專利名稱：：脫氧羥腐胺賴氨酸合酶編碼基因及其反義核苷酸序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及脫氧羥腐胺賴氨酸合酶編碼基因及其反義核苷酸序列，特別涉及脫氧羥腐胺賴氨酸合酶編碼基因及其抑制該基因表達(dá)的方法與專用反義核苷酸序列。
背景技術(shù)：
：植物的生長發(fā)育受環(huán)境影響很大。各種環(huán)境脅迫會(huì)嚴(yán)重影響作物的生長情況，造成作物減產(chǎn)，引發(fā)全球糧食和生態(tài)危機(jī)。在當(dāng)今糧食供給全球緊張的情況下，提高作物的抗性，使其克服各種不良環(huán)境，如低溫、高溫、干旱、鹽漬等，進(jìn)而提高作物產(chǎn)量，對(duì)緩解糧食壓力尤為必要。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們已能夠在基因組成、表達(dá)調(diào)控及信號(hào)傳導(dǎo)等分子水平上認(rèn)識(shí)植物對(duì)逆境脅迫的耐(抗)性機(jī)理。經(jīng)過大量研究，人們已在植物抗逆的形態(tài)學(xué)、生理生化、生物物理、生態(tài)及細(xì)胞遺傳學(xué)方面取得了廣泛進(jìn)展，并已克隆到在植物抗逆反應(yīng)中起重要作用的一些基因(梁慧敏，夏陽，王太明，植物抗寒凍、抗旱、耐鹽基因工程研究進(jìn)展，草業(yè)學(xué)報(bào)，2003，12(3):1-7)。目前業(yè)已分離和鑒定了大量的抗逆基因。這些基因主要有以下幾類一類為滲透保護(hù)劑類基因，這類基因能夠增加植物滲透性代謝產(chǎn)物的合成能力，使植物在水分脅迫下能合成更多的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(如甘露醇、甜菜堿、海藻糖等)，以提高植物的滲透調(diào)節(jié)能力，從而增強(qiáng)植物的抗旱性；這些基因包括脯氨酸合成酶基因(如脯氨酸合成酶P5cs)、果聚糖合成酶基因(如果聚糖蔗糖酶基因sacB)、甜菜堿合成相關(guān)酶基因(如甜菜堿醛脫氫酶BADH)、海藻糖生物合成相關(guān)基因(如細(xì)菌的6-磷酸海藻糖合成酶基因otsA，細(xì)菌的6-磷酸海藻糖磷酸化酶基因otsB)等；這類基因主要用于改良植物的抗旱性。第二類為清除活性氧的相關(guān)酶類基因；對(duì)干旱脅迫下的植物體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的研究表明，此系統(tǒng)是由一些能夠清除活性氧的酶系和抗氧化物質(zhì)組成，如超氧化歧化酶(S0D)、過氧化物酶(P0D)、過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸(AsA)等，它們協(xié)同抵抗干旱脅迫誘導(dǎo)的氧化傷害。第三類為編碼轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)基因；這些轉(zhuǎn)錄因子能調(diào)節(jié)功能基因的表達(dá)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，它們?cè)谵D(zhuǎn)基因植物中的過量表達(dá)會(huì)激活許多抗逆功能基因的表達(dá)，因此，可以通過轉(zhuǎn)化調(diào)節(jié)基因來提高植物的耐旱性。其中DREB轉(zhuǎn)錄因子是目前研究較多的抗非生物脅迫的轉(zhuǎn)錄因子，響應(yīng)抗鹽和低溫脅迫。由于生長在自然界中的植物，常常同時(shí)受到一種或幾種環(huán)境逆境的威脅，因此，尋找對(duì)各種脅迫均產(chǎn)生響應(yīng)的基因，會(huì)更有效地改良農(nóng)林作物的抗逆特性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種脫氧羥腐胺賴氨酸合酶及其編碼基因。本發(fā)明所提供的脫氧羥腐胺賴氨酸合酶，來源于本生煙草(^CO"朋3/e"Z^g/iw'朋a)，為如下(a)或(b)的蛋白(a)由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列4的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且編碼所述脫氧羥腐胺賴氨酸合酶的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。其中，序列表中序列4由379個(gè)氨基酸組成。為了使(a)中的脫氧羥腐胺賴氨酸合酶便于純化，可在由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的N端或C端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1、標(biāo)簽的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>上述(a)和(b)中的脫氧羥腐胺賴氨酸合酶可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。(b)中的脫氧羥腐胺賴氨酸合酶的編碼基因可通過將序列表中序列3的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。本發(fā)明所提供的脫氧羥腐胺賴氨酸合酶的編碼基因選自如下(1)、(2)或(3):(1)核苷酸序列為序列表中序列3所示的DNA分子；(2)在嚴(yán)格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且編碼所述脫氧羥腐胺賴氨酸合酶的DNA分子；(3)與(1)限定的DNA序列有9(m以上同源性且編碼所述脫氧羥腐胺賴氨酸合酶的DNA分子。上述嚴(yán)格條件是，在6XSSC，0.5。/。SDS的溶液中，在65。C下雜交，然后用2XSSC,0.1%SDS和1XSSC，0.1%SDS各洗膜一次。含有上述任一所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或表達(dá)盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種專用反義核苷酸序列。本發(fā)明所提供的專用反義核苷酸序列，可以為上述編碼基因的反義核苷酸序列中的任一段大于等于25bp的序列；具體可以為序列表中序列2所示的核苷酸序列。含有本發(fā)明任一專用反義核苷酸序列的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或表達(dá)盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；所述重組載體中還可以包括用于實(shí)現(xiàn)反義多核苷酸轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)序列，如啟動(dòng)子、終止子。其中，所述重組載體可以為將本發(fā)明任一專用反義核苷酸序列插入載體pBI121的多克隆位點(diǎn)得到的；所述重組載體具體可以為將序列表中序列2所示的專用反義核苷酸序列插入載體PBI121的Xbal和Sacl位點(diǎn)間得到的。本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供一種培育抗逆性提高的植物的方法。本發(fā)明所提供的培育抗逆性植物的方法，是將上述任一所述專用反義核苷酸序列導(dǎo)入植物中，培育得到抗逆性植物。一般可以采用如下常規(guī)方法將所述專用反義核苷酸序列導(dǎo)入植物中，例如基因槍法，高壓電穿孔法，脂質(zhì)體法，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化方法或轉(zhuǎn)染等。本發(fā)明是利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法將所述反義核苷酸序列導(dǎo)入植物中的，具體如下首先通過重組DNA技術(shù)將所述專用反義核苷酸序列導(dǎo)入載體中，得到含有所述專用反義核苷酸序列的重組載體，再將所述重組載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌中，得到含有所述專用反義核苷酸序列的重組農(nóng)桿菌；再利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法把重組DNA分子導(dǎo)入到植物中，從而使植物體的相應(yīng)遺傳性狀發(fā)生改變。本發(fā)明方法中所用的重組載體可以為將上述任一專用反義核苷酸序列插入載體pBI121的多克隆位點(diǎn)得到的，具體可以為將序列表中序列2所示的專用反義核苷酸序列插入載體pBI121的Xbal和Sacl位點(diǎn)間得到的。所述抗逆性可以為抗干旱性和/或抗低溫性和/或抗鹽性。上述方法可以應(yīng)用于雙子葉植物中，具體可應(yīng)用于煙草中。本發(fā)明中所述編碼基因的序列是指編碼基因中編碼鏈的序列；所述編碼基因的反義核苷酸序列(5'至3')是指上述編碼鏈的互補(bǔ)鏈從5'端至3'端的序列。脫氧羥腐胺賴氨酸合酶參與翻譯起始因子的翻譯后活化，翻譯起始因子通過控制特定mRNA的運(yùn)輸而調(diào)控特定蛋白的翻譯。本發(fā)明是通過抑制脫氧羥腐胺賴氨酸合酶的表達(dá)，從而抑制某些與植物抗逆性相關(guān)的蛋白的表達(dá)，進(jìn)而提高植物的抗逆性。本發(fā)明的培育抗逆性植物的方法是利用脫氧羥腐胺賴氨酸合酶編碼基因(DHS)的反義核苷酸序列，抑制了植物內(nèi)源DHS基因的正常表達(dá)，進(jìn)而提高了植物對(duì)多種不同^>迫環(huán)境的抗性，如抗旱性、耐低溫性和抗鹽性。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明方法得到的植物，其抗旱性、耐低溫性和抗鹽性均顯著高于陰性對(duì)照，而且這幾種抗性都是同時(shí)得到提高的。另外，本發(fā)明方法還省時(shí)省力，降低了成本。因此，本發(fā)明的培育抗逆性植物的方法可用于農(nóng)作物抗逆遺傳改良及開發(fā)，對(duì)提高作物的產(chǎn)量有重要意義，適合于推廣應(yīng)用。圖1為本生煙草NbDHScDNA克隆的PCR檢測結(jié)果。圖2為Xbal和Sacl酶切T-NbDHS-1質(zhì)粒的檢測結(jié)果。圖3為轉(zhuǎn)基因煙草在分化培養(yǎng)基中生長結(jié)果。圖4為T0代轉(zhuǎn)化植株Southern鑒定結(jié)果。圖5為Tl代轉(zhuǎn)基因煙草種子的篩選鑒定。圖6為Tl代轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR鑒定。圖7為干旱脅迫處理下轉(zhuǎn)基因煙草生長情況。圖8為低溫脅迫處理下轉(zhuǎn)基因煙草生長情況。圖9為高鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草生長情況。具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、脫氧羥腐胺賴氨酸合酶編碼基因cDNA序列的分離脫氧羥腐胺賴氨酸合酶編碼基因ZM^全長cDNA序列是通過反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)方法結(jié)合cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)方法獲得的。具體地說，首先以來源于本生煙草GWco&'3朋力e/7f力柳ia朋)葉片的總RNA為模板，通過反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈；再以cDNA第一鏈為模板，根據(jù)巳發(fā)表的擬南芥、普通煙草(Wc"ia朋^tecc鵬)同源基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得868bpiWScDNA片段。然后在此片段內(nèi)部分別設(shè)計(jì)正向和反向引物，通過RACE方法，分別獲得cDNA的3'和5'末端序列，進(jìn)而再通過RT-PCR方法克隆出全長基因。1、總RNA提取采用TRIzol(Invitrogen)提取本生煙草d'c"ia"3Ae77tA3yz7j'3y7a)(國家禾中質(zhì)庫)正在衰老葉片的總RNA。取100mg植物葉片材料，液氮研磨后，轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，迅速加入lmlTRIzol試劑，25。C下溫育5min;4。C下12000rpm離心IOmin;取上清水相，轉(zhuǎn)移到一新的離心管中，加0.2ml氯仿，劇烈震蕩；25。C下溫育3min;4"C下12000rpm離心15min;取上清水相，轉(zhuǎn)移到一新的離心管中；加等體積5MLiCl，混勻；-2(TC下靜止lhr，沉淀RNA;12000rpm離心45min，4°C;棄上清，力n1ml75%乙醇，7500rpm離心5min，2-8。C;重復(fù)3次；棄乙醇，超鏡臺(tái)中空氣干燥10rain;加50|ilDEPC處理的雙蒸水溶解10min，55-60°C。2、868bpcDNA片段的克隆(1)cDNA第一鏈的合成使用ThermoScriptTMRT-PCR試劑盒(Invitrogen)，按照說明書的說明合成cDNA第一鏈。以oligo(dT)加為引物，42。C保溫lhr，之后加入lplRNaseH(2U/Vl)，37"C保溫10分鐘。(2)cDNA片段的PCR擴(kuò)增以lplcDNA第一鏈反應(yīng)混合物為模板，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增ZW5"cDNA片段，上游引物為DHSfl:5，-TTCACTTCAAACCTTGTTTCTTC，下游引物為DHSrl:5，-CCATGATACAGCTTCATCAGG。反應(yīng)體系為25|il，其中包含2.5(il10XPCRBuffer、1.5filMgCl2(25mM)、0.5[ildNTPmix(10raMeach)、各1jil的上游引物DHSf1和下游引物DHSrl(10|oM)、1^1cDNA第一鏈反應(yīng)混合物、0.15^tlTaqDNA聚合酶(5U/jil)和17.35[ilH20。PCR反應(yīng)運(yùn)行條件如下95°C，5min;94°C，30s，62°C，30s，—l。C/cycle，72°C，40s，12cycles;94°C，30s，50°C，30s，72°C,40s，30cycles;72°C，5min。反應(yīng)結(jié)束后，取20nlPCR產(chǎn)物在1X瓊脂糖凝膠上電泳檢測，結(jié)果如圖l所示，其中M為marker,泳道l為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。(3)DNA片段的電泳純化回收采用Vitagene-DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒，純化DHScDNA片段電泳完畢在紫外燈下切下目的條帶，放在1.5mlEP管中；加入3倍體積的凝膠熔化劑，混合后75°。溫浴8分鐘，期間間斷混合，使凝膠徹底熔化；力叫.5倍凝膠熔化劑體積的高離液序列溶液，混合均勻；取一新的離心吸附柱，置于2ml離心管中，將上一步所得的溶液加入離心吸附柱中，3600rpm，離心lmin，棄濾液；將離心吸附柱置回離心管中，加O.5ml洗滌液W1，3600rpm，離心30s，棄濾液；將離心吸附柱置回離心管中，加O.7ml洗滌液W2，3600rpm，離心30s，棄濾液，重復(fù)上步操作一次；將離心吸附柱置回離心管中，12000rpra離心lmin，盡量除去漂洗液；將離心吸附柱置于潔凈的l.5ml離心管中，在DNA制備膜正中央加25iul水，室溫靜置lmin，12000rpm離心lmin洗脫DNA，得到純化的DHScDNA片段。(4)DHSc.DNA片段克隆及測序使用pGEM-TEasy(promega)載體克隆DHScDNA片段取4)al純化的cDNA片段，依次加入5|il2xT4連接酶緩沖液，0.5|ilpGEM-TEasyvector(50ng/|il)，0.5|ilTJ)NA連接酶(3U/V1)，4"溫浴過夜。獲得DHScDNA片段與pGEM-TEasy載體的連接產(chǎn)物。大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞購自invitrogen(貨號(hào)18265017)，超凈臺(tái)內(nèi)，將連接產(chǎn)物加入到50^ilDH5a感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，置冰上30分鐘；42°C，熱激90s;冰浴2min;250|alLB液體培養(yǎng)基，37T培養(yǎng)lhr;將150(il細(xì)胞懸液混勻涂布在含100嗎/mlA卿、X-gal(40mg/L)，IPTG(40mg/L)的LB固體培養(yǎng)基上，37°C避光倒置培養(yǎng)過夜。挑取LB平板上的白色克隆3個(gè)，分別置于3mlLB培養(yǎng)基中，37'C震蕩培養(yǎng)過夜；隨后的質(zhì)粒DNA提取和^bo旦限制性內(nèi)切酶反應(yīng)參照《分子克隆》(ColdSpringHarborLaboratoryPress,edition1，1989)進(jìn)行。電泳檢測酶切片段的大小。含重組克隆的質(zhì)粒經(jīng)雙氧法測序，獲得的DHScDNA片段的核苷酸序列如序列表中序列l(wèi)所示，長度為868bp。將含序列表中序列l(wèi)所示核苷酸序列的質(zhì)粒載體命名為T-NbDHS。3、DHS基因cDNA3'和5'末端擴(kuò)增通過RACE技術(shù)擴(kuò)增DHScDNA3'和5，末端區(qū)域。根據(jù)上面獲得的DHS868bpcDNA片段的序列設(shè)計(jì)套式特異性引物DHSf2:5'-GAGGCTGTCCATGCTGGTTCGAG、DHSf3:5，-GCCTAAGCATCATGTTTGCAATG和DHSr2:5，-GGCGTCACCAAGATTAGCAGCTTGG、DHSr3:5，-CAATCTTCTATGGGCTGCTCATGTG，使用5'/3'RACE試劑Kit(羅氏應(yīng)用科學(xué)公司，目錄號(hào)03353621001)，按照說明書提供的方案，通過多重PCR，分別擴(kuò)增出DHScDNA3'和5'末端區(qū)域。擴(kuò)增的PCR片段經(jīng)電泳純化回收、克隆、測序，獲得DHScDNA3'和5，末端序列。所得的序列與前面獲得的868bpcDNA片段的序列拼接后，獲得該基因的全長編碼區(qū)核苷酸序列(即開放閱讀框)，如序列表中序列3所示。通過DNAMAN軟件推斷該開放閱讀框編碼的蛋白質(zhì)序列如序列表中序列4所示。實(shí)施例2、煙草抗逆性提高實(shí)驗(yàn)一、植物表達(dá)重組載體pAND的構(gòu)建以T-NbDHS質(zhì)粒為模板，利用弓I物DHS5，GAGCTCCTCATAAAATGCCTTGCACC(弓|入SacI位點(diǎn))和DHS3，TCTAGAACCATTTCGCATCATATTG(引入Xbal位點(diǎn))進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得516bp的DHScDNA片段，所得的PCR片段與pGEM-TEasy載體連接獲得T-NbDHS-l載體，導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)中，鑒定后提取質(zhì)粒。質(zhì)粒經(jīng)XbaI和Sacl雙酶切后，電泳檢測，結(jié)果如圖2所示，表明切出3.0kb和516bp的條帶，回收516bp的片段，再進(jìn)行測序，其序列如序列表中序列1自5'末端第268-783位核苷酸所示，表明片段序列正確。植物表達(dá)載體pBI121中含有花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子(CaMV35S啟動(dòng)子)和農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶基因3'終止子(NOS終止子)，其可以調(diào)節(jié)反義核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄。用限制性內(nèi)切酶Xbal和SacI酶切植物表達(dá)載體pBI121(Clontech，美國)，回收13kb的片段；取lul的516bp片段和10ul的13bk片段，加入10ul的連接緩沖液I，16。C連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR檢測、酶切檢測和測序，獲得含有516bpZM9反義核苷酸序列的重組質(zhì)粒載體，516bpZW5"反義核苷酸序列(自5'端至3'端)如序列表中序列2所示，516bp/M5"反義核苷酸序列位于載體中CaMV35S'啟動(dòng)子下游，將結(jié)構(gòu)正確的重組載體命名為pAND載體。二、植物表達(dá)重組載體pAND轉(zhuǎn)化煙草1、制備農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞挑取農(nóng)桿菌C58單菌落，接種在3mlLB培養(yǎng)基(含終濃度為5rag/L的四環(huán)素，終濃度為50mg/L的利福平)中，28。C震蕩培養(yǎng)過夜；取lml培養(yǎng)物接種在100mlLB培養(yǎng)基中，28"震蕩培養(yǎng)至OD,為0.5(約5-8hr);用50ml聚丙稀管收集菌液，4000rpm離心10min，4°C;棄上清液，用15ml預(yù)冷純水(18Q)懸浮細(xì)胞沉淀，4000rpm離心10min，4°C;重復(fù)上步一次；棄上清液，用10ml預(yù)冷的10%甘油(18Q純水配制)懸浮細(xì)胞沉淀，4000rpm離心10min，4°C;棄上清液，用0.75ml(每100ml菌液)預(yù)冷的10%甘油懸浮細(xì)胞沉淀；分裝在1.5mlEP管中，每管40^tl，液氮冷凍后，于-80°。冰箱內(nèi)保存。2、植物表達(dá)載體p認(rèn)D電擊轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌C58中自冰箱中取出C58電擊用感受態(tài)細(xì)胞，置冰上緩慢融化；將2iil質(zhì)粒加入到感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，置冰上；將感受態(tài)細(xì)胞和質(zhì)粒pANDDNA混合物加入到預(yù)冷的電擊杯中；2.5kv，400a25pF條件下電擊；迅速向電擊杯加入lmlLB培養(yǎng)基；將電擊杯中的全部溶液轉(zhuǎn)移到1.5mlEP管中，28。C溫育1hr;4000rpm離心2分鐘，棄800pi上清，余200重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液混勻涂布在含5mg/L四環(huán)素、50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上；待液體完全吸收后，28。C避光倒置培養(yǎng)，3天可見菌落。經(jīng)PCR檢測陽性農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子，獲得含有植物表達(dá)載體pAND的農(nóng)桿菌菌株。3、煙草的轉(zhuǎn)化挑取一個(gè)新鮮的含有植物表達(dá)載體pAND的農(nóng)桿菌單菌落，接種到LB液體培養(yǎng)基中(含終濃度為5mg/L四環(huán)素，終濃度為50mg/L利福平，終濃度為50mg/L卡那霉素)，28"C振蕩培養(yǎng)過夜。取lml菌液加入新鮮40ml的LB液體培養(yǎng)基，28°C220轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)2-3h(OD6。。=0.4-0.8)，待用。采用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草切取生長旺盛的煙草組培苗葉片，用刀片切成約lcm2;浸入稀釋的農(nóng)桿菌中，侵染5分鐘；用滅菌濾紙吸干多余的菌液，置于共培養(yǎng)基上，暗中共培養(yǎng)；共培養(yǎng)兩天后轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)；長出綠芽后(約2周左右)，轉(zhuǎn)至繼代培養(yǎng)基(即分化培養(yǎng)基)上繼代培養(yǎng)，每經(jīng)過2周繼代培養(yǎng)一次；分化出的小芽長至此2-3cm時(shí)(圖3)，轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基；生根后，移栽至花盆，溫室培養(yǎng)。所需培養(yǎng)基如下1)共培養(yǎng)培養(yǎng)基:MS+6-BAlmg/L+NAA0.lrag/L;2)分化篩選培養(yǎng)基MS+6-BAlrag/L+NAA0.1mg/L+Kan200rag/L+cef500mg/L;生根培養(yǎng)基MS+NAA0.1mg/L+Kan100mg/L+cef200mg/L。MS培養(yǎng)基的組成如表2所示。以轉(zhuǎn)入空載體pBI121的煙草W38作為空白對(duì)照。表2、MS培養(yǎng)基的組成<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>從浸染至篩選分化50天的外植體的分化狀態(tài)如圖3所示，A為轉(zhuǎn)入空載體pBI121的煙草W38陰性對(duì)照，其外植體幾乎不分化或分化緩慢，在kan抗性的篩選下，逐漸發(fā)黃死去；B為經(jīng)過含有pAND質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液浸染的外植體，已經(jīng)分化出數(shù)株獨(dú)立小苗，此時(shí)便可以剪出轉(zhuǎn)入篩選生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)。三、轉(zhuǎn)化植株的鑒定1、Southern分析鑒定TO代轉(zhuǎn)化植株Southern雜交按照《分子克隆》(ColdSpringHarborLaboratoryPress,edition1，1989)的說明進(jìn)行。使用HindIII和EcoRI雙酶切植物基因組，酶切電泳結(jié)果如圖4A所示，泳道1為pAND質(zhì)粒陽性對(duì)照，泳道4和12為轉(zhuǎn)入空載體pBI121的煙草W38陰性對(duì)照，泳道15為Marker,其余泳道為轉(zhuǎn)化的煙草；結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA經(jīng)酶切后，獲得一條1.5kb的特異帶。Southern雜交結(jié)果如圖4B所示。結(jié)果表明，除了第7泳道的轉(zhuǎn)化株系外，其它的轉(zhuǎn)化煙草苗均能雜交出1.5kb的目標(biāo)帶，由此表明這些植株的基因組中已經(jīng)插入煙草反義DHS基因片段。2個(gè)陰性對(duì)照W38(第4和第12泳道)均沒有雜交出目標(biāo)帶，由于有DHS內(nèi)源基因的存在，因此所有的植物基因組樣品泳道均雜出了2條大于2kb的帶。2、Tl代轉(zhuǎn)基因煙草的篩選鑒定將部分轉(zhuǎn)基因TO代植株移栽至自然環(huán)境中，在自然條件下生長成熟，收下種子，種子消毒后在kan200-800mg/l的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，同時(shí)以轉(zhuǎn)入空載體pBI121的煙草W38種子一起播種做對(duì)照。培養(yǎng)觀察，Kan濃度《400mg/1時(shí)W38種子仍然能正常生長，而當(dāng)Kan濃度達(dá)到600mg/L時(shí)，轉(zhuǎn)基因種子和對(duì)照種子的生長情況有明顯區(qū)別，如圖5所示所有陰性對(duì)照W38種子在kan600mg/l的MS培養(yǎng)基中都不能發(fā)芽或發(fā)芽生長約10天后逐漸發(fā)黃死亡(圖5B);而轉(zhuǎn)基因種子，由于F1代世代分離，一部分種子能夠正常發(fā)芽生長，另外一部分和陰性對(duì)照W38種子表現(xiàn)一樣(圖5A)。隨機(jī)抽取一部分Kan600mg/L的MS培養(yǎng)基篩選出的抗性苗，提取基因組DNA，做PCR鑒定，以如下引物進(jìn)行PCR鑒定DHS5':GAGCTCCTCATAAAATGCCTTGCACC和DHS3，TCTAGAACCATTTCGCATCATATTG，結(jié)果如圖6所示，表明經(jīng)過Kan篩選出來的小苗DNA樣品都能檢測到外源基因的存在，即能從kan600mg/L的MS培養(yǎng)基中生長出來的小苗均是轉(zhuǎn)基因植株。能在kan600mg/1的MS培養(yǎng)基正常生長的植株均為PCR檢測陽性苗，而W38的種子在該篩選強(qiáng)度上無法生長(圖5和圖6)。3、轉(zhuǎn)基因煙草的表型鑒定(1)抗旱性鑒定將上述篩選得到的陽性轉(zhuǎn)基因小苗移栽至蛭石和肥料組成的營養(yǎng)土中培養(yǎng)2個(gè)月，小苗生長穩(wěn)定，然后停止?jié)补?5天，以進(jìn)行逆境脅迫，觀察DHS下調(diào)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株表型性狀。結(jié)果如圖7所示(A組為W38陰性對(duì)照，B組為轉(zhuǎn)基因植株)。顯示停止?jié)补?5天的轉(zhuǎn)基因植株和W38對(duì)照的表型性狀。結(jié)果表明，2個(gè)W38對(duì)照都已經(jīng)嚴(yán)重萎蔫，葉片全部干癟皺縮，停止生長，臨近死亡；而轉(zhuǎn)基因植株中，各株系表現(xiàn)不同，有的株系長勢(shì)很好，幾乎沒有萎蔫，而有的株系出現(xiàn)不同程度的萎蔫狀，但是葉片持綠性相當(dāng)好，而且葉表面光滑，尚未出現(xiàn)干癟皺縮的現(xiàn)象。表明轉(zhuǎn)入反義DHS基因的株系的抗干旱能力有明顯的提高。(2)耐寒性鑒定將上述篩選得到的陽性轉(zhuǎn)基因小苗移栽至蛭石和肥料組成的營養(yǎng)土中培養(yǎng)2個(gè)月，小苗生長穩(wěn)定，然后將小苗從自然光溫室中轉(zhuǎn)入4"C冷害脅迫3天，之后室溫下放置3天，觀察小苗生長狀況，結(jié)果如圖8所示(A1和A2為W38陰性對(duì)照，Bl和B2為轉(zhuǎn)基因株系)。結(jié)果表明，W38陰性對(duì)照株表現(xiàn)為植株倒伏，葉片下垂腐爛，受到明顯的低溫傷害；而兩個(gè)轉(zhuǎn)基因株系仍然挺立，大部分葉片也沒有下垂腐爛，保持綠色，繼續(xù)生長，沒有明顯的受到冷害的現(xiàn)象。表明轉(zhuǎn)入反義DHS基因的株系的抗寒能力有明顯的提高。(3)抗鹽鑒定將上述篩選得到的陽性轉(zhuǎn)基因小苗移栽至蛭石和肥料組成的營養(yǎng)土中培養(yǎng)2個(gè)月，小苗生長穩(wěn)定，然后從營養(yǎng)土中挖出小苗(小心挖掘，避免傷害其根系)，用清水洗凈附在根系上的土壤，然后置于穿孔的漂浮板上，將其根系插入含有3%NaC1的MS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)6天，取出照相。結(jié)果如圖9所示，其中左側(cè)兩株為W38陰性對(duì)照，右側(cè)三株為轉(zhuǎn)基因IO號(hào)株系。表明，在3。/。的NaCl的MS培養(yǎng)基中生長6天后，左邊2個(gè)對(duì)照株的所有葉片已經(jīng)萎蔫，表面失去光澤，整個(gè)植株變得很癱軟柔弱，同時(shí)部分葉細(xì)胞已經(jīng)破損，導(dǎo)致葉片變褐腐爛；，而右側(cè)3個(gè)DHS下調(diào)的轉(zhuǎn)基因株的葉片仍保持自然光澤，整個(gè)植株仍然保持健壯直立，葉片也沒有表現(xiàn)出褐化腐爛的現(xiàn)象，表現(xiàn)出良好的抗鹽特征。表明轉(zhuǎn)入反義DHS基因的株系的有明顯的耐高鹽能力。序列表<160>4<210>1<211〉868〈212〉DNA<213〉煙草屬本生煙草OVicoz^'朋a力eWA3則'a朋)<400〉1tcaactggttgattggaggctctggtgtta3ctsc3gctggacttttcttttggttcctaatgtatgaagctgggtaaggcctgtattctttcaaaaaggggagatatcsattatcctagggtgcagattgcccgtcctgtccaagctgctttcacatgaagtctgtgacgagacaccatgtggtattgatacctggagcatgacaactagtcctggcttgggccatgaagtggggggctttgctgtctaatgaagctgttaatcttggtgcagcccatagtgcaaaatcccgctaccttggaggatctctgttctacgcctgcaaatttagsgaaggtttgaascctcaaactgatggataatccagattagcgaggctgcctaagcatatcatggagacgccsttcgaagattgcatttttggggtgttcagcaccataaaatgcctcaaaaggatgagaattggactgtggacac七3Cttgt3tttcagtgggtgttt33tcctggtccatgctgcatgtttgcagcacaagagtaaattgttaagtgaagaagatC3CttC3S3gtatggttgattgcaccaactgssccgtsttC3tCCC33tcatctaaagtgggcttac33acstgctgtagtctwtC3tgttcgaggssatgccaatatttgatggtagtcaaatgctaaagagatgtcccttgtctcttgttgtggttctacasggggtggtaatttattttgaccsacattgcgcgcgasccgggttcttccsttcttgacattgtggscgggsatggatgcgcaattgactctggt60120180240300360420480540600660720780840868〈210〉2〈211〉516〈212〉DNA<213〉煙草屬本生煙草(yV/co"朋sZOT^zs肌'a/^)〈400〉23ccsttgcgcS3tcattccctcccacaatggaaagaatggaggaacccggcaggcgcgcacatttggtcagtcccccttgatcatsttgggtcttcctcgtcaatgatta3agtscagcattcttgtaagatgsctttagaaaattgggaccaatacggttaggttggtgcattgcaaacaaccagcatggaccaggatttgtcacccacatggtgtccatgstccaatttcwtcctttcaaggcatttatgstgcttsgacagcctcgtgatccatcagtatgsggttcagaaccttcctcswtttgtgagcgtagatatgagggcagcccccctsttc3tggttatctggatgttaagccsgtcatcattaa七Cttt33tCtcagtagttgtacagctccagcacctaggstccctgst3tcctcccttttttttccttsccgctcttcatacattaggaac60120180240300360420480516<210〉3〈211〉1140〈212>DNA〈213〉煙草屬本生煙草GVz'coz^a/7a力朋z^3肌'a/a)<400>3atgggagagggctgagctttattc333ttgtgcagtgaaggggttcacttcaccgtatggtgccttgcacggattgaacctggatcstcctattgggcttggtgacatgccctggtctaagctggttcgatgc3atgccsgagtttgatgcgtggtggtggtagctgagaccctcaacgtgttctgccactcaagtctatcasaccttgtttgatgttgtgtattggtaacaatttttgaaagtcattgc3C33gs3ccgtgtscttcc3tcsttgacatggsagscgggatatgatgcggtagtgactcccaagactgtcatttgcagcaatggagtcaaaaaatcgaaggcctcaactgctagattggtgtcacatacctcttctggtggttactacagggggacttttttattggttccasatgtatgcgcctgggtggttcctgtattCtttC333tgtgggagataatgattatccaatggtgcatggtgcccgtgaaggtacatgtaagatcgaggctatgattggtttccaagaggctttcacagagagtctggttagagacagctggtggtatctttacctgcctaatgacagaagagcagaaaggaaattattctgtcctgaagggagatcstcsgggccactaggtgggggattttgctgcctgatgaagtgtgatgcaagssctctccctcaata33ggctgctwtctatgsgcagcctgacgtgcasccatccgctattgaggsggagagctgttctactactgcaaatgatgsaacgcttaactgac3g3twtcctgaatagcgaggctgcctaactgtatcatgcasttgc3ttatataagatgagaatcggaacgtt3sct3ttggtgacgccaatctttttgccttgttcagtctcataaaaacgctcaaaaggttctgtggctcst3cttgtggatcagtgsgatttt33tggctgtccatgcatcatgttcactgcacaagggs33aat3tccc3t3tta6012018024030036042048054060066〇720780840900960102010801140〈210〉4〈211〉379〈212〉Pro〈213〉煙草屬本生煙草GWc"J'a7a力e/7^a肌's/7a)〈400〉4MetGlyGluAlaLeuAsnValMetGluSerValArgSerlieValPhe151015LysGluSerGluAsnLeuGluGlySerAlaThrLyslieGluGlyTyr202530AspPheAsnLysGlyValAsnTyrAlaGluLeuPheLysSerMetAla354045SerThrGlyPheGinAlaAlaAsnLeuGlyAspAlalieGinlieVal505560AsnGinMetLeuAspTrpArgLeuSerHisGluGinProlieGluAsp65707580CysSerGluGluGluArgAspValThrTyrArgGluSerValThrCys859095LysliePheLeuGlyPheThrSerAsnLeuValSerSerGlyValArg100105110AspThrlieArgTyrLeuValGinHisArgMetValAspValValVal115120125ThrThrAlaGlyGlylieGluGluAspLeulieLysCysLeuAlaPro130135140ThrTyrLysGlyAspPheSerLeuProGlyAlaValLeuArgSerLys145150155160GlyLeuAsnArglieGlyAsnLeuLeuValProAsnAspAsnTyrCys165170175LysPheGluAsnTrplielieProliePheAspGinMetTyrGluGlu'180185190GinlieLysGluLysValLeuTrpThrProSerLysVallieAlaArg195200205LeuGlyLysGlulieAsnAspGluThrSerTyrLeuTyrTrpAlaTyr210215220LysAsnArgValProValPheCysProGlyLeuThrAspGlySerVal225230235240GlyAspMetLeuTyrPheHisSerPheLysLysGlyAspProAspAsn245250255ProAspPheAsnProGlyLeulielieAsplieValGlyAsplieArg260265270AlaMetAsnSerGluAlaValHisAlaGlySerArgLysThrGlyMet275280285lielieLeuGlyGlyGlyLeuProLysHisHisValCysAsnAlaAsn290295300MetMetArgAsnGlyAlaAspPheAlaValTyrlieAsnThrAlaGin305310315320GluPheAspGlySerAspSerGlyAlaArgProAspGluAlaValSer325330335TrpGlyLyslieArgGlyGlyAlaLysThrValLysValHisCysAsp340345350AlaThrlieAlaPheProlieLeuValAlaGluThrPheAlaAlaLys355360365ArgLysGluLeuSerHislieArgCysGinVal37037權(quán)利要求1、脫氧羥腐胺賴氨酸合酶，選自如下(a)或(b)(a)由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列4的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且編碼所述脫氧羥腐胺賴氨酸合酶的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。2、權(quán)利要求l所述脫氧羥腐胺賴氨酸合酶的編碼基因。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因選自如下(l)、(2)或(3):(1)核苷酸序列為序列表中序列3所示的DNA分子；(2)在嚴(yán)格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且編碼所述脫氧羥腐胺賴氨酸合酶的DNA分子；(3)與(1)限定的DNA序列有9(m以上同源性且編碼所述脫氧羥腐胺賴氨酸合酶的DNA分子。4、含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或表達(dá)盒。5、一種專用反義核苷酸序列，是權(quán)利要求2或3中任一所述編碼基因的反義核苷酸序列中的任一段大于等于25bp的序列。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的專用反義核苷酸序列，其特征在于所述專用反義核苷酸序列的核苷酸序列如序列表中序列2所示。7、含有權(quán)利要求5或6中任一所述專用反義核苷酸序列的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或表達(dá)盒。8、一種培育抗逆性植物的方法，是將權(quán)利要求5或6中任一所述專用反義核苷酸序列導(dǎo)入植物中，培育得到抗逆性植物。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述專用反義核苷酸序列是通過重組載體導(dǎo)入植物中的。10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述抗逆性為抗干旱性和/或抗低溫性和/或抗鹽性；所述植物為雙子葉植物。全文摘要本發(fā)明公開了脫氧羥腐胺賴氨酸合酶編碼基因及其抑制該基因表達(dá)的方法與專用反義核苷酸序列。本發(fā)明的脫氧羥腐胺賴氨酸合酶，選自如下(a)或(b)(a)由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列4的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且編碼所述脫氧羥腐胺賴氨酸合酶的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明中利用DHS的反義核苷酸序列抑制植物內(nèi)源DHS基因的正常表達(dá)，進(jìn)而提高了植物對(duì)多種不同脅迫環(huán)境的抗性，如抗旱性、耐低溫性和抗鹽性，每種抗性都顯著高于陰性對(duì)照，而且這幾種抗性都是同時(shí)得到提高的。因此，本發(fā)明脫氧羥腐胺賴氨酸合酶編碼基因及其反義核苷酸序列與本發(fā)明方法對(duì)提高作物的產(chǎn)量有重要意義。文檔編號(hào)C12N15/63GK101386842SQ20081011999公開日2009年3月18日申請(qǐng)日期2008年10月21日優(yōu)先權(quán)日2008年10月21日發(fā)明者李瑞芬,王宏芝,王彥珍,馬榮才,魏建華申請(qǐng)人:北京市農(nóng)林科學(xué)院