專利名稱：：一種培育抗鹽脅迫乳酸乳球菌的方法及其專用培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種培育抗鹽脅迫乳酸乳球菌的方法及其專用培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
：乳酸菌作為益生菌是一類重要的工業(yè)微生物，在食品發(fā)酵中應(yīng)用的歷史非常悠久。乳酸菌不僅具有很好的保健功效，還可用于提高食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，改善食品風(fēng)味，提高食品保藏性和附加值。乳酸是醬油重要理化指標(biāo)之一和風(fēng)味物質(zhì)，所以在醬油釀造過(guò)程中適當(dāng)?shù)厝斯そ臃N乳酸菌，對(duì)于提高醬油的風(fēng)味有良好的作用。目前，國(guó)內(nèi)菌種庫(kù)中有可耐鹽度達(dá)18%以上的乳酸菌。日本已成功篩選出適合高鹽稀醪工藝使用的嗜鹽性乳酸菌。我們作為醬油大國(guó)，獲得耐高鹽性乳酸菌對(duì)提高醬醅產(chǎn)品的質(zhì)量，創(chuàng)造更多的經(jīng)濟(jì)效益具有重大的意義。最近發(fā)現(xiàn)多種試劑如N-乙酰氨基葡糖、泛酸、泛酰巰基乙胺、肽和乳果糖能提高用于發(fā)酵食品的乳酸菌存活率。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種培育抗鹽脅迫乳酸乳球菌的方法及其專用培養(yǎng)基。本發(fā)明解決了生產(chǎn)實(shí)踐中乳酸菌不可避免的接觸不良環(huán)境而引起的菌株活力下降、死亡的實(shí)際問(wèn)題，且本發(fā)明的方法操作簡(jiǎn)單，不增加額外的設(shè)備和人工，僅通過(guò)較低的附加試劑投入，顯著增強(qiáng)了菌體的存活效率，且作為益生菌的乳酸乳球菌被食用后到達(dá)腸道能更有效的發(fā)揮其生理功能，提高了發(fā)酵食品的附加值。本發(fā)明所提供的乳酸乳球菌的抗鹽脅迫培養(yǎng)基，命名為抗鹽脅迫培養(yǎng)基，是在培養(yǎng)乳酸乳球菌的培養(yǎng)基中添加3.2-32.0ramol/L谷胱甘肽得到的培養(yǎng)基。其中，所述乳酸乳球菌為能吸收谷胱甘肽的乳酸乳球菌乳脂亞種菌株。所述乳酸乳球菌具體為乳酸乳球菌SKll。所述培養(yǎng)乳酸乳球菌的培養(yǎng)基可為任何能培養(yǎng)乳酸乳球菌的培養(yǎng)基，如由下述物質(zhì)組成的培養(yǎng)基；K2HP043g/L，乙酸鈉1g/L，檸檬酸三銨0.6g/L，酪氨酸0.5g/L，維生素C0.5g/L，(5-甘油磷酸二鈉19g/L,丙氨酸0.24g/L，精氨酸0.125g/L,天冬酰胺0.42g/L，半胱氨酸鹽酸鹽0.13g/L，谷氨酸0.5g/L，氨基乙酸0.175g/L，組氨酸0.15g/L，異亮氨酸0.21g/L,亮氨酸0.475g/L，賴氨酸0.44g/L，甲硫氨酸0.125g/L，苯丙氨酸0.275g/L，脯氨酸0.675g/L，絲氨酸0.34g/L，蘇氨酸0.225g/L，色氨酸0.05g/L，纈氨酸0.325g/L,MgCl26H200.2g/L，CaCL2H200.05g/L，MnCl24H200.016g/L，F(xiàn)eCl36H200.008g/L，F(xiàn)eS047H200.007g/L，ZnS047H200.005g/L，CoS047H200.0025g/L，CuS047H200.0025g/L，(NH4)eMo70242H200.0025g/L,腺嘌呤0.01g/L，0.Olg/L鳥(niǎo)嘌呤，尿嘧啶0.01g/L，黃嘌呤0.01g/L，p-氨基苯甲酸10mg/L，次黃嘌呤核苷5mg/L，乳清酸5mg/L，吡哆胺鹽酸鹽5mg/L，胸腺嘧啶脫氧核苷5mg/L，D-生物素2.5mg/L，6，8-硫辛酸2.5mg/L，吡哆醇鹽酸鹽2mg/L，葉酸1mg/L，煙堿酸1mg/L，D-(+)-泛酸鈣lmg/L，核黃素lmg/L，硫胺鹽酸鹽1mg/L，維生素B121mg/L。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育抗鹽脅迫乳酸乳球菌的方法，是將乳酸乳球菌在所述的抗鹽脅迫培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得抗鹽脅迫的乳酸乳球菌。其中，所述乳酸乳球菌為能吸收谷胱甘肽的乳酸乳球菌乳脂亞種菌株；所述乳酸乳球菌具體為乳酸乳球菌SKI1。本發(fā)明利用含有巰基(-SH)的還原型谷胱甘肽能清除微生物細(xì)胞在高濃度鹽脅迫下誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧自由基，減慢過(guò)氧化反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞膜上的高度不飽和脂肪酸免遭氧化的特性，采用在培養(yǎng)基中添加適量谷胱甘肽的方法，提高菌株對(duì)不良環(huán)境的適應(yīng)性尤其是提高抗鹽性。本發(fā)明將乳酸乳球菌在含有3.2-32.0mmol/L的谷胱甘肽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)到穩(wěn)定期后，用高濃度鹽溶液(5MNaCl)處理，菌體的存活率得到了提高，比對(duì)照菌株提高100-1000倍。在乳酸菌工業(yè)生產(chǎn)中，本發(fā)明的培育抗鹽脅迫乳酸乳球菌的方法能提高乳酸乳球菌在不良環(huán)境條件下的存活率，使乳酸乳球菌能正常發(fā)揮其生理功能，增強(qiáng)了產(chǎn)品的附加值，創(chuàng)造更大的經(jīng)濟(jì)效益。圖1為對(duì)照和含有4.6raM的GSH的抗鹽脅迫培養(yǎng)基中培養(yǎng)的乳酸乳球菌經(jīng)過(guò)5MNaCl處理不同時(shí)間的菌落數(shù)(CFU)具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、培育抗鹽脅迫的乳酸乳球菌a)培養(yǎng)基LM17培養(yǎng)基取植質(zhì)蛋白胨5.0g，聚蛋白胨5.0g，牛肉浸膏2.5g，瓊脂15g，e-甘油磷酸二鈉19g，酵母提取物5.0g，抗壞血酸0.5g，MgS047H200.25g，溶于1L蒸餾水中，使pH為7.1，在121'C條件下滅菌15min，然后每升補(bǔ)加15g乳糖。全合成培養(yǎng)基(CDM)(g*L—%(1)取iyiP043g，乙酸鈉lg(在400|al10MNaOH中預(yù)溶)，檸檬酸三銨0.6g，酪氨酸O.5g;(2)取維生素C0.5g在5ml蒸餾水中預(yù)溶；(3)將(1)和(2)混合，再加入卩-甘油磷酸二鈉19g，用蒸餾水定容至870ml，隨后加入100ml的10X氨基酸濃縮液，10ral金屬離子濃縮液，10ml核苷酸濃縮液，10ml維生素濃縮液，用5MNaOH將pH調(diào)到6.8，最后無(wú)菌過(guò)濾。10X氨基酸濃縮液(g'L—')由如下物質(zhì)組成丙氨酸2.40g，精氨酸1.25g,天冬酰胺4.20g，半胱氨酸鹽酸鹽1.30g，谷氨酸5.00g，氨基乙酸1.75g，組氨酸1.50g，異亮氨酸2.10g，亮氨酸4.75g,賴氨酸4.40g，甲硫氨酸1.25g，苯丙氨酸2.75g，脯氨酸6.75g,絲氨酸3.40g，蘇氨酸2.25g，色氨酸0.50g，纈氨酸3.25g。IOOX金屬離子濃縮液由如下物質(zhì)組成(gL-'):MgCl26H2O20g，CaCl22H205.Og，MnCl24H201.6g，F(xiàn)eCl36H200.8g，F(xiàn)eS047H200.7g，ZnS047H200.5g，CoS047H200.25g，CuS047H200.25g，(NH4)6M070242H200.25g，用5MHC1將pH調(diào)到1.5。IOOX核苷濃縮液由如下物質(zhì)組成lOrag腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、尿嘧啶和黃嘌呤在10ml的0.1MNaOH中溶解。100X維生素濃縮液由如下物質(zhì)組成(mg'L—'):p-氨基苯甲酸IOOO，次黃(嘌呤核)苷500，乳清酸500，吡哆胺鹽酸鹽500，胸(腺嘧啶脫氧核)苷500，D-生物素250，6,8-硫辛酸250，吡哆醇鹽酸鹽200，葉酸100，煙堿酸100，D-(+)-泛酸鈣100，核黃素IOO，硫胺鹽酸鹽IOO，維生素B12100。抗鹽脅迫培養(yǎng)基全合成培養(yǎng)基(CDM)中添加谷胱甘肽GSH，使其終濃度分別3.2、4.6、16和32.0mmol/L。b)菌種的活化取0.4ml-70°C乳酸乳球菌(LsctococciAshe"5)(來(lái)自荷蘭NIZO菌種保藏中心，保藏編號(hào)SKll)甘油貯存液接種于15ml乳酸乳球菌LM17培養(yǎng)基中，在30。C下靜止培養(yǎng)12h后，作為活化種子。c)鹽脅迫及存活率鑒定活化種子以1%的接種量分別轉(zhuǎn)接于新鮮乳酸乳球菌CDM培養(yǎng)基(對(duì)照)和含有表1中4種不同濃度的GSH的抗鹽脅迫培養(yǎng)基，在30"C下靜止培養(yǎng)16-20h。分別取上述五種發(fā)酵液，調(diào)整初始細(xì)胞密度后，用生理鹽水(質(zhì)量百分比為0.85%的NaCl溶液)洗滌細(xì)胞兩次，重懸于lml的5mol/LNaCl溶液中，脅迫0、6和24小時(shí)后，立即離心(10，000g，lrain),將沉淀物用生理鹽水洗滌細(xì)胞兩次，以去除殘余的NaCl。隨后，將細(xì)胞重懸于0，4ml的生理鹽水中。分別以不同的稀釋度點(diǎn)種于LM17培養(yǎng)基平板上測(cè)定CFU。將平板置于30°C下培養(yǎng)48h，對(duì)平板上的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。對(duì)照和含有不同濃度GSH的抗鹽脅迫培養(yǎng)基培養(yǎng)的乳酸乳球菌在5mol/LNaCl溶液中處理不同時(shí)間的菌落數(shù)(CFU)如表1所示。表1.對(duì)照和含有不同濃度GSH的抗鹽脅迫培養(yǎng)基培養(yǎng)的乳酸乳球菌在5mol/LNaCl溶液中處理不同時(shí)間的菌落數(shù)(CFU)存活菌落數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，5MNaCl脅迫下，3.2-32.0mraol/LGSH對(duì)乳酸乳球菌的抗鹽性均有顯著提高，添加GSH的菌體的存活率與對(duì)照菌株相比提高100-1000倍左右。其中，對(duì)照和含有4.6mM的GSH的抗鹽脅迫培養(yǎng)基(圖l中以"CDM培養(yǎng)基添加GSH"表示)中培養(yǎng)的乳酸乳球菌經(jīng)過(guò)5MNaCl處理不同時(shí)間的菌落數(shù)(CFU)如圖l所示，表明不添加GSH的培養(yǎng)基(圖1中以"CDM培養(yǎng)基"表示)中，菌休經(jīng)過(guò)高濃度鹽溶液(5MNaCl)處理，存活率隨鹽脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)快速持續(xù)下降；而加入4.6mraol/LGSH培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌體經(jīng)過(guò)高濃度鹽溶液(5MNaCl)處理10h之后，存活率下降不明顯，同樣鹽脅迫處理36h后加入4.6mMGSH的培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌體存活率與對(duì)照相比提高100倍。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乳酸乳球菌從培養(yǎng)基中吸收GSH，經(jīng)高濃度的鹽溶液(5MNaCl)處理不同的時(shí)間，其菌株的存活率與對(duì)照菌株相比提高100倍。權(quán)利要求1、乳酸乳球菌抗鹽脅迫培養(yǎng)基，是在培養(yǎng)乳酸乳球菌的培養(yǎng)基中添加3.2-32.0mmol/L谷胱甘肽得到的培養(yǎng)基。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述乳酸乳球菌為能吸收谷胱甘肽的乳酸乳球菌乳脂亞種菌株。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述乳酸乳球菌為乳酸乳球菌SKll。4、根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)乳酸乳球菌的培養(yǎng)基由如下物質(zhì)組成；K2HP043g/L，乙酸鈉lg/L,檸檬酸三銨0.6g/L，酪氨酸0.5g/L，維生素C0.5g/L，(3-甘油磷酸二鈉19g/L，丙氨酸0.24g/L，精氨酸0.125g/L，天冬酰胺0.42g/L，半胱氨酸鹽酸鹽0.13g/L，谷氨酸0.5g/L,氨基乙酸O.175g/L，組氨酸0.15g/L，異亮氨酸0.21g/L，亮氨酸0.475g/L，賴氨酸0.44g/L,甲硫氨酸0.125g/L，苯丙氨酸0.275g/L，脯氨酸0.675g/L，絲氨酸0.34g/L，蘇氨酸O.225g/L，色氨酸0.05g/L,纈氨酸0.325g/L，MgCl26H200.2g/L，CaCl22H200.05g/L，MnCl24H200.016g/L，F(xiàn)eCl36H200.008g/L，F(xiàn)eS047H200.007g/L，ZnSO',7H200.005g/L，CoS047H200.0025g/L，CuS047H200.0025g/L，(NH4)sMo70242H200.0025g/L，腺嘌呤0.Olg/L'0.01g/L鳥(niǎo)嘌呤，尿嘧啶0.01g/L，黃嘌呤0.01g/L，p-氨基苯甲酸10mg/L，次黃嘌呤核苷5mg/L，乳清酸5mg/L，吡哆胺鹽酸鹽5mg/L，胸腺嘧啶脫氧核苷5mg/L，D-生物素2.5mg/L，6，8-硫辛酸2.5mg/L，吡哆醇鹽酸鹽2mg/L，葉酸1mg/L，煙堿酸lmg/L，D-(+)-泛酸鈣lmg/L，核黃素1mg/L，硫胺鹽酸鹽1mg/L，維生素B121mg/L。5、一種培育抗鹽脅迫乳酸乳球菌的方法，是將乳酸乳球菌在權(quán)利要求1至4中任一所述的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得抗鹽脅迫的乳酸乳球菌。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述乳酸乳球菌為能吸收谷胱甘肽的乳酸乳球菌乳脂亞種菌株。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述乳酸乳球菌為乳酸乳球菌SKll。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種培育抗鹽脅迫乳酸乳球菌的方法及其專用培養(yǎng)基。所述乳酸乳球菌抗鹽脅迫培養(yǎng)基，是在培養(yǎng)乳酸乳球菌的培養(yǎng)基中添加3.2-32.0mmol/L谷胱甘肽得到的培養(yǎng)基。其中，所述乳酸乳球菌為能吸收谷胱甘肽的乳酸乳球菌乳脂亞種菌株，具體可為乳酸乳球菌SK11。所述培育抗鹽脅迫乳酸乳球菌的方法，是將乳酸乳球菌在所述的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得抗鹽脅迫的乳酸乳球菌。本發(fā)明的培育抗鹽脅迫乳酸乳球菌的方法能提高乳酸乳球菌在不良環(huán)境條件下的存活率，使乳酸乳球菌能正常發(fā)揮其生理功能，增強(qiáng)了產(chǎn)品的附加值，創(chuàng)造更大的經(jīng)濟(jì)效益。文檔編號(hào)C12R1/01GK101302487SQ20081011619公開(kāi)日2008年11月12日申請(qǐng)日期2008年7月4日優(yōu)先權(quán)日2008年7月4日發(fā)明者張延平,張艷禾,寅李申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所