專利名稱：：一種重組多型漢遜酵母菌及其專用重組表達載體與應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種重組多型漢遜酵母菌及其專用重組表達載體與應用。技術背景尿酸氧化酶(Urateoxidase，Uricase，EC.1.7.3.3)是生物體內嘌呤降解代謝途徑中的一種酶，催化尿酸氧化為尿囊素和過氧化氫，尿囊素是除人和猿類以外的其它哺乳動物嘌呤代謝的排泄物。但在高等哺乳動物(猿和人類)體內沒有尿酸氧化酶，而以尿酸作為嘌呤代謝的終產(chǎn)物。尿酸及其鹽類在血液中溶解度很低，如果體內嘌呤代謝紊亂，產(chǎn)生過量尿酸，或者尿酸排泄受阻，血液中尿酸濃度增高，形成高尿酸癥，長期尿酸過高就會引起痛風。尿酸氧化酶是一種重要的醫(yī)藥用酶。在臨床上，被廣泛用于尿酸的檢測及痛風、高尿酸血癥和腫瘤溶解綜合征的治療。微生物是尿酸氧化酶的重要來源，目前來源于細菌、酵母菌和絲狀真菌的尿酸氧化酶已被分離。但天然來源的尿酸氧化酶由于受產(chǎn)酶條件及產(chǎn)酶水平的影響，而限制了在商業(yè)化生產(chǎn)中的有效應用，因此尿酸氧化酶的異源表達逐漸成為研究的熱點。已有不同來源的尿酸氧化酶在大腸桿菌和釀酒酵母中進行了異源表達，雖然都獲得了有生物活性的蛋白質產(chǎn)物，但仍然存在酶產(chǎn)量低，分離純化程序復雜的問題。更為重要的是天然來源的酶或在大腸桿菌和釀酒酵母中異源表達的酶抗原性高，必須經(jīng)過修飾才能應用于臨床治療上。近年來，漢遜酵母作為外源基因表達系統(tǒng)越來越受到人們的重視。由于其表達的外源蛋白抗原性低而成為生產(chǎn)具有重要醫(yī)用價值蛋白質的理想的微生物細胞工廠。但目前在國內外還沒有尿酸氧化酶在漢遜酵母中表達的報道。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是提供一種重組多型漢遜酵母菌及其專用重組表達載體與應用。本發(fā)明所提供的重組表達載體，是含有如下表達盒的重組酵母表達載體；所述表達盒從上游至下游依次包括甲醇氧化酶基因的啟動子、尿酸氧化酶基因和轉錄終止子。其中，上述重組表達載體中的所述尿酸氧化酶基因為編碼如下蛋白(a)或(b)的基因(a)由GenBankAcessionNo.BM06804的自氨基末端第1—303位所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)在(a)限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸殘基且具有尿酸氧化酶活性的由(a)衍生的蛋白質。本發(fā)明中所述尿酸氧化酶基因來源于產(chǎn)朊假絲酵母(Ai/"h's)CGMCC2.120(中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心)。并且，所述表達盒還包括釀酒酵母a因子信號肽的編碼序列，所述釀酒酵母a因子信號肽的編碼序列位于所述甲醇氧化酶基因的啟動子和所述尿酸氧化酶基因之間，且與所述尿酸氧化酶基因形成融合基因。其中，所述釀酒酵母a因子信號肽的編碼序列是編碼如下蛋白的DNA分子由GenBankAcessionNo.M55016的自氨基末端第1一89位所示的氨基酸序列組成的蛋白質；所述重組表達載體中含有的所述甲醇氧化酶基因啟動子為如下a)或b)的DNA分子a)GenBankAcessionNo.A11156的核苷酸序列自5'端1-1510位脫氧核糖核苷酸所示的DNA分子；b)嚴格條件下與a)限定的DNA序列雜交的DNA分子；上述嚴格條件可為在0.1XSSPE(或0.1XSSC)，0.1%SDS的溶液中，在65T下雜交并洗膜。所述酵母表達載體具體可為pGAPZ-alpha-A，所述乙醇氧化酶基因的終止子序列來源于所述載體pGAPZ-alpha-A，所述載體pGAPZ-alpha-A上還帶有Zeocin抗性基因。本發(fā)明提供的重組多型漢遜酵母也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明所述的重組多型漢遜酵母菌(^a/^e/^a/oJy/Hor/7力a)，是將所述重組表達載體導入多型漢遜酵母菌中得到重組菌。所述載體導入的酵母宿主優(yōu)選為多型漢遜酵母(vfe/^朋"7apo/y邁orp力a)CGMCC2.2498。本發(fā)明得到的能穩(wěn)定分泌表達尿酸氧化酶的重組多型漢遜酵母菌(泡/7se加7a/o7/歷or/7力a)HPMU6，已于2008年1月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)大屯路)，保藏編號為CGMCCNo.2351。其菌落呈凸起狀、乳白色、有光澤、邊緣整齊，細胞呈橢圓形，該菌株的最適生長溫度為37。C，生長最適pH為5.5。本發(fā)明中構建所述重組多型漢遜酵母的方法包括以下步驟1)構建適用于外源基因在多型漢遜酵母中進行表達的載體pMOXZ-alpha-A;2)將產(chǎn)朊假絲酵母尿酸氧化酶的編碼序列WZw插入到載體pMOXZ-alpha-A的多克隆位點，獲得表達載體pMOXZ-alpha-U0Xu。3)線性化的表達載體pMOXZ-alpha-UOXu電轉化多型漢遜酵母(泡/7se/whpWy/z/or/^a)CGMCC2.2498，獲得產(chǎn)尿酸氧化酶的重組多型漢遜酵母菌株。本發(fā)明所述重組多型漢遜酵母菌可在生產(chǎn)尿酸氧化酶中的應用。重組多型漢遜酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)尿酸氧化酶具體過程包括斜面菌種培養(yǎng)、液體菌種培養(yǎng)、液體種子培養(yǎng)、發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)。其中所述斜面菌種培養(yǎng)、液體菌種培養(yǎng)、液體種子培養(yǎng)和發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基為分別含有l(wèi)ml/100ml、2ml/100ml、4ml/100ml甘油的YPG培養(yǎng)基，pH為5.5-7.0。在生產(chǎn)過程中，向發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基中流加0.5ml/100ml甲醇誘導所述尿酸氧化酶的表達。尿酸氧化酶是重要的醫(yī)學用酶，有效地提高尿酸氧化酶的產(chǎn)量和降低其免疫原性對尿酸氧化酶在醫(yī)學領域的廣泛應用至關重要。多型漢遜酵母是醫(yī)用蛋白進行異源表達的理想的宿主系統(tǒng)。本發(fā)明在國內外首次實現(xiàn)了尿酸氧化酶在多型漢遜酵母中的表達，利用甲醇氧化酶基因啟動子和釀酒酵母a因子信號肽序列實現(xiàn)尿酸氧化酶的誘導性分泌表達，利用甲醇氧化酶基因啟動子序列為同源整合位點使尿酸氧化酶多拷貝整合到多型漢遜酵母染色體上，獲得遺傳穩(wěn)定的重組菌株。重組多型漢遜酵母HPMU6CGMCC2351的生理生化特性與常規(guī)的多型漢遜酵母沒有明顯差異，對發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件沒有特殊要求，通過在簡單培養(yǎng)基中的高密度發(fā)酵可以實現(xiàn)尿酸氧化酶的高效表達。圖1為甲醇氧化酶基因啟動子序列PCR產(chǎn)物的電泳2為ct信號肽序列PCR產(chǎn)物的電泳3為載體pMOXZ-alpha-A的構建過程示意4為尿酸氧化酶編碼序列Z/OJw的PCR產(chǎn)物電泳5為重組表達載體pMOXZ-alpha-UOXu的構建過程示意6為重組多型漢遜酵母的Zeocin抗性篩選圖圖7為重組多型漢遜酵母的PCR分析8為重組多型漢遜酵母HPMU6CGMCC2351在搖瓶實驗中產(chǎn)尿酸氧化酶的時間曲線圖9為重組多型漢遜酵母HPMU6CGMCC2351高密度發(fā)酵產(chǎn)尿酸氧化酶時間曲線圖10為高密度發(fā)酵實驗中重組多型漢遜酵母產(chǎn)尿酸氧化酶的SDS-PAGE檢測具體實施方式下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。實施例1、構建產(chǎn)尿酸氧化酶的重組多型漢遜酵母(J7朋s朋"7apWj^orp力a)一、含有尿酸氧化酶編碼序列的重組表達載體pMOXZ-alpha-U0Xu的構建1、甲醇氧化酶基因抓J啟動子序列的PCR擴增根據(jù)文獻報導的MOXl啟動子的核甘酸序列(GenBankAccessNo.A11156自5'末端第1-1510位的脫氧核糖核苷酸所示的序列)，設計引物M0Xp-L:5，-TCAAGATCTTCGACGCGGAGAACGATCT-3，MOXp-R:5，-CCGAAGCTTTGTTTTTGTACTTTAGATTGATG-3'劃線部分分別是^^II和歷'/7din識別位點。PCR反應以M0Xp-L、MOXp-R為引物，以多型漢遜酵母CGMCC2.2498的基因組DNA為模板，在50ji1PCR反應混合液中含25plPfuMix，10(imol/l引物各2nL，0.3ng/(xl模板DNAlO(il，加無菌水llpl調整至50^d。反應條件為94。C，變性5min，循環(huán)參數(shù)94。C變性40s;56。C退火lmin;72。C延伸2min;30個循環(huán)；72。C延伸15min使產(chǎn)物延伸完全。將得到的PCR產(chǎn)物進行O.8%的瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果如圖l所示，得到一條約1.5kb的特異性條帶，其大小與預期相當。圖1中，泳道1為DNA分子量標準(4500，3000，2000，1200,800，500，200bp)，泳道2為PCR擴增MM啟動子序列的產(chǎn)物?；厥赵摷s1.5kb的DNA片段，進行測序，結果表明擴增得到的抓W啟動子具有GenBankAccessNo.A11156的自5'端第1一1510位脫氧核糖核苷酸所示的序列。2、釀酒酵母ct信號肽序列的PC財廣增根據(jù)文獻報道的釀酒酵母a信號肽序列設計引物。-L5，-CACAAGCTTCGMACGATGAGATTTCCTTC-3，,和"-R5'-CGTGAATTCAGCTTCAGCCTC-3';劃線部分分別為歷'"dni和fcoRI識別位點。以載體pGAPZ-alpha-A(Invitrogen，USA)為模板進行PCR擴增。在50(ilPCR反應混合液中含25plPfuMix,10(omol/l引物各2^iL，0.3fig/pl模板DNAlOpl，加無菌水llfil調整至50(n。反應條件為94'C，變性5min，循環(huán)參數(shù)94'C變性40s;56'C退火lmin;72"C延伸lmin;30個循環(huán)；72'C延伸15min使產(chǎn)物延伸完全。將得到的PCR產(chǎn)物進行2。/。的瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果如圖2所示，擴增產(chǎn)物約270bp，其大小與預期一致。圖2中，泳道l為DNA分子量標準(4500，3000，2500，2000,1500，1000,800，500，400，200,100bp)，泳道2為PCR擴增a信號肽序列的產(chǎn)物?；厥赵摷s270bp的DNA片段，進行測序，結果表明擴增得到的釀酒酵母a信號肽序列具有GenBankAccessNo.M55016自5'端第293—560位脫氧核糖核苷酸所示的序列，編碼由GenBankAcessionNo.AAA34778.1自氨基末端第1一89位所示的氨基酸序列組成的蛋白質。3、載體pM0XZ-alpha-A的構建用^^II和fcoRI酶切載體pGAPZ-alpha-A(InvitrogenUSA)，用萬Wn和^z'/2dlII酶切PCR擴增的MZi啟動子序列(M0Xp)，用歷'/dni和AcoRI酶切PCR擴增的釀酒酵母a信號肽序列(alpha-MF)。低烙點瓊脂糖凝膠電泳回收酶切的各DNA片段，然后在T4-DNA連接酶的作用下，將上述三個DNA片段連接，得到載體pMOXZ-alpha-A(圖3)。4、重組表達載體pMOXZ-alpha-U0Xu的構建根據(jù)GenBankAccessNo.D32043中報道的產(chǎn)朊假絲酵母尿酸氧化酶的核甘酸序列設計引物UOXu-L5'-CTGGAATTCATGTCAACAACGCTCTCATC-3'，和UOXu-R5'-GCCTCTAGATTACAACTTGGTCTTCTCCT-3'，劃線部分分別為AcoRI和必al識別位點。以UOXu-L和UOXu-R為引物，以產(chǎn)朊假絲酵母CGMCC2.120總DNA為模板，進行PCR擴增。在50|alPCR反應混合液中含25plPfuMix,10(imol/l引物各2pL，0.3jigAi1模板咖AlOpl，加無菌水ll|il調整至50nl。反應條件為94。C，變性5min，循環(huán)參數(shù)94。C變性40s;56。C退火lmin;72。C延伸1.5min;30個循環(huán)；72。C延伸15rain使產(chǎn)物延伸完全。將得到的PCR產(chǎn)物進行iy。的瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果如圖4所示，擴增產(chǎn)物約909bp，其大小與預期一致?；厥赵摷s909bp的DNA片段，進行測序，結果表明擴增得到的產(chǎn)朊假絲酵母尿酸氧化酶基因序列具有GenBankAccessNo.D32043自5'末端第356—1264位脫氧核糖核苷酸所示的序列，編碼由GenBankAcessionNo.BAA06804自氨基末端第1—303位所示的氨基酸序列組成的蛋白質。圖4中，泳道1為DNA分子量標準(4500，3000,2000，1200,800，500，200bp)，泳道2為PCR擴增尿酸氧化酶編碼序列的產(chǎn)物，命名為WJ"。用&oRI和化al酶切載體pMOXZ-alpha-A和WJw，低熔點瓊脂糖凝膠電泳回收酶切的DNA片段，然后在T4-DNA連接酶的作用下，將上述兩個DNA片段連接，得到重組表達載體pM0XZ-alpha-U0Xu(圖5)。二、重組多型漢遜酵母的構建分別用5bal酶切載體pMOXZ-alpha-A，用&cll酶切載體pMOXZ-alpha-U0Xu，使載體線性化。線性化的載體通過電轉化法(Bio-RadGene-Pulser儀，1.5kV，50uF，200Q，3mSec)轉化多型漢遜酵母(泡/^朋〃hpWi^arpAg)CGMCC2.2498。在含有l(wèi)OOug/mlZeocin的YEPDS(含1M山梨醇的YEPD)培養(yǎng)基平板上篩選轉化子。獲得Zeocin抗性轉化子。在含有不同濃度Zeocin(100-1000ug/ml)的YEPD培養(yǎng)基平板上，檢測不同轉化子的Zeocin抗性，獲得分別抗100、200、500和1000ug/mlZeocin的轉化子(圖6)。提取不同轉化子的基因組DNA，以此為模板，用U0Xu-L和UOXu-R為引物進行PCR擴增，結果從重組轉化子中均擴增出約909bp的DNA片段，而以空載體轉化的對照菌的基因組DNA為模板時，沒有PCR產(chǎn)物(圖7)。說明尿酸氧化酶基因已整合到多型漢遜酵母染色體上。圖7中，泳道l:陽性對照；泳道2:PC財廣增空載體轉化子基因組的產(chǎn)物；泳道3:PCR擴增抗100ug/mlZeocin的重組多型漢遜酵母基因組DNA的產(chǎn)物；泳道4&5:PC財廣增抗200ug/mlZeocin的重組多型漢遜酵母基因組DNA的產(chǎn)物；泳道6&7:PCR擴增抗500ug/mlZeocin的重組多型漢遜酵母基因組DNA的產(chǎn)物；泳道8:PCR擴增抗1000ng/ralZeocin的重組多型漢遜酵母基因組DNA的產(chǎn)物。三、重組多型漢遜酵母產(chǎn)尿酸氧化酶能力的比較將分別抗IOO、200、500和1000ug/mlZeocin的重組轉化子和作為對照的空載體轉化子接于10mlYPG培養(yǎng)基(2g/100ml蛋白胨，lg/100ml酵母粉，lml/100ml甘油)中，37°C，200rpm培養(yǎng)20小時，離心收集細胞，無菌水洗兩次后，細胞重懸于10mlYPM培養(yǎng)基(2g/100ml蛋白胨，lg/100ml酵母粉，lml/100ml甲醇)中，37°C，200rpm進行誘導培養(yǎng)，每24小時補加甲醇至終濃度為0.5ml/100ml。每12小時取發(fā)酵液，測定尿酸氧化酶活性，尿酸氧化酶的活性測定按照辣根過氧化物酶方法進行，具體方法如下溶液的配制尿酸溶于O.1M，pH8.5的硼酸鹽緩沖液中，尿酸終濃度為2mmol/l;30mmol/l的4-氨基安替比林(4-AAP)水溶液；體積百分數(shù)l.5%苯酚水溶液；20U/ml的辣根過氧化物酶水溶液；分別配制0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.Ommol/1的過氧化氫水溶液；標準曲線的制備反應體系含O.3ral過氧化氫水溶液，2.lml2mM尿酸溶液，0.3ml30mM4-AAP，0.15ml體積百分數(shù)1.5%苯酚，0.15ml20U/ml辣根過氧化物酶，25°C，反應20min，測定505nm的吸光值；實驗設三次重復，求平均值。分別測定反應體系含0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0mmol/l的過氧化氫水溶液的反應液在505nm的吸光值。制作505nm的吸光值相對于過氧化氫濃度的標準曲線。發(fā)酵液中尿酸氧化酶活性測定在3ml酶反應體系中，含有2mmol/l的尿酸溶液2.2ml，30ramol/l的4-AAP溶液O.3ml，體積百分數(shù)l.5%苯酚溶液0.15ml，20U/ml的辣根過氧化物酶水溶液O.15ml，待測樣品液0.2ml;反應液快速混勻，25°C，反應20分鐘，測定505nm的吸光值(A)，實驗設三次重復，每個重復測定O.2ml發(fā)酵液；發(fā)酵液中尿酸氧化酶活性按如下函數(shù)關系式計算酶活(U/ml)=0.369XA—0.0054。一個酶活力單位定義為在上述反應條件下每分鐘產(chǎn)生l^imol過氧化氫所需要的酶量。不同轉化子發(fā)酵液中尿酸氧化酶測定結果見表l。_表l不同轉化子發(fā)酵液中尿酸氧化酶活性比較<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表1是轉化子在YPM培養(yǎng)基中誘導培養(yǎng)60小時的測定結果，T100-l和T100-2分別表示抗100iig/mlZeocin的兩個重組轉化子，T200-l和T200-2分別表示抗200ug/ralZeocin的兩個重組轉化子，T500-1和T500-2分別表示抗500ug/mlZeocin的兩個重組轉化子，T1000-l和T1000-2分別表示抗1000ug/mlZeocin的兩個重組轉化子。測定結果表明，空載體轉化子的發(fā)酵液和細胞中都沒有檢測到尿酸氧化酶活性；重組轉化子的發(fā)酵液均有尿酸氧化酶活性，經(jīng)過60小時誘導培養(yǎng)后，發(fā)酵液中的尿酸氧化酶活性大小為O.15-0.6U/ml發(fā)酵液(表l)。在重組轉化子中產(chǎn)尿酸氧化酶活性最高的是抗200ug/mlZeocin的重組轉化子，經(jīng)過60小時誘導培養(yǎng)后，發(fā)酵液中尿酸氧化酶活性為O.6U/ml發(fā)酵液，該重組轉化子被命名為重組多型漢遜酵母(#朋"/2￡/"/o77//ar;A3)HPMU6，已于2008年1月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCCNo.2351。四、重組多型漢遜酵母HPMU6CGMCC2351遺傳穩(wěn)定性檢測將重組多型漢遜酵母HPMU6CGMCC2351接于5mlYEPD培養(yǎng)基中，37。C培養(yǎng)，每24小時轉接于新鮮YEPD培養(yǎng)基中，連續(xù)傳代培養(yǎng)240小時后，將菌液適當稀釋，涂于YEPD平板上，37。C培養(yǎng)至長出單菌落，PCR檢測單菌落，結果所有檢測的單菌落中都有尿酸氧化酶基因存在，沒有出現(xiàn)目標基因丟失現(xiàn)象，因此重組多型漢遜酵母HPMU6CGMCC2351是遺傳穩(wěn)定的。實施例2、重組多型漢遜酵母HPMU6CGMCC2351產(chǎn)尿酸氧化酶條件的優(yōu)化在搖瓶中，采用單因子發(fā)酵實驗和多因子正交實驗進行重組多型漢遜酵母HPMU6CGMCC2351產(chǎn)尿酸氧化酶條件的優(yōu)化。確定最優(yōu)條件為以YPG(2g/100ml蛋白胨，lg/100ml酵母粉，lml/100ml甘油)為培養(yǎng)基，培養(yǎng)基pH為7.0;細胞濕重為6克濕細胞/升時加入甲醇(終濃度為lml/100ml)誘導產(chǎn)尿酸氧化酶，每12小時補加一次甲醇至終濃度為lml/100ml;37°C、200rpm誘導培養(yǎng)72小時。在此最優(yōu)條件下，實驗重復3次，每次接種3個搖瓶，每個搖瓶(200ml)中裝有20ml培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)72小時，測定尿酸氧化酶活性。實驗設三次重復，每個重復測定2ml發(fā)酵液。標準曲線的制備方法，以及尿酸氧化酶活性的測定方法和計算公式同實施例l，測定結果見表2。表2優(yōu)化條件下重組多型漢遜酵母HPMU6CGMCC2351產(chǎn)尿酸氧化酶分析重復次數(shù)發(fā)酵液稀釋倍數(shù)平行樣品的A值及(平均值)酶活(U/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表2是在優(yōu)化條件下，誘導培養(yǎng)72小時，測定的發(fā)酵液中尿酸氧化酶活性。結果表明尿酸氧化酶產(chǎn)量達最高，為2.6U/ml發(fā)酵液(圖8)。圖8中，(參)表示重組多型漢遜酵母HPMU6CGMCC2351的生物量，(△)表示重組多型漢遜酵母HPMU6CGMCC2351尿酸氧化酶的產(chǎn)量。對上述發(fā)酵液上清進行SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)從48小時開始可以檢測到尿酸氧化酶的蛋白帶，72小時蛋白帶濃度明顯提高。SDS-PAGE分析掃描結果表明，最優(yōu)條件下，重組多型漢遜酵母HPMU6CGMCC2351在搖瓶中誘導培養(yǎng)72小時，尿酸氧化酶的產(chǎn)量為63mg/L發(fā)酵液。上述實驗結果為三次重復實驗的平均值。實施例3、產(chǎn)尿酸氧化酶的重組多型漢遜酵母HPMU6CGMCC2351的高密度發(fā)酵重組多型漢遜酵母HPMU6CGMCC2351在YPG(2g/100ml蛋白胨，lg/100ml酵母粉，lml/100ml甘油)培養(yǎng)基中，37°。培養(yǎng)18小時，按10。/。接種量轉接于400mlYPG中，37t:搖床培養(yǎng)至0D6。。為10-12，該菌液即為種子液。種子液接于裝有甘油濃度為4%(v/v)的2LYPG的發(fā)酵罐中，37。C培養(yǎng)，pH控制在6.5，溶氧為20%。在甘油將被消耗完時(培養(yǎng)24小時后)，以20ml/l/h的速度流加甘油3小時，使細胞干重達50g/L發(fā)酵液。然后流加甲醇使發(fā)酵液中甲醇濃度保持在0.5%左右，每隔12小時取樣，測定細胞生物量(細胞干重)和尿酸氧化酶活性。實驗設三次重復，每次同一種子液接種2個發(fā)酵罐，尿酸氧化酶活性測定每次每個重復測2ml發(fā)酵液。標準曲線制備方法，以及尿酸氧化酶活性的測定方法和計算公式同實施例l。結果表明在甲醇誘導培養(yǎng)69小時后，即總發(fā)酵時間為96小時，發(fā)酵液中尿酸氧化酶活性達最高，為52.3U/ml發(fā)酵液(圖9)。圖9中，(■)表示重組多型漢遜酵母HPMU6的生物量，(△)表示重組多型漢遜酵母HPMU6尿酸氧化酶的產(chǎn)量。SDS-PAGE分析及凝膠掃描結果表明，重組蛋白濃度為2.lg/L發(fā)酵液(圖10)。與搖瓶實驗相比，尿酸氧化酶活性提高了22.7倍，重組蛋白產(chǎn)量提高了33.3倍。上述實驗結果為三次重復實驗的平均值。圖10中，M:蛋白分子量標準(97.4、66.2、43、31、20.1KDa);泳道1-5:重組多型漢遜酵母發(fā)酵24、48、72、84、96小時的培養(yǎng)液上清液；泳道6:空載體轉化子培養(yǎng)液上清液。權利要求1.一種重組表達載體，是含有如下表達盒的重組酵母表達載體；所述表達盒從上游至下游依次包括甲醇氧化酶基因的啟動子、尿酸氧化酶基因和轉錄終止子。2、根據(jù)權利要求1所述的重組表達載體，其特征在于所述尿酸氧化酶基因為編碼如下蛋白(a)或(b)的基因；(a)由GenBankAcessionNo.BAA06804的自氨基末端第l一303位所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)在(a)限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸殘基且具有尿酸氧化酶活性的由(a)衍生的蛋白質。3、根據(jù)權利要求1或2所述的重組表達載體，其特征在于所述表達盒還包括釀酒酵母a因子信號肽的編碼序列，所述釀酒酵母a因子信號肽的編碼序列位于所述甲醇氧化酶基因的啟動子和所述尿酸氧化酶基因之間，且與所述尿酸氧化酶基因形成融合基因。4、根據(jù)權利要求1或2所述的重組表達載體，其特征在于所述甲醇氧化酶基因啟動子為如下a)或b)的DNA分子a)GenBankAcessionNo.A11156的核苷酸序列自5'端1-1510位脫氧核糖核苷酸所示的DNA分子；b)嚴格條件下與a)限定的DNA序列雜交的DNA分子。5、根據(jù)權利要求1或2所述的重組表達載體，其特征在于所述酵母表達載體為pGAPZ-alpha-A。6、一種重組多型漢遜酵母菌，是將權利要求1-5所述的任一重組表達載體導入多型漢遜酵母菌中得到的重組菌。7、根據(jù)權利要求6所述的重組多型漢遜酵母菌，其特征在于所述多型漢遜酵母出發(fā)菌株為多型漢遜酵母CGMCC2.2498。8、根據(jù)權利要求6或7所述的重組多型漢遜酵母菌，其特征在于所述重組多型漢遜酵母菌為重組多型漢遜酵母菌HPMU6CGMCCNo.2351。9、權利要求6或7或8所述重組多型漢遜酵母菌在生產(chǎn)尿酸氧化酶中的應用。10、根據(jù)權利要求9所述的應用，其特征在于用于生產(chǎn)所述尿酸氧化酶的所述重組多型漢遜酵母菌的培養(yǎng)基為含lml/100m1-4ml/100ml甘油的YPG培養(yǎng)基，優(yōu)選為含4ml/100ml甘油的YPG培養(yǎng)基；在生產(chǎn)過程中，用0.5ml/100ml甲醇誘導所述尿酸氧化酶的表達。全文摘要本發(fā)明公開了一種重組多型漢遜酵母菌及其專用重組表達載體與應用。本發(fā)明公開的重組多型漢遜酵母菌，是將產(chǎn)朊假絲酵母的尿酸氧化酶基因導入多型漢遜酵母CGMCC2.2498中，得到能分泌表達尿酸氧化酶的重組菌；所述尿酸氧化酶的編碼基因插入到載體pMOXZ-alpha-A中的MOX啟動子和AOX1終止子之間獲得重組表達載體，然后通過轉化，使尿酸氧化酶表達盒整合到多型漢遜酵母染色體上。本發(fā)明的重組多型漢遜酵母菌通過高密度發(fā)酵，可以高水平生產(chǎn)尿酸氧化酶，其尿酸氧化酶產(chǎn)量是目前已報道產(chǎn)量的8.6倍。利用本研究構建的重組多型漢遜酵母菌生產(chǎn)的尿酸氧化酶，產(chǎn)量高、免疫原性低，非常有利于尿酸氧化酶在醫(yī)藥領域的廣泛應用。文檔編號C12N15/53GK101255440SQ20081010180公開日2008年9月3日申請日期2008年3月12日優(yōu)先權日2008年3月12日發(fā)明者何秀萍,張博潤,王肇悅,郭雪娜,陳志禹申請人:中國科學院微生物研究所