Cyp2c9*2基因多態(tài)性的檢測(cè)方法以及該方法的核酸探針和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種CYP2C9*2基因多態(tài)性的檢測(cè)探針和擴(kuò)增引物，屬于生物技術(shù)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 華法林是近幾十年來(lái)廣泛應(yīng)用于心房顫動(dòng)的血栓預(yù)防、卒中、靜脈血栓栓塞癥、機(jī) 械瓣植入術(shù)后抗栓治療等領(lǐng)域口服抗凝藥物。該藥為消旋異構(gòu)體，其中R型對(duì)映體和S型 對(duì)映體作用強(qiáng)度不同，S型的藥理作用是R型的3-6倍。該藥物有很強(qiáng)的水溶性，經(jīng)胃腸道 迅速吸收，生物利用度近于100%。口服給藥后90分鐘達(dá)血藥濃度峰值，半衰期36?42小 時(shí)。在血液循環(huán)中與血漿蛋白結(jié)合（結(jié)合率98%?99% )。儲(chǔ)積于肝臟的兩種對(duì)映異構(gòu)體 通過(guò)不同途徑代謝，大約90% S型華法林發(fā)生氧化代謝反應(yīng)，主要被肝臟細(xì)胞色素 P450系 統(tǒng)的CYP2C9酶催化，少部分由CYP3A4催化。大約60% R型華法林發(fā)生氧化代謝反應(yīng)，主要 被肝臟細(xì)胞色素 P450系統(tǒng)的CYP1A2和CYP3A4酶催化，少部分由CYP2C19催化。華法林的 量效關(guān)系受遺傳和環(huán)境因素（例如藥物、飲食、各種疾病狀態(tài)）影響，這些因素對(duì)其吸收、藥 物動(dòng)力學(xué)及藥效學(xué)產(chǎn)生影響。
[0003] 受遺傳因素的影響：華法林用藥的劑量反應(yīng)變異性大。
[0004] 華法林在不同種族、年齡、性別人群的劑量不同。維生素 K環(huán)氧化物還原酶主要受 S型華法林抑制，而S型華法林的代謝主要由細(xì)胞色素 P450 (CYP2C9)催化。大量研究證明 細(xì)胞色素 P450(CYP2C9)和維生素 K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合體亞單位I(VKORCl)是兩個(gè)重要 的決定了華法林的代謝及抗凝效果的基因。兩個(gè)基因中主要有三個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性，基因多 態(tài)性影響華法林的起始劑量和維持劑量。華法林維持劑量在不同人群中存在差異，亞洲人 劑量較低。CYP2C9*2和CYP2C9*3的基因多態(tài)性導(dǎo)致對(duì)S型華法林的代謝減弱，進(jìn)而引起 對(duì)華法林的清除下降，半衰期延長(zhǎng)。以上兩種突變較CYP2C9*1*1患者需要更低的華法林劑 量。CYP2C9*3和VK0RC1-1639A是危險(xiǎn)等位基因。攜帶此等位基因的患者需要更低的華法 林劑量，同時(shí)面對(duì)更高的出血風(fēng)險(xiǎn)。因此基因多態(tài)性影響了華法林的代謝清除和維持量。以 往研究顯示VK0RC1-1639G>A和CYP2C9*2和CYP2C9*3遺傳背景可以解釋約50%的華法令 劑量的變異。2007年美國(guó)FDA對(duì)華法林的基因多態(tài)性增加信息提示：CYP2C9和VKORCl的 基因多態(tài)性影響了藥物的清除及穩(wěn)態(tài)時(shí)的藥物劑量，對(duì)于存在基因多態(tài)性的患者建議華法 林起始應(yīng)用較低劑量。目前CYP2C9和VKORCl基因檢測(cè)已經(jīng)商品化，但國(guó)內(nèi)醫(yī)療機(jī)構(gòu)對(duì)華 法林敏感基因檢測(cè)只能使用西方的商業(yè)化產(chǎn)品。
[0005] 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院在華法林用藥劑量檢測(cè)技術(shù)的研究方面具有 豐富的臨床數(shù)據(jù)和臨床資源積累，同時(shí)這一研究也是"十二五"重大新藥創(chuàng)制課題之一。將 研究成果轉(zhuǎn)化為供臨床應(yīng)用的檢測(cè)試劑盒和對(duì)應(yīng)的用藥指南，能方便準(zhǔn)確的確定臨床用藥 劑量和指導(dǎo)醫(yī)師用藥，對(duì)提高心血管疾病的臨床治療效果將具有重大的價(jià)值。
[0006] 現(xiàn)有技術(shù)中TaqMan探針?lè)ㄊ且环N高度特異的定量PCR技術(shù)，其技術(shù)原理的核心是 利用Taq酶的5 '_3'外切核酸酶活性，切斷探針，產(chǎn)生熒光信號(hào)。由于探針與模板是特異 性結(jié)合，所以熒光信號(hào)的強(qiáng)弱就代表了模板的數(shù)量。
[0007] 在TaqMan探針?lè)ǖ亩縋CR反應(yīng)體系中，包括一對(duì)PCR引物和一條探針。探 針只與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)在兩條引物之間。探針的5 '端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán) (Reporter, R)，如FAM、VIC等，3'端標(biāo)記有突光淬滅基團(tuán)（Quencher, Q)，如BHQ等。當(dāng)探 針完整的時(shí)候，報(bào)告基團(tuán)所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收，儀器檢測(cè)不到信號(hào)。隨著PCR 的進(jìn)行，Taq酶在鏈延伸過(guò)程中遇到與模板結(jié)合的探針，其5 '_3'外切酶活性就會(huì)將探針 切斷，報(bào)告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，其能量不能被吸收，即產(chǎn)生熒光信號(hào)。所以，每經(jīng)過(guò)一個(gè)PCR 循環(huán)，熒光信號(hào)也和目的片段一樣，有一個(gè)同步指數(shù)增長(zhǎng)的過(guò)程。信號(hào)的強(qiáng)度就代表了模板 的DNA的拷貝數(shù)。
[0008] MGB探針的淬滅基團(tuán)采用非熒光淬滅基團(tuán)（NFQ)，本身不產(chǎn)生熒光，可以大大降低 本底信號(hào)的強(qiáng)度。同時(shí)探針上還連接有MGB (Minor Groove Binder)修飾基團(tuán)，可以將探針 的Tm值提高KTC左右，因?yàn)闉榱双@得同樣的Tm值，MGB探針可以比普通的TaqMan探針設(shè) 計(jì)得更短，既降低了合成成本，也使得探針設(shè)計(jì)的成功率大為提高。因?yàn)樵谀０宓腄NA堿基 組成不理想的情況下，短的探針比長(zhǎng)的更容易設(shè)計(jì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種能有效檢測(cè)CYP2C9*2基因多態(tài)性的探針， 并提供檢測(cè)CYP2C9*2基因多態(tài)性的，以及用于該方法的試劑盒。
[0010] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0011] 本發(fā)明第一方面提供了 CYP2C9*2基因多態(tài)性的檢測(cè)探針，其特征在于，所示檢測(cè) 探針的核苷酸序列選自序列1和序列2,運(yùn)用TaqMan探針技術(shù)的原理，在5'和3'端分別 具有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)。為了在PCR儀中能同時(shí)測(cè)量突變型探針和野生型探針的熒光信 號(hào)，突變型探針和野生型探針?biāo)B接的熒光基團(tuán)所發(fā)熒光波長(zhǎng)的峰值要求在不同的位置；
[0012] 序列 1CYP2C9*2 突變型探針 5' -aacacAgtcctcaAtgctcc-3'
[0013] 序列 2CYP2C9*2 野生型探針 5' -ttgaacacGgtcctcaatgctc-3'。
[0014] 作為熒光染料，可以使用常規(guī)的染料。熒光染料向寡核苷酸結(jié)合的方法可以使用 常規(guī)的方法。
[0015] 本發(fā)明的探針'兩端都可以用熒光染料標(biāo)記。優(yōu)選是探針的5'端標(biāo)記熒光基團(tuán)， 3'端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)。
[0016] 現(xiàn)有技術(shù)中公開的各種熒光基團(tuán)均可以運(yùn)用于本發(fā)明，舉例如下：
[0017] 第1組：熒光基團(tuán)FAM其熒光波長(zhǎng)的峰值在520nm。
[0018] 第2組：熒光基團(tuán)VIC, JOE, HEX其熒光波長(zhǎng)的峰值在550nm。
[0019] 第3組：熒光基團(tuán)CY3, NED, TAMRA其熒光波長(zhǎng)的峰值在580nm。
[0020] 第4組：熒光基團(tuán)R0X，TEXAS RED其熒光波長(zhǎng)的峰值在610nm。
[0021] 第5組：熒光基團(tuán)CY5其熒光波長(zhǎng)的峰值在670nm。
[0022] 優(yōu)選的突變型探針和野生型探針上的熒光基團(tuán)分別選自FAM、HEX。
[0023] 現(xiàn)有技術(shù)中公開的各種淬滅基團(tuán)均可以運(yùn)用于本發(fā)明。根據(jù)本發(fā)明的CYP2C9*2 基因多態(tài)性的檢測(cè)探針，優(yōu)選的淬滅基團(tuán)選自MGB、BHQ2。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明的CYP2C9*2基因多態(tài)性的檢測(cè)探針，優(yōu)選的探針選自如下群組：
[0025] *2 突變型探針 FAM_aacacAgtcctcaAtgctcc_BHQ2
[0026] *2 野生型探針 HEX-ttgaacacGgtcctcaatgctc_BHQ2
[0027] *2 突變型探針 HEX-aacacAgtcctcaAtgctcc_BHQ2
[0028] *2 野生型探針 FAM_ttgaacacGgtcctcaatgctc_BHQ2
[0029] *2 突變型探針 FAM-aacacAgtcctcaAtgctcc-MGB
[0030] *2 野生型探針 HEX-ttgaacacGgtcctcaatgctc-MGB
[0031] *2 突變型探針 HEX-aacacAgtcctcaAtgctcc-MGB
[0032] *2 野生型探針 FAM-ttgaacacGgtcctcaatgctc-MGB
[0033] *2 突變型探針 BHQ2_aacacAgtcctcaAtgctcc_FAM
[0034] *2 野生型探針 BHQ2-ttgaacacGgtcctcaatgctc_HEX
[0035] *2 突變型探針 BHQ2-aacacAgtcctcaAtgctcc_HEX
[0036] *2 野生型探針 BHQ2_ttgaacacGgtcctcaatgctc_FAM
[0037] *2 突變型探針 MGB-aacacAgtcctcaAtgctcc-FAM
[0038] *2 野生型探針 MGB-ttgaacacGgtcctcaatgctc-HEX
[0039] *2 突變型探針 MGB-aacacAgtcctcaAtgctcc-HEX
[0040] *2 野生型探針 MGB-ttgaacacGgtcctcaatgctc-FAM。
[0041] 本發(fā)明第二方面提供了一種檢