專利名稱：基因表達的定量的制作方法
基因表達的定量本申請為分案申請，原申請的申請日為2003年9月5日，申請?zhí)枮?03824852. 2 (PCT/US2003/028081)，發(fā)明名稱為“基因表達的定量”。
背景技術(shù)：
在許多病理學的狀況，例如不同的良性和惡性腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、心臟病和自身免疫紊亂中檢測和定量差異表達的基因可對這些病理學狀況的診斷、預后和治療有用。 基因表達的定量也可用于診斷感染性的疾病和在分子水平上追蹤藥物或毒素的作用。例如，基因表達數(shù)據(jù)可用于確定藥物或毒素的藥理學機制(Libutti et al. , Microarray technology and gene expression analysis for the study of angiogenesis. Expert Opin Biol Ther. 2002 Jun ；2 (5) :545-56)。用于轉(zhuǎn)錄本檢測和定量的方法傳統(tǒng)上包括基于Northern-印跡雜交、核糖核酸酶保護分析、和逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈式反應(RT-PCR)的方法。然而，除缺少靈敏性(除RT-PCR 外)的缺點外，這些方法只可用于粗略地評估來自不同來源的樣本間每種轉(zhuǎn)錄本的相對表達的變化。基于RT-PCR的不同方法是為了診斷目的的最合適的定量方法，因為它們是很靈敏的并且因此只需要合乎診斷測試所需的小的樣本規(guī)模。如果想要比較樣品之間，甚至相同樣品內(nèi)的基因表達，需要絕對定量樣品中轉(zhuǎn)錄本的拷貝數(shù)。然而，由于PCR反應固有的非線性特性，利用基于PCR的方法很難定量核酸的拷貝數(shù)。PCR擴增可從指數(shù)階段變化到試劑耗盡或酶鈍化的平臺期階段。經(jīng)常地，必須分別確定PCR的指數(shù)階段，其可能包括在不同時間點對PCR反應進行取樣或利用不同稀釋度的模板進行PCR。進一步地，由于模板間擴增效率的差異，不能在線性范圍中直接比較不同 PCR產(chǎn)物的起始數(shù)量。傳統(tǒng)上在擴增完成后進行PCR產(chǎn)物的檢測。一般地，通過瓊脂糖凝膠電泳、用溴化乙啶染色、并且用紫外光顯現(xiàn)來區(qū)別PCR反應產(chǎn)物等分的大小。備選地，可以用熒光染料或放射性的分子標記引物。比較樣品間的條帶強度容許定性地估計擴增的模板的相對起始濃度，但是這個方法不是定量的并且不能確定絕對的拷貝數(shù)。已經(jīng)描述了許多基于定量的RT-PCR的方法，包括利用PCR和互補的DNA(cDNA) 陳列的 RNA 定量法(Shalon et al. , Genome Research6 (7) :639-45,1996 ；Bernard et al.，Nucleic Acids Research24 (8) : 1435-42，1996)、基于引物延伸反應的固相迷你測序方法(美國專利號 6，013，431，Suomalainen et al. Mol. Biotechnol. Jun ； 15 (2) :123-31, 2000)、離子對高效液相色譜(Doris et al. J. Chromatogr. A May 8 ；806(1) :47-60,1998), 和 5'核酸酶分析或?qū)崟r RT-PCR(Hoiland et al. Proc Natl Acad Sci USA88 :72767280, 1991)。研制提供靈敏和精確的定量mRNA轉(zhuǎn)錄本的方法將是有用的，其可以是容易地自動化操作的，并且規(guī)模擴大至容許測試大量樣品，以及克服與PCR擴增相關的問題。這種方法能夠診斷不同的病理學狀況，包括病毒、細菌和寄生蟲，以及不同的良性和惡性腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、心臟病和自身免疫紊亂。這種方法也提供以診斷、預后和治療為目的的定量令人感興趣的轉(zhuǎn)錄本，并且最終便于基因組藥理學的應用。這種方法也可提供對基因表達有影響的大量試劑的篩選。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及測定樣品中靶核酸的數(shù)量的方法，其中使用的標準物被設計成與目標基因或"靶核酸序列"相比具有一個堿基的差異。使用這種標準物與"增加"標準物與測試的核酸樣品中的差異的方法的結(jié)合可，利用例如，正好在突變位點進行的堿基延伸反應， 容許以相同的效率擴增標準和靶核酸，從而有助于定量靶核酸。此后使用定量"增加的" 標準和靶核酸樣品的手段來確定靶核酸的數(shù)量。在優(yōu)選的實施方案中，定量手段是質(zhì)譜法。本發(fā)明的方法是靈敏的、精確的和高度可重復的，并且它也不依賴于PCR循環(huán)的數(shù)目，而極大地使分析簡單化。本發(fā)明的方法是獨特的，因為可同時測量相同基因的不同等位基因，可獲得對基因表達的絕對定量，因此可直接比較來自不同實驗的數(shù)據(jù)，并且可用于高-通量分析而幾乎不需要為了 PCR進行優(yōu)化。另外，該方法容許精確地測定生物標本，例如人的液體(血清、血漿等)中的傳染物，例如病毒、細菌和寄生蟲的拷貝數(shù)。本發(fā)明提供定量生物標本中靶基因/核酸的數(shù)量或靶基因/核酸的多元性的方法，包括將已知濃度的核酸標準加入生物標本中，其中該標準被設計成與靶核酸序列具有一個堿基的差異；例如利用聚合酶鏈式反應用的靶和標準核酸擴增樣品，通過例如用磷酸酶(例如Sirimp堿性磷酸酶)處理擴增樣品以除去過量的dNTPs，并固此通過例如靶和標準核酸樣品中的不同堿基來增加標準和測試核酸之間的核酸差異。標準和靶核酸產(chǎn)生2種不同的產(chǎn)物，一般具有1個至2個堿基的差異，隨后進行定量?？筛鶕?jù)擴增樣品中存在的標準物的數(shù)量來計算轉(zhuǎn)錄本的濃度。例如，本發(fā)明能夠檢測，更重要的是定量傳染物。它可容易地用于高通量的方法， 其中在384-規(guī)格的硅芯片上可以定量大約100個傳染物。在一個優(yōu)選的實施方案中，利用MALDI-T0F質(zhì)譜法(例如，利用kquenom' s MassArray 系統(tǒng))根據(jù)"增加的"靶和標準核酸產(chǎn)物的不同質(zhì)量進行定量，其中使用質(zhì)譜中峰值的比率來計算標準物和靶核酸的比率?？梢愿鶕?jù)擴增前樣品中使用/加入的標準的初始量來計算轉(zhuǎn)錄本的濃度。在一個優(yōu)選的實施方案中，利用引物延伸方法來增強標準和靶核酸之間的核酸差
已在另一個實施方案中，利用熒光標記的dNTP/ddNTP進行堿基延伸來增強PCR后靶和標準中的核酸差異。在另一實施方案中，利用不同染料標記的ddNIPs增強PCR后靶和標準中的核酸差異，其中將不同染料標記的ddNIPs差異性地摻入到引物延伸反應中的靶和標準核酸中。在一個實施方案中，利用實時PCR來增強PCR后靶和標準中的核酸差異。在另一個實施方案中，利用基于雜交的方法來增強PCR后靶和標準中的核酸差異，其中2種寡核苷酸特異于設計用于雜交的靶或標準。在另一個實施方案中，利用熱測序技術(shù)來增強PCR后靶和標準中的核酸差異。在另一個實施方案中，利用使用人工的單核苷酸多態(tài)性(SNP)作為內(nèi)參照的第三浪潮侵入分析(Third Wave Invader assay)來增強PCR后靶和標準中的核酸差異。在備選的實施方案中，當使用焦磷酸測序時，不需要預擴增。在一個實施方案中，靶核酸是來自至少一種傳染物的核酸。在另一實施方案中，本發(fā)明提供一種試劑盒，其包括至少一個，優(yōu)選幾個不同的引物，該引物被設計成與不同小瓶中的至少一種，優(yōu)選幾種靶核酸相差一個核酸，或優(yōu)選地與所有的標準核酸相差一個核酸，該標準核酸以已知的預定濃度存在于適于PCR的緩沖液中，或在直接的增強反應中如上所述增加標準物和相應靶核酸之間的差異。該試劑盒也包括說明反應條件和利用標準核酸測量靶核酸數(shù)量的手冊。本發(fā)明預期的試劑盒包括但不限于用于確定生物樣品中傳染物數(shù)量的試劑盒和確定在施用醫(yī)藥或藥物后，或由于例如腫瘤的疾病狀況而預期有增減的一種或多種轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量的試劑盒。附圖簡述

圖1顯示用于測量基因表達的實時競爭性PCR和質(zhì)譜方法的流程圖。為簡單起見， 只顯示一個DNA鏈。在該流程圖中也顯示延伸的oligos —般為約20個堿基，而不是7個堿基。圖2顯示相同濃度相同oligo的峰面積分布。使用0. 3 μ m的01igo47%4(5' -AT GGCCACAGTTGTATCA-3‘)，并且將15nL點樣到用3-羥基吡啶甲酸(HPA)預點樣的硅芯片上。 相同芯片的不同位置、相同濃度斑點的oligos的絕對峰面積顯示平均峰面積為12395(任意數(shù))和標準偏差為3737的適度變異性。圖3A和;3B顯示質(zhì)譜中峰面積比與oligo的濃度比準確相關。Courtesy of Kal Tang(Sequenom)。利用 MassArray (Sequenom)分析 4. 5nL 的不同比率的 2 種 oligo 混合物溶液(1 1、1 2、1 5、1 IOU 20)。圖3A顯示質(zhì)譜，而圖顯示質(zhì)譜中實際濃度比率對信號強度(峰面積)比率的折線圖。圖4A-4E顯示以不同比率混合的僅有一個堿基不同的2種DNA模板的質(zhì)譜。在圖 4A中比率是1 1;在圖4B中比率是3 1;在圖4C中比率是10 1;在圖4D中比率是 1 3;而在圖4E中比率是1 10，但是總濃度固定OXlO—ig/yL)。通過PCR(30個循環(huán))、堿基延伸(40個循環(huán))來擴增模板，然后點樣到用3-羥基吡啶甲酸(HPA)預點樣的硅芯片上，并且用MALDI-T0F分析。圖5顯示推定的DNA濃度比和測量的DNA濃度比(由峰面積比表示)之間的相關性。PCR擴增分別是20、30和40個循環(huán)，結(jié)果是不依賴于PCR-循環(huán)。各個數(shù)據(jù)點重復4 次(n = 4)并顯示誤差線。圖6顯示利用實時競爭性PCR和質(zhì)譜的基因表達(GAPDH、HMBS和CXCR4)分析。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及測量樣品中基因表達或核酸量的新方法。這個方法組合了競爭性的 PCR(聚合酶鏈式反應)、堿基延伸以及此后進行的測量。該方法可用于直接測量特異性基因的拷貝數(shù)，或比較來自不同樣品的特異性基因的上調(diào)或下調(diào)。將已知濃度的標準核酸(DNA或RNA)加入RNA樣品(用于RNA標準)或逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(用于DNA標準)中。然后通過PCR擴增包括標準物的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。將該標準物設計成與目標基因，即靶核酸相比具有一個堿基突變的差異。因此，在PCR中以相同的效率擴增標準物和靶核酸?？衫美缯迷谕蛔兾稽c處進行的堿基延伸反應來鑒定這2種核酸。因此通過多種方式中的任何一種，優(yōu)選通過質(zhì)譜(MALDI-T0F，或矩陣輔助的激光解吸電離-飛行時間)測量PCR產(chǎn)物的數(shù)量。來自標準物和目標基因的產(chǎn)物之間的峰面積比代表了標準物和目標基因的比率。既然已知標準的濃度，可以計算目標基因的濃度。在至少下列的方面中，本發(fā)明的方法是獨特的。首先，可選擇基因的自然突變來構(gòu)建標準物。因此，不僅可以測量基因的表達水平，而且可以確定表達基因的基因型。第二， PCR中單一點突變的使用確保了幾乎等同的擴增。這消除了由其他競爭性PCR方法中的差異擴增產(chǎn)生的問題，在這些競爭性的PCR中，所述的標準物一般與基因是不同長度的。在優(yōu)選的實施方案中，堿基延伸和MALDI-TOF MS檢測的組合也消除了來自常規(guī)的檢測方法，例如凝膠電泳遇到的形成異源雙鏈的問題。來自標準物的延伸產(chǎn)物也在 MALDI-TOP MS中起內(nèi)標準的作用。因此，當加入到反應中的標準物的數(shù)量是已知的時，可定量地測量核酸的數(shù)量。這個方法具有至少下列優(yōu)點。首先，這個方法在PCR中幾乎不需要優(yōu)化。第二，這個方法不依賴于PCR循環(huán)的數(shù)目。第三，該方法是高度精確的、靈敏的和可重復的。第四， 該方法可用于高通量的基因表達分析，其中在一個384-硅芯片上可以測量至少50-100個、 甚至達到至少1000個基因的表達。如下列實施例所示，通過這個方法分析在人的培養(yǎng)細胞中GAPDH、HMBS和CXCR4的
表達可產(chǎn)生與其他方法一致的結(jié)果。如在此所使用的，術(shù)語"生物樣品"是指從任何來源(例如人、動物、植物、細菌、 真菌、原生生物、病毒)獲得的任何生物材料。為了用于本發(fā)明，該生物樣品應包含核酸分子。用于本發(fā)明的合適的生物樣品的實例包括固體材料(例如組織、細胞沉淀顆粒、活檢樣品)和生物液體(例如尿液、血液、唾液、羊水、漱口劑)。可利用本領域已知的許多方法中的任何一種從特定的生物樣品分離核酸分子，其中選擇適于特定的生物樣品的特定分離方法。病毒、細菌、真菌和其他感染性的生物體包含與宿主細胞中含有的序列不同的獨特的核酸序列。檢測或定量特異于感染性生物體的核酸序列對于診斷或監(jiān)測感染是很重要的。感染人和動物，并且可通過已公開的方法檢測的致病病毒的實例包括逆轉(zhuǎn)錄病毒科(例如，人類免疫缺陷性病毒、例如HIV-I (也稱為HTLV-III、LAV或HTLV-III/ LAV、參見 Ratner, L. et al.，Nature, Vol. 313，Pp. 227-284(1985) ；Wain Hobson, S. et al, Cell, Vol. 40 :Ρρ·9-17 (1985)) ；HIV_2(參見 Guyader et al.，Nature, Vol. 328, Pp. 662-669(1987)；歐洲專利公開號0269520 ；和其他分離物，例如HIV-LP(國際公開號 W094/00562，題目為“新的人免疫缺陷病毒”；小RNA病毒科(例如，脊髓灰質(zhì)炎病毒、甲型肝炎病毒、(Gust, I.D.等人，Intervirology, Vol. 20，Ppl_7 (1983)；腸道病毒屬、人柯薩奇病毒、鼻病毒、艾柯病毒)；環(huán)狀病毒科(例如，導致腸胃炎的毒株)；披蓋病毒科(馬腦炎病毒、風疹病毒)、黃病毒科(登革熱病毒、腦炎病毒、黃熱病毒)；冠狀病毒科(例如，冠狀病毒)；棒狀病毒科(例如水泡性口炎病毒、狂犬病毒)；纖絲病毒科(例如埃波拉病毒)； 副黏病毒科(副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)；正黏病毒科(流感病毒)；Bungaviridae (例如，Hantaan viruses、bunga 病毒、phleboviruses 禾口 Nario 病毒)； 沙粒病毒科(出血熱病毒)；呼腸孤病毒科(呼腸孤病毒、環(huán)狀病毒和輪狀病毒)；雙RNA病毒科；嗜肝DNA病毒科(乙型肝炎病毒)；細小病毒科(細小病毒)；乳多空病毒科(乳頭狀瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(大多數(shù)腺病毒)；皰疹病毒科(1和2型單純性皰疹病毒 (HSV)、水痘帶狀皰疹病毒、巨細胞病毒(CMV)、皰疹病毒)；痘病病毒(天花病毒、牛痘病毒、 痘病毒)；虹彩病毒(例如，非洲豬瘟病毒)；以及未分類的病毒(例如，海綿狀腦病的病原體、丁型肝炎的病原體(認為是乙型肝炎病毒的缺陷型衛(wèi)星)、非甲非乙型肝炎的病原體(1類=內(nèi)部傳遞的；2類=非腸道傳遞的)(即丙型肝炎)；Norwalk及相關病毒，以及星形病毒)。傳染性細菌的實例包括幽門螺桿菌、布氏疏螺旋體、嗜肺軍團菌、分枝桿菌屬(例如結(jié)核分枝桿菌、貪食分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、戈登分枝桿菌)、金黃色葡萄球菌、淋病奈瑟氏球菌、腦膜炎奈瑟氏球菌、單核細胞增生利斯特氏菌、釀膿鏈球菌(A群鏈球菌)、無乳鏈球菌(B群鏈球菌)、鏈球菌(綠色群)、糞鏈球菌、牛鏈球菌、鏈球菌(厭氧種)、肺炎鏈球菌、致病的彎曲桿菌屬、腸球菌屬、流感嗜血菌、炭疽芽孢桿菌、白喉棒桿菌、 棒桿菌屬、豬紅斑丹毒絲菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、破傷風梭菌、產(chǎn)氣腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、多殺巴斯德氏菌、擬桿菌屬、具核梭桿菌、念珠狀鏈桿菌、徹白密螺旋體、極細密螺旋體、鉤端螺旋體和衣氏放線菌。這種技術(shù)可直接用于開發(fā)高通量和精確的基因表達分析。其也可用于開發(fā)用于診斷疾病的測量至少大約2、5、10、25、50-100以及達到至少1000個基因的臨床診斷芯片。用于“增強”其中已經(jīng)根據(jù)本發(fā)明的方法增強了標準物和靶核酸之間堿基差異的 PCR產(chǎn)物的方法包括但不限于PYROSEQUENCING 、實時PCR、基于雜交的技術(shù)、第三浪潮侵入分析、基于熒光的PCR技術(shù)、固相迷你側(cè)序。隨后可利用例如MALDI-T0F質(zhì)譜法(MS)，通過增強的靶和標準核酸之間的質(zhì)量差異定量“增強的”PCR產(chǎn)物。本發(fā)明所使用的術(shù)語“增強，，意在涵蓋了使得靶和標準核酸包括質(zhì)量差異的不同技術(shù)。由于標準物和靶核酸優(yōu)選地只具有一個堿基的差異，因此可對其加以鑒別，并且利用標記核酸的引物延伸技術(shù)擴增或增強該差異。備選地，可利用等位基因特異的雜交探針或不同產(chǎn)物的酶切割，類似于INVADER分析而產(chǎn)生質(zhì)量差異。在一個實施方案中，通過為合成所必需的測序的PYROSEQUENCING (Uppsala，瑞典)來增強只有一個堿基不同的PCR產(chǎn)物。首先將設計為直接鄰近于靶和標準物之間的不同核酸的測序引物與單標準的、PCR擴增的、包括靶和標準PCT產(chǎn)物的DNA模板雜交，并且與酶、DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和腺苷三磷酸雙磷酸酶以及底物、磷酸硫酸化 5'腺苷酸(APQ和熒光素孵育。然后將4種三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)中的一種，例如相應于存在于標準模板中的核苷酸加入反應中。DNA聚合酶催化dNTP摻入到標準的DNA鏈中。 各個摻入事件伴隨有與摻入核苷酸的數(shù)量等摩爾數(shù)量的焦磷酸(PPi)的釋放。因此，ATP硫酸化酶在存在磷酸硫酸化5'腺苷酸時定量地將PPi轉(zhuǎn)化為ATP。這個ATP將熒光素的熒光素酶-介導的轉(zhuǎn)化驅(qū)動為產(chǎn)生與ATP的數(shù)量成比例的數(shù)量的可見光的氧化熒光素。通過電荷耦合裝置(CCD)照相機檢測在熒光素酶-催化反應中產(chǎn)生的光并且視為PYR0GRAM 中的峰值。各個光信號與摻入的核苷酸的數(shù)目成比例，并且容許確定標準核酸序列的數(shù)量。此后，腺苷三磷酸雙磷酸酶，一種降解核苷酸的酶連續(xù)地降解未摻入的dNIPs和過量的ATP。 當完成降解作用時，加入相應于存在于待確定數(shù)量的靶模板中的dNTP的另一種dNTP。最后，一次加入一種dNTPs。使用脫氧腺苷α-硫代三磷酸(dATPM)作為天然脫氧腺苷三磷酸(dATP)的替代物，因為其通過DNA聚合酶而不是由熒光素酶辨別來被有效地使用。因為加入PCR中的標準物的數(shù)量是已知的，可從摻入的dNIPs的比率來計算靶的數(shù)量。關于反應條件的詳細信息，參見例如美國專利號6，210，891，其在此全部引入作為參考?？捎糜谠黾覲CR產(chǎn)物的標準物和靶核酸之間的堿基差異的方法的另一個實例是實時PCR。所有的實時PCR系統(tǒng)依賴于熒光報告子的檢測和定量，熒光報告子信號的增加與反應中PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比。根據(jù)本發(fā)明的有用的實時PCR方法的實例包括，TaqMan 和分子信標，兩者都是用于定量的依賴于熒光共振能量傳遞(fret)的雜交探針。TaqMan探針是在5'堿基上一般包含熒光染料，而在3‘堿基上一般定位有淬滅染料的寡核苷酸。當照射時，激發(fā)的熒光染料將能量轉(zhuǎn)移到附近的淬滅染料分子上而不是發(fā)熒光，從而產(chǎn)生非熒光的底物。設計TaqMan探針能夠與PCR產(chǎn)物內(nèi)部的區(qū)域雜交(ABI 7700 (TaqMan ), Applied BioSystems, Foster City，CA)。因此，設計 2 種不同的引物，一種與靶雜交，而另一種與標準的核酸模板雜交。因此容許引物與實時PCR反應中的相應核酸雜交。在PCR期間，當聚合酶復制其上結(jié)合有TaqMan探針的模板時，該聚合酶的5 ‘核酸外切酶活性切割探針，因此這使熒光染料和淬滅染料分離開來而不再發(fā)生FRET。在每個循環(huán)中熒光增加，并與探針裂解的速率成比例。分子信標也包含熒光和淬滅染料，但是只有當淬滅染料直接鄰近于熒光染料時才發(fā)生FRET。設計分子信標使其具有發(fā)夾同時游離在溶液中，使得熒光染料和淬滅染料更為接近。因此，設計2種不同的分子信標，一種識別靶而另一種識別標準的核酸。當分子信標與靶和標準核酸雜交時，熒光染料和淬滅劑分離開來，F(xiàn)RET不再發(fā)生，因此熒光染料在照射下發(fā)光。不同于TaqMan探針，分子信標被設計成在擴增反應期間保持完整，并且在每個循環(huán)中必須與靶再結(jié)合來用于信號測量。TaqMan探針和分子信標容許測量相同樣品中的多種DNA種類(多重PCR)，因為具有不同發(fā)射光譜的熒光染料可能結(jié)合不同的探針，例如將不同的染料用于制備標準探針和靶探針。多重PCR提供共-擴增的內(nèi)對照，并且容許單試管、同質(zhì)分析中的等位基因鑒別。(Ambion Inc, Austin, TX, TechNotes 8 (1)-2001年2月， Real-time PCR goes prime time)。用于增加靶和標準核酸之間差異的另一方法是例如用于固相“迷你”測序(Hultman, et al.,1988, Nucl. Acid. Res. ,17,4937-4946 ；Syvanen et al. ,1990, Genomics, 8，684-692)的弓|物延伸方法。在原始的報道中，測量放射性標記的核苷酸的摻入并用于分析人脫脂蛋白E基因的三等位多態(tài)性?？勺兒塑账岬臋z測方法是基于檢測步驟中引物的延伸和可檢測的三磷酸核苷的摻入。通過從緊鄰于可變核苷酸的區(qū)域選擇檢測步驟的引物，可在摻入幾乎只有一個三磷酸核苷后檢測到這個變化。加入相配于可變核苷酸的標記的三磷酸核苷，并且測量摻入到檢測步驟引物中的標記。使該檢測步驟的引物退火至靶核酸的拷貝，將包含包括至少一個標記的或修飾的三磷酸核苷的一種或多種三磷酸核苷的溶液在促進引物延伸的條件下與聚合劑一起加入?？墒褂脴擞浀拿撗鹾颂呛塑杖姿?(dNTPs)或端鏈雙脫氧核糖核苷三磷酸(ddNIPs)，并且標記優(yōu)選為染料，包括熒光染料。固相“迷你”測序方法在例如美國專利號6，013，431和Wartiovaara和Syvanen，Quantitative analysis of human DNA sequences by PCR and solid-phase minisequencing. Mol Biotechnol 2000Jun ； 15 (2) 123-131 中有描述。另一個增加PCR產(chǎn)物中靶和標準核酸之間差異的方法是利用熒光標記的dNTP/ ddNIPs。除在固相“迷你”測序方法中使用熒光標記之外，可使用標準的核酸測序凝膠來檢測摻入PCR擴增產(chǎn)物的熒光標記的數(shù)量。設計測序引物使其能退火至緊接于從模板辨別標準物的堿基上。利用以熒光染料標記的端鏈雙脫氧核糖核苷三磷酸(ddNTPs)進行引物延伸反應，將一個結(jié)合ddNTP的標記加入標準核酸中，而另一個結(jié)合ddNTP的標記加入靶核酸中。此后利用熒光檢測核酸測序儀中的變性凝膠或利用毛細管凝膠電泳分離引物延伸產(chǎn)物，摻入到標準物和靶核酸中的熒光標記的數(shù)量導致熒光峰，從峰的大小確定該數(shù)量。標準的熒光測序方法是本領域技術(shù)人員已知的(例如，參見Amersham Life Sciences, Uppsala, 瑞典，禾口 Applied Biosystems, Foster City, CACity, CA)。備選地，可使用INVADER 分析(Third Wave Technologies, Inc (Madison, WI))。這個分析一般是基于多種酶的結(jié)構(gòu)特異的核酸酶活性，使用這種酶切割靶依賴的裂解結(jié)構(gòu)，由此指明樣品中存在特異的核酸序列或其特異的變化(參見，例如美國專利號 6，458，535)。例如，INVADER 操作系統(tǒng)(OS)提供用于檢測和定量DNA和RNA的方法。 INVADER OS是以"完全匹配"的酶-底物反應為基礎的。INVADES OS使用專有的 CLBAVASE 酶(Third Wave Technologies, Inc (Madison, WI))，其識別并且只切割在INVADER 過程期間形成的特異結(jié)構(gòu)。INVADER os依賴于由INVADER0 過程產(chǎn)生的信號的線性擴增，而不是依賴于靶的指數(shù)擴增。這就容許定量靶的濃度。在INVADER 過程中，使2種短的DNA探針與靶雜交以形成被CLEAVASE 酶辨別的結(jié)構(gòu)。然后該酶切割一個探針而釋放短的DNA"片狀結(jié)構(gòu)(flap)"。各個釋放的片狀結(jié)構(gòu)結(jié)合熒光-標記的探針而形成另一個斷裂結(jié)構(gòu)。當CLEAVASE 酶切割標記的探針時，該探針發(fā)射可檢測的熒光信號。定量的優(yōu)選方法是MALDI-T0F MS。利用MALDI-T0F MS定量的方法的細節(jié)如下在實施例中給出。本發(fā)明也預期包括至少一種、優(yōu)選幾種不同引物的試劑盒，設計該引物使其與在單獨的小瓶或試管中的至少一種，優(yōu)選與幾種靶核酸相差一個核酸，或優(yōu)選地與一組在相同小瓶或試管中的具有已知量的干燥的標準核酸、包括至少2種不同的標準物的組合標準物有一個核酸不同，并且含有在合適的緩沖液，例如PBS中稀釋樣品至已知濃度，以用于定量反應的說明書。備選地，在合適的緩沖液，例如PBS中以已知的濃度預先稀釋標準物。合適的緩沖液可以是適于儲備核酸或適于例如PCR或直接的增強反應，以如上所述增加標準物和相應靶核酸之間的差異，或該緩沖液剛好適于儲備樣品并且提供單獨的稀釋緩沖液而更適于后繼的PCR、增強和定量反應。在優(yōu)選的實施方案中，將所有的標準核酸組合在有緩沖液的一個試管或小瓶中，使得只向包含靶核酸的核酸樣品加入一個標準混合物。該試劑盒優(yōu)選也包括說明反應條件和利用標準核酸或其混合物測量靶核酸的數(shù)量并且給出所有標準物的詳細濃度和緩沖液種類的手冊。本發(fā)明預期的試劑盒包括但不限于用于確定生物樣品中傳染物數(shù)量的試劑盒和確定在施用醫(yī)藥或藥物后，或由于例如腫瘤的疾病狀況而預期有增減的一種或多種轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量的試劑盒。
實施例MALDI-T0F MS 是定量的在MassArray系統(tǒng)中絕對信號(通過質(zhì)譜中的峰面積測量的)在MALDI-TOF MS試驗中是相對穩(wěn)定的(圖2)。這對于精確的定量分析是夠好的。然而，利用類似序列的oligo 作為內(nèi)對照，我們可以精確地測量oligo的濃度(圖3)。在2個DNA混合物系統(tǒng)中不依賴于PCR循環(huán)數(shù)的實時競爭性的PCR操作。在這個實驗中，以恒定的總濃度為^KTyg/yL的不同比率(10 1、3 1、 1 1、1 3、1 10)混合僅僅只有一個核苷酸不同的2種DNAs。用HotStart DNA聚合酶進行PCR擴增，然后通過Sirimp堿性磷酸酶(SAP)處理以除去過量的dNIPs。然后，用ThermoSequenase與適當ddNTP/dNTP的混合物(一般為3種不同的ddNTP和一種dNTP)進行堿基延伸實驗。通過MALDI-T0F檢測延伸產(chǎn)物，并且用RT (實時)軟件(kquenom Inc.) 分析峰面積。圖4顯示來自5種不同比率的模板混合物的質(zhì)譜。圖5顯示質(zhì)譜中峰面積比和為了分析而預確定的DNA模板比率之間的相關性。對另一對2種DNAs重復相同的實驗并且獲得了與上述相似的結(jié)果。這些原始數(shù)據(jù)明顯地顯示，至少在這個簡單的人工系統(tǒng)中，與質(zhì)譜法鑒定聯(lián)合的實時競爭性的PCR是測量基因表達的潛在的精確方法。測量的峰面積比與達到100倍范圍的已知DNA濃度比成線性相關(R2 > 0. 999)?？梢暂p易地延伸在標準DNA的100-倍離析下的3個梯度至動態(tài)范圍為106，而這足以用于大多數(shù)的實際應用。測試用于人類基因表達的實時競爭性的PCR通過這個實時競爭性的PCR和MALDI-T0F方法分析培養(yǎng)細胞中GAPDH、HMBS和 CXCR4的表達。向cDNA樣品中分別加入增加濃度的每種基因的競爭物。通過實時競爭性的 PCR和MALDI-TOF MS測量內(nèi)源基因及其競爭物的頻率。既然我們已知競爭物的濃度，就可以計算目標基因的表達水平。擴大高通量基因表達分析的規(guī)模微陣列是用于以小的群體/條件規(guī)模(一般不多于50)篩選數(shù)以萬計的基因的理想(至少目前是)方法。一般通過一些在對照和樣品之間顯著不同的統(tǒng)計標準選擇幾百個基因。例如，Golub等人報道利用38個骨髓樣品的微陣列分析，選擇能夠共同鑒別急性淋巴母細胞性白血病(ALL)和急性的骨髓性白血病(AML)的50個基因。來自小樣本規(guī)模的 (38個樣品)的大的統(tǒng)計自由度和大的基因數(shù)目規(guī)模(6817個)，連同微陣列方法的低精確度，使得人們明顯懷疑在更大的患者樣本規(guī)模上這個預測值(50個基因)能夠進行得有多好。從經(jīng)濟學上來說，在數(shù)百個患者樣本的規(guī)模上用微陣列測試這個是不可行的。在我們的方法中，我們可以在384個芯片上輕易地測量大約100個基因的表達，并且可以測試數(shù)以百計的患者樣品。微陣列是高通量基因數(shù)目方式的，而我們的方法是高通量患者數(shù)目方式的，其可使得這兩種方法高度互補。我們也可使用這個方法來研究基因表達的化學計量。這里科學的假定是，作為功能單元工作密切的基因(或其產(chǎn)物，蛋白質(zhì))同樣將具有相似的表達水平。已經(jīng)使用質(zhì)譜法分析了蛋白質(zhì)復合物(Gavin et al. , Ho et al.)。我們可以分析相同復合物中這些基因的mRNA表達，并且評估這些組合的化學計量。計算第一個問題是PCR oligo設計。對于其他的RT-PCR方法，例如實時PCR，如果對于你的目標基因擴增是非特異性的，則它可能是失敗的，因為它將導致對表達水平明顯的估計不足。并且更壞的是，非特異性的擴增可能依賴于樣品。在我們的情況中，既然我們在目標基因的相同反應中總是具有內(nèi)標準，這個問題應該是不嚴重的。如上所述，對避免非特異性的擴增來說它仍然是很重要的。設計擴增oligos中的另一個問題出現(xiàn)在倍增PCR中。 此外應該注意避免弓丨物-引物之間的相互作用。計算機應用和統(tǒng)計技術(shù)也可應用于分析波譜。在MALDI-T0F實驗中，通過激光束擊中相同樣品斑點的5個不同位置。并且，如果我們對每種樣品進行4次重復，我們將具有 20個數(shù)據(jù)點；足以應用統(tǒng)計模型例如正態(tài)分布來更精確地計算峰比率。另一個問題是標準化。已經(jīng)使用多種管家基因(GAPDH、β-肌動蛋白、親環(huán)蛋白、ISsrRNA)。使用這些基因的組合來進行標準化可能是更好的。參考文獻1. Amexis, G. ,et al. , Quantitative mutant analysis of viral quasispecies by chip-based matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Proc Natl Acad SciU S A, 2001. 98(21) :p. 12097-102.2.Bittner, M. ， et al. ， Molecular classification of cutaneous malignant melanoma by gene expression profiling. Nature,2000. 406(6795) :p. 536-40.3. Cho, R. J. , et al. ,A genome-wide transcriptional analysis of the mitotic cell cycle. Mol Cell, 1998. 2 (1) :p. 65-73.4. Freeman, W. M. ，S. J. Walker, and K. E. Vrana, Quantitative RT-PCR :pitfalls and potential. Biotechniques，1999. 26.5. Gavin, A. C.，et al.，F(xiàn)unctional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature,2002. 415(6868) :p· 141-7.6. Golub, T. R.，et al.，Molecular classification of cancer class discovery and class prediction by gene expression monitoring. Science，1999， 286(5439) :p. 531-7.7. Hayward-Lester, A.，P. J. Oefner, and P. A. Doris，Rapid quantification of gene expression by competitive RT-PCR and ion-pair revers ed—phase HPLC. Biotechniques，1996，20(2) :p.250-7.8. Ho, Y. , et al. , Systematic identification of protein complexes inSaccharomyces cerevisiae by mass spectrometry. Nature,2002.415 (6868) p. 180-3.9. Hughes, T. R.，et al.，F(xiàn)unctional discovery via a compendium of expression profiles. Cell, 2000. 102(1) :p. 109-26.10.Jurinke, C. ， et al. ， Automated genotyping using the DNA MassArray technology. Methods Mol Biol，2001. 170 :p.103-16.11.Libutti, S. K. and N. G.Costouros, Microarray technology and gene expression analysis for the study of angiogenesis. Expert Opin Biol Ther, 2002. 2(5) :p. 545-56.12. Livak，K. J.，et al.，Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization. PCR Methods Appl,1995. 4 (6) :p. 357-62.13. Lockhart, D. J.，et al.，Expression monitoring by hybridization to high-density oligonucleotide arrays. Nat Biotechnol,1996.14(13) :p· 1675-80.14. McCulloch，R. K.，C. S. Choong，and D. M. Hurley, An evaluation of competitor type and size for use in the determination of mRNA by competitive PCR.PCR Methods Appl, 1995. 4 (4) :p. 219-26.15. Prediger, E. A.，Detection and quantitation of mRNAs usingribonuclease protection assays. Methods Mol Biol, 2001. 160 :p.495-505.16. Prediger, Ε. Α.，Quantitating mRNAs with relative and competitive RT-PCR. Methods Mol Biol，2001. 160 :p. 49-63.17. Zhang，J.，I. N. Day, and C. D. Byrne, A novel medium throughput quantitative competitive PCR technology to simultaneously measure mRNA levels from multiple genes. Nucleic Acids Res,2002. 30(5) :p. e20.在此和整個說明書中所引用的參考文獻于此全部引入作為參考。
權(quán)利要求
1.一種測定生物樣品中靶核酸序列的數(shù)量的方法，包括下列步驟a)通過加入已知量的標準核酸來制備樣品，該標準核酸具有與包含靶核酸的生物標本的靶核酸序列相比至少有一個堿基不同的核苷酸序列，由此在靶和標準核酸之間產(chǎn)生區(qū)別位點；b)擴增步驟a)的樣品；c)增加該標準和該靶核酸序列之間在區(qū)別位點處的差異；以及d)通過測量擴增的靶核酸與擴增的標準核酸的比率來定量步驟 c)的增加的產(chǎn)物，以測量存在于生物樣品中的靶核酸序列的數(shù)量。
2.權(quán)利要求1的方法，其中靶核酸來自于傳染物。
3.權(quán)利要求1的方法，其中靶核酸是mRNA轉(zhuǎn)錄本。
4.權(quán)利要求1的方法，其中利用MALDI-T0F質(zhì)譜法進行定量。
5.權(quán)利要求1的方法，其中利用在區(qū)別位點處的引物延伸進行步驟C)。
6.權(quán)利要求1的方法，其中利用在區(qū)別位點處的等位基因特異的酶裂解進行步驟C)。
7.權(quán)利要求1的方法，其中利用在區(qū)別位點處的等位基因特異的雜交進行步驟C)。
8.權(quán)利要求1、5、6、和7的方法，其中利用MALDI-T0F質(zhì)譜法進行定量。
9.一種試劑盒，包括包含在試管中的、至少一種設計成與至少一種相應的靶核酸不同的標準核酸，以及關于如何使用標準物根據(jù)權(quán)利要求1的方法定量核酸樣品中相應靶核酸的數(shù)量的用法說明。
全文摘要
本發(fā)明涉及測定樣品中靶核酸的數(shù)量的方法，其中將使用的標準物設計成與目標基因或″靶核酸序列″相比具有一個堿基的差異。使用這種標準物與方法結(jié)合來″增加″標準物和測試的核酸樣品中的差異，其中利用例如，正好在突變位點進行的堿基延伸反應而容許以相同的效率擴增標準物和靶核酸，從而有助于定量靶核酸。此后使用定量″增加″的標準物和靶核酸樣品的方式來確定靶核酸的數(shù)量。在優(yōu)選的實施方案中，該定量方式是質(zhì)譜法。
文檔編號G01N33/50GK102344960SQ20111028273
公開日2012年2月8日 申請日期2003年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月6日
發(fā)明者C·R·坎托爾, C·丁 申請人:波士頓大學信托人