就被稱(chēng)為這一器官的結(jié)核病，如結(jié)核病發(fā)生在骨骼，稱(chēng)為骨結(jié)核；發(fā)生有肺部，稱(chēng)為肺結(jié)核。結(jié)核病起病較隱匿，病情進(jìn)展緩慢，病程比較長(zhǎng)，是一種慢性消耗性疾病?；疾∑鞴俚墓δ芤虼嬖诮Y(jié)核病變而嚴(yán)重破壞。因而對(duì)人類(lèi)的健康和生命危害極大。結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷目前有細(xì)菌學(xué)，免疫學(xué)，以及分子生物學(xué)方法。目前用于臨床免疫學(xué)檢測(cè)的有以ESAT6、PT63、MPT64、CFP10等為基礎(chǔ)的方法。在結(jié)核病治療方面，目前結(jié)核分枝桿菌的耐藥性已成為結(jié)核病治療的難點(diǎn)，新的抗結(jié)核藥物會(huì)給結(jié)核病治療帶來(lái)新希望。因此，本領(lǐng)域需要用于預(yù)防、治療和檢測(cè)結(jié)核病的改進(jìn)的疫苗和方法。
發(fā)明內(nèi)容細(xì)菌粘附素是細(xì)菌在其表面表達(dá)的一種物質(zhì)，具有凝集素樣特性，能夠凝集紅細(xì)胞，并與宿主細(xì)胞表面表達(dá)的互補(bǔ)的糖綴生物結(jié)合，參與介導(dǎo)-宿主細(xì)胞間的相互作用，促進(jìn)細(xì)菌自體凝集。細(xì)菌通過(guò)粘附素粘附到哺乳動(dòng)物宿主組織，在介導(dǎo)微生物致病性方面是一種重要的毒力因素。HBHA是結(jié)核分枝桿菌分泌的一種粘附素，它是由致病性結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生的一種糖蛋白，能通過(guò)其賴(lài)氨酸豐富的碳末端功能區(qū)域非吞噬細(xì)胞(如上皮細(xì)胞等)上含硫酸乙酰肝素的受體結(jié)合，從而介導(dǎo)肺結(jié)核和肺外播散性結(jié)核的發(fā)生。但目前仍未有關(guān)于分枝桿菌粘附素HBHA在于預(yù)防治療、診斷結(jié)核病中的應(yīng)用方面的研究。3本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，HBHA是結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞表面蛋白，在結(jié)核患者的血清中存在抗HBHA的抗體，因此可以通過(guò)使用預(yù)先制備好的HBHA蛋白對(duì)血清中是否存在抗HBHA的抗體進(jìn)行檢測(cè)，如果結(jié)果為陽(yáng)性，則說(shuō)明血清中存在抗HBHA的抗體，進(jìn)而該患者患有結(jié)核病。另外，還可以通過(guò)對(duì)患者注射HBHA,使患者體內(nèi)產(chǎn)生抗HBHA的抗體，進(jìn)而治療結(jié)核病，或者達(dá)到預(yù)防的目的。本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，HBHA的上述功能是通過(guò)其抗原決定簇發(fā)揮的。因此，本發(fā)明提供了一種多肽，其包含結(jié)核桿菌粘附素HBHA的抗原決定簇，其中所述結(jié)核桿菌粘附素HBHA的抗原決定簇序列包含Arg-Thr-Asp-Thr-Arg-Ser-Arg-Val-Glu(SEQIDNO:4)。除非明確說(shuō)明外，這里所使用的術(shù)語(yǔ)"多肽"包括任何長(zhǎng)度的氨基酸鏈，其中的氨基酸殘基由共價(jià)鍵肽鍵連接。這樣，所述多肽包含HBHA蛋白的抗原決定簇氨基酸序列，還可以包含附加序列。本領(lǐng)域4支術(shù)人員可以理解，所述的附加序列可以來(lái)自于天然結(jié)合分枝桿菌抗原，因此所述附加序列也可以是免疫原性的。所述"免疫原性"是指在患者(包括人)和/或生物樣品中激發(fā)免疫反應(yīng)(例如，細(xì)胞免疫)的能力。例如，所述多肽可以是全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的HBHA蛋白。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，對(duì)HBHA的抗原決定簇進(jìn)行保守取代仍可達(dá)到本發(fā)明的目的。所述的保守取代，是指在多肽中的氨基酸被其他氨基酸所取代后，免疫原性并沒(méi)有實(shí)質(zhì)性的改變。例如下表中第3列同一行中的氨基酸可以相互替換<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>需要說(shuō)明的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，對(duì)于氨基酸名稱(chēng)的縮寫(xiě)有兩種方式，分別使用三個(gè)字母與一個(gè)字母，這兩種縮寫(xiě)是——對(duì)應(yīng)的。例如，丙氨酸可以縮寫(xiě)為"Ala",也可以縮寫(xiě)為"A"。如在生物化學(xué)，王鏡巖/朱圣庚/徐長(zhǎng)法2006-10第三版中所描述的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例中所提供的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行驗(yàn)證，與本發(fā)明的多肽或核酸高度同源的多肽或者核酸也可以用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。根據(jù)本發(fā)明，"同源蛋白質(zhì)"可以被理解為包括蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)含有至少70%氨基酸序列相應(yīng)于本發(fā)明的氨基酸序列，或者該蛋白質(zhì)由前面所述的多聚核苷酸序列編碼，優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選95%，其中相應(yīng)被理解為是指相應(yīng)的氨基酸相同的或者互補(bǔ)的同源氨基酸。同源性，通?？梢杂靡阎能浖蛘唠娔X程序來(lái)分析，例如BestFit或者Gap配對(duì)比對(duì)軟件(GCGWisconsinPackage,GeneticsComputerGroup,575ScienceDrive,Madison,Wisconsin53711)。另一方面，本發(fā)明還提供了核酸分子，其包含編碼所述HBHA的抗原決定簇的核苷酸序列，以及包含所述核酸分子的表達(dá)載體。所述核酸分子和表達(dá)載體可以用于轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。因此，本發(fā)明還提供了一種宿主細(xì)胞，其中所述被核酸分子和表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化。本發(fā)明還提供了一種治療結(jié)核病的藥物組合物，其中所述組合物包含一種或者多種多肽和生理學(xué)上可以接受的載體，所述多肽的氨基酸序列中包含HBHA的抗原決定簇。另一方面，本發(fā)明還提供了一種治療結(jié)核病的藥物組合物，其中所述組合物包含核酸分子和生理學(xué)上可以接受的載體，其中所述核酸分子包含編碼所述HBHA的抗原決定簇的核香酸序列。另一方面，本發(fā)明還提供了一種疫苗，所述疫苗包含多肽，所述多肽的氨基酸序列中包含HBHA的抗原決定簇。另外，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述疫苗還可以含有免疫反應(yīng)增強(qiáng)劑，所述免疫反應(yīng)增強(qiáng)劑包括但不限于CpG寡核苷酸。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)"抗原決定簇"是抗原分子表面的特定化學(xué)基因，其決定抗原的特異性。因此，抗原決定簇是免疫應(yīng)答和免疫反應(yīng)具有特異性的物質(zhì)基礎(chǔ)。另一方面，在一個(gè)實(shí)施例中，還可以將編碼外源性抗原的基因直接導(dǎo)入人或動(dòng)物體內(nèi)，讓其在宿主細(xì)胞中表達(dá)抗原蛋白，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答?？乖蛟谝欢〞r(shí)限內(nèi)的持續(xù)表達(dá)，不斷刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，達(dá)到免疫的目的。因此，本發(fā)明還提供了一種疫苗，所述疫苗包含一種或者多種核酸分子，其中所述核酸分子包含編碼所述HBHA的抗原決定簇的核普酸序列。另外，本發(fā)明還提供了一種診斷試劑盒，其中所述試劑盒多肽，所述多肽的氨基酸序列中包含HBHA的抗原決定簇。另一方面，本發(fā)明還提供了一種抗體，是通過(guò)使用氨基酸序列中包含HBHA的抗原決定簇的所述多肽對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行免疫而產(chǎn)生的。所述哺乳動(dòng)物通常是人，但也可以是動(dòng)物，典型的宿主是可以被分支桿菌天然或人工感染的。宿主可以是哺乳動(dòng)物，例如靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、牛、綿羊、豬、獾和嚙齒類(lèi)動(dòng)物如大鼠和小鼠。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明可以用于治療、診斷和預(yù)防的結(jié)核病包括但不限于原發(fā)性肺結(jié)核、血行播散性肺結(jié)核、繼發(fā)性肺結(jié)核、結(jié)核性胸膜炎以及其他肺外結(jié)核。其中原發(fā)性肺結(jié)核為原發(fā)結(jié)核感染所致的臨床病癥，包括原發(fā)綜合征及胸內(nèi)淋巴結(jié)結(jié)核。血行播散性肺結(jié)核包括急性血行播散性肺結(jié)核(急性粟粒型肺結(jié)核)及亞急性、慢性血行播散性肺結(jié)核。繼發(fā)性肺結(jié)核包括浸潤(rùn)性、纖維空洞及干酪性肺炎等。結(jié)核性胸膜炎包括結(jié)核性干性胸膜炎、結(jié)核性滲出性胸膜炎、結(jié)核性膿胸。其他肺外結(jié)核核包括骨關(guān)節(jié)結(jié)核、結(jié)核性腦膜炎、腎結(jié)核、腸結(jié)核等。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以在本發(fā)明中使用的藥物上可以接受的載體是指藥物上可以接受的材料、組合物、媒介物例如液體或固體填充物、稀釋劑、賦形劑或溶劑封裝材料，其參與將對(duì)象化合物從身體的一個(gè)器官或身體部分?jǐn)y帶或轉(zhuǎn)送到其他身體的器官或身體部分。載體是"可以接受的，，的意思是與制劑的其他成分兼容，并適合用于患者。能夠作為藥物上可以接受的載體的材料的例子包括但不限于(l)糖，諸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，諸如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；(3)纖維素及其衍生物，諸如羧曱基纖維素鈉、乙基纖維素和纖維素醋酸酯；(4)西黃蓍膠粉；(5)麥芽；(6)明膠；(7)滑石；(8)賦形6劑，諸如椰子油和栓劑蠟；(9)油，諸如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；(10)二醇，諸如丙二醇；(ll)多羥基化合物，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯，諸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)瓊脂；(14)緩沖劑，諸如氫氧化鎂和氫氧化鋁;(15)褐藻酸；(16)無(wú)熱源水；(17)等滲鹽水；(18)林格氏溶液(Ringer'ssolution);(19)乙醇；(20)pH緩沖液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；和(22)在藥物制劑中采用的其他無(wú)毒性的兼容材料。本發(fā)明的藥物組合物，可以通過(guò)以可注射組合物的形式施用，但是也可以配制成眾所周知的藥物遞送系統(tǒng)(例如口服、直腸、胃腸外(靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或者皮下)、池內(nèi)、陰道內(nèi)、腹膜內(nèi)、局部(粉末、軟膏或者滴劑)、或者作為口腔噴霧劑或者鼻腔噴霧劑)。需要說(shuō)明的是，本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)"治療，，不必然意味著完全治愈。對(duì)不期望癥狀或者疾病病理影響的任何緩解到任何程度，或者疾病進(jìn)展速度的降低都可以被認(rèn)為是治療。而且，治療可以包括使患者的整體健康感覺(jué)或者外形變差的行為。例如，對(duì)癌癥患者進(jìn)行化學(xué)療法，其可能使患者感覺(jué)"病情更嚴(yán)重"，但仍被認(rèn)為是治療。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)"預(yù)防"是指降低生物體感染或發(fā)展出與結(jié)核病相關(guān)的疾病或癥狀的可能性。在某些情況中，應(yīng)當(dāng)將另一種治療藥劑與至少一種這里所述的提取物聯(lián)合給藥。僅僅作為例子，如果接受其中一種這里所述提取物治療的患者同時(shí)患有高血壓，那么應(yīng)當(dāng)與初始治療劑聯(lián)合給藥抗高血壓劑。本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從下面結(jié)合附圖對(duì)實(shí)施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中圖1表示SDS-PAGE檢測(cè)分離純化天然與重組的HBHA蛋白。圖2表示W(wǎng)estern-blot檢測(cè)分離純化的天然與重組的HBHA蛋白。圖3以散點(diǎn)圖的形式表示ELISA方法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組血清HBHA抗體在OD450的吸光^f直分布。圖4表示免疫預(yù)防組病理學(xué)結(jié)果(HE染色，400X)。7圖5表示免疫預(yù)防組病理切片抗酸染色結(jié)果(抗酸染色，400X)。圖6表示免疫治療組病理學(xué)結(jié)果(HE染色，400X)。圖7表示免疫治療組病理切片抗酸染色結(jié)果(抗酸染色，400X)。下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出，其中自件。下面通過(guò)參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能解釋為對(duì)本發(fā)明的限制。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1HBHA抗原決定簇的研究HBHA的基因全長(zhǎng)序列為atggctgaaaactcgaacattgatgacatcaaggctccgttgcttgccgcgcttggagcggccgacctggccttggccactgtcaacgagttgatcacgaacctgcgtgagcgtgcggaggagactcgtacggacacccgcagccgggtcgaggagagccgtgctcgcctgaccaagctgcaggaagatctgcccgagcagctcaccgagctgcgtgagaagttcaccgccgaggagctgcgtaaggccgccgagggctacctcgaggccgcgactagccggtacaacgagctggtcgagcgcggtgaggccgctctagagcggctgcgcagccagcagagcttcgaggaagtgtcggcgcgcgccgaaggctacgtggaccaggcggtggagttgacccaggaggcgttgggtacggtcgcatcgcagacccgcgcggtcggtgagcgtgccgccaagctggtcggcatcgagctgcctaagaaggctgctccggccaagaaggccgctccggccaagaaggccgctccggccaagaaggcggcggccaagaaggcgcccgcgaagaaggcggcggccaagaaggtcacccagaagtag(SEQIDNO:1)。其氨基酸序列為MAENSNIDDIKAPLLAALGAADLALATVNELITNLRERAEETRTDTRSRQIDNO:2)申請(qǐng)人確定HBHA抗原決定簇的氨基酸序列為Arg43-Thr-Asp-Thr-Arg-Ser匿Arg-Val-Glu51。根據(jù)固相化學(xué)合成法方法，申請(qǐng)人合成了多肽A，經(jīng)測(cè)序，其氨基酸序列為Arg-Thr-Asp-Thr-Arg-Ser-Arg-Val-Glu(SEQIDNO:4)。實(shí)施例2結(jié)核分枝桿菌粘附素HBHA的制備及其在診斷結(jié)核病中的應(yīng)用2.1天然HBHA蛋白的制備(1)BCG菌抹的培養(yǎng)將在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的BCG菌抹研磨成均勻菌懸液，適量接種于蘇通培養(yǎng)基中，37。C培養(yǎng)至穩(wěn)定期。(2)天然HBHA蛋白的分離純化及其Western-Blot鑒定BCG在2L改良蘇通培養(yǎng)基中37。C培養(yǎng)至穩(wěn)定期。13000g離心20min,棄上清，沉淀用含有0.05%Tween80的PBS(PBS/TW)洗滌一次，離心棄上清用100mLPBS/TW重懸沉淀，8(TC加熱1h,13OOOg離心20min,棄上清，應(yīng)用PBS/TW洗滌一次，沉淀重懸于25mL含有l(wèi)mmol/LPMSF的PBS/TW中，混勻置于冰上間歇超聲25min后，13000g離心20min,收集上清，沉淀進(jìn)行重復(fù)的超聲，離心和收集上清。將收集的上清進(jìn)行34000g離心3小時(shí)，棄去沉淀，取上清500ml通過(guò)特異性吸附HBHA的CL-6B層析柱，用100mlPBS緩沖液洗柱，應(yīng)用含0~500mmol/L的NaCL的PBS洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.5ml/min，在洗脫過(guò)程中，在波長(zhǎng)280nm下監(jiān)測(cè)吸光度，找出最大吸收峰，利用原核表達(dá)的HBHA蛋白免疫小白鼠制備的HBHA多抗血清作為一抗，HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG作為二抗，進(jìn)行WestBlot鑒定分離純化的蛋白。結(jié)果見(jiàn)圖(1,2)。2.2.重組HBHA蛋白的制備(1)PCR擴(kuò)增目的基因、連接至T載體、陽(yáng)性克隆的鑒定及序列分析采用煮沸15mim裂解BCG菌液，取上清進(jìn)行PCR，引物的設(shè)計(jì)借助DNAStar軟件，在hbhA基因兩端設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，由上海生工生物技術(shù)有限服務(wù)公司合成。上游5'AACGAATTCATGGCTGAAAACTCGAACATT3':下為BamHI酶切位點(diǎn)，下游引物酶切位點(diǎn)為HindIII酶切位點(diǎn)。PCR反應(yīng)體系為10xBuffer5iu1,DNA模板lpl,5，和3，端引物(10nM)各2p1,TaqDNAPolymerase0.5ju1(5u/ul),MgS04(50mmol/L)2p1，dNTP(2.5mmol/L)4加無(wú)菌水至終體積50|ul。退火溫度為55。C。采用膠回收試劑盒回收的目的DNA片段。連接到pMD18-T載體。采用菌落PCR法鑒定陽(yáng)性克隆后，再進(jìn)一步雙酶切法(BamHI/HindlII)進(jìn)行鑒定。鑒定正確的陽(yáng)性克隆各取兩個(gè)送寶生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。鑒定克隆序列的正確性。測(cè)序結(jié)果為T(mén)TTCAGCC(SEQIDNO:3)。(2)PET-32a(+)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及陽(yáng)性菌的小量誘導(dǎo)表達(dá)HBHA蛋白質(zhì)粒提取試劑盒提取裝入T載體的HBHA陽(yáng)性質(zhì)粒，酶切后連接到PET-32a(+)表達(dá)載體上，然后將經(jīng)過(guò)鑒定的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至BL21大腸桿菌中。挑取單個(gè)菌落接種于含有抗生素的LB培養(yǎng)基中(羧芐青霉素100ng/ml)，37。C培養(yǎng)過(guò)夜；次日，按l:50擴(kuò)大培養(yǎng)，37。C培養(yǎng)至菌密度為A600=0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度為lmmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)4h。然后進(jìn)行全菌蛋白的SDS-PAGE電泳分析。并且通過(guò)8mol/L尿素裂解菌體后，應(yīng)用Nisapharose4B特異性吸附柱進(jìn)行分離純化。洗脫純化產(chǎn)物依次用尿素進(jìn)行梯度透析(6mol/L,4mol/L,2mol/L，0mol/L)和蛋白的復(fù)性。結(jié)果見(jiàn)圖(1,2)2.3.HBHA檢測(cè)結(jié)核病血清抗體水平應(yīng)用50ul包被液包被天然和重組HBHA蛋白，包被蛋白量0.1jug,以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG抗體為二抗，對(duì)各實(shí)驗(yàn)組血清進(jìn)行ELISA檢測(cè)。結(jié)果見(jiàn)圖3，表l。表1HBHA抗原檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌敏感性和特異性血清來(lái)源份數(shù)敏感性(％)特異性(。/。)天然HBHA重組HBHA天然H朋A重組HBHA肺結(jié)核病人4741(87.2'/。)39(83.0%)肺外結(jié)核病人4744(93.6%)43(91.5%PPD(+)健康者4746(97.9%)45(95.7%)PPD(-)健康者4745(95.7%)44(93.6W圖3散點(diǎn)圖中顯示(1)天然與重組兩種HBHA蛋白在各組血清樣本抗體檢測(cè)中的OD450值分布相近，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)(t爿.069，PX).05)差異沒(méi)有顯著性。(2)PPD陽(yáng)性和PPD陰性健康對(duì)照組之間血清抗體水平差異同樣不具有顯著性(t=1.238，P〉0.05)。(3)肺結(jié)核組與肺外結(jié)核組的血清抗體OD值分布在散點(diǎn)圖中顯示差異明顯，肺結(jié)核OD450值分布集中分布在0.30-0.40之間，肺外結(jié)核OD450值分布在0.350-0.45之間。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)(t42.224,PO.05)結(jié)差異具有顯著性。(4)結(jié)核組(肺結(jié)核，肺外結(jié)核)與對(duì)照組(PPD陰性，PPD陽(yáng)性)OD450值分布具有顯著不同。散點(diǎn)圖中很直觀的顯示對(duì)照組全部小于0.3，結(jié)核組OD值則集中分布于0.30-0.45之間。結(jié)核組與健康組之間(t=25.909,P<0.05)血清抗體水平具有顯著性差異。實(shí)施例3結(jié)核分枝桿菌粘附素hbha在預(yù)防中的作用3.1實(shí)^r動(dòng)物分組將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為以下5組CpG免疫預(yù)防組，HBHA免疫預(yù)防組，CpG+HBHA免疫預(yù)防組，BCG免疫預(yù)防組和對(duì)照組。3.2給藥方法CpG免疫預(yù)防組腹腔注射每只小鼠CpG30jug，HBHA免疫預(yù)防組腹腔注射每只小鼠HBHA5jug，CpG+HBHA免疫預(yù)防組腹腔注射CpG30mg和HBHA5jug，給藥后14天攻毒，BCG免疫預(yù)防組尾靜脈注射BCG1~=2x105CFU。對(duì)照組在攻毒前注射100ul生理鹽水。2周后加強(qiáng)免疫1次。3.3結(jié)核病小鼠模型的建立取在改良羅氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好的結(jié)核分枝桿菌H37Rv2周的培養(yǎng)物，用瑪瑙乳缽磨成10mg/3ml的均勻菌懸液，用生理鹽水稀釋成lmg/3ml的菌懸液，從小鼠尾靜脈注射0.3ml(相當(dāng)于濕菌O.lmg)，含菌量約為106CFU。ii3.4結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)與病理檢查攻毒后4周脫頸處死小鼠，其中每組2只小鼠作病理檢查，2只小鼠進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)。電子天平稱(chēng)取結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)組小鼠體重，立刻無(wú)菌解咅'1,稱(chēng)取肺臟和脾臟重量，將肺臟和脾臟在組織研磨器中磨成均勻的細(xì)胞懸液，用生理鹽水按l:10、1:100、1:1000、1:10000、1:100000稀釋的組織勻漿液100ul，接種于羅氏培養(yǎng)基斜面。每個(gè)稀釋度做2個(gè)復(fù)管。先傾斜10度放置1小時(shí)，37。C培養(yǎng)，28天后觀察結(jié)果。病理檢查組小鼠處死后，取肺臟和脾臟放入10。/。中性曱醛中固定，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋和切片，分別做HE和抗酸染色。3.5實(shí)驗(yàn)結(jié)果小鼠肺脾濕重，結(jié)果見(jiàn)表2表2免疫預(yù)防組攻毒4周后各研究組小鼠體重與肺脾重量(g)組別體重肺脾CpG20.430.380.67HBHA22.060.360.59CpG+H朋A18.850.310.63BCG預(yù)防組16.830.270.23空白對(duì)照20.100.320.52本研究每組選擇2只小鼠，稱(chēng)體重，處死后稱(chēng)肺脾濕重，取2只小鼠的均值。結(jié)果顯示，BCG預(yù)防組在小鼠體重和肺脾濕重方面明顯^f氐于其它各對(duì)照組。菌落計(jì)數(shù)結(jié)果，本研究每組選擇2只小鼠，處死后取全肺和全脾，磨成勻漿后，以10倍級(jí)數(shù)稀釋接種于羅氏培養(yǎng)基，4周后觀察結(jié)果，以2只鼠的均值計(jì)數(shù)菌落數(shù)。研究發(fā)現(xiàn)HBHA免疫預(yù)防組菌落數(shù)明顯低于對(duì)照組，但明顯高于BCG免疫預(yù)防組。見(jiàn)表3。病理檢驗(yàn)結(jié)果，從圖4可以看出空白對(duì)照組病理?yè)p害相當(dāng)嚴(yán)重，見(jiàn)實(shí)變壞死及肉芽胂形成。BCG組雖有局部彌散小病變，肺組織結(jié)構(gòu)基本正常，間質(zhì)輕度充血，病理?yè)p害較輕。其它各組病理?yè)p害介于對(duì)照組和BCG免疫預(yù)防組之間?？顾崛旧Y(jié)果，從圖5可以看出空白對(duì)照組病理切片有大量的抗酸桿菌存在，其它各組也可見(jiàn)少量抗酸桿菌。提示其它各組都有一定的預(yù)防效果。實(shí)施例4結(jié)核分枝桿菌粘附素HBHA在治療中的作用124.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為以下4組CpG免疫治療組，HBHA免疫治療組，CpG+HBHA免疫治療組和對(duì)照組。4.2給藥方法攻毒后14天給CpG免疫治療組腹腔注射每只小鼠CpG30jag,HBHA免疫治療組腹腔注射每只小鼠HBHA5mg，CpG+HBHA免疫治療組腹腔注射CpG30mg和hbha5ng，對(duì)照組在攻毒后14天注射100ul生理鹽水。2周后加強(qiáng)免疫1次。4.3結(jié)核病小鼠模型的建立與實(shí)施例3相同。4.4結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)與病理檢查與實(shí)施例3相同。4.5實(shí)驗(yàn)結(jié)果小鼠肺脾濕重，結(jié)果見(jiàn)表4表4免疫治療組治療4周后各研究組小鼠體重與肺脾重量(g)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>研究發(fā)現(xiàn)HBHA免疫治療組菌落計(jì)數(shù)結(jié)果優(yōu)于空白對(duì)照組，其他組間差異不顯著病理檢驗(yàn)結(jié)果和抗酸染色結(jié)果，從病理組織學(xué)圖譜可以明顯地看出，HBHA免疫治療組的組織損害程度明顯低于空白對(duì)照組，和CpG組相當(dāng)。對(duì)于病理切片抗酸染色可見(jiàn)空白對(duì)照組細(xì)菌數(shù)明顯多于其它各組。見(jiàn)圖6，7。從圖6病理組織學(xué)圖錯(cuò)可以明顯地看出，HBHA免疫治療組的組織損害程度明顯低于空白對(duì)照組，和CpG組相當(dāng)。對(duì)于病理切片抗酸染色可見(jiàn)空白對(duì)照組細(xì)菌數(shù)明顯多于其它各組。從圖可以看出，對(duì)照組小鼠肺組織有大片肉芽腫形成，病理?yè)p害相當(dāng)嚴(yán)重。其它各組也可見(jiàn)廣泛的肺部病變彌散分布，但病變程度明顯輕于對(duì)照組。從圖7可以看出空白對(duì)照組病理切片中有大量的抗酸桿菌存在，其它各組也可見(jiàn)少量抗酸桿菌。提示其它各組都有一定的治療效果。另外，申請(qǐng)人使用多肽A重復(fù)了上述病理實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)多肽A在診斷、治療以及預(yù)防方面具有與結(jié)核分枝桿菌粘附素HBHA相當(dāng)?shù)淖饔?。從研究結(jié)果不難看出結(jié)含有SEQIDNO:4序列的多肽，如結(jié)核分枝桿菌粘附素HBHA在結(jié)核病，尤其是肺外結(jié)核病的輔助診斷中具有很好的敏感性與特異性。并且在結(jié)核病的治療、預(yù)防研究中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示比較明顯的治療效果。盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，可以理解在不脫離本發(fā)明的原理和精神的情況下可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型。14序列表<110〉北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所〈120〉結(jié)核分枝桿菌粘附素HBHA在結(jié)核病診斷與治療中的應(yīng)用<130〉PIDC080022<160〉4<170〉Patentln3.3版<210><211><212〉<213〉1600DNA結(jié)核分枝桿菌<400〉13tggCtg3犯actcgaacattgatgacatcaaggctccgttgcttgccgcgcttggagcg60gCCg3CCtggccttggccactgtcaacgsgttg3tC3Cg3acctgcgtgagcgtgcggag120gagactcgtacggacacccgC3gCCgggtCgaggagagccgtgctcgcctgaccaagctg180caggaagatctgCCCg3gC3gctcaccgagctgcgtgagaagttcaccgccgaggagctg240cgtaaggccgccgsgggctacctcgaggccgcgactagccggtacaacgagctggtcgag300cgcggtgsggCCgCtCt3g3gcggctgcgcagccagcagsgcttcgaggaagtgtcggcg360cgcgccg犯ggCt3Cgtggaccaggcggtggagttgaccc3gg3ggCgUgggtacggtc420gcatcgcagacccgcgcggtcggtgsgcgtgccgccaagctggtcggcatcgagctgcct480aag犯ggctgctccggccaagaaggccgctccggccaagaaggccgctccggcca柳ag540gcggcggcca3g犯ggCgCCcgcgaagaaggcggcggccsagaaggtcacccagaagtag600<210>2〈211>199<212>PRT<213>結(jié)核分枝桿菌〈400〉2MetAlaGluAsnSerAsnlieAspAsplieLysAlaProLeuLeuAla151015AlaLeuGlyAlaAlaAspLeuAlaLeuAla丁hrValAsnGluLeulie202530ThrAsnLeuArgGluArgAlaGluGluThrArgThrAspThrArgSer354045ArgValGluGluSerArgAlaArgLeuThrLysLeuGinGluAspLeu505560ProGluGinLeuThrGluLeuArgGluLysPheThrAlaGluGluLeu65707580ArgLysAlaAlaGluGlyTvrLeuGluAlaAlaThrSerArgTyrAsn85909^GluLeuValGluArgGlyGluAlaAlaLeuGluArgLeuArgSerGin100105110GinSerPheGluGluValSerAlaArgAlaGluGlyTyrValAspGin115120125AaValGluLeuThrGinGluAlaLeuGlyThrValAlaSerGinThr130135140ArgAlaVal.GlyGluArgAlaAlaLysLeuValGlylieGluLeuPro145150155160LysLysAlaAlaProAlaLysLysAlaAlaProAlaLysLysAlaAla165170175ProAlaLysLysAlaAlaAlaLysLysAlaProAlaLysLysAlaAla180185lbOAlaLvsLysValThrGinLys<210〉3<2U〉598<212〉DNA〈213>人工序列<400〉3ctacttctgggtgaccttcttggccgccgccttcttcgcgggcgccttcttggccgccgc60cttcttggccggagcggccttcUggccggagcggccttcUggccggagcagccttctt120aggcagctcgatgccgeccagcttggcggcacgctcaccgaccgcgcgggtctgcgatgc180g3ccgtacccaacgcctcctgggtcaactccaccgcctggtccacgtagccttcggcgcg240cgccgacacttcctcgaagctctgctggctgcgcsgccgctctageigcggcctcaccgcg300ctcgaccagctcgttgtaccggctagtcgcggcctcgaggtagccctcggcggccttacg360csgctcctcggcggtgaacttctcacgcagctcggtgagctgctcgggcagatcttcctg420cagct.t.ggtcaggcgagcacggctctcctcgacccggctgcgggtgtccgtacgagtctc480ctccgcacgctC3CgC3ggttCgtg3tC33ctcgttgacagtggccaaggccaggtcggc540cgctccaagcgCggC33gC3acggagccttg3tgtcatca3tgttCg3gttttcagcc598〈210>4〈211〉9〈212>PRT〈213〉人丁序列<400>4ArgThrAspThrArgSerArgValGlu1權(quán)利要求1.一種多肽，其包含結(jié)核桿菌粘附素HBHA抗原決定簇，其中所述結(jié)核桿菌粘附素HBHA抗原決定簇的序列包含SEQIDNO4所示的氨基酸序列。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其序列為SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。3.—種核酸，其包含編碼根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽的核苷酸序列。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的核酸，其序列為SEQIDNO:l所示的核苷酸序列。5.—種表達(dá)載體，該載體包含根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的核酸。6.—種治療結(jié)核病的藥物組合物，其中所述組合物包含權(quán)利要求1或2所述的多肽。7.—種疫苗，所述疫苗包含權(quán)利要求1或2所述的多肽。8.—種診斷試劑盒，其中所述試劑盒包含權(quán)利要求1或2所述的多肽。9.一種抗體，是通過(guò)使用權(quán)利要求1或2所述的多肽，或者權(quán)利要求3或4所述的核酸對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行免疫而產(chǎn)生的。10.—種基因疫苗，所述疫苗包含權(quán)利要求3或4所述的核酸。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種多肽，其包含結(jié)核分枝桿菌肝素結(jié)合血凝素(heparin-bindinghaemagglutinin，HBHA)抗原決定簇，其中所述結(jié)核分枝桿菌粘附素HBHA抗原決定簇的序列包含Arg-Thr-Asp-Thr-Arg-Ser-Arg-Val-Glu；還公開(kāi)了一種包含編碼所述多肽的核苷酸序列的DNA分子，以及含有所述核酸分子的載體，使用載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。另外，本發(fā)明還公開(kāi)了用于診斷、治療和預(yù)防結(jié)核病的藥物組合物、疫苗和診斷試劑盒。另外，本發(fā)明還公開(kāi)了使用所述多肽對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行免疫而產(chǎn)生的抗體。從研究結(jié)果不難看出結(jié)核分枝桿菌粘附素HBHA在結(jié)核病，尤其是肺外結(jié)核病的輔助診斷中具有很好的敏感性與特異性。并且在結(jié)核病的治療、預(yù)防研究中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示比較明顯的治療效果。文檔編號(hào)C12N15/31GK101580542SQ20081009731公開(kāi)日2009年11月18日申請(qǐng)日期2008年5月12日優(yōu)先權(quán)日2008年5月12日發(fā)明者張旭霞,李傳友申請(qǐng)人:北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所