專利名稱：：一種糖化酶及其編碼基因與表達(dá)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種糖化酶及其編碼基因與表達(dá)方法。
背景技術(shù)：
：糖化酶(又名葡萄糖淀粉酶，EC3.2.1.3)從非還原性末端催化寡糖或者多糖，以e—D—葡萄糖的形式將葡萄糖從糖鏈上水解下來。糖化酶屬于糖苷水解酶家族15(Biochem.J.1993，293:781-788)。糖化酶是工業(yè)上極其重要的酶，應(yīng)用非常廣泛。主要用在淀粉的酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)高果糖漿(Starch.1989，41:57-64)，還應(yīng)用于葡萄糖生產(chǎn)、面包生產(chǎn)、低熱量啤酒生產(chǎn)以及整粒谷物生產(chǎn)酒精中(J.FoodBiochem.1997,21:1-52.)。酶轉(zhuǎn)化淀粉生產(chǎn)葡萄糖，需要兩個步驟，第一步是利用耐熱a—淀粉酶在95-1()5°。條件下液化，第二步是利用真菌糖化酶在pH4.5、6(TC的條件下糖化(J.Appl.Biochem.1983,5:235—260.17.)。然而大多數(shù)糖化酶并不耐高溫(Starch.1995，47:439-445)，而且在工業(yè)生產(chǎn)中，考慮到成本因素，一般會采用高濃度的淀粉生產(chǎn)高濃度的葡萄糖漿(高達(dá)30%)，在此條件下，真菌糖化酶會使葡萄糖縮合生成麥芽糖、異麥芽糖等寡糖，降低了轉(zhuǎn)化率(Starch.1999,51:269-274.)。因此找到一種耐高溫、耐高濃度葡萄糖、低副反應(yīng)甚至無副反應(yīng)的糖化酶是非常有必要的。騰沖熱厭氧菌(Thermoanaerobactertengcongensis)是中國科學(xué)院微生物研究所首先發(fā)現(xiàn)的一類嗜熱厭氧革蘭氏陰性真細(xì)菌，生活在我國云南省騰沖地區(qū)熱泉中，最適生長溫度為75。C(Int.J.Syst.Evol.MICrobiol.2001，51:1335-1341)，保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為AS1.2430T(AS1.2430T=JCM11007T)。其全基因組已測序，Genbank保存號為AE008691。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種糖化酶。本發(fā)明所提供的糖化酶，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有糖化酶活性的由a)衍生的蛋白質(zhì)。為了使上述(a)中的蛋白便于純化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表l所示的標(biāo)簽。表l標(biāo)簽的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>上述(b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(b)中的蛋白的編碼基因可通過將序列表中序列l(wèi)所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個或幾個堿基對的錯義突變，禾口/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。上述糖化酶的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。上述糖化酶的編碼基因具體可為如下a)、b)或c)的基因a)其核苷酸序列為序列表中序列1所示的DNA分子；b)與序列表中序列1所限定的DNA序列具有70%以上同源性且編碼具有糖化酶活性的蛋白質(zhì)的DNA序列；其中，所述同源性是指至少70%相同，較佳的是至少80%相同，更佳的是至少90%相同，最佳的是至少95%相同。c)在嚴(yán)格條件下與a)或b)所限定的DNA序列雜交且編碼具有糖化酶活性的蛋白質(zhì)的DNA分子。擴增上述任一所述基因全長或其任意片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述引物對具體可為擴增序列表中序列1所示的DNA分子的一對引物對，其中的一條引物序列如序列表中序列3所示，另一條引物序列如序列表中序列4所示。含有上述任一所述基因的重組載體、重組菌或表達(dá)盒也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述重組載體具體可為在pET21a的多克隆位點插入序列表中序列1所示核苷酸序列得到的重組表達(dá)載體pTGA612。所述重組菌可以通過將所述重組載體導(dǎo)入原核微生物細(xì)胞或真核微生物細(xì)胞得到，其中，原核或真核微生物具體可為大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和酵母細(xì)胞。所述重組菌具體可以通過將上述重組表達(dá)載體pTGA612導(dǎo)入大腸桿菌得到，其中一株重組菌為大腸埃希氏菌(^5c力en'c/L'aTGAR612，該菌株已于2007年11月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏中心的地址為北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏號為CGMCCNo.2252。本發(fā)明的另一個目的是提供一種表達(dá)糖化酶的方法。本發(fā)明所提供的表達(dá)糖化酶的方法為發(fā)酵上述任一種重組菌得到糖化酶。以發(fā)酵大腸埃希氏菌(^sc力eric力i3coh')TGAR612CGMCCNo.2252為例，發(fā)酵方法可以為如下在無菌條件下，將重組菌(&c力aric/L^TGAR612接種于含有100ug/ral氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，36-38'C振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)10-18小時后，將重組菌(T^c力en'CT^aco7i)TGAR612轉(zhuǎn)接入發(fā)酵罐中，當(dāng)菌體濃度的0D6W值達(dá)到0.5-1.2時，加入IPTG誘導(dǎo)糖化酶過量表達(dá)，IPTG在培養(yǎng)基中的終濃度一般以0.l-2raM為宜，當(dāng)菌體濃度的OD,值達(dá)到3.2時，收集菌體，離心沉淀，純化得到糖化酶蛋白。本發(fā)明的糖化酶具有高度的熱穩(wěn)定性，且不催化葡萄糖生成寡糖，克服了其它來源的糖化酶不耐高溫、催化逆反應(yīng)的弊端，在實際生產(chǎn)中能節(jié)約成本，提高轉(zhuǎn)化率，有重要的經(jīng)濟意義。本發(fā)明的糖化酶表達(dá)方法，能夠高效表達(dá)糖化酶，糖化酶的產(chǎn)量可達(dá)112800U/L發(fā)酵液。圖1為重組表達(dá)載體pTGA612的構(gòu)建示意圖。圖2為糖化酶在不同溫度下的相對酶活力。圖3為糖化酶在不同pH值下的相對酶活力。圖4為糖化酶的溫度穩(wěn)定性的檢測結(jié)果。圖5為糖化酶基因在重組菌中表達(dá)后的純化產(chǎn)物的電泳鑒定圖。具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明均為常規(guī)方法。實施例1、糖化酶編碼基因的獲得及含有糖化酶編碼基因的重組菌的構(gòu)建一、糖化酶編碼基因的獲得分析騰沖熱厭氧菌(77ei7H朋/^ero力ac力erz^/^coA^e7w^)ASI.2430的基因組DNA(Genbank號為AE008691)，結(jié)果表明，在騰沖熱厭氧菌(r力ei7Ho朋3e/^Z^cz^rfe/^coA^e/2w's)ASI.2430T的基因組中存在著一段基因序5列，該段基因序列編碼的氨基酸序列與CA^^iV力/瓜spG0005糖化酶的氨基酸序列相似，相似性達(dá)70.9%，全基因組測序解釋為hypotheticalprotein,因此推斷由該段基因序列編碼的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白為糖化酶(TGA)。根據(jù)推測的糖化酶的基因序列，設(shè)計如下引物引物l，5'GACTGCCATATGTGTTCTGATGTTTCATACGT3'(序列表中序列3)(含NdeI酶切位點)；引物2，5,CTGACTCGAGTCTCTCCCCTAATACATACC3'(序列表中序列4)(含XhoI酶切位點)。為實現(xiàn)糖化酶編碼基因在大腸桿菌胞內(nèi)的高效表達(dá)，通過上述引物擴增出糖化酶編碼基因的主要功能區(qū)域，而不包括編碼該糖化酶蛋白N端信號肽的基因序列。以騰沖熱厭氧菌(7力e/7Z703朋e^^acz^rz^/^co/^e/Ls^s)ASI.24307基因組DNA為模板，用上述引物，進(jìn)行PCR擴增，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，測得的序列如序列表中序列l(wèi)所示，此序列即為糖化酶編碼基因序列，由2058個堿基組成，編碼糖化酶成熟肽(不含信號肽部分)，2056-2058位核苷酸為終止密碼子。由序列表中序列1所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列如序列表中序列2所示。二、構(gòu)建含有糖化酶編碼基因的重組菌將步驟一獲得的PCR產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物用T4連接酶連接到同樣酶切后的pET21a(+)表達(dá)載體上，獲得含有糖化酶編碼基因的重組表達(dá)載體pTGA612(圖l);將重組表達(dá)載體pTGA612轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)抗性培養(yǎng)基篩選得陽性克隆，提取質(zhì)粒并用Ndel和Xhol進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果表明在pTGA612中，糖化酶編碼基因(序列表中序列l(wèi)所示核苷酸序列)已插入pET21a(+)的NdeI和XhoI位點間。將獲得的含有pTGA612的重組大腸桿菌菌株命名為大腸埃希氏菌(^sc力ei^c力iacoh')TGAR612，該菌株己于2007年11月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏中心的地址為北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏號為CGMCCNo.2252。實施例2、發(fā)酵大腸埃希氏菌(^sc力e".ch'acoh')TGAR612CGMCCNo.2252制備糖化酶及酶活測定和酶性質(zhì)分析一、發(fā)酵大腸埃希氏菌(^sc力ew'c力iacoh')TGAR612CGMCCNo.2252制備糖化酶在無菌條件下，將重組菌(^sc/er化力iacoh')TGAR612CGMCCNo.2252接種于含有100ug/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)12小時后，將重組菌(^sc力erich'aTGAR612的種子液按照1%的體積比(種子液和發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基的體積比)轉(zhuǎn)接入發(fā)酵罐中，當(dāng)菌體濃度的0D6。。值達(dá)到0.5-1.2時，加入IPTG至其終濃度達(dá)0.5mM誘導(dǎo)糖化酶表達(dá)，當(dāng)菌體濃度的OD,值達(dá)到3.2左右時，收集菌體。取0D6。。值為3.2時的發(fā)酵液，將其中表達(dá)后的濕菌體懸浮于50raM的檸檬酸一磷酸二氫鈉緩沖液(pH4.6)中，超聲破碎菌體，離心去沉淀，得到上清，將上清在7(TC溫育1小時，再離心，將絕大部分雜蛋白去除，得到上清，然后將上清過Ni親和柱，用咪唑洗脫，電泳單一條帶純的蛋白。將得到的純蛋白用SDS—PAGE電泳進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果表明所得蛋白為單一條帶，分子量為77.5kDa，與本發(fā)明的糖化酶蛋白的分子量相符(圖5，其中M表示marker,泳道8所示為純化后得到的蛋白)。二、糖化酶的活性測定發(fā)酵液中表達(dá)產(chǎn)物活性的檢測可以以可溶性淀粉為底物，加入上述純化后的蛋白進(jìn)行酶反應(yīng)，測定反應(yīng)生成的葡萄糖的量，如果有葡萄糖生成則表明發(fā)酵產(chǎn)物具有糖化酶活性。具體的酶活測定方法如下取OD,值為3.2時的發(fā)酵液50ml，將其中表達(dá)后的濕菌體懸浮于12ml50mM的檸檬酸一磷酸二氫鈉緩沖液(pH4.6)中，超聲破碎菌體，離心去沉淀，得到12.5ml上清液l，將12.5ml上清液1在70°C溫育1小時，再離心，將絕大部分雜蛋白去除，得到約12ml上清液2。取25u1pH為4.6、0.2M的檸檬酸一磷酸二氫鈉緩沖液，向其中加入50u12%(質(zhì)量百分含量)可溶性淀粉水溶液，再向其中加入5ul上述上清液2，最后加入去離子水定容至100ul;將上述反應(yīng)體系振蕩混勻，70°C反應(yīng)6分鐘，然后迅速將反應(yīng)體系置于沸水中煮4分鐘終止反應(yīng)；離心，用SBA生物傳感分析儀檢測生成的葡萄糖的量。其中，酶活單位(U)定義為在70。C、pH4.6的條件下，lh水解可溶性淀粉產(chǎn)生lmg葡萄糖所需的酶量，即為一個酶活力單位(GB8276-1987)。實驗設(shè)三次重復(fù)。該100ul反應(yīng)體系中，三次分別測得的葡萄糖的量依次為0.235mg、0.236mg、0.234mg，其平均值為0.235mg。換算得到的酶活力為0.235x12000/5x60/6x1000/50=112800U/L發(fā)酵液。三、酶的性質(zhì)分析71、酶的最適溫度及溫度穩(wěn)定性檢測最適溫度的確定用可溶性淀粉作為底物，在pH值4.6的條件下分別測定不同溫度下的步驟二獲得的上清液2中酶活力，確定其最適反應(yīng)溫度。其中，除反應(yīng)溫度外，其余具體的酶活測定方法同步驟二所述。實驗設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明此酶在20-85"C的溫度范圍內(nèi)都有比較高的活性，其最適反應(yīng)溫度為70°C。圖2中的相對酶活是將70°C、pH4.6條件下反應(yīng)6分鐘的酶活計作100%。溫度穩(wěn)定性的確定將步驟二獲得的上清液2分別在60。C、70°C、75°C、80°C、9(TC不同溫度下保溫，每個溫度下分別保溫10分鐘，0.5小時、l小時、2小時，4小時，7小時，12小時，然后放入冰水中冷卻，于7(TC和pH值4.6的條件下測定酶活力。其中，酶活測定方法同步驟二所述。實驗設(shè)3次重復(fù)。以沒有熱處理的酶液活力記作100%,不同樣品的酶活與之比較的百分?jǐn)?shù)為相對酶活(圖4)。結(jié)果表明本發(fā)明的糖化酶具有高度的熱穩(wěn)定性，在70。C保溫7小時后不失活，在70°C保溫12小時仍有20%活性。2、酶的最適pH值的測定最適pH值的確定分別配制含可溶性淀粉的pH值分別為3.6、4.2、4.4、4.6、5.0，5.4，6.0的0.1M檸檬酸-磷酸緩沖液，7(TC反應(yīng)6分鐘測定步驟二獲得的上清液2的酶活力，確定該酶的最適pH值。其中，除反應(yīng)pH值外，酶活測定方法同步驟二所述。由于反應(yīng)時間和酶量相同，其它條件都一樣，故以生成的葡萄糖濃度表示相對活力。實驗設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明該酶在酸性環(huán)境(pH3.5-6.0)中具有糖化酶活性，其最適pH為4.6(圖3，其中縱坐標(biāo)為葡萄糖的濃度，單位是mg葡萄糖/ml酶反應(yīng)體系)。3、金屬離子對酶活性的影響配制含有不同金屬離子的底物緩沖液在含有1%淀粉(質(zhì)量百分含量)，pH4.6，0.1M的檸檬酸-磷酸緩沖液中，分別加入終濃度至lmM的Na+，Li+，K+，Mg2+，Ca2+，Cu2+,Zn2+,Ni2+，及EDTA;然后分別以含有不同金屬離子的底物緩沖液為底物，進(jìn)行酶活測定，酶活測定方法同步驟二所述；以不加金屬離子的反應(yīng)體系作為對照。實驗設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果表明該糖化酶活性不依賴于金屬離子。4、對不同底物具有不同的活性分別向含1%底物(質(zhì)量百分含量)，pH4.6，0.1M的檸檬酸-磷酸緩沖液體系中加入5ul步驟二獲得的上清液2，反應(yīng)6分鐘，SBA傳感儀測量生成葡萄糖的含量計算酶活力；其中底物分別為麥芽低聚糖、糊精、麥芽三糖、可溶性淀粉、麥芽糖、支鏈淀粉、直鏈淀粉。實驗設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果表明，對不同來源的熱糊化淀粉均有較強活性，對不同底物的活性表現(xiàn)為麥芽低聚糖>糊精"麥芽三糖>可溶性淀粉>麥芽糖>支鏈淀粉>直鏈淀粉。5、檢測糖化酶是否催化葡萄糖縮合形成寡糖向pH值為4.6、含30%(質(zhì)量百分含量)葡萄糖、0.lM的檸檬酸-磷酸緩沖液中，加入5ul步驟二獲得的上清液2，65。C反應(yīng)46小時，SBA傳感儀檢測葡萄糖的減少量。實驗設(shè)3次重復(fù)，每次測得的葡萄糖的濃度為30%、30%、30%。結(jié)果表明未有葡萄糖減少，證明該酶在30%葡萄糖條件下不催化逆向反應(yīng)。9序列表<160〉4<210>1〈211〉2058<212〉DNA〈213〉騰沖熱厭氧菌(7力er/z703朋ar。^3"erteA^co/^e/757'50〈400>1atgtgttctgatgtttcatacgtgaaggttgaacatttagataaaaccgaagcttctcaa60ggaccaggggagagagatacatgggcgacagctcaaaaacagggcattggcactgccaat120aatgatgtatcgaaagtatggtttactttagctcagggggccctttctgagatttactat180cctaccattgacagagccaacagcaagtttttaaaatttattgttactgatggcaaaact240tttgtggctgatgagacaactgacactgtaagcaaggtagagaagattaacaacaggtct300ttagcttacaggctagtgaatattgata犯agaggaaggtataaaattacaaaagagata360tttactgacccaagaaggaattctgttgtcatgaaggtgagatttgaagcgttaaaaggg420aaaatggaagattataaactttatcttgtgtacgaccctcatatttctaatcaaggagcg480gataatgaggggtatgttgtaaaagcgaatggtgaatacggatttatggcttgtagaaac540aatgtgtattcagccttaatgactgatgcgaaatgggggagctattctgtaggatataacGOOggtgttaatgaccctgtgagcgatttaaagaaaaataagaaaatgacttacaagttcgat660agggctaaagggaatataattgagggtattgagattgatttaagagacaagacggaattt720aaaaccgttctttcctttggagaaagtgaggaagaggcgttaaagacggctcttagtact780ttaaaagacagttacgacaggatgcttgggatatatatagcagaatggaataaatactgc840gacgggcttaaaaactttggtggagaggcagacgagctttactataccagtttaatgttt900ttaaaggcgagtgaagataaaaccaacaaaggagcttttattgcctccctttcaattcca%0tggggagaaggacagggggatgagaataaaggagggtatcacttagtttgggcaagagat1020ttataccaceitcgccaatgcttttattgcagctaaagatatagattcggctaatagggct1080ttggattttctagctatggtggtagaaaaaaatggatttatgcctcaaaacacttggata1140、aacggagacccttactggaacgggattcagatggacgaacaggctgacccgataatcctg1200gcatatcaccttaaaagatacgatttgtatgaaaaattggtaaaaccccttgctgatttt1260atagtaagagtaggacctaagacaggacaagagaggtgggaggaagcgggagggtattct1320cctgccactatggcagctgaagttgctggacttgtctgtgctgctgatattgcgaagcaa1380aacaaagatatggaaagggcaaagaaatatctggagacagctgacaaatggcaagagttg1440atagacaaactcacttatactacgaaaggaccttatggcaatgggcagtattatataaga1500attgcaggtttaccggacccggatgccgactttttaataagcattgccaacggaggagga1560gtgtatgaccagaaggagattgtagatccaagttttttagagcttgtaaggttaggagta1620aaagcttatgatgacccaaagatattgaatactatttcggtagttgatagcctccttaaa1680gtaaatactcctaaagggccttcgtggtacaggtacaatcatgatggctatggtgaaccc1740gccaaaggagaactttatcatggcaaaggtaaaggcagattatggcctcttcttacagga180010gagagagggatgtacgaaattgcagcagggaaaaaagcagatgactatctagagtatatg1860agaaattttgctaatgaaggttttgtcttgtcagagcaaatttgggaagatacaggactt1920cctacagattctgcttctcctctcaattgggctcatgcggaatatgtggtgctttttgca1980tctaacatagaagggaaggtagttgatatgccacaaattgtatacaaaaggtatgtatta2040ggggagagactcgagtga2058<210〉2<211>685〈212〉PRT<213〉騰沖熱厭氧菌(7力ei7/703朋eroZ3"erfe/^co/7《e/757'50<400〉2MetCysSerAspValSerTyrValLysValGluHisLeuAspLysThr151015GluAlaSerGinGlyProGlyGluArgAspThrTrpAlaThrAlaGin202530LysGinGlylieGlyThrAlaAsnAsnAspValSerLysValTrpPhe354045ThrLeuAlaGinGlyAlaLeuSerGlulieTyrTyrProThrlieAsp505560ArgAlaAsnSerLysPheLeuLysPhelieValThrAspGlyLysThr65707580PheValAlaAspGluThrThrAspThrValSerLysValGluLyslie859095AsnAsnArgSerLeuAlaTyrArgLeuValAsnlieAspLysArgGly100105110ArgTyrLyslieThrLysGluliePheThrAspProArgArgAsnSer115120125ValValMetLysValArgPheGluAlaLeuLysGlyLysMetGluAsp130135140TyrLysLeuTyrLeuValTyrAspProHislieSerAsnGinGlyAla145150155160AspAsnGluGlyTyrValValLysAlaAsnGlyGluTyrGlyPheMet165170175AlaCysArgAsnAsnValTyrSerAlaLeuMetThrAspAlaLysTrp180185190GlySerTyrSerValGlyTyrAsnGlyValAsnAspProValSerAsp195200205LeuLysLysAsnLysLysMetThrTyrLysPheAspArgAlaLysGly210215220AsnlielieGluGlylieGlulieAspLeuArgAspLysThrGluPhe225230235240LysThrValLeuSerPheGlyGluSerGluGluGluAlaLeuLysThr245250255AlaLeuSerThrLeuLysAspSerTyrAspArgMetLeuGlylieTyr260265270lieAlaGluTrpAsnLysTyrCysAspGlyLeuLysAsnPheGlyGly275280285GluAlaAspGluLeuTyrTyrThrSerLeuMetPheLeuLysAlaSer290295300GluAspLysThrAsnLysGlyAlaPhelieAlaSerLeuSerliePro305310315320TrpGlyGluGlyGinGlyAspGluAsnLysGlyGlyTyrHisLeuVal325330335TrpAlaArgAspLeuTyrHislieAlaAsnAlaPhelieAlaAlaLys340345350AsplieAspSerAlaAsnArgAlaLeuAspPheLeuAlaMetValVal35536036512GluLysAsnGlyPheMetProGinAsnThrTrplieAsnGlyAspPro370375380TyrTrpAsnGlylieGinMetAspGluGinAlaAspProlielieLeu385390395400AlaTyrHisLeuLysArgTyrAspLeuTyrGluLysLeuValLysPro405410415LeuAlaAspPhelieValArgValGlyProLysThrGlyGinGluArg420425430TrpGluGluAlaGlyGlyTyrSerProAlaThrMetAlaAlaGluVal435440445AlaGlyLeuValCysAlaAlaAsplieAlaLysGinAsnLysAspMet450455460GluArgAlaLysLysTyrLeuGluThrAlaAspLysTrpGinGluLeu465470475480lieAspLysLeuThrTyrThrThrLysGlyProTyrGlyAsnGlyGin485490495TyrTyrlieArglieAlaGlyLeuProAspProAspAlaAspPheLeu500505510lieSerlieAlaAsnGlyGlyGlyValTyrAspGinLysGlulieVal515520525AspProSerPheLeuGluLeuValArgLeuGlyValLysAlaTyrAsp530535540AspProLyslieLeuAsnThrlieSerValValAspSerLeuLeuLys545550555560ValAsnThrProLysGlyProSerTrpTyrArgTyrAsnHisAspGly565570575TyrGlyGluProAlaLysGlyGluLeuTyrHisGlyLysGlyLysGly580585590ArgLeuTrpProLeu595AlaGlyLysLysAla610AsnGluGlyPheVal625ProThrAspSerAla645ValLeuPheAlaSer660lieValTyrLysArg675〈210〉3〈211〉32<212>DNA<220〉<223><400〉3gactgccatatgtgtixtgatgtttcatacgt32<210>4<211〉30<212>DNA<220><223><400〉4ctgactcgagtctctcccctaatacatacc30LeuThrGlyGluArgGlyMetTyrGlulieAla600605AspAspTyrLeuGluTyrMetArgAsnPheAla615620LeuSerGluGinlieTrpGluAspThrGlyLeu630635640SerProLeuAsnTrpAlaHisAlaGluTyrVal650655AsnlieGluGlyLysValValAspMetProGin665670TyrValLeuGlyGluArgLeuGlu6806851權(quán)利要求1、一種糖化酶，是如下a)或b)的蛋白質(zhì)a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有糖化酶活性的由a)衍生的蛋白質(zhì)。2、權(quán)利要求l所述糖化酶的編碼基因。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述編碼基因為如下的基因a)其核苷酸序列為序列表中序列1所示的DNA分子；b)與序列表中序列1所限定的DNA序列具有70%以上同源性且編碼具有糖化酶活性的蛋白質(zhì)的DNA分子；c)在嚴(yán)格條件下與a)或b)所限定的DNA序列雜交且編碼具有糖化酶活性的蛋白質(zhì)的DNA分子。4、擴增權(quán)利要求2或3所述基因全長或其任意片段的引物對。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的引物對，其特征在于所述引物對中的一條引物序列如序列表中序列3所示，所述引物對中的另一條引物序列如序列表中序列4所示。6、含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的重組載體、重組菌或表達(dá)盒。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為在表達(dá)載體pET21a(+)的多克隆位點插入序列表中序列l(wèi)所示核苷酸序列得到的重組表達(dá)載體pTGA612。8、根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組菌，其特征在于所述重組菌是通過將權(quán)利要求6或7所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌、枯草芽孢桿菌或酵母得到的。9、根據(jù)權(quán)利要求6或8所述的重組菌，其特征在于所述重組菌為大腸埃希氏菌(^sc力en'c力iaco7i)TGAR612CGMCCNo.2252。10、一種表達(dá)糖化酶的方法，是發(fā)酵權(quán)利要求6、8或9所述重組菌得到糖化酶。全文摘要本發(fā)明公開了一種糖化酶及其編碼基因與表達(dá)方法。本發(fā)明的糖化酶是如下a)或b)的蛋白質(zhì)a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有糖化酶活性的由a)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的糖化酶具有高度的熱穩(wěn)定性，且不催化葡萄糖生成寡糖，克服了其它來源的糖化酶不耐高溫、催化逆反應(yīng)的弊端，在實際生產(chǎn)中能節(jié)約成本，提高轉(zhuǎn)化率，有重要的經(jīng)濟意義。本發(fā)明的糖化酶表達(dá)方法，能夠高效表達(dá)糖化酶，糖化酶的產(chǎn)量可達(dá)112800U/L發(fā)酵液。文檔編號C12N15/56GK101532002SQ20081010169公開日2009年9月16日申請日期2008年3月11日優(yōu)先權(quán)日2008年3月11日發(fā)明者李子龍,寧江,鵬賀申請人:中國科學(xué)院微生物研究所