一種外源基因敲入乳酸乳球菌快速篩選系統(tǒng)及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬生物技術(shù)，具體說(shuō)是將一個(gè)外源基因克隆到乳酸乳球菌（Lactococcus lactis，L. lactis)染色體上的新方法，該方法利用lacZ基因的表型特征，使篩選外源基因 敲入株更加方便快捷。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳酸乳球菌（Lactococcus lactis，L. Lactis)是一種非侵入性、非致病性的食品 安全級(jí)革蘭陽(yáng)性球菌，傳統(tǒng)上被用于多種食品（例如奶酪、黃油等）的生產(chǎn)之中。由于其重 要的應(yīng)用價(jià)值，從20世紀(jì)80年代開(kāi)始，乳酸乳球菌得到廣泛而深入的研究，其生化、免疫 以及遺傳背景已研究得比較清楚。由于其良好的安全性，乳酸乳球菌被廣泛用于表達(dá)各種 外源蛋白，包括各種酶、治療性蛋白產(chǎn)品和疫苗組分，應(yīng)用于食品工業(yè)、生物制藥和疫苗研 制等領(lǐng)域，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。其中，乳酸乳球菌乳脂亞種（L. lactis subsp. cremoris) MG1363和NZ9000,應(yīng)用得最為廣泛。MG1363菌株具有生長(zhǎng)迅速、遺傳操作簡(jiǎn)便、外源基因?qū)?入穩(wěn)定等特點(diǎn)，并有大量的遺傳學(xué)工具。NZ9000是MG1363的衍生菌株，是在MG1363的p印N 基因中插入了 nisRK基因。該基因的產(chǎn)物能在微量的食品安全級(jí)抗菌肽nisin的誘導(dǎo)下， 增強(qiáng)PnisZ啟動(dòng)子下游基因的過(guò)表達(dá)，蛋白表達(dá)量可達(dá)到生產(chǎn)級(jí)。因此，NZ9000被當(dāng)做"細(xì) 菌工廠"，用于生產(chǎn)多種多樣的異源蛋白。由于乳酸乳球菌具有一般安全級(jí)（GRAS)性質(zhì)，同 時(shí)它不屬于正常菌群，只在消化道內(nèi)短期定植，因此NZ9000特別適于作為載體表達(dá)異源蛋 白，可直接用于人或動(dòng)物的消化道。
[0003]在乳酸乳球菌中表達(dá)外源蛋白，可將目的基因克隆到質(zhì)?；蛘呒?xì)菌染色體上兩個(gè) 方式，其中克隆到染色體上的方式更適宜，因?yàn)橥庠椿蚋鼮榉€(wěn)定，且不引入耐藥基因?？?隆的方式通常采用同源重組敲入（knock in)，需要在質(zhì)粒上構(gòu)建針對(duì)敲入位點(diǎn)的兩個(gè)同源 臂，而目的基因則位于上下游同源臂之間。敲入過(guò)程有兩個(gè)步驟：首先將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入乳酸乳球 菌，通過(guò)單交換同源重組，整個(gè)質(zhì)粒整合到細(xì)菌基因組敲入位點(diǎn)，整合子通過(guò)質(zhì)粒的耐藥標(biāo) 記被篩選出來(lái)。然后將整合子在不含抗生素的培養(yǎng)基中傳代，此時(shí)部分細(xì)菌會(huì)發(fā)生雙交換 同源重組，整合的質(zhì)粒被切離，同時(shí)質(zhì)粒上的外源基因取代敲入位點(diǎn)序列，完成外源基因在 染色體上的克隆。對(duì)雙交換同源重組的篩選，一般是以質(zhì)粒攜帶的耐藥標(biāo)志存在與否來(lái)進(jìn) 行初步判斷，即挑選大量傳代細(xì)菌克隆，檢測(cè)其是否仍具有耐藥性，失去耐藥性的克隆即為 發(fā)生了雙交換同源重組的克隆；進(jìn)一步檢測(cè)該克隆的基因組上是否存在目的基因。由于雙 交換同源重組是一個(gè)小概率事件，往往要挑選成千上萬(wàn)個(gè)克隆才能篩選到目的菌株，工作 量非常大，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了能夠簡(jiǎn)化篩選步驟，本發(fā)明的目的是提供一種可以通過(guò)直觀觀察的篩選標(biāo) 記，最大程度地減少篩選工作量的篩選系統(tǒng)。為了達(dá)到這個(gè)目的，發(fā)明人在乳酸乳球菌染色 體上敲入了一個(gè)lacZ基因，將其作為敲入位點(diǎn)，由于lacZ基因的編碼產(chǎn)物是半乳糖苷酶， 可分解X-Gal (5-溴-4-氯-3-吲哚-3-D半乳糖苷）產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物，使菌落在含有X-Gal 的固體培養(yǎng)基上呈藍(lán)色。而如果lacZ基因被敲入的外源基因取代，該藍(lán)色表型則消失，菌 落呈白色。這種藍(lán)-白色的變化，可以在培養(yǎng)固體培養(yǎng)基上直觀地觀察到，因此大大減少篩 選的工作量和時(shí)間，簡(jiǎn)化克隆步驟。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下的技術(shù)方案：
[0007] -種外源基因敲入乳酸乳球菌的快速篩選系統(tǒng)，所述篩選系統(tǒng)包括溫敏質(zhì)粒和乳 酸乳球菌；其中，所述溫敏質(zhì)粒包含his基因片段和溫敏復(fù)制子-紅霉素抗性基因（Ts-Enf) 片段；所述乳酸乳球菌的染色體上包含lacZ基因表達(dá)片段；優(yōu)選地，所述his基因片段的 序列為SEQ ID N0:2;更優(yōu)選地，所述溫敏復(fù)制子-紅霉素抗性基因（Ts-EnO片段的序列 為SEQ ID N0 :5;尤其優(yōu)選地，所述lacZ基因表達(dá)片段的核苷酸序列為SEQ ID N0 :12。
[0008] 在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述溫敏質(zhì)粒是以pUC18質(zhì)粒為骨架質(zhì)粒構(gòu)建 的。
[0009] 在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述溫敏質(zhì)粒的核苷酸序列為SEQ ID N0 :1。
[0010] 本發(fā)明還提供了上述篩選系統(tǒng)的構(gòu)建方法，所述方法包括：
[0011] 1)提供骨架質(zhì)粒，將his基因片段和溫敏復(fù)制子-紅霉素抗性基因（Ts-Enf)片段 連接到所述骨架質(zhì)粒中得到溫敏質(zhì)粒；優(yōu)選地，所述骨架質(zhì)粒為PUC18質(zhì)粒；
[0012] 2)將lacZ基因的表達(dá)片段通過(guò)同源重組的方法導(dǎo)入到乳酸乳球菌染色體上得到 染色體上含有l(wèi)acZ基因的表達(dá)片段的乳酸乳球菌；
[0013] 優(yōu)選地，所述his基因片段的序列為SEQIDN0 :2;更優(yōu)選地，所述溫敏復(fù)制子-紅 霉素抗性基因（Ts-Enf)片段的序列為SEQIDN0 :5;尤其優(yōu)選地，所述lacZ基因表達(dá)片段 的核苷酸序列為SEQIDN0 :12。
[0014] 在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，步驟1)所述的溫敏質(zhì)粒是通過(guò)包括下述步驟 的方法實(shí)現(xiàn)的：
[0015] a)以序列為SEQIDN0 :18的引物HisF和序列為SEQIDN0 :19的引物HisR擴(kuò) 增乳酸乳球菌NZ9000的his基因，將獲得的基因序列克隆到骨架質(zhì)粒中；
[0016] b)以序列為SEQIDN0:20的引物TsF和序列為SEQIDN0:21的引物TsR擴(kuò)增 質(zhì)粒pCrePA2的Ts-Enf片段，并將獲得的Ts-Em1'片段克隆到經(jīng)步驟1)處理的骨架質(zhì)粒中；
[0017] c)經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選，取陽(yáng)性克隆提取，即得溫敏質(zhì)粒。
[0018] 在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，步驟a)中將所述his基因序列克隆到pUC18質(zhì) 粒的EcoRI-Smal酶切位點(diǎn)。
[0019] 在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，步驟b)中將所述Ts-Enf片段克隆到pUC18質(zhì) 粒的BamHI-PstI酶切位點(diǎn)。
[0020] 在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，步驟2)所述的染色體上含有l(wèi)acZ基因的表達(dá) 片段的乳酸乳球菌是通過(guò)包括下述步驟的方法實(shí)現(xiàn)的：
[0021] d)合成序列為SEQ ID N0:6的啟動(dòng)子？^，以序列為SEQ ID N0:22的引物PZF 和序列為SEQ ID NO :23的引物PZR擴(kuò)增PnisZ，獲得Pnis^擴(kuò)增產(chǎn)物；同時(shí)以序列為SEQ ID NO :24的引物L(fēng)F和序列為SEQ ID NO :25的引物L(fēng)R擴(kuò)增lacZ基因，獲得lacZ基因的擴(kuò)增 產(chǎn)物；
[0022] e)將步驟d)得到的PnisZ的擴(kuò)增產(chǎn)物與lacZ基因的擴(kuò)增產(chǎn)物等比例混合作為模 板，然后以PZF和LR為引物擴(kuò)增，獲得序列為SEQ ID N0 :9的PZL片段；
[0023] f)將步驟e)得到的PZL片段插入序列為SEQ ID N0:10的pMG36e質(zhì)粒的 EcoRI-Xbal位點(diǎn)，通過(guò)紅霉素抗性LB固體培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性克隆，酶切鑒定后提取得到質(zhì)粒 pMG36e-PZL ；
[0024] g)以pMG36e-PZL質(zhì)粒為模板，序列為SEQ ID N0:22的PZRec和序列為SEQ ID NO :22的TerRec為引物，擴(kuò)增得到序列為SEQ ID NO :11的PZLT片段，然后將所述PZLT片 段克隆入線性化PJW質(zhì)粒的AscI位點(diǎn)中，通過(guò)氨芐青霉素抗性固體培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性克隆， 經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定后，提取得到序列為SEQ ID N0 :11的pJW-PZLT質(zhì)粒；
[0025] h)將步驟g)得到的pJW-PZLT質(zhì)粒轉(zhuǎn)化受體菌NZ9000,然后先將獲得的細(xì)菌在紅 霉素抗性培養(yǎng)基Ml7GS中以38. 5 °C的高溫培養(yǎng)，再在無(wú)抗性Ml7GS培養(yǎng)基中以25 °C的低溫 培養(yǎng)，之后將低溫培養(yǎng)得到的培養(yǎng)液經(jīng)適當(dāng)稀釋后涂布于無(wú)抗性的含有40 μ g/mL的X-Gal 和0. 1 μ g/mL的nisin的M17GS固體培養(yǎng)基上，然后對(duì)獲得的藍(lán)色菌落進(jìn)行紅霉素抗性篩 選；篩選到的無(wú)紅霉素抗性藍(lán)色克隆經(jīng)鑒定即得到PZLT片段敲入株P(guān)ZLTNZ。
[0026] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了上述篩選系統(tǒng)在快速篩選敲入乳酸乳球菌的外源基因中的 應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用為：將外源基因插入到所述溫敏質(zhì)粒的his基因片段的中間， 使his基因片段在外源基因兩側(cè)形成同源臂，獲得含有外源基因的溫敏質(zhì)粒；然后將所述 含有外源基因的溫敏質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到染色體上包含lacZ基因表達(dá)片段的乳酸乳球菌中，誘導(dǎo) 同源重組；以含有X-Gal的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，其中白色菌落即是成功敲入外源基因的乳酸 乳球菌的菌落。
[0027] 在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述外源基因?yàn)樾蛄袨镾EQIDN0:14的SACNP 基因。
[0028] 由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明具有如下的優(yōu)點(diǎn)：
[0029]目前將外源基因克隆到乳酸乳球菌染色體上的方法，存在篩選工作量大，費(fèi)時(shí)費(fèi) 力，效率低下的問(wèn)題。本發(fā)明針對(duì)這個(gè)問(wèn)題，提供了一種利用菌落顏色的變化來(lái)快速篩選出 陽(yáng)性克隆的快速篩選系統(tǒng)。本發(fā)明通過(guò)在乳酸乳球菌的染色體上插入了一個(gè)lacZ基因，將 其作為敲入位點(diǎn)，由于lacZ基因的編碼產(chǎn)物是半乳糖苷酶，可分解X-Gal產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物，使 菌落在含有X-Gal的平板上呈藍(lán)色。而如果lacZ基因被敲入的外源基因取代，該藍(lán)色表型 則消失，菌落呈白色。這種藍(lán)-白色的變化，可以在培養(yǎng)平板上直觀地觀察到，因此大大減 少篩選的工作量和時(shí)間。
【附圖說(shuō)明】
[0030] 圖1為溫敏質(zhì)粒PJW的圖譜及其構(gòu)建。其中his為乳酸乳球菌NZ9000的his (組 氨酸合成酶）基因，用作同源重組雙交換的左右臂；Ts Ori為來(lái)自pCrePA2質(zhì)粒的溫敏復(fù) 制子；〇ri為來(lái)自pUC18質(zhì)粒的復(fù)制子;MCS為多克隆位點(diǎn)；Enf為紅霉素抗性基因；Ap"為氨 芐青霉素抗性基因；P(Enf)為紅霉素抗性基因啟動(dòng)子；PApD為氨芐青霉素抗性基因啟動(dòng) 子。〇
[0031] 圖2為lacZ基因表達(dá)片段PZLT敲入質(zhì)粒pJW-PZLT的構(gòu)建。其中his為乳酸乳球 菌NZ9000的his (組氨酸合成酶）基因，用作同源重組雙交換的左右臂；Hisa和Hisb，his 基因經(jīng)AscI酶切后的兩個(gè)片段，作為同源重組雙交換的左右臂；Ts Ori為來(lái)自pCrePA2質(zhì) 粒的溫敏復(fù)制子；Ori為來(lái)自pUC18質(zhì)粒的復(fù)制子；Ori o