專利名稱：編碼植物脫氧海普賴氨酸合成酶的dna,植物真核起始因子5a,轉(zhuǎn)基因植物和控制植物衰 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有衰老誘導(dǎo)的表達(dá)的編碼植物多肽的多核苷酸。本發(fā)明還涉及含有反義方向的所述多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物和控制植物程序性細(xì)胞死亡，包括衰老的方法。更具體地講，本發(fā)明涉及一種衰老誘導(dǎo)的植物脫氧海普賴氨酸(deoxyhypusine)合成酶基因和衰老誘導(dǎo)的eIF-5A基因，其表達(dá)是通過包括衰老在內(nèi)的程序性細(xì)胞死亡的開始誘導(dǎo)的，以及將脫氧海普賴氨酸合成酶基因和eIF-5A基因單獨(dú)或組合用于控制植物的程序性細(xì)胞死亡和衰老。
現(xiàn)有技術(shù)衰老是植物生命的生物學(xué)發(fā)育的終結(jié)期。它預(yù)示著死亡，并且在各種水平的生物學(xué)組構(gòu)上發(fā)生，包括全植株、器官、花和果實(shí)，組織和單細(xì)胞。
衰老的開始可以由不同因素，包括內(nèi)部和外部因素誘導(dǎo)。衰老是植物或諸如果實(shí)、花和葉的植物組織的生命中復(fù)雜的、高度調(diào)控的發(fā)育階段。衰老會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜和大分子的協(xié)調(diào)的降解，以及隨后將代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到植物的其他部分。
除了在正常植物發(fā)育期間所發(fā)生的程序衰老之外，細(xì)胞和組織的死亡以及所引起的代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)移是由于外部環(huán)境因子的協(xié)調(diào)作用而引起的。引起衰老提前開始(又被稱作壞死或程序死亡)的外部因子包括環(huán)境脅迫，如溫度、干旱、光照不足或營(yíng)養(yǎng)不良，以及病原體侵襲。受到環(huán)境脅迫的植物組織還能產(chǎn)生乙烯，通常稱之為脅迫乙烯(Buchanan，Wollaston，V.，1997，實(shí)驗(yàn)植物學(xué)雜志43，181-199；Wright，M.1974，植物，152063-69)。已知乙烯能在某些植物中導(dǎo)致衰老。
衰老不是一個(gè)被動(dòng)的過程，相反，它是一個(gè)積極調(diào)控的過程，包括特定基因的調(diào)節(jié)表達(dá)。在衰老期間，總RNA水平降低并且很多基因的表達(dá)被關(guān)閉(Bate等，1991，實(shí)驗(yàn)植物學(xué)雜志42，801-11；Hensel等，1993，植物細(xì)胞，5，553-64)。不過，由越來越多的證據(jù)表明，衰老過程取決于從頭開始的核基因的轉(zhuǎn)錄。例如，衰老是受mRNA和蛋白合成抑制劑和去核化抑制的。將來自衰老葉片和綠色葉片的mRNA用于體外翻譯實(shí)驗(yàn)的分子研究發(fā)現(xiàn)了衰老葉片中葉片蛋白產(chǎn)物的改變了的形式(Thomas等，1992，植物生理學(xué)雜志，139，403-12)。利用視差篩選和扣除雜交技術(shù)業(yè)已從多種不同的植物中鑒定了代表衰老誘導(dǎo)基因的許多cDNA克隆，包括單子葉和雙子葉植物，如擬南芥屬、玉米、黃瓜、蘆筍、番茄、水稻和馬鈴薯。專門在衰老期間表達(dá)的基因的鑒定是衰老的發(fā)展需要從頭轉(zhuǎn)錄的有利證據(jù)。
在衰老期間所發(fā)生的事件似乎是高度協(xié)調(diào)的，以便能夠在壞死和死亡發(fā)生之前最大限度地利用細(xì)胞成分。復(fù)雜的相互作用包括對(duì)特殊信號(hào)的感知和必須發(fā)生的一連串基因表達(dá)的誘導(dǎo)，以便調(diào)控該過程。編碼衰老相關(guān)蛋白的基因的表達(dá)有可能是通過共同的活化蛋白調(diào)控的，而活化蛋白是通過激素信號(hào)直接或間接活化的。對(duì)有關(guān)該過程的起始信號(hào)或隨后的協(xié)調(diào)作用的機(jī)制所知甚少。
協(xié)調(diào)的基因表達(dá)需要與轉(zhuǎn)錄和翻譯相關(guān)的因子，包括起始因子。業(yè)已在包括植物在內(nèi)的各種生物中分離并鑒定了翻譯起始因子基因。真核翻譯起始因子5A(eIF-5A)是大小為17KDa的一種重要的蛋白因子，它與真核細(xì)胞蛋白合成的開始相關(guān)。其特征是存在海普賴氨酸(hypusine)[N-(4-氨基-2-羥基丁基)賴氨酸]，它是一種修飾過的氨基酸，已知其僅存在于eIF-5A中。海普賴氨酸是在翻譯之后通過將多胺、亞精胺上的丁基氨基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到eIF-5A上面的特定賴氨酸殘基的側(cè)鏈氨基基團(tuán)上并羥化而形成的。eIF-5A的活化包括將亞精胺的丁胺殘基轉(zhuǎn)移到eIF-5A的賴氨酸上，形成海普賴氨酸并活化eIF-5A。在真核生物中，脫氧海普賴氨酸合成酶(DHS)能介導(dǎo)海普賴氨酸在eIF-5A中的翻譯后合成。不過，在植物中尚未鑒定相應(yīng)的DHS基因，已知植物eIF-5A含有海普賴氨酸。用甲硫氨酰嘌呤霉素測(cè)定業(yè)已證實(shí)了海普賴氨酸的改性是eIF-5A活化所必需的。
海普賴氨酸僅存在于eIF-5A中，并且存在于所有真核生物、某些古細(xì)菌(似乎與真核生物相關(guān))，但不存在于真桿菌中。另外，eIF-5A的氨基酸序列是高度保守的，特別是在海普賴氨酸殘基周圍的部分，這表明eIF-5A及其活化蛋白脫氧海普賴氨酸合成酶在真核細(xì)胞生理學(xué)中執(zhí)行著在根本上很重要的步驟(Joe等，JBC，27022386-22392，1995)。業(yè)已從人、苜蓿、粘菌、粗糙鏈孢霉、煙草和酵母中克隆了eIF-5A。根據(jù)它是從兔網(wǎng)質(zhì)紅細(xì)胞裂解物的核糖體中分離的這一事實(shí)及其在促進(jìn)甲硫氨酸嘌呤霉素合成方面的體外活性最初將其確定為一種普通的翻譯起始因子。不過，最新的證據(jù)表明，eIF-5A不是球蛋白合成的翻譯起始因子，而是起著促進(jìn)特殊mRNA群體的特征的亞類的翻譯的作用。例如，有來自用動(dòng)物細(xì)胞和酵母所做實(shí)驗(yàn)的有利的證據(jù)表明，eIF-5A的一種或多種同種型在介導(dǎo)與細(xì)胞增殖相關(guān)的mRNA亞類的翻譯中起著重要的作用。在酵母中有兩種同種型，并且如果兩個(gè)基因都是沉默的，該細(xì)胞就不能夠分裂(Park等，生物學(xué)信號(hào)6，115-123，1997)。類似的，使能活化eIF-5A的酵母脫氧海普賴氨酸合成酶的表達(dá)沉默，能抑制細(xì)胞分裂。實(shí)際上，業(yè)已開發(fā)了脫氧海普賴氨酸合成酶的抑制劑，它很可能在過度增殖的癥狀的治療中起重要作用(Wolff等，JBC，27215865-15871，1997)。其他研究業(yè)已證實(shí)，eIF-5A的另一種同種型是HIA-1復(fù)制的Rev功能或HTLLVV復(fù)制的Rex功能所必需的(Park等，生物學(xué)信號(hào)6115-123，1997)。在煙草中至少也有兩種表達(dá)的eIF-5A基因?；?qū)Ｒ恍詸z測(cè)表明，盡管這兩種基因在所有檢查過的組織中都能表達(dá)，但每一種基因具有不同的表達(dá)形式，它有可能調(diào)控特定轉(zhuǎn)錄物的翻譯(Chamot等，核酸研究20625-669，1992)。
業(yè)已從大鼠睪丸、HeLa細(xì)胞、粗糙鏈孢霉和酵母中純化了脫氧海普賴氨酸合成酶。脫氧海普賴氨酸合成酶的氨基酸序列是高度保守的，并且來自不同物種的這種酶具有類似的物理特性和催化特性，并且表現(xiàn)出與異源eIF-5A前體的交叉物種反應(yīng)性(Park等，生物學(xué)信號(hào)6115-123，1997)。
植物多胺與多種生理學(xué)作用相關(guān)，包括花的誘導(dǎo)、胚胎發(fā)生、病原體抗性、細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和分裂(Evans等，1989，植物生理學(xué)植物分子生物學(xué)年度綜述40，235-269；和Galston等，1990，植物生理學(xué)94，406-10)。業(yè)已證實(shí)，eIF-5A是一種中間介體，通過它多胺發(fā)生其作用(Chamot等，1992，核酸研究，20，4，665-69)。
業(yè)已鑒定了來自煙草的編碼eIF-5A的同種型的兩種基因(NeIF-5A1和NeIF-5A2)(Chamot等，1992，核酸研究，20，4，665-69)。業(yè)已證實(shí)這兩種基因非常相似。不過，它們具有不同的表達(dá)方式。其中的一個(gè)基因似乎在mRNA水平上是組成型表達(dá)的，而另一種基因的表達(dá)形式與光合作用活性的存在或缺乏相關(guān)。根據(jù)基因結(jié)構(gòu)和基因組Southern作圖業(yè)已發(fā)現(xiàn)，在煙草中存在NeIF-5A基因的多基因家族。有可能存在一種eIF-5A同種型，它調(diào)控著衰老/壞死專一性mRNA轉(zhuǎn)錄物亞型的翻譯。
目前，還沒有能廣泛應(yīng)用的用來控制由內(nèi)部因子或諸如環(huán)境脅迫的外部因子所導(dǎo)致的程序性細(xì)胞死亡(包括衰老)開始的方法。因此，人們有興趣開發(fā)衰老調(diào)節(jié)技術(shù)，該技術(shù)適用于所有類型的植物，并且在導(dǎo)致衰老的一連串事件的最初階段是有效的。
發(fā)明概述本發(fā)明基于編碼番茄衰老誘導(dǎo)的脫氧海普賴氨酸合成酶(DHS)的完整長(zhǎng)度cDNA克隆，以及源于擬南芥屬葉片和香石竹花瓣的完整長(zhǎng)度衰老誘導(dǎo)的DHS cDNA克隆的發(fā)現(xiàn)和克隆。本文披露了有關(guān)核苷酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列。
本發(fā)明還部分基于源于番茄、擬南芥屬和香石竹的編碼衰老誘導(dǎo)的eIF-5A基因的完整長(zhǎng)度cDNA克隆的發(fā)現(xiàn)和克隆。本文披露了每一種eIF-5A cDNA克隆的核苷酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列。
本發(fā)明提供了一種對(duì)植物進(jìn)行遺傳學(xué)修飾以便控制衰老開始的方法，所述衰老是與年齡相關(guān)的衰老或環(huán)境脅迫誘導(dǎo)的衰老。將本發(fā)明的衰老誘導(dǎo)的DHS核苷酸序列，其片段或所述片段的組合沿反方向?qū)胫参锛?xì)胞，以便抑制內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的DHS基因的表達(dá)，從而降低內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的DHS蛋白的含量，并降低和/或抑制eIF-5A的活化，并導(dǎo)致介導(dǎo)衰老的基因的表達(dá)。
在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明的衰老誘導(dǎo)的eIF-5A核苷酸序列、其片段或所述片段的組合沿反方向?qū)胫参锛?xì)胞，以便抑制內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的eIF-5A基因的表達(dá)，從而降低內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的eIF-5A蛋白的含量，并降低和/或抑制導(dǎo)致能介導(dǎo)衰老的基因的表達(dá)。另外，可以同時(shí)使用DHS和eIF-5A序列，以便降低內(nèi)源DHS和eIF-5A蛋白的含量。
在另一方面，本發(fā)明涉及一種對(duì)植物進(jìn)行遺傳學(xué)修飾以便控制衰老開始的方法，所述衰老是與年齡相關(guān)的衰老或環(huán)境脅迫誘導(dǎo)的衰老，該方法是這樣實(shí)現(xiàn)的將組合的本發(fā)明的衰老誘導(dǎo)的eIF-5A核苷酸序列和本發(fā)明的衰老誘導(dǎo)的DHS核苷酸序列沿反方向?qū)胫参锛?xì)胞，以便抑制內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的eIF-5A基因和衰老誘導(dǎo)的DHS基因的表達(dá)，從而降低內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的DHS蛋白的含量，并降低和/或抑制eIF-5A的活化，并導(dǎo)致能介導(dǎo)衰老的基因的表達(dá)。
利用本發(fā)明方法生產(chǎn)了轉(zhuǎn)基因植物，并監(jiān)測(cè)其生長(zhǎng)、發(fā)育，以及自然的或提前誘導(dǎo)的衰老。選擇由于衰老誘導(dǎo)的DHS、衰老誘導(dǎo)的eIF-5A或這兩者的含量降低而表現(xiàn)出較長(zhǎng)的壽命或貨架壽命(例如，花的延長(zhǎng)的壽命，果實(shí)或蔬菜腐爛的減少，增加了的生物物質(zhì)，提高了的種子產(chǎn)量，減弱了的種子老化和/或減弱了的葉片黃化)的植物或植物的分離部分(例如，結(jié)穗、花、蔬菜、果實(shí)、種子或葉片)作為具有改善了的特性的理想產(chǎn)品，所述特性包括減弱了的葉片黃化、減弱了的花瓣脫落、在運(yùn)輸和儲(chǔ)存期間減弱了的果實(shí)和蔬菜的腐爛。繁殖上述優(yōu)良植物。類似地，選擇對(duì)環(huán)境脅迫具有較高抗性，例如，受低溫(冷害)、干旱、感染等的影響較小和/或?qū)Σ≡w具有較高抗性的植物作為優(yōu)良產(chǎn)物。
在一方面，本發(fā)明涉及一種編碼衰老誘導(dǎo)的DHS的分離的DNA分子，其中，該DNA分子能與SEQ ID NO1雜交，或者能與SEQ IDNO1雜交的所述分離的DNA分子的功能性衍生物。在本發(fā)明這一方面的一種實(shí)施方案中，所述分離的DNA分子具有SEQ ID NO1的核苷酸序列，即與SEQ ID NO1具有100％的互補(bǔ)性(序列相同性)。
本發(fā)明還涉及一種編碼衰老誘導(dǎo)的DHS的分離的DNA分子，其中，該DNA分子能與SEQ ID NO9雜交，或者能與SEQ ID NO9雜交的所述分離的DNA分子的功能性衍生物。在本發(fā)明這一方面的一種實(shí)施方案中，所述分離的DNA分子具有SEQ ID NO9的核苷酸序列，即與SEQ ID NO9具有100％的互補(bǔ)性(序列相同性)。
本發(fā)明還涉及一種編碼衰老誘導(dǎo)的eIF-5A的分離的DNA分子，其中，該DNA分子能與SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15雜交，或能與SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15雜交的所述分離的DNA分子的功能性衍生物。在本發(fā)明這一方面的一種實(shí)施方案中，所述分離的DNA分子具有SEQ ID NO11、SEQ IDNO13或SEQ ID NO15的核苷酸序列，即與SEQ ID NO11、SEQID NO13或SEQ ID NO15具有100％的互補(bǔ)性(序列相同性)。
在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中，提供了一種由上述DNA分子所編碼的分離的蛋白，或其功能性衍生物。一種優(yōu)選的蛋白具有SEQ IDNO2的氨基酸序列，或者是它的功能性衍生物。另一種優(yōu)選的蛋白具有SEQ ID NO10的氨基酸序列，或者是它的功能性衍生物。本發(fā)明的其他優(yōu)選的蛋白具有SEQ ID NO12、SEQ ID NO14或SEQ IDNO16的氨基酸序列。
本發(fā)明還提供了一種編碼RNA分子的反義寡核苷酸或多核苷酸，它互補(bǔ)于上文所述DNA分子的RNA轉(zhuǎn)錄物的相應(yīng)部分，其中，所述寡核苷酸或多核苷酸能與所述RNA轉(zhuǎn)錄物雜交，以便改變內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的DHS的表達(dá)。在本發(fā)明這一方面的另一種實(shí)施方案中，所述反義寡核苷酸或多核苷酸是能與上文所述DNA分子的RNA轉(zhuǎn)錄物的相應(yīng)部分雜交的RNA分子，以便改變內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的eIF-5A的表達(dá)。所述反義寡核苷酸或多核苷酸可以是完整長(zhǎng)度的，或者優(yōu)選具有大約6-大約100個(gè)核苷酸。
所述反義寡核苷酸或多核苷酸可以大體上互補(bǔ)于編碼衰老誘導(dǎo)的DHS的DNA分子的一股鏈的相應(yīng)部分，其中，編碼衰老誘導(dǎo)的DHS的DNA分子能與SEQ ID NO1、SEQ ID NO5、SEQ ID NO9或其組合雜交，或者基本上互補(bǔ)于由編碼衰老誘導(dǎo)的DHS的DNA分子所編碼的RNA序列的至少一個(gè)相應(yīng)部分。在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，所述反義寡核苷酸或多核苷酸基本上互補(bǔ)于核苷酸SEQ ID NO1、SEQ ID NO5、SEQ ID NO9的一股鏈的相應(yīng)部分或其組合雜交，或由SEQ ID NO1、SEQ ID NO5或SEQ ID NO9或其組合轉(zhuǎn)錄的RNA轉(zhuǎn)錄物。在另一種實(shí)施方案中，所述反義寡核苷酸基本上互補(bǔ)于編碼衰老誘導(dǎo)的DHS的DNA分子的一股鏈的5’非編碼部分或3’部分的相應(yīng)部分，其中，所述DNA分子能與SEQ ID NO1、SEQ ID NO5、SEQ ID NO9或其組合雜交。
另外，所述反義寡核苷酸或多核苷酸可以基本上互補(bǔ)于編碼衰老誘導(dǎo)的eIF-5A的DNA分子的一股鏈的相應(yīng)部分，其中，編碼衰老誘導(dǎo)的eIF-5A的DNA分子能與SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15或其任意組合雜交，或者基本上互補(bǔ)于由SEQ ID NO11、SEQ IDNO13或SEQ ID NO15轉(zhuǎn)錄的RNA序列的至少一個(gè)相應(yīng)部分。在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，所述反義寡核苷酸或多核苷酸基本上互補(bǔ)于核苷酸SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15或其組合的一股鏈的相應(yīng)部分，或者所編碼的RNA轉(zhuǎn)錄物基本上互補(bǔ)于由編碼衰老誘導(dǎo)的eIF-5A的DNA分子所編碼的RNA序列的相應(yīng)部分。在另一種實(shí)施方案中，所述反義寡核苷酸基本上互補(bǔ)于編碼衰老誘導(dǎo)的eIF-5A的DNA分子的一股鏈的5’非編碼或3’非編碼區(qū)的相應(yīng)部分，其中，所述DNA能與SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15或其組合雜交。
本發(fā)明還涉及一種用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的載體，包括(a)一種反義寡核苷酸或多核苷酸，它基本上互補(bǔ)于(1)編碼衰老誘導(dǎo)的DHS的DNA分子的一股鏈的相應(yīng)部分，其中，所述編碼衰老誘導(dǎo)的eIF-5A的DNA分子能與SEQ ID NO1、SEQ ID NO5或SEQ ID NO9雜交，或(2)由編碼衰老誘導(dǎo)的DHS的DNA分子所編碼的RNA序列的相應(yīng)部分；和(b)可操作地連接于所述反義寡核苷酸或多核苷酸上的調(diào)控序列，以便所述反義寡核苷酸或多核苷酸能在用它轉(zhuǎn)化過的植物細(xì)胞中表達(dá)。
本發(fā)明還涉及用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的載體，包括(a)一種反義寡核苷酸或多核苷酸，它基本上互補(bǔ)于(1)編碼衰老誘導(dǎo)的eIF-5A的DNA分子的一股鏈的相應(yīng)部分，其中，所述編碼衰老誘導(dǎo)的eIF-5A的DNA分子能與SEQ ID NO11、SEQ ID NO13或SEQ ID NO15雜交，(2)由編碼衰老誘導(dǎo)的eIF-5A的DNA分子所編碼的RNA序列的相應(yīng)部分；和(b)可操作地連接于所述反義寡核苷酸或多核苷酸上的調(diào)控序列，以便所述反義寡核苷酸或多核苷酸能在用它轉(zhuǎn)化過的植物細(xì)胞中表達(dá)。
所述調(diào)控序列包括能在轉(zhuǎn)化過的植物細(xì)胞中起作用的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子可以是誘導(dǎo)型的或組成型的，所述調(diào)控序列可選擇性地包括一個(gè)聚腺苷酸化信號(hào)。
本發(fā)明還提供了一種用上文所述載體或所述載體的組合轉(zhuǎn)化過的植物細(xì)胞、由所述細(xì)胞所產(chǎn)生的小植株或成熟植株，或所述小植株或植株的植物部分。
本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)與未修飾過的植物相比具有較低含量的衰老誘導(dǎo)的DHS、衰老誘導(dǎo)的eIF-5A或這兩者的方法，包括(1)用上述載體或載體的組合轉(zhuǎn)化植物；(2)讓所述植物至少生長(zhǎng)到小植株階段；(3)評(píng)估轉(zhuǎn)化過的植株或小植株的改變了的衰老誘導(dǎo)的DHS活性和/或eIF-5A活性，和/或改變了的衰老和/或改變了的環(huán)境脅迫誘導(dǎo)的衰老和/或改變了的病原體誘導(dǎo)的衰老和/或乙烯誘導(dǎo)的衰老；和(4)篩選并生長(zhǎng)與未轉(zhuǎn)化過的植物相比具有改變了的衰老誘導(dǎo)的DHS活性和/或減少了的eIF-5A和/或改變了的衰老和/或改變了的環(huán)境脅迫誘導(dǎo)的衰老和/或改變了的病原體誘導(dǎo)的衰老和/或乙烯誘導(dǎo)的衰老的植株。
按上述方法的植株或后代、雜交種、克隆或植物部分優(yōu)選具有降低了的衰老誘導(dǎo)的DHS表達(dá)，降低了的衰老誘導(dǎo)的eIF-5A活性，或同時(shí)具備這兩者，以及推遲了的衰老和/或推遲了的脅迫誘導(dǎo)的衰老和/或病原體誘導(dǎo)的衰老和/或乙烯誘導(dǎo)的衰老。
本發(fā)明還涉及一種抑制植物細(xì)胞中內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的DHS表達(dá)的方法，該方法包括(1)將一種載體整合到植物基因組中，該載體包括(A)一種反義寡核苷酸或多核苷酸，它基本上互補(bǔ)于(i)編碼內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的DHS的DNA分子的一股鏈的至少一部分，其中，所述編碼內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的DHS的DNA分子能與SEQ ID NO1、SEQ ID NO5和/或SEQ ID NO9雜交，或(ii)由內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的DHS基因所編碼的RNA序列的至少一部分；和(B)可操作地連接于所述反義寡核苷酸或多核苷酸上的調(diào)控序列，以便表達(dá)所述反義寡核苷酸或多核苷酸；和(2)生長(zhǎng)所述植物，以便所述反義寡核苷酸或多核苷酸被轉(zhuǎn)錄并且轉(zhuǎn)錄物結(jié)合在所述內(nèi)源RNA上，從而抑制所述衰老誘導(dǎo)的DHS基因的表達(dá)。
本發(fā)明還涉及一種抑制植物細(xì)胞中內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的eIF-5A表達(dá)的方法，該方法包括
(1)將一種載體整合到植物基因組中，該載體包括(A)一種反義寡核苷酸或多核苷酸，它互補(bǔ)于(i)編碼內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的eIF-5A的DNA分子的一股鏈的相應(yīng)部分，其中，所述編碼內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的eIF-5A的DNA分子能與SEQ ID NO11、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17或其組合雜交，或(ii)由所述內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的eIF-5A基因所編碼的RNA序列的至少一部分；和(B)可操作地連接于所述反義寡核苷酸或多核苷酸上的調(diào)控序列，以便表達(dá)所述反義寡核苷酸或多核苷酸；和(2)生長(zhǎng)所述植物，以便所述反義寡核苷酸或多核苷酸被轉(zhuǎn)錄并且轉(zhuǎn)錄物結(jié)合在所述內(nèi)源RNA上，從而抑制所述衰老誘導(dǎo)的eIF-5A基因的表達(dá)。
附圖簡(jiǎn)述


圖1表示從番茄葉片cDNA文庫(kù)獲得的衰老誘導(dǎo)的番茄葉片DHScDNA序列的核苷酸序列(SEQ ID NO1)以及衍生的氨基酸序列(SEQID NO2)。
圖2A表示通過將番茄DHS序列與擬南芥屬基因庫(kù)中的未鑒定的基因組序列進(jìn)行排比所獲得的擬南芥屬DHS基因的核苷酸序列(http//genome-www.stanford.edu/Arabidopsis/)(SEQ ID NO5)。氨基酸序列之間的缺口是推測(cè)的內(nèi)含子。圖2B表示衍生的擬南芥屬DHS氨基酸序列(SEQ ID NO6)。圖2C表示通過PCR獲得的600個(gè)堿基對(duì)的衰老誘導(dǎo)的擬南芥屬DHS cDNA的核苷酸序列。圖2D表示該衰老誘導(dǎo)的擬南芥屬DHS cDNA衍生的氨基酸序列。
圖3是衍生的完整長(zhǎng)度番茄葉片衰老誘導(dǎo)的DHS氨基酸序列(SEQID NO2)和衍生的完整長(zhǎng)度擬南芥屬衰老誘導(dǎo)的DHS氨基酸序列與人、酵母、真菌和古細(xì)菌的DHS蛋白序列的排比。在三種序列或四種中相同的氨基酸用方框標(biāo)出。
圖4是番茄DHS cDNA的限制圖。
圖5是從番茄葉片中分離的并且用32P-dCTP標(biāo)記的完整長(zhǎng)度番茄衰老誘導(dǎo)的DHS cDNA檢測(cè)的基因組DNA的Southern印跡。
圖6是從不同發(fā)育階段的番茄花中分離的RNA的Northern印跡。圖6A是總RNA的溴化乙錠染色的凝膠。每一個(gè)泳道含有10微克RNA。圖6B是用32P-dCTP標(biāo)記的完整長(zhǎng)度番茄衰老誘導(dǎo)的DHS cDNA檢測(cè)的Northern印跡的放射性自顯影。
圖7是從各個(gè)成熟階段的番茄果實(shí)中分離的用32p-dCTP標(biāo)記的完整長(zhǎng)度番茄衰老誘導(dǎo)的DHS cDNA檢測(cè)的RNA的Northern印跡，每一個(gè)泳道含有10微克RNA。
圖8是從通過用2M山梨醇處理6小時(shí)而受到干旱脅迫的番茄葉片中分離的RNA的Northern印跡。用32p-dCTP標(biāo)記的完整長(zhǎng)度番茄衰老誘導(dǎo)的DHS cDNA檢測(cè)該印跡。
圖9是從受到過冷害溫度的番茄葉片中分離的RNA的Northern印跡。圖9A是總RNA的溴化乙錠染色的凝膠。每一個(gè)泳道含有10微克RNA。圖9B是用32P-dCTP標(biāo)記的完整長(zhǎng)度番茄衰老誘導(dǎo)的DHS cDNA檢測(cè)的Northern印跡的放射性自顯影。圖9C表示相應(yīng)的滲漏數(shù)據(jù)，是作為葉片擴(kuò)散物的導(dǎo)電性測(cè)定的。
圖10是香石竹DHS完整長(zhǎng)度(1384bp)cDNA克隆核苷酸序列(SEQ ID NO9)，不包括聚腺苷酸尾巴和5’末端非編碼區(qū)。衍生的氨基酸序列在核苷酸序列下面示出(373個(gè)氨基酸)(SEQ ID NO10)。
圖11是來自衰老的擬南芥屬葉片并用32P-dCTP標(biāo)記的完整長(zhǎng)度番茄衰老誘導(dǎo)的DHS cDNA檢測(cè)的總RNA的Northern印跡。放射性自顯影在上面，溴化乙錠染色的凝膠在下面。
圖12是從各個(gè)時(shí)期的香石竹花瓣中分離的總RNA的Northern印跡。印跡是用32P-dCTP標(biāo)記的完整長(zhǎng)度番茄衰老誘導(dǎo)的DHS cDNA檢測(cè)的。放射性自顯影在上面，溴化乙錠染色的凝膠在下面。
圖13是番茄果實(shí)衰老誘導(dǎo)的eIF-5A基因的核苷酸序列(頂部)(SEQ ID NO11)和衍生的氨基酸序列(底部)(SEQ ID NO12)。
圖14是香石竹衰老誘導(dǎo)的eIF-5A基因的核苷酸序列(頂部)(SEQID NO13)和衍生的氨基酸序列(底部)(SEQ ID NO14)。
圖15是擬南芥屬衰老誘導(dǎo)的eIF-5A基因的核苷酸序列(頂部)(SEQ ID NO15)和衍生的氨基酸序列(底部)(SEQ ID NO16)。
圖16是從各個(gè)發(fā)育階段的擬南芥屬植物葉片中分離的總RNA的Northern印跡。用32P-dCTP標(biāo)記的完整長(zhǎng)度擬南芥屬衰老誘導(dǎo)的DHScDNA和完整長(zhǎng)度衰老誘導(dǎo)的eIF-5A檢測(cè)該印跡。放射性自顯影在上面，溴化乙錠染色的凝膠在下面。
圖17是從處在發(fā)育的生硬(BK)、紅-硬(RF)和紅-軟(RS)階段的番茄果實(shí)中分離的總RNA的Northern印跡。用32P-dCTP標(biāo)記的完整長(zhǎng)度衰老誘導(dǎo)的DHS cDNA和完整長(zhǎng)度衰老誘導(dǎo)的eIF-5A檢測(cè)該印跡。與果實(shí)成熟吻合，在紅-軟果實(shí)中DHS和eIF-5A同時(shí)上調(diào)。放射性自顯影在上部，溴化乙錠染色的凝膠在下部。
圖18是從用山梨醇處理過的以便誘導(dǎo)干旱脅迫的番茄葉片中分離的總RNA的Northern印跡。C是對(duì)照，S是山梨醇處理。用32P-dCTP標(biāo)記的完整長(zhǎng)度衰老誘導(dǎo)的DHS cDNA和完整長(zhǎng)度衰老誘導(dǎo)的eIF-5A檢測(cè)該印跡。隨著干旱脅迫，eIF-5A和DHS都被上調(diào)。放射性自顯影在上部，溴化乙錠染色的凝膠在下部。
圖19是從用番茄植物的花芽和開放的衰老的花中分離的總RNA的Northern印跡。用32P-dCTP標(biāo)記的完整長(zhǎng)度衰老誘導(dǎo)的DHS cDNA和完整長(zhǎng)度衰老誘導(dǎo)的eIF-5A檢測(cè)該印跡。在開放的/衰老的花中eIF-5A和DHS都被上調(diào)。放射性自顯影在上部，溴化乙錠染色的凝膠在下部。
圖20是從用冷害損傷的番茄葉片中分離的總RNA的Northern印跡。用32P-dCTP標(biāo)記的完整長(zhǎng)度衰老誘導(dǎo)的DHS cDNA和完整長(zhǎng)度衰老誘導(dǎo)的eIF-5A檢測(cè)該印跡。在回溫期間隨著冷害損傷的發(fā)展eIF-5A和DHS都被上調(diào)。放射性自顯影在上部，溴化乙錠染色的凝膠在下部。
圖21是3.1周齡擬南芥屬野生型(左)和表達(dá)沿反義方向的衰老DHS基因的3’末端(如圖36所述的序列)的轉(zhuǎn)基因植物的照片，在轉(zhuǎn)基因植物上表現(xiàn)出葉片大小的增加。
圖22是4.6周齡擬南芥屬野生型(左)和表達(dá)沿反義方向的衰老DHS基因的3’末端(如圖36所述的序列)的轉(zhuǎn)基因植物的照片，在轉(zhuǎn)基因植物上表現(xiàn)出葉片大小的增加。
圖23是5.6周齡擬南芥屬野生型(左)和表達(dá)沿反義方向的衰老DHS基因的3’末端(如圖36所述的序列)的轉(zhuǎn)基因植物的照片，在轉(zhuǎn)基因植物上表現(xiàn)出葉片大小的增加。
圖24是6.1周齡擬南芥屬野生型(左)和表達(dá)沿反義方向的衰老DHS基因的3’末端(如圖36所述的序列)的轉(zhuǎn)基因植物的照片，在轉(zhuǎn)基因植株上表現(xiàn)出大小的增加。
圖25是表示能表達(dá)沿反義方向衰老誘導(dǎo)的DHS基因的三個(gè)轉(zhuǎn)基因擬南芥屬植物品系組織產(chǎn)量提高的曲線圖。種子產(chǎn)量以種子體積形式表示。給出了野生型植物的n＝30的SE。
圖26是能表達(dá)沿反義方向的衰老DHS基因的3’末端(圖36所示序列)的轉(zhuǎn)基因番茄植物(左)和野生型植物(右)的照片，表示轉(zhuǎn)基因植物葉片大小的增加和植株大小的增加。該照片是在將小植株移栽到土壤中18天之后拍攝的。
圖27是能表達(dá)沿反義方向的衰老DHS基因的3’末端(圖36所示序列)的轉(zhuǎn)基因番茄植物(左)和野生型植物(右)的照片，表示轉(zhuǎn)基因植物葉片大小的增加和植株大小的增加。該照片是在將小植株移栽到土壤中32天之后拍攝的。
圖28-35是來自野生型的番茄果實(shí)(頂部照片)和能表達(dá)沿反義方向的完整長(zhǎng)度衰老DHS基因的轉(zhuǎn)基因植物的番茄果實(shí)(底部照片)的照片。果實(shí)是在發(fā)育的生硬階段收獲的，并在生長(zhǎng)箱中熟化。收獲后的天數(shù)在每一幅照片的左上角示出。
圖36是用于沿反義方向轉(zhuǎn)化植物的擬南芥屬衰老誘導(dǎo)的DHS基因的3’末端的核苷酸序列(頂部)(SEQ ID NO30)和衍生的氨基酸序列(底部)。
圖37是用于沿反義方向轉(zhuǎn)化植物的番茄衰老誘導(dǎo)的DHS基因的3’末端的核苷酸序列(頂部)(SEQ ID NO31)和衍生的氨基酸序列(底部)。
圖38是用于分離完整長(zhǎng)度擬南芥屬基因的600bp擬南芥屬衰老誘導(dǎo)的DHS探針的核苷酸序列(頂部)(SFQ ID NO26)和衍生的氨基酸序列(底部)。
圖39是用于分離完整長(zhǎng)度香石竹基因的483bp香石竹衰老誘導(dǎo)的DHS探針的核苷酸序列(頂部)(SEQ ID NO27)和衍生的氨基酸序列(底部)。
發(fā)明詳述提供了用于改變植物細(xì)胞中衰老誘導(dǎo)的DHS基因、衰老誘導(dǎo)的eIF-5A基因或這兩種基因的表達(dá)的方法和組合物。植物中衰老誘導(dǎo)的DHS和衰老誘導(dǎo)的eIF-5A表達(dá)的單獨(dú)的或組合的改變會(huì)導(dǎo)致衰老開始的推遲，并改善對(duì)環(huán)境脅迫和病原體的抗性，因此延長(zhǎng)了該植物的貨架壽命和/或生長(zhǎng)期。
業(yè)已通過逆轉(zhuǎn)錄酶介導(dǎo)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)分離了具有衰老誘導(dǎo)的表達(dá)的編碼番茄DHS基因的完整長(zhǎng)度cDNA序列，用從冷害損傷的番茄葉片中分離的RNA作模板，并用RT-PCR產(chǎn)物篩選冷害損傷的、山梨醇處理過的番茄葉片cDNA文庫(kù)。利用相當(dāng)于分離的番茄葉片cDNA序列的特定部分以及完整長(zhǎng)度番茄葉片cDNA的多核苷酸探針確定編碼DHS基因的mRNA在環(huán)境脅迫的(冷害)番茄葉片、(脫水的)山梨醇處理過的番茄葉片、成熟的番茄果實(shí)和衰老的番茄花中的存在。
將由擬南芥屬DHS基因組克隆設(shè)計(jì)的引物用于制備聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)物，使用衰老的擬南芥屬葉片cDNA文庫(kù)作模板。擬南芥屬核苷酸序列和氨基酸序列分別與衰老誘導(dǎo)的番茄DHS的相應(yīng)序列具有73％的相同性和81％的相同性。
本發(fā)明的衰老誘導(dǎo)的番茄DHS基因是通過RT-PCR分離的。用于分離番茄DHS基因的上游引物是24個(gè)核苷酸的引物5’AG TCT AGAAGG TGC TCG TCC TGA T3’(SEQ ID NO3)；下游引物含有34個(gè)核苷酸5’G ACT GCA GTC GAC ATC GAT(T)153’(SEQ ID NO4)。使用100皮摩爾的下游引物通過標(biāo)準(zhǔn)RT-PCR分離cDNA的第一股鏈。然后將這第一股鏈用作RT-PCR的模板，使用上游和下游引物。在瓊脂糖凝膠上分離RT-PCR產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)了大小在1.5kb至600bp范圍內(nèi)的三條不同帶的存在。使用分別存在于上游和下游引物上的XbaI和SalI克隆位點(diǎn)將這三種片段亞克隆到質(zhì)粒載體pBluescriptTM(Stratagene克隆系統(tǒng)，LaJolla，CA)上，并進(jìn)行測(cè)序。比較所述片段的序列并與GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行排比。結(jié)果證實(shí)1.5kb和1kb的片段是番茄DHS序列。600bp的片段還與人、酵母和鏈孢霉屬DHS序列排比。
將600bp的RT-PCR片段用于篩選番茄(品種Match F1雜種)cDNA文庫(kù)，該文庫(kù)是用2M山梨醇處理了6小時(shí)以便誘導(dǎo)脫水的番茄葉片中獲得的RNA制備的。所述cDNA文庫(kù)是用λZapTM(Stratagene克隆系統(tǒng)，LaJolla，CA)cDNA文庫(kù)試劑盒構(gòu)建的。獲得了三種相同的相應(yīng)于衰老誘導(dǎo)的DHS基因的陽(yáng)性完整長(zhǎng)度cDNA克隆，并進(jìn)行測(cè)序。衰老誘導(dǎo)的DHS cDNA克隆的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。所述cDNA克隆編碼具有381個(gè)氨基酸的多肽(SEQ ID NO2)，其分子量為42.1.
根據(jù)所述基因在發(fā)育中的和受到脅迫的番茄花、果實(shí)和葉片中的表達(dá)形式，它與衰老相關(guān)。
將番茄DHS cDNA序列擬南芥基因組文庫(kù)(http//genome-www.stanford.edu/Arabidopsis/)中的未鑒定的基因組序列進(jìn)行排比。該結(jié)果表示了與一種未鑒定的擬南芥屬基因組序列(AB107060)的排比。利用該排比信息鑒定擬南芥屬序列上的開放讀框，并由此產(chǎn)生推測(cè)的氨基酸序列。所得到的排比擬南芥屬DHS基因的核苷酸序列和氨基酸序列分別被稱為SEQ ID NO5(圖2A)和SEQ ID NO6。
制備了基于鑒定的擬南芥屬DHS序列的短區(qū)域的兩種引物引物1，5’GGTGGTGTTGAGGAAGATC3’(SEQ ID NO7)；和引物2，5’GGTGCACGCCCTGATGAAGC3’(SEQ ID NO8)。在標(biāo)準(zhǔn)PCR用擬南芥屬衰老葉片cDNA文庫(kù)作以上兩種引物的模板。分離600bp的PCR產(chǎn)物并測(cè)序，并證實(shí)它具有與基因組DHS序列的相應(yīng)片段相同的序列。
同樣將完整長(zhǎng)度衰老誘導(dǎo)的DHS cDNA克隆用于分離完整長(zhǎng)度衰老誘導(dǎo)的擬南芥屬和香石竹DHS cDNA克隆。所述擬南芥屬和香石竹DHS cDNA克隆是通過用完整長(zhǎng)度番茄DHS cDNA克隆作探針分別篩選衰老擬南芥屬葉片cDNA文庫(kù)和衰老的香石竹花瓣cDNA文庫(kù)分離的。然后對(duì)從cDNA文庫(kù)獲得的cDNA克隆進(jìn)行測(cè)序。以這種方式分離的擬南芥屬完整長(zhǎng)度cDNA克隆的核苷酸序列與通過與番茄cDNA序列排比確定為編碼擬南芥屬DHS的擬南芥屬基因組序列的編碼區(qū)相同(圖2A，SEQ ID NO5)。完整長(zhǎng)度香石竹花瓣篩選衰老的DHS克隆核苷酸序列和衍生的氨基酸序列在
圖10中示出(分別為SEQ IDNO9和SEQ ID NO10)。
因此，本發(fā)明的源于番茄、香石竹和擬南芥屬的編碼DHS的cDNA序列能以相似的方式用作探針從其他植物中分離DHS基因，然后利用這些基因改變轉(zhuǎn)基因植物的衰老。
衰老誘導(dǎo)的DHS基因似乎是DHS家族的一員。利用從雜交植物中提取的基因DNA進(jìn)行番茄葉片DNA的基因組Southern印跡分析。所述DNA用各種限制酶進(jìn)行裂解，所述酶能識(shí)別DHS基因的編碼區(qū)內(nèi)的單一位點(diǎn)，或者不能識(shí)別DHS基因的開放讀框內(nèi)的任何位點(diǎn)。番茄DHS限制圖如圖4所示。
用32P-dCTP標(biāo)記過的完整長(zhǎng)度番茄DHS cDNA檢測(cè)限制酶消化過的番茄葉片基因組DNA。在高嚴(yán)格條件下進(jìn)行的雜交發(fā)現(xiàn)了所述完整長(zhǎng)度cDNA探針與每一種限制酶消化過的DNA樣品的2-3種限制片段的雜交。特別要指出的是，當(dāng)番茄葉片基因組DNA是用XbaI和EcoRI消化的時(shí)候，這兩種酶在DHS的開放讀框內(nèi)有限制位點(diǎn)(圖4)，在Southern印跡中可以檢測(cè)到兩種以上的限制片段(圖5)。來自雜交品種Match F1和純合品系UCT5的基因組DNA能產(chǎn)生相同形式的限制片段。上述結(jié)果表明，在番茄植物中存在兩種或兩種以上DHS基因的同種型。如圖3所示，DHS基因在物種之間是高度保守的，因此可以預(yù)料在任何物種內(nèi)的同種型之間存在明顯的保守性。
用完整長(zhǎng)度番茄cDNA檢測(cè)的番茄花總RNA的Northern印跡表明，在番茄花中衰老誘導(dǎo)的DHS基因的表達(dá)被明顯誘導(dǎo)，但在芽中的表達(dá)勉強(qiáng)可以檢測(cè)到(圖6)。
在番茄果實(shí)各個(gè)發(fā)育階段的DHS表達(dá)的Northern印跡分析證實(shí)，在生硬的和粉紅色的果實(shí)中DHS基因以低水平表達(dá)，而DHS表達(dá)在紅色(熟的)番茄果實(shí)中明顯增強(qiáng)(圖7)。
Northern印跡分析還證實(shí)，衰老誘導(dǎo)的DHS基因是通過環(huán)境脅迫條件誘導(dǎo)的，例如，脫水(圖8)和冷害(圖9)。與未處理過的葉片相比，用2M山梨醇進(jìn)行過處理以便誘導(dǎo)脫水的番茄葉片表現(xiàn)出在脫水葉片中DHS表達(dá)的誘導(dǎo)(圖8)。接觸過冷害溫度并回溫到環(huán)境溫度的植物表現(xiàn)出與冷害損傷癥狀(例如，滲漏)的發(fā)展吻合的衰老誘導(dǎo)的DHS基因的誘導(dǎo)表達(dá)(圖9)。在番茄植物和各種植物組織，例如，葉片、果實(shí)和花中基因表達(dá)的總體形式表明，本發(fā)明的DHS基因與這些植物和植物組織的衰老的開始相關(guān)。
就DHS基因表達(dá)的誘導(dǎo)而言，在擬南芥屬葉片衰老和香石竹花瓣衰老的開始方面觀察到了相似結(jié)果。從各種年齡的植物中分離的擬南芥屬葉片總RNA的Northern印跡分析表明，衰老誘導(dǎo)的DHS基因的表達(dá)在幼苗期不明顯(5周齡植物)，但在大約6周時(shí)開始出現(xiàn)。到第7周時(shí)，DHS基因的表達(dá)被明顯誘導(dǎo)。Northern印跡分析表明，擬南芥屬DHS基因隨著植物的年齡明顯增強(qiáng)(
圖11)。
Northern印跡分析還表明，DHS基因在諸如香石竹的顯花植物中是以類似方式調(diào)控是的(
圖12)。從各種年齡的香石竹花瓣中分離的總RNA的Northern印跡分析證實(shí)，香石竹DHS的表達(dá)在來自具有年齡誘導(dǎo)的衰老癥狀的花的花瓣中被明顯誘導(dǎo)，如花瓣卷曲，它是衰老的最初形態(tài)學(xué)證據(jù)，但在緊湊的花芽中的表達(dá)更低一些。來自將要開放的香石竹花的花瓣中DHS的表達(dá)明顯高于在緊湊花芽階段花中的表達(dá)，而完全開放的花的花瓣也表現(xiàn)出DHS的增強(qiáng)了的表達(dá)。
因此，預(yù)計(jì)通過明顯抑制或改變衰老誘導(dǎo)的DHS基因在植物組織中的表達(dá)，可以推遲腐爛和變質(zhì)，延長(zhǎng)易壞果實(shí)、花卉和蔬菜的貨架壽命，并使得植物及其組織更能耐受脅迫和更抗病原體。這一目的可以通過生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物而實(shí)現(xiàn)，其中，DHS cDNA或其寡核苷酸片段能以反義構(gòu)型在果實(shí)、花、葉片和營(yíng)養(yǎng)組織中表達(dá)，優(yōu)選使用諸如CaMV35S啟動(dòng)子的組成型啟動(dòng)子，或使用組織專一性或衰老/脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
在本發(fā)明中還分離并測(cè)序了另一種基因eIF-5A，它參與誘導(dǎo)與植物形態(tài)改變相關(guān)的衰老，與DHS一樣，可將其用于改變植物的衰老和與衰老相關(guān)的過程，優(yōu)選沿反義方向?qū)胫参?。分別從成熟的番茄果實(shí)，衰老的擬南芥屬葉片和衰老的香石竹花cDNA文庫(kù)中分離完整長(zhǎng)度衰老誘導(dǎo)的eIF-5A cDNA克隆。每一種完整長(zhǎng)度克隆的核苷酸序列和推測(cè)的氨基酸序列示于
圖13(番茄衰老誘導(dǎo)的eIF-5A)、14(香石竹衰老誘導(dǎo)的eIF-5A)和15(擬南芥屬衰老誘導(dǎo)的eIF-5A)。上述每一種cDNA的核苷酸序列還表現(xiàn)為SEQ ID NO11(番茄)(
圖13)、SEQ ID NO13(香石竹)(
圖14)和SEQ ID NO15(擬南芥屬)(
圖15)。所述每一種基因的衍生的氨基酸序列分別表示為SEQ IDNO12(
圖13)SEQ ID NO14(
圖14)和SEQ ID NO16(
圖15)。
與本文所披露的DHS基因序列一樣，本發(fā)明的eIF-5A序列可用于從其他植物中分離eIF-5A基因。所分離的eIF-5A序列可用于改變植物的衰老和與衰老相關(guān)的過程。從植物中分離eIF-5A序列可以用已知方法根據(jù)物種之間至少大約70％的序列相似性完成。
在衰老期間，在植物中會(huì)同時(shí)發(fā)生eIF-5A和DHS的誘導(dǎo)。Northern印跡分析表明，在自然和脅迫誘導(dǎo)的衰老開始時(shí)，eIF-5A與DHS被同時(shí)上調(diào)(
圖16-20)。例如，從各種年齡的擬南芥屬植物的葉片中分離的總RNA的Northern印跡分析表明，從植物上出現(xiàn)葉片衰老開始，eIF-5A的表達(dá)就被誘導(dǎo)，并且表達(dá)隨著衰老的發(fā)展明顯加強(qiáng)。在諸如番茄的結(jié)實(shí)植物中，在紅色-軟果實(shí)中eIF-5A和DHS被同時(shí)上調(diào)，與果實(shí)變軟和腐爛一致(
圖17)。
Northern印跡分析還表明，在受到諸如干旱(
圖18)和冷害損傷(圖20)的環(huán)境脅迫的植物中eIF-5A和DHS被同時(shí)上調(diào)。類似的，在顯花植物中，在開放的花中eIF-5A和DHS被同時(shí)上調(diào)，并且兩種基因的表達(dá)在隨后的階段持續(xù)增強(qiáng)。
在沿反方向(反義)導(dǎo)入受組成型啟動(dòng)子控制，如玄參花葉病毒35S啟動(dòng)子、花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子CaMV35S、雙35S啟動(dòng)子或MAS啟動(dòng)子控制的克隆的衰老誘導(dǎo)的DHS基因、其片段或克隆的衰老誘導(dǎo)的eIF-5A基因或其片段、或eIF-5A和DHS序列的組合時(shí)，可用于對(duì)植物進(jìn)行遺傳學(xué)修飾，并改變修飾過的植物的衰老。來自其他植物的與番茄、擬南芥屬或香石竹衰老誘導(dǎo)的DHS基因或衰老誘導(dǎo)的eIF-5A基因具有足夠的序列相同性的特定反義序列可用于實(shí)現(xiàn)類似的遺傳修飾。遺傳學(xué)修飾的一個(gè)結(jié)果是，內(nèi)源可翻譯衰老誘導(dǎo)的DHS編碼mRNA、eIF-5A編碼mRNA或這兩者的含量的降低。因此，降低了植物細(xì)胞中所產(chǎn)生的衰老誘導(dǎo)的DHS和衰老誘導(dǎo)的eIF-5A的量，從而降低了活化eIF-5A的量，后者又降低了衰老誘導(dǎo)蛋白的翻譯，包括衰老誘導(dǎo)的脂酶，衰老誘導(dǎo)的蛋白酶和衰老誘導(dǎo)的核酸酶。由此抑制或推遲了衰老，因?yàn)樗ダ系拈_始需要從頭開始的蛋白合成。
例如，用能沿反義方向表達(dá)完整長(zhǎng)度擬南芥屬衰老誘導(dǎo)的DHS基因(SEQ ID NO26)或3’部分(圖38)，受雙35S啟動(dòng)子調(diào)控的載體轉(zhuǎn)化過的擬南芥屬植物與對(duì)照植物相比表現(xiàn)出較高的生物量，例如，較大的葉片體積和在生長(zhǎng)的所有階段的總體上較大的植物生長(zhǎng)，以及推遲了的葉片衰老，如圖21-24所示。
由于在轉(zhuǎn)基因擬南芥屬植物中沿反義方向表達(dá)完整長(zhǎng)度的擬南芥屬衰老誘導(dǎo)的DHS基因或其3’編碼區(qū)所引起的衰老誘導(dǎo)的DHS基因的減弱了的表達(dá)的結(jié)果還被視為轉(zhuǎn)化過的植物的種子產(chǎn)量的增加。能表達(dá)擬南芥屬衰老誘導(dǎo)的DHS基因的反義3’非編碼區(qū)的擬南芥屬植物品系所產(chǎn)生的種子比野生型種子多6倍(圖25)。
用受雙35S啟動(dòng)子調(diào)控的沿反義方向的番茄衰老誘導(dǎo)的DHS基因(SEQ ID NO27)的3’末端轉(zhuǎn)化過的番茄植物獲得了類似結(jié)果。與對(duì)照(未轉(zhuǎn)化過的)番茄植物相比，用反義方向的該基因的3’末端轉(zhuǎn)化過的植物表現(xiàn)出增加了的葉片大小和增加了的植株大小(圖26和27)。
與野生型植物相比，用反義方向的完整長(zhǎng)度番茄衰老誘導(dǎo)的DHS轉(zhuǎn)化的番茄植物所產(chǎn)生的果實(shí)表現(xiàn)出推遲了的變軟和腐爛(圖28-35)。因此，本發(fā)明的方法和序列可用于推遲果實(shí)變軟和腐爛，以及用于從總體上增加植物的生物量和種子產(chǎn)量，推遲植物衰老。本發(fā)明的分離的核苷酸序列可用于從其他植物或生物中分離基本上互補(bǔ)的DHS和/或eIF-5A核苷酸序列。上述序列反過來又可用于轉(zhuǎn)化植物，并因此改變轉(zhuǎn)化過的植物的衰老。與使用本文所述分離的核苷酸序列的使用方法相同。
通過用DHS、eIF-5A、其片段或其組合轉(zhuǎn)化所實(shí)現(xiàn)的遺傳學(xué)修飾可以實(shí)現(xiàn)在植物中衰老誘導(dǎo)的DHS、eIF-5A或這兩者的含量的永久性改變，并可以通過自交或其他繁殖方法在后代植物中繁殖。將遺傳學(xué)改變過的植物用于產(chǎn)生新的植物品種或品系，其中，所述改變?cè)谑来g被穩(wěn)定傳遞。本發(fā)明首次提供了合適的DNA序列，該序列可用于實(shí)現(xiàn)對(duì)多種不同植物的衰老進(jìn)行穩(wěn)定的遺傳學(xué)修飾。
一般，為了鑒定并分離基因，使用本領(lǐng)域所公知的常規(guī)方法進(jìn)行質(zhì)粒DNA的制備、限制酶消化、DNA的瓊脂糖凝膠電泳、蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳、PCR、RT-PCR、Southern印跡、Northern印跡、DNA連接和細(xì)菌轉(zhuǎn)化。例如，參見Sambrook，J.等，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版，冷泉港出版社，冷泉港，NY，1989，Sambrook披露了核酸雜交技術(shù)(同上)。
在本文中，術(shù)語“植物”是指全植株、植物部分、植物細(xì)胞或一組植物細(xì)胞?？捎糜诒景l(fā)明方法中的植物的類型不受限制，并且可以包括，例如，乙烯敏感型和乙烯不敏感型植物；結(jié)實(shí)植物，如杏、蘋果、橙、香蕉、葡萄、梨、番茄、草莓、腭梨等；蔬菜，如胡蘿卜、豌豆、萵苣、甘藍(lán)、蘿卜、馬鈴薯、花莖甘藍(lán)、蘆筍等；花卉，如香石竹、玫瑰、梅等；農(nóng)業(yè)作用和森林植物，如玉米、水稻、大豆、和苜蓿等；并且總體上包括能攝取并表達(dá)本發(fā)明DNA分子的任何植物。它可以包括多種倍性水平的植物，包括半倍體、二倍體、四倍體和多倍體。所述植物可以是單子葉植物或雙子葉植物。
轉(zhuǎn)基因植物在本文中被定義為通過某種方式進(jìn)行過遺傳學(xué)修飾的植物，包括，但不限于在其基因組中整合了異源或同源衰老誘導(dǎo)的DHSDNA或修飾過的DNA或異源衰老誘導(dǎo)的DHS DNA或同源衰老誘導(dǎo)的DHS DNA的某些部分植物。另外，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可以在其基因組中整合了異源或同源衰老誘導(dǎo)的eIF-5A DNA或修飾過的DNA或異源衰老誘導(dǎo)的eIF-5A DNA或同源衰老誘導(dǎo)的eIF-5A DNA的某些部分。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可以在其基因組中整合了異源或同源衰老誘導(dǎo)的DHS和eIF-5A DNA或修飾過的DNA或異源衰老誘導(dǎo)的eIF-5A DNA或同源衰老誘導(dǎo)的DHS DNA的某些部分或異源和同源DHS和eIF-5A序列的組合。改變了的遺傳材料可以編碼一種蛋白，包括一種調(diào)控或控制序列，或者可以是或包括一種反義序列或編碼一種反義RNA，該RNA是與該植物的內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的DNA或eIF-5A DNA或mRNA序列或其部分反義的。“轉(zhuǎn)基因”或“轉(zhuǎn)基因序列”被定義為業(yè)已整合到轉(zhuǎn)基因植物中的外源基因或部分序列。
本文所使用的術(shù)語“雜交”一般被用于表示在適當(dāng)嚴(yán)格的條件下核酸的雜交，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)探針序列和靶序列的性質(zhì)方便地確定所述合適條件。雜交和洗滌條件為本領(lǐng)域所熟知，根據(jù)所需要的嚴(yán)格度而進(jìn)行的條件的調(diào)整可以通過改變培養(yǎng)時(shí)間、溫度和/或溶液的離子強(qiáng)度而方便地實(shí)現(xiàn)。例如，參見Sambrook J.等，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版，冷泉港出版社，冷泉港，NY，1989。條件的選擇是由被雜交的序列長(zhǎng)度，特別是探針序列的長(zhǎng)度，核酸的相對(duì)G-C含量和允許的錯(cuò)配量決定的。當(dāng)需要在具有較低程度的互補(bǔ)性的鏈之間進(jìn)行部分雜交時(shí)，優(yōu)選低嚴(yán)格條件。當(dāng)需要完全或接近完全的互補(bǔ)性時(shí)，優(yōu)選高嚴(yán)格條件。對(duì)于典型的高嚴(yán)格條件來說，雜交溶液含有6×SSC、0.01MEDTA、1×denhardt’s溶液和0.5％SDS。對(duì)于克隆DNA片段來說，雜交是在大約68℃下進(jìn)行大約3-4小時(shí)，而對(duì)于總真核DNA來說，進(jìn)行大約12-16小時(shí)。對(duì)于較低的嚴(yán)格條件來說，雜交溫度被降低到大約42℃，低于雙鏈體的解鏈溫度(Tm)。已知Tm受G-C含量和雙鏈體長(zhǎng)度以及溶液的離子強(qiáng)度的影響。
在本文中，術(shù)語“明顯的序列相同性”或“明顯的同源性”被用于表示與另一種核苷酸或氨基酸序列有明顯的結(jié)構(gòu)或功能相同性的核苷酸序列或氨基酸序列。具有明顯的序列相同性或結(jié)構(gòu)同源性的序列之間的任何結(jié)構(gòu)或功能的差異都不微不足道的；就是說這些差異不會(huì)影響該序列在所需要的用途中發(fā)揮預(yù)期作用的能力。例如，這些差異可能是由于在不同物種之間密碼子利用方面所固有的差異所導(dǎo)致。如果在兩種或兩種以上不同序列之間存在大量的序列重疊或相似性，或者如果不同的序列具有相似的物理特征，即使這些序列在長(zhǎng)度或結(jié)構(gòu)上不同，其結(jié)構(gòu)差異也被視為微不足道。例如，所述特征包括在特定條件下雜交的能力，或者對(duì)于蛋白來說，免疫交叉反應(yīng)性、類似的酶促活性等。上述每一種特征可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過本領(lǐng)域所公知的方法方便地加以確定。
另外，如果兩個(gè)核苷酸序列之間的序列相似性至少為大約70％，更優(yōu)選80％，最優(yōu)選大約90％的話，這兩種核苷酸序列就是“基本上互補(bǔ)的”。如果兩種多肽活性之間的相似性至少為50％，優(yōu)選70％的話，這認(rèn)為這兩種氨基酸基本是同源的。
在本文中，短語與DNA或RNA分子的相應(yīng)部分雜交表示雜交的分子，例如寡核苷酸、多核苷酸、或任何核苷酸序列(有義或反義方向)能識(shí)別并與另一種核酸分子上的序列雜交，它們具有大體上相同的大小，并具有足夠的序列相似性，以便實(shí)現(xiàn)在合適條件下的雜交。例如，源于番茄DHS的3’編碼或非編碼區(qū)的100個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的反義分子能夠識(shí)別并與分別來自香石竹DHS基因或任何其他植物DHS基因的3’編碼或非編碼區(qū)的核苷酸序列的大約100個(gè)核苷酸的部分雜交，只要在這兩種序列之間具有大約70％或更高的序列相似性?？梢岳斫獾氖?，“相應(yīng)部分”的大小允許在雜交中有某些錯(cuò)配，因此，所述“相應(yīng)部分”可以比要雜交的分子小或大，例如，大或小20-30％，優(yōu)選大或小不超過大約12-15％。
術(shù)語核酸(或多核苷酸或寡核苷酸)的“功能性衍生物”在本文中被用于表示編碼衰老誘導(dǎo)的DHS或衰老誘導(dǎo)的eIF-5A的基因或核苷酸序列的片段、變體、同系物、或類似物。功能性衍生物可能至少保留了衰老誘導(dǎo)的DHS或eIF-5A編碼DNA的一部分功能，這使得它能用于本發(fā)明中。所述功能可以包括在低嚴(yán)格條件下與天然番茄、擬南芥屬或香石竹衰老誘導(dǎo)的DHS或eIF-5A或源于其他植物的編碼衰老誘導(dǎo)的DHS或eIF-5A的基本上同源的DNA或與其mRNA轉(zhuǎn)錄物雜交的能力，或在反義方向上抑制植物衰老誘導(dǎo)的DHS或eIF-5A mRNA轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的能力等。
基因或DNA序列的“片段”是指任何分子的亞類，例如更短的多核苷酸或寡核苷酸?！白凅w”是指基本上類似于完整基因或其片段的分子，如具有一個(gè)或多個(gè)取代的核苷酸的核苷酸取代變體，不過它保留了與特定基因雜交的能力或編碼與能天然DNA雜交的mRNA轉(zhuǎn)錄物的能力?！巴滴铩笔侵竵碜圆煌参飳倩蚍N的片段或變體序列?！邦愃莆铩笔侵富旧项愃朴谕暾肿?、其變體或片段或以與之相關(guān)的方式起作用的非天然分子。
一種基因，例如，衰老誘導(dǎo)的DHS基因或衰老誘導(dǎo)的eIF-5A基因的“改變了的表達(dá)”或“修飾過的表達(dá)”是指以某種方式改變了所述基因的正常表達(dá)，例如，在未修飾過的結(jié)實(shí)、開花或其他植物中的表達(dá)的任何過程或結(jié)果。在本文中，基本表達(dá)的改變是衰老誘導(dǎo)的DHS基因或衰老誘導(dǎo)的eIF-5A基因或這兩者表達(dá)的完全或部分減弱，但還可以包括表達(dá)時(shí)序的改變，或其他狀態(tài)，其中，衰老誘導(dǎo)的DHS基因或衰老誘導(dǎo)的eIF-5A基因或這兩者的表達(dá)不同于在未修飾過的植物或栽培種中天然發(fā)生的表達(dá)。優(yōu)選的改變是這樣的，與在未修飾過的植物中的產(chǎn)量相比，這種改變會(huì)導(dǎo)致衰老誘導(dǎo)的DHS產(chǎn)量、衰老誘導(dǎo)的eIF-5A產(chǎn)量或這兩者的降低。
在生產(chǎn)本發(fā)明的進(jìn)行過遺傳學(xué)改變的植物時(shí)，優(yōu)選根據(jù)所需形狀、總體上減弱了的衰老誘導(dǎo)的DHS表達(dá)或產(chǎn)量或減弱了的衰老誘導(dǎo)的eIF-5A表達(dá)或這兩者選擇單個(gè)的小植株或植株。例如，衰老誘導(dǎo)的DHS和衰老誘導(dǎo)的eIF-5A的表達(dá)可以通過觀察在轉(zhuǎn)基因植物上衰老的推遲或減弱來確定。還可以用已知測(cè)定方法定量相對(duì)對(duì)照(正常的非轉(zhuǎn)基因)植物而言，轉(zhuǎn)基因植物中DHS和/或eIF-5A的活性。
為了讓新插入的基因或DNA序列表達(dá)，導(dǎo)致它所編碼的蛋白的產(chǎn)生，或者對(duì)于要轉(zhuǎn)錄的反義DNA來說，導(dǎo)致反義RNA分子的產(chǎn)生，相對(duì)所述基因或DNA序列而言，應(yīng)當(dāng)在正確的位置上存在正確方向的正確的調(diào)控因子。所述調(diào)控區(qū)可以包括一個(gè)啟動(dòng)子、一個(gè)5’-非翻譯前導(dǎo)序列和一個(gè)3’-聚腺苷酸化信號(hào)，以及增強(qiáng)子和其他調(diào)控序列。可用于與衰老誘導(dǎo)的DHS基因組合使用以便制備該基因的有義或反義轉(zhuǎn)錄物的啟動(dòng)子調(diào)控因子包括常見的任何植物啟動(dòng)子，更具體地講，包括組成型啟動(dòng)子，如玄參花葉病毒35S啟動(dòng)子，花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子，CaMV35S啟動(dòng)子，或MAS啟動(dòng)子，或組織專一性或衰老誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，如香石竹花瓣GST1啟動(dòng)子或擬南芥屬SAG12啟動(dòng)子(例如，參見J.C.Palaqui等，植物生理學(xué)，1121447-1456，1996；Morton等，分子育種，1123-132，1995；Fobert等，植物雜志，6567-577，1994；和Gan等，植物生理學(xué)，113313，1997，被收作本文參考)。用于本發(fā)明的啟動(dòng)子優(yōu)選是組成型啟動(dòng)子，最優(yōu)選使用雙35S啟動(dòng)子。
用于本發(fā)明的啟動(dòng)子的表達(dá)水平可以用常規(guī)表達(dá)系統(tǒng)測(cè)定，例如，通過測(cè)定報(bào)導(dǎo)基因產(chǎn)物的含量，例如，導(dǎo)入了該啟動(dòng)子/報(bào)導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)基因植物的葉片、花、果實(shí)或其他組織的提取物中的蛋白或mRNA。
本發(fā)明提供了互補(bǔ)于編碼番茄衰老誘導(dǎo)的DHS、香石竹衰老誘導(dǎo)的DHS、擬南芥屬衰老誘導(dǎo)DHS的基因或互補(bǔ)于源于其他植物的能與番茄、香石竹或擬南芥屬衰老誘導(dǎo)的DHS基因在低至高嚴(yán)格條件下雜交的基因或基因片段的反義寡核苷酸或多核苷酸。本發(fā)明提供了互補(bǔ)于編碼番茄衰老誘導(dǎo)的eIF-5A、香石竹衰老誘導(dǎo)的eIF-5A、擬南芥屬衰老誘導(dǎo)eIF-5A的基因或互補(bǔ)于源于其他植物的能與番茄、香石竹或擬南芥屬衰老誘導(dǎo)的eIF-5A基因在低至高嚴(yán)格條件下雜交的基因或基因片段的反義寡核苷酸或多核苷酸。所述反義寡核苷酸的長(zhǎng)度至少為大約6個(gè)核苷酸，以便提供最低的雜交專一性，并可互補(bǔ)于編碼衰老誘導(dǎo)的基因或其部分的一股DNA或mRNA，或互補(bǔ)于與調(diào)控衰老誘導(dǎo)的DHS或eIF-5A基因表達(dá)相關(guān)的基因組DNA上的旁側(cè)序列。所述反義寡核苷酸可以大到100個(gè)核苷酸或更大，并可以延伸到和超過反義的完整編碼序列的長(zhǎng)度。所述反義寡核苷酸可以是DNA或RNA或其嵌合混合物或衍生物形式，它是單鏈的或雙鏈的。
所述反義寡核苷酸的作用可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞中衰老誘導(dǎo)的DHS表達(dá)、衰老誘導(dǎo)的eIF-5A表達(dá)或這兩者的改變，主要是抑制。對(duì)反義的一般性描述可以參見Alberts等，細(xì)胞分子生物學(xué)，第2版，Garland出版公司，紐約，1989(特別是195-196頁(yè)，收作本文參考)。
所述反義寡核苷酸可以互補(bǔ)于衰老誘導(dǎo)的DHS或eIF-5A基因的任何相應(yīng)部分。在一種實(shí)施方案中，所述反義寡核苷酸的長(zhǎng)度可以是6-100個(gè)核苷酸，并可以互補(bǔ)于例如，衰老誘導(dǎo)的DHS或eIF-5A序列的5’非編碼序列或3’末端的序列。已知主要互補(bǔ)于5’非編碼序列的反義寡核苷酸是編碼轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)的有效抑制劑，Branch，M.A.分子細(xì)胞生物學(xué)，134284-4290，1993。
優(yōu)選的反義寡核苷酸基本上互補(bǔ)于編碼衰老誘導(dǎo)的DHS或衰老誘導(dǎo)的eIF-5A的mRNA的一部分，所述mRNA部分的大小大體上與該反義寡核苷酸相同。例如，將編碼衰老誘導(dǎo)的DHS或eIF-5A的完整長(zhǎng)度cDNA克隆沿反義方向?qū)胫参铮A(yù)計(jì)會(huì)導(dǎo)致衰老誘導(dǎo)的DHS和/或eIF-5A基因表達(dá)的成功改變。另外，如圖21-35所示，將部分序列定向?qū)胨ダ险T導(dǎo)的DHS基因或衰老誘導(dǎo)的eIF-5A基因或這兩者的特定部分可能是同樣有效的。
本發(fā)明所需要的最低程度的同源性是足于產(chǎn)生足夠的互補(bǔ)性，以便能識(shí)別特定的靶RNA或DNA，并抑制或減弱其翻譯或功能而不影響其他RNA或DNA分子的功能以及其他基因的表達(dá)。盡管本發(fā)明的反義寡核苷酸包括互補(bǔ)于衰老誘導(dǎo)的DHS基因或衰老誘導(dǎo)的eIF-5A基因的RNA轉(zhuǎn)錄物的相應(yīng)部分的序列，但絕對(duì)的互補(bǔ)性是沒有必要的，不過是優(yōu)選的。雜交的能力可能取決于反義寡核苷酸的長(zhǎng)度和互補(bǔ)程度。一般，雜交的核酸越長(zhǎng)，與衰老誘導(dǎo)的DHS靶序列所包含的堿基錯(cuò)配就越多，但仍然能形成穩(wěn)定的雙鏈體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以用標(biāo)準(zhǔn)方法確定錯(cuò)配的允許程度，例如，通過測(cè)定雜交復(fù)合體的解鏈溫度。
反義RNA寡核苷酸序列可以通過由外源導(dǎo)入的核酸序列轉(zhuǎn)錄而在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生。這種反義分子可以通過用一種載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染或感染而輸送到細(xì)胞內(nèi)，如在它上面整合了編碼所述反義衰老誘導(dǎo)的DHS序列的DNA的質(zhì)粒或病毒。所述DNA可操作地連接于合適的調(diào)控因子上，包括啟動(dòng)子。所述外源DNA序列在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生衰老誘導(dǎo)的DHS基因的反義RNA。
載體優(yōu)選是質(zhì)粒，或者可以是本領(lǐng)域已知的病毒或其他載體，以便在植物細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞中復(fù)制并表達(dá)它所編碼的基因。所述載體被整合到染色體上，以便它能夠轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生所需要的反義衰老誘導(dǎo)的DHSRNA。所述質(zhì)粒或病毒載體可以通過本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)構(gòu)建，例如，所述載體可以是含有能夠在原核宿主中起作用的復(fù)制系統(tǒng)和本發(fā)明的反義寡核苷酸或多核苷酸的質(zhì)粒載體。另外，所述載體可以是含有能在農(nóng)桿菌屬中起作用的復(fù)制系統(tǒng)和本發(fā)明的反義寡核苷酸或多核苷酸的質(zhì)粒。能夠在農(nóng)桿菌屬中起作用的質(zhì)粒為本領(lǐng)域所公知。參見Miki等，將外源DNA導(dǎo)入植物的方法，植物分子生物學(xué)和生物技術(shù)方法，B.R.Glick和J.E.Thompson著，CRC出版社，1993，67-83頁(yè)。
按以下方法將番茄DHS基因沿反義方向克隆到一種質(zhì)粒載體上。PCD質(zhì)粒是從pUC18主鏈構(gòu)建而成的，并含有源于花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子，隨后是一個(gè)多克隆位點(diǎn)和一個(gè)章魚氨酸合成酶終止序列，將該質(zhì)粒用于克隆番茄DHS基因。通過利用XhoI和SacI限制位點(diǎn)將完整長(zhǎng)度番茄DHS基因沿反義方向亞克隆到pCD質(zhì)粒上構(gòu)建pCd-DHS(反義)質(zhì)粒。
長(zhǎng)度優(yōu)選為大約6-100個(gè)核苷酸并互補(bǔ)于衰老誘導(dǎo)的DHS或衰老誘導(dǎo)的eIF-5A基因的寡核苷酸可以通過重組核苷酸技術(shù)制備或者由單核苷酸或較短的寡核苷酸合成。自動(dòng)化合成儀可用于本發(fā)明寡核苷酸和多核苷酸的化學(xué)合成。用于構(gòu)建本發(fā)明重組核苷酸分子的方法披露于Sambrook等的文獻(xiàn)中，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版，冷泉港出版社，冷泉港，NY，1989，該文獻(xiàn)被全文收作本文參考。編碼衰老誘導(dǎo)的脫氧海普賴氨酸合成酶序列的反義RNA的寡核苷酸可以用本領(lǐng)域所熟知的方法制備。有關(guān)該方法的細(xì)節(jié)披露于以下文獻(xiàn)中Maniatis，T.等，控制基因表達(dá)的分子機(jī)制，Nierlich等著，學(xué)術(shù)出版社，紐約，1976。
在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中，內(nèi)源植物衰老誘導(dǎo)的DHS、衰老誘導(dǎo)的eIF-5A或這兩者的表達(dá)的抑制是通過導(dǎo)入植物細(xì)胞的外源衰老誘導(dǎo)的DHS或eIF-5A基因或基因片段或這兩者的超量表達(dá)的共抑制所導(dǎo)致的。在本發(fā)明的該實(shí)施方案中，以本文所披露的用于反義分子的相同方法將編碼衰老誘導(dǎo)的DHS、衰老誘導(dǎo)的eIF-5A或這兩者的載體沿有義方向?qū)爰?xì)胞。所述衰老誘導(dǎo)的DHS或衰老誘導(dǎo)的eIF-5A優(yōu)選可操作地與強(qiáng)的組成型啟動(dòng)子可操作地連接，如玄參花葉病毒啟動(dòng)子或CaMV35S或雙35S啟動(dòng)子。
在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中，內(nèi)源植物衰老誘導(dǎo)的DHS、衰老誘導(dǎo)的eIF-5A或這兩者的表達(dá)的抑制是通過使用核酶實(shí)現(xiàn)的。核酶是具有序列專一性內(nèi)切核糖核酸酶活性的RNA分子。一種例子是錘頭核酶，它能裂解靶RNA上的UH(其中H是A、C或U殘基)識(shí)別位點(diǎn)，并含有堿基配對(duì)區(qū)，它能引導(dǎo)核酶的催化域至底物RNA的靶位點(diǎn)。核酶是高度定向?qū)Ｒ恍缘模⒖梢栽O(shè)計(jì)成使多基因家族的一個(gè)成員失活，或針對(duì)相關(guān)mRNA的保守區(qū)(參見Merlo等，植物細(xì)胞，101603-1621，1998)?？梢酝ㄟ^用諸如質(zhì)粒或病毒的載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染將核酶分子輸送到細(xì)胞中，在所述載體上整合了可操作地與合適的調(diào)控因子，包括啟動(dòng)子連接的核酶。所述核酶結(jié)構(gòu)含有堿基配對(duì)臂，該臂能將它引導(dǎo)至衰老誘導(dǎo)的DHS mRNA或衰老誘導(dǎo)的eIF-5A mRNA上的裂解位點(diǎn)，導(dǎo)致DHS或eIF-5A mRNA的裂解，并抑制衰老誘導(dǎo)的DHS和/或eIF-5A表達(dá)。
按照本發(fā)明生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因植物可以通過本領(lǐng)域所公知的任何植物轉(zhuǎn)化方法通過DNA轉(zhuǎn)化而制備。植物轉(zhuǎn)化方法包括用根癌農(nóng)桿菌與植物、組織或細(xì)胞直接共培養(yǎng)或直接感染(Miki等，植物分子生物學(xué)和生物技術(shù)方法，1993)直接將基因轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體或原生質(zhì)體吸收(Paszkowski等，EMBO雜志，122717，1984)；電穿孔(Fromm等，自然，319719，1986)；粒子轟擊(Klein等，生物技術(shù)，6559-563，1988)；注射到幼苗和植物的分生組織中(De LaPena等，自然，325274-276，1987)；注射到培養(yǎng)細(xì)胞或組織的原生質(zhì)體中(Reich等，生物技術(shù)，41001-1004，1986)。
一般，完整植株是通過轉(zhuǎn)化方法獲得的。植株是從原生質(zhì)體、愈傷組織、組織部分或外殖體等再生的。本文所使用的“植物”的定義包括從再生植株獲得的植物部分，其中，衰老誘導(dǎo)DHS、衰老誘導(dǎo)的eIF-5A或這兩者的表達(dá)改變了，如葉片、花、果實(shí)和種子等?！爸参铩钡亩x還包括再生植物的后代，變體和突變體。
番茄、香石竹或擬南芥屬衰老誘導(dǎo)的DHS蛋白或其功能衍生物，和番茄、香石竹或擬南芥屬衰老誘導(dǎo)的eIF-5A蛋白或其功能衍生物優(yōu)選是通過重組技術(shù)生產(chǎn)，選擇性地與化學(xué)合成方法組合。在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，衰老誘導(dǎo)的DHS是作為一種融合蛋白表達(dá)的，它優(yōu)選包括與麥芽糖結(jié)合蛋白融合的衰老誘導(dǎo)的DHS。
本文所披露的衰老誘導(dǎo)DHS或衰老誘導(dǎo)的eIF-5A蛋白的“功能性衍生物”分別是衰老誘導(dǎo)DHS或衰老誘導(dǎo)的eIF-5A的片段、變體、類似物或化學(xué)衍生物，它至少保留了一部分衰老誘導(dǎo)DHS或eIF-5A活性或能與分別對(duì)衰老誘導(dǎo)DHS或衰老誘導(dǎo)的eIF-5A專一的抗體有免疫交叉反應(yīng)性。衰老誘導(dǎo)DHS或衰老誘導(dǎo)的eIF-5A蛋白的片段是指所述分子的任何亞型。變體肽可以通過直接化學(xué)合成制備，例如，使用本領(lǐng)域所熟知的方法。衰老誘導(dǎo)DHS或衰老誘導(dǎo)的eIF-5A的類似物是指基本上與所述完整蛋白或其片段類似的非天然蛋白。衰老誘導(dǎo)DHS或衰老誘導(dǎo)的eIF-5A的化學(xué)衍生物含有正常情況下不是所述肽或肽片段的一部分的額外的化學(xué)部分。通過讓能夠與特定側(cè)鏈或末端殘基起反應(yīng)的有機(jī)衍生劑與所述肽的特定氨基酸殘基反應(yīng)將修飾引入這種肽或其片段。
本發(fā)明的衰老誘導(dǎo)DHS或老誘導(dǎo)的eIF-5A蛋白或肽可以這樣生產(chǎn)培養(yǎng)用本發(fā)明的核苷酸序列(有義方向)轉(zhuǎn)化過的細(xì)胞，讓所述細(xì)胞合成所述蛋白，然后根據(jù)所使用的克隆方法以游離蛋白形式或融合蛋白形式從培養(yǎng)基或從細(xì)胞提取物中分離所述蛋白。另外，所述蛋白可以在無細(xì)胞系統(tǒng)中產(chǎn)生。Ranu等，酶學(xué)方法，60459-484，1979。
已經(jīng)對(duì)本發(fā)明作了一般性說明，通過結(jié)合下面的實(shí)施例可以更好地理解本發(fā)明，這些實(shí)施例是用于說明目的的，而不是要限定本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1mRNA分離從各種發(fā)育階段的番茄花和番茄果實(shí)中并且從葉片中分離總RNA(未處理過或者在冷害或山梨醇處理之后)。簡(jiǎn)單地講，在液氮研磨組織(5克)。將磨碎的粉與30毫升胍緩沖液(4M異硫氰酸胍，2.5mM乙酸鈉，pH8.5，0.8％β-巰基乙醇)混合?；旌衔锿ㄟ^四層紗布過濾，并在4℃下以10000×g的速度離心30分鐘。然后將上清液放在氯化銫密度梯度上然后以26000×g的速度離心20小時(shí)。沉淀的RNA用75％乙醇漂洗，重新懸浮在600微升DEPC處理過的水中，并在-70℃下用0.75毫升95％乙醇和30微升3M乙酸鈉使RNA沉淀。在1.2％變性甲醛瓊脂糖凝膠上分離10微克RNA，并轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。在42℃下用隨機(jī)啟動(dòng)的32P-dCTP標(biāo)記的完整長(zhǎng)度DHS cDNA(SEQ ID NO1)檢測(cè)該膜移液。然后用含有1％SDS的1×SSC在室溫下洗滌該膜1次，15分鐘，用含有0.1％SDS的0.2×SSC在65℃下洗滌3次，每次15分鐘。在-70℃下讓該膜對(duì)X光膠片進(jìn)行曝光一夜。
用購(gòu)自pROMEGA的PolyA+片段mRNA分離系統(tǒng)從總RNA中分離PolyA+mRNA。用PolyA+mRNA作模板利用購(gòu)自Stratagene(LaJolla，加州)的ZAP ExpresscDNA合成系統(tǒng)進(jìn)行cDNA合成。
番茄葉片cDNA文庫(kù)篩選將用從用2M山梨醇處理了6小時(shí)的Match F1雜交番茄葉片中分離的mRNA制備的cDNA文庫(kù)稀釋到大約5×106PFU/毫升。用32P標(biāo)記過的600bp RT-PCR片段篩選該cDNA文庫(kù)。切除3個(gè)陽(yáng)性cDNA克隆，并利用生產(chǎn)商說明書中推薦的方法將其重新環(huán)化pBK-CMV(Stratagene)噬菌粒。將完整長(zhǎng)度pBK-CMV載體上。
質(zhì)粒DNA分離，DNA測(cè)序利用Sambrook等(同上)所披露的堿性裂解方法分離質(zhì)粒DNA。用雙脫氧測(cè)序方法對(duì)完整長(zhǎng)度陽(yáng)性cDNA進(jìn)行測(cè)序。Sanger等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)，745463-5467。利用BLAST檢索(GenBank，Bethesda，MD)編輯并分析開放讀框，五種最同源的蛋白與編碼基因的衍生氨基酸序列的排比是利用BCM Search LAUNCHER實(shí)現(xiàn)的多重序列排比方式誘導(dǎo)的多重排比方法(參見F.Corpet核酸研究1610881-10890，1987)。通過MultiFinder鑒定存在于衍生氨基酸序列上的功能基序。
番茄RNA的Northern印跡雜交在1％變性的甲醛瓊脂糖凝膠上分離從各種階段的番茄花(花芽和花以及充分展開或干燥的衰老的花瓣)、番茄葉片、和各種成熟階段的番茄果實(shí)(生硬，即花色少于10％的綠色果實(shí)，粉紅，即整個(gè)果實(shí)是橘紅和粉紅色，和紅色，軟或硬)中分離的10微克總RNA，并固定在尼龍膜上。將利用隨機(jī)引物試劑盒(Boehringer Mannheim)通過32P-dCTP標(biāo)記的完整長(zhǎng)度番茄cDNA用于檢測(cè)該濾膜(7×107cpm)。在室溫下用1×SSC，0.1％SDS洗滌該濾膜1次，在65℃下用0.2×SSC，0.1％SDS洗滌該膜3次。讓該濾，膜干燥并在-70℃下讓該膜對(duì)X光膠片進(jìn)行曝光一夜。結(jié)果如圖6、7、8和9所示。
擬南芥屬RNA的Northern印跡雜交在1％變性的甲醛瓊脂糖凝膠上分離按上述方法從5周齡(泳道1)、6周齡(泳道2)和7周齡(泳道3)擬南芥屬植物的葉片中分離的總RNA，并固定在尼龍膜上。將利用隨機(jī)引物試劑盒(BoehringerMannheim)通過32P-dCTP標(biāo)記的完整長(zhǎng)度擬南芥屬衰老誘導(dǎo)的DHScDNA用于檢測(cè)該濾膜(7×107cpm)。在室溫下用1×SSC，0.1％SDS洗滌該濾膜1次，在65℃下用0.2×SSC，0.1％SDS洗滌該膜3次。讓該濾膜干燥并在-70℃下讓該膜對(duì)X光膠片進(jìn)行曝光一夜。結(jié)果如圖所示。
香石竹RNA的Northern印跡雜交在1％變性的甲醛瓊脂糖凝膠上分離按上述方法從在花的各種發(fā)育階段的香石竹植物花瓣，即緊湊的花芽(泳道1)、開始開放(泳道2)、完全開放的花(泳道3)、具有向內(nèi)翻卷的花瓣的花(泳道4)中分離的總RNA，并固定在尼龍膜上。將利用隨機(jī)引物試劑盒(BoehringerMannheim)通過32P-dCTP標(biāo)記的完整長(zhǎng)度香石竹衰老誘導(dǎo)的DHScDNA用于檢測(cè)該濾膜(7×107cpm)。在室溫下用1×SSC，0.1％SDS洗滌該濾膜1次，在65℃下用0.2×SSC，0.1％SDS洗滌該膜3次。讓該濾，膜干燥并在-70℃下讓該膜對(duì)X光膠片進(jìn)行曝光一夜。結(jié)果示于
圖12中。
實(shí)施例2番茄衰老誘導(dǎo)的DHS基因的山梨醇誘導(dǎo)在密封空間用2M山梨醇處理番茄葉片6小時(shí)。按以下方法從山梨醇處理過的葉片中提取RNA。
在液氮中研磨葉片(5克)。將磨碎的粉與30毫升胍緩沖液(4M異硫氰酸胍，2.5mM乙酸鈉，pH8.5，0.8％β-巰基乙醇)混合?；旌衔锿ㄟ^四層紗布過濾，并在4℃下以10000×g的速度離心30分鐘。然后將上清液放在氯化銫密度梯度上然后以26000×g的速度離心20小時(shí)。沉淀的RNA用75％乙醇漂洗，重新懸浮在600微升DEPC處理過的水中，并在-70℃下用0.75毫升95％乙醇和30微升3M乙酸鈉使RNA沉淀。在1.2％變性甲醛瓊脂糖凝膠上分離10微克RNA，并轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。在42℃下用隨機(jī)啟動(dòng)的32P-dCTP標(biāo)記的完整長(zhǎng)度DHS cDNA(SEQ ID NO1)檢測(cè)該膜移液。然后用含有1％SDS的1×SSC在室溫下洗滌該膜1次，15分鐘，用含有0.1％SDS的0.2×SSC在65℃下洗滌3次，每次15分鐘。在-70℃下讓該膜對(duì)X光膠片進(jìn)行曝光一夜。
結(jié)果如圖8所示。如圖所示，通過山梨醇在葉片中誘導(dǎo)的DHS的轉(zhuǎn)錄。
實(shí)施例3在衰老中的花中誘導(dǎo)番茄DHS基因采集番茄植物的緊湊的花瓣和開放的花、衰老的花，并按例2所述方法分離RNA。在1.2％變性的甲醛瓊脂糖凝膠上分離10微克RNA，并轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。在42℃下用隨機(jī)啟動(dòng)的32P-dCTP標(biāo)記的完整長(zhǎng)度DHS cDNA(SEQ ID NO1)檢測(cè)該膜移液。然后用含有1％SDS的1×SSC在室溫下洗滌該膜1次，15分鐘，用含有0.1％SDS的0.2×SSC在65℃下洗滌3次，每次15分鐘。在-70℃下讓該膜對(duì)X光膠片進(jìn)行曝光一夜。
結(jié)果如圖6所示。如圖所示，在衰老的花中誘導(dǎo)了DHS的轉(zhuǎn)錄。
實(shí)施例4在成熟的果實(shí)中誘導(dǎo)番茄DHS基因按例2所述方法從生硬、粉紅色和成熟果實(shí)中分離RNA。在1.2％變性的甲醛瓊脂糖凝膠上分離10微克RNA，并轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。在42℃下用隨機(jī)啟動(dòng)的32P-dCTP標(biāo)記的完整長(zhǎng)度DHS cDNA(SEQ ID NO1)(
圖1)檢測(cè)該膜移液。然后用含有1％SDS的1×SSC在室溫下洗滌該膜1次，15分鐘，用含有0.1％SDS的0.2×SSC在65℃下洗滌3次，每次15分鐘。在-70℃下讓該膜對(duì)X光膠片進(jìn)行曝光一夜。
結(jié)果如圖7所示。如圖所示，在導(dǎo)致腐爛的衰老即將開始之前DHS的轉(zhuǎn)錄在成熟的、紅色果實(shí)中最強(qiáng)。
實(shí)施例5通過冷害誘導(dǎo)番茄衰老誘導(dǎo)的DHS基因在生長(zhǎng)箱中，在6℃下處理花盆中的番茄植物(7-8周齡)2天、3天或6天。將光照周期設(shè)定為8小時(shí)黑暗和16小時(shí)光照。通過將植物重新送回溫室進(jìn)行回溫。不回溫的植物在從所述生長(zhǎng)箱中取出后馬上收獲。按以下方法從葉片中提取RNA。在液氮中研磨葉片(5克)。將磨碎的粉與30毫升胍緩沖液(4M異硫氰酸胍，2.5mM乙酸鈉，pH8.5，0.8％β-巰基乙醇)混合?；旌衔锿ㄟ^四層紗布過濾，并在4℃下以10000×g的速度離心30分鐘。然后將上清液放在氯化銫密度梯度上然后以26000×g的速度離心20小時(shí)。沉淀的RNA用75％乙醇漂洗，重新懸浮在600微升DEPC處理過的水中，并在-70℃下用0.75毫升95％乙醇和30微升3M乙酸鈉使RNA沉淀。在1.2％變性甲醛瓊脂糖凝膠上分離10微克RNA，并轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。在42℃下用隨機(jī)啟動(dòng)的32P-dCTP標(biāo)記的完整長(zhǎng)度DHS cDNA(SEQ ID NO1)檢測(cè)該膜移液。然后用含有1％SDS的1×SSC在室溫下洗滌該膜1次，15分鐘，用含有0.1％SDS的0.2×SSC在65℃下洗滌3次，每次15分鐘。在-70℃下讓該膜對(duì)X光膠片進(jìn)行曝光一夜。
結(jié)果如圖9所示。如圖所示，通過接觸冷害溫度然后再回溫在葉片中誘導(dǎo)了DHS轉(zhuǎn)錄，并且增強(qiáng)了的轉(zhuǎn)錄與冷害損傷相關(guān)，這種損害是以膜滲漏形式測(cè)定的。
實(shí)施例6利用基于未鑒定的擬南芥屬基因組序列的引物制備擬南芥屬PCR產(chǎn)物利用一對(duì)由擬南芥屬基因組序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物通過PCR由擬南芥屬cDNA模板制備部分長(zhǎng)度衰老誘導(dǎo)的DHS序列。5’引物是十九聚體，其序列為5’-GGTGGTGTTGAGGAAGATCSEQ ID NO7)；3’引物是二十聚體，其序列為GGTGCACGCCCTGATGAAGC-3’(SEQID NO8)。利用擴(kuò)增高保真PCR系統(tǒng)(Boehringer Mannheim)按照以下方法進(jìn)行PCR，并用擬南芥屬衰老的葉片cDNA文庫(kù)作模板。
反應(yīng)成分cDNA 1微升(5×107PFU)dNTP(各10mM) 1微升氯化鎂(5mM)+10倍緩沖液5微升引物1和2(各100μM)2微升擴(kuò)增高保真DNA聚合酶 1.75U反應(yīng)體積 50微升反應(yīng)參數(shù)94℃30分鐘94℃1分鐘，58℃1分鐘，72℃2分鐘，進(jìn)行45輪72℃15分鐘。
實(shí)施例7基因組DNA的分離和Southern分析通過在液氮中將10克番茄葉片組織研磨成細(xì)粉從番茄葉片中提取基因組DNA。將預(yù)先加熱到60℃的含有25毫升勻漿緩沖液[100mMTris-HCl，pH8.0，100mM EDTA，250mM氯化鈉、1％十二烷基肌氨酸鈉，1％2-巰基乙醇，10微克/毫升RNase和12.5毫升苯酚]的37.5毫升混合物加入研磨過的組織中。搖動(dòng)該混合物15分鐘。再將12.5毫升氯仿/異戊醇(24∶1)添加到該混合物中，并再搖動(dòng)15分鐘。對(duì)該混合物進(jìn)行離心，并用25毫升苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)和氯仿/異戊醇(24∶1)對(duì)水相進(jìn)行再次提取。通過在室溫下用15毫升異丙醇沉淀回收核酸。將沉淀重新懸浮在1毫升水中。
按以下方法對(duì)基因組DNA進(jìn)行限制酶消化。
讓10微克基因組DNA、40微升10倍反應(yīng)緩沖液和100U限制酶(XbaI、EcoRI、EcoRV或HindIII)在400微升總反應(yīng)體積中反應(yīng)5-6小時(shí)。然后對(duì)該混合物進(jìn)行苯酚提取并用乙醇沉淀。對(duì)消化過的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在0.8％瓊脂糖凝膠上以15伏的電壓電泳大約5小時(shí)。將凝膠在變性緩沖液[87.66克氯化鈉和20克氫氧化鈉/升]中浸沒30分鐘，同時(shí)輕微振動(dòng)，用蒸餾水漂洗，并浸沒在中和緩沖液[87.66克氯化鈉和60.55ke Tris-HCl，pH7.5/升]中，同時(shí)輕微振動(dòng)，通過毛細(xì)吸印將DNA轉(zhuǎn)移到Hybond-N+尼龍膜上。
用1×106CPM/毫升32P-dCTP標(biāo)記的完整長(zhǎng)度DHS cDNA或DHScDNA克隆的3’非編碼區(qū)在42℃下進(jìn)行雜交過夜。預(yù)雜交和雜交是在含有50％甲酰胺、6×SSC、5×denhardt’s溶液、0.1％SDS和100毫克/毫升變性的鮭魚精DNA的緩沖液中進(jìn)行的。將所述膜預(yù)雜交2-4小時(shí)；雜交進(jìn)行一夜。
在雜交結(jié)束之后，然后在室溫下用2×SSC和0.1％SDS漂洗膜，然后用2×SSC和0.1％SDS洗滌15分鐘，并用0.2×SSC和0.1％SDS洗滌15分鐘。然后在-80℃讓該膜對(duì)X光膠片曝光一夜。結(jié)果如圖5所示。
實(shí)施例8從擬南芥屬中分離衰老誘導(dǎo)的eIF-5A基因用擬南芥屬衰老的葉片cDNA文庫(kù)作模板通過PCR獲得在擬南芥屬葉片中表達(dá)的衰老誘導(dǎo)的eIF-5A基因的完整長(zhǎng)度cDNA克隆。首先，利用與載體T7引物<AATACGACTCACTATAG>(SEQ ID NO18)配對(duì)的簡(jiǎn)并上游引物<AAARRYCGMCCYTGCAAGGT>(SEQ ID NO17)和與載體T3引物<ATTAACCCTCACTAAAG>(SEQ ID NO20)配對(duì)的簡(jiǎn)并下游引物<TCYTTNCCYTCMKCTAAHCC>(SEQ ID NO19)制備相應(yīng)于該基因的5’和3’末端的PCR產(chǎn)物。將該P(yáng)CR產(chǎn)物亞克隆到pBluescript上進(jìn)行測(cè)序。然后用與3’-專一性引物<AGAAGAAGTATAAAAACCATC>(SEQ ID NO22)配對(duì)的5’-專一性引物<CTGTTACCAAAAAATCTGTACC>(SEQ ID NO21)獲得完整長(zhǎng)度cDNA，并亞克隆到pBluescript上進(jìn)行測(cè)序。
實(shí)施例9從番茄果實(shí)中分離衰老誘導(dǎo)的eIF-5A基因用番茄果實(shí)cDNA文庫(kù)作模板通過PCR獲得在番茄果實(shí)中表達(dá)的衰老誘導(dǎo)的eIF-5A基因的完整長(zhǎng)度cDNA克隆。首先，利用與載體T7引物(SEQ ID NO18)配對(duì)的簡(jiǎn)并上游引物(SEQ ID NO17)和與載體T3引物(SEQ ID NO20)配對(duì)的簡(jiǎn)并下游引物(SEQ ID NO19)制備相應(yīng)于該基因的5’和3’末端的PCR產(chǎn)物。將該P(yáng)CR產(chǎn)物亞克隆到pBluescript上進(jìn)行測(cè)序。然后用與載體T7引物(SEQ ID NO18)配對(duì)的5’-專一性引物<AAAGAATCCTAGAGAGAGAAAGG>(SEQ IDNO23)獲得完整長(zhǎng)度cDNA，并亞克隆到pBluescript上進(jìn)行測(cè)序。
實(shí)施例10從香石竹中分離衰老誘導(dǎo)的eIF-5A基因用香石竹衰老的花cDNA文庫(kù)作模板通過PCR獲得在香石竹花中表達(dá)的衰老誘導(dǎo)的eIF-5A基因的完整長(zhǎng)度cDNA克隆。首先，利用與載體T7引物(SEQ ID NO18)配對(duì)的簡(jiǎn)并上游引物(SEQ ID NO17)和與載體T3引物(SEQ ID NO20)配對(duì)的簡(jiǎn)并下游引物(SEQ IDNO19)制備相應(yīng)于該基因的5’和3’末端的PCR產(chǎn)物。將該P(yáng)CR產(chǎn)物亞克隆到pBluescript上進(jìn)行測(cè)序。然后用與3’專一性引物<ACAAAACCTGTGTTATAACTCC>(SEQ ID NO25)配對(duì)的5’專一性引物<TTTTACATCAATCGAAAA>(SEQ ID NO24)獲得完整長(zhǎng)度cDNA，并亞克隆到pBluescript上進(jìn)行測(cè)序。
實(shí)施例11從擬南芥屬中分離衰老誘導(dǎo)的DHS基因通過篩選擬南芥屬衰老葉片的cDNA文庫(kù)獲得在擬南芥屬葉片中表達(dá)的衰老誘導(dǎo)的DHS基因的完整長(zhǎng)度cDNA克隆。用于篩選的探針的序列(SEQ ID NO26)如圖38所示。該探針是利用所述衰老葉片cDNA文庫(kù)作模板和由GeneBank中的未鑒定的基因組序列(AB017060)設(shè)計(jì)的引物(在圖38中表示為加下劃線的部分)通過PCR獲得的。將該P(yáng)CR產(chǎn)物亞克隆到pBluescript上進(jìn)行測(cè)序。
實(shí)施例12從香石竹中分離衰老誘導(dǎo)的DHS基因通過篩選香石竹衰老花瓣cDNA文庫(kù)獲得在香石竹花瓣中表達(dá)的衰老誘導(dǎo)的DHS基因的完整長(zhǎng)度cDNA文庫(kù)。用于篩選的探針的序列(SEQ ID NO27)如圖39所示。該探針是利用衰老花瓣cDNA文庫(kù)作模板和簡(jiǎn)并引物(上游5’TTGARGAAGATYCATMAARTGCCT3’，SEQ ID NO28；下游5’CCATCAAAYTCYTGKGCRGTGTT3’，SEQ IDNO29)通過PCR獲得的。將該P(yáng)CR產(chǎn)物亞克隆到pBluescript上進(jìn)行測(cè)序。
實(shí)施例13用反義方向的完整長(zhǎng)度的擬南芥屬DHS或其3’片段部分轉(zhuǎn)化擬南芥屬用二元載體pKYLX71轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，該載體含有完整長(zhǎng)度的衰老誘導(dǎo)的擬南芥屬DHS cDNA序列或該DHS基因的3’末端(SEQ ID NO30)(圖36)，這兩者都是以反義形式表達(dá)的，受雙35S啟動(dòng)子的控制。通過真空滲濾用轉(zhuǎn)化過的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥屬植物，并在氨芐青霉素上篩選來自所得到的T0植株的轉(zhuǎn)化的種子。
圖21-24是轉(zhuǎn)化過的擬南芥屬植物的照片，表示在轉(zhuǎn)化過的植物中DHS基因或其3’末端沿反義方向的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致生物量的增加，例如，較大的葉片和較大的植物體積。圖25表示轉(zhuǎn)基因擬南芥屬植物具有較高的種子產(chǎn)量。
實(shí)施例14用反義方向的完整長(zhǎng)度的番茄DHS或其3’片段部分轉(zhuǎn)化番茄植物用二元載體pKYLX71轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，該載體含有完整長(zhǎng)度的衰老誘導(dǎo)的番茄DHS cDNA序列或該DHS基因的3’末端(SEQ ID NO31)(圖37)，用所述農(nóng)桿菌產(chǎn)生番茄葉片外殖體，并制備轉(zhuǎn)化過的愈傷組織和小植株，通過標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)方法篩選。在溫室條件下將轉(zhuǎn)化過的小植株生長(zhǎng)成成熟的結(jié)實(shí)的T1植株。
圖26-35是照片，表示衰老誘導(dǎo)的番茄DHS基因在轉(zhuǎn)化過的植物中的減弱了的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致較高的生物量，例如，較大的葉片和較大的植株，正如在轉(zhuǎn)化過的擬南芥屬植物中所看到的，以及番茄果實(shí)推遲了的軟化和腐爛。
序列表序列表<110>J.E.湯普森(Thompson，John E.)T.-W.王(Wang，Tzann-Wei)D.L.盧(Lu，Dongen Lilly)<120>編碼植物脫氧海普賴氨酸合成酶的DNA，植物真核起始因子5A，轉(zhuǎn)基因植物和控制植物衰老和程序性細(xì)胞死亡的方法<130>10799/29<140><141><150>09/34 8,675<151>1999-07-06<160>35<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1609<212>DNA<213>番茄屬種(Lycopersicon sp.)<220><221>CDS<222>(54..1196)<220><223>DHS<400>1cgcagaaact cgcggcggca gtcttgttcc ctacataatc ttggtctgca ata atg 56Met1gga gaa gct ctg aag tac agt atc atg gac tca gta aga tcg gta gtt 104Gly Glu Ala Leu Lys Tyr Ser Ile Met Asp Ser Val Arg Ser Val Val5 10 15ttc aaa gaa tcc gaa aat cta gaa ggt tct tgc act aaa atc gag ggc 152Phe Lys Glu Ser Glu Asn Leu Glu Gly Ser Cys Thr Lys Ile Glu Gly20 25 30tac gac ttc aat aaa ggc gtt aac tat gct gag ctg atc aag tcc atg 200Tyr Asp Phe Asn Lys Gly Val Asn Tyr Ala Glu Leu Ile Lys Ser Met35 40 45gtt tcc act ggt ttc caa gca tct aat ctt ggt gac gcc att gca att 248Val Ser Thr Gly Phe Gln Ala Ser Asn Leu Gly Asp Ala Ile Ala Ile50 55 60 65gtt aat caa atg cta gat tgg agg ctt tca cat gag ctg ccc acg gag 296Val Asn Gln Met Leu Asp Trp Arg Leu Ser His Glu Leu Pro Thr Glu70 75 80gat tgc agt gaa gaa gaa aga gat gtt gca tac aga gag tcg gta acc 344Asp Cys Ser Glu Glu Glu Arg Asp Val Ala Tyr Arg Glu Ser Val Thr85 90 95tgc aaa atc ttc ttg ggg ttc act tca aac ctt gtt tct tct ggt gtt 392Cys Lys Ile Phe Leu Gly Phe Thr Ser Asn Leu Val Ser Ser Gly Val100 105 110aga gac act gtc cgc tac ctt gtt cag cac cgg atg gtt gat gtt gtg 440Arg Asp Thr Val Arg Tyr Leu Val Gln His Arg Met Val Asp Val Val115 120 125gtt act aca gct ggt ggt att gaa gag gat ctc ata aag tgc ctc gca 488Val Thr Thr Ala Gly Gly Ile Glu Glu Asp Leu Ile Lys Cys Leu Ala130 135 140 145cca acc tac aag ggg gac ttc tct tta cct gga gct tct cta cga tcg 536Pro Thr Tyr Lys Gly Asp Phe Ser Leu Pro Gly Ala Ser Leu Arg Ser150 155 160aaa gga ttg aac cgt att ggt aac tta ttg gtt cct aat gac aac tac 584Lys Gly Leu Asn Arg Ile Gly Asn Leu Leu Val Pro Asn Asp Asn Tyr165 170 175tgc aaa ttt gag aat tgg atc atc cca gtt ttt gac caa atg tat gag 632Cys Lys Phe Glu Asn Trp Ile Ile Pro Val Phe Asp Gln Met Tyr Glu180 185 190gag cag att aat gag aag gtt cta tgg aca cca tct aaa gtc att gct 680Glu Gln Ile Asn Glu Lys Val Leu Trp Thr Pro Ser Lys Val Ile Ala195 200 205cgt ctg ggt aaa gaa att aat gat gaa acc tca tac ttg tat tgg gct 728Arg Leu Gly Lys Glu Ile Asn Asp Glu Thr Ser Tyr Leu Tyr Trp Ala210 215 220 225tac aag aac cgg att cct gtc ttc tgt cct ggc ttg acg gat gga tca 776Tyr Lys Asn Arg Ile Pro Val Phe Cys Pro Gly Leu Thr Asp Gly Ser230 235 240ctt ggt gac atg cta tac ttc cat tct ttc aaa aag ggt gat cca gat 824Leu Gly Asp Met Leu Tyr Phe His Ser Phe Lys Lys Gly Asp Pro Asp245 250 255aat cca gat ctt aat cct ggt cta gtc ata gac att gta gga gat att 872Asn Pro Asp Leu Asn Pro Gly Leu Val Ile Asp Ile Val Gly Asp Ile260 265 270agg gcc atg aat ggt gaa gct gtc cat gct ggt ttg agg aag aca gga 920Arg Ala Met Asn Gly Glu Ala Val His Ala Gly Leu Arg Lys Thr Gly275 280 285atg att ata ctg ggt gga ggg ctg cct aag cac cat gtt tgc aat gcc 968Met Ile Ile Leu Gly Gly Gly Leu Pro Lys His His Val Cys Asn Ala290 295 300 305aat atg atg cgc aat ggt gca gat ttt gcc gtc ttc att aac acc gca 1016Asn Met Met Arg Asn Gly Ala Asp Phe Ala Val Phe Ile Asn Thr Ala310 315 320caa gag ttt gat ggt agt gac tct ggt gcc cgt cct gat gaa gct gta 1064Gln Glu Phe Asp Gly Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val325 330 335tca tgg gga aag ata cgt ggt ggt gcc aag act gtg aag gtg cat tgt 1112Ser Trp Gly Lys Ile Arg Gly Gly Ala Lys Thr Val Lys Val His Cys
340 345 350gat gca acc att gca ttt ccc ata tta gta gct gag aca ttt gca gct 1160Asp Ala Thr Ile Ala Phe Pro Ile Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala Ala355 360 365aag agt aag gaa ttc tcc cag ata agg tgc caa gtt tgaacattga 1206Lys Ser Lys Glu Phe Ser Gln Ile Arg Cys Gln Val370 375 380ggaagctgtc cttccgacca cacatatgaa ttgctagctt ttgaagccaa cttgctagtg 1266tgcagcacca tttattctgc aaaactgact agagagcagg gtatattcct ctaccccgag 1326ttagacgaca tcctgtatgg ttcaaattaa ttatttttct ccccttcaca ccatgttatt 1386tagttctctt cctcttcgaa agtgaagagc ttagatgttc ataggttttg aattatgttg 1446gaggttggtg ataactgact agtcctctta ccatatagat aatgtatcct tgtactatga 1506gattttgggt gtgtttgata ccaaggaaaa tgtttatttg gaaaacaatt ggatttttaa 1566tttatttttt cttgtttaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 1609<210>2<211>381<212>PRT<213>番茄屬種(Lycopersicon sp.)<220><223>DHS<400>2Met Gly Glu Ala Leu Lys Tyr Ser Ile Met Asp Ser Val Arg Ser Val15 10 15Val Phe Lys Glu Ser Glu Asn Leu Glu Gly Ser Cys Thr Lys Ile Glu20 25 30Gly Tyr Asp Phe Asn Lys Gly Val Asn Tyr Ala Glu Leu Ile Lys Ser35 40 45Met Val Ser Thr Gly Phe Gln Ala Ser Asn Leu Gly Asp Ala Ile Ala50 55 60Ile Val Asn Gln Met Leu Asp Trp Arg Leu Ser His Glu Leu Pro Thr65 70 75 80Glu Asp Cys Ser Glu Glu Glu Arg Asp Val Ala Tyr Arg Glu Ser Val85 90 95Thr Cys Lys Ile Phe Leu Gly Phe Thr Ser Asn Leu Val Ser Ser Gly100 105 110Val Arg Asp Thr Val Arg Tyr Leu Val Gln His Arg Met Val Asp Val115 120 125Val Val Thr Thr Ala Gly Gly Ile Glu Glu Asp Leu Ile Lys Cys Leu130 135 140Ala Pro Thr Tyr Lys Gly Asp Phe Ser Leu Pro Gly Ala Ser Leu Arg145 150 155 160Ser Lys Gly Leu Asn Arg Ile Gly Asn Leu Leu Val Pro Asn Asp Asn165 170 175Tyr Cys Lys Phe Glu Asn Trp Ile Ile Pro Val Phe Asp Gln Met Tyr180 185 190Glu Glu Gln Ile Asn Glu Lys Val Leu Trp Thr Pro Ser Lys Val Ile195 200 205Ala Arg Leu Gly Lys Glu Ile Asn Asp Glu Thr Ser Tyr Leu Tyr Trp210 215 220Ala Tyr Lys Asn Arg Ile Pro Val Phe Cys Pro Gly Leu Thr Asp Gly225 230 235 240Ser Leu Gly Asp Met Leu Tyr Phe His Ser Phe Lys Lys Gly Asp Pro245 250 255Asp Asn Pro Asp Leu Asn Pro Gly Leu Val Ile Asp Ile Val Gly Asp260 265 270Ile Arg Ala Met Asn Gly Glu Ala Val His Ala Gly Leu Arg Lys Thr275 280 285Gly Met Ile Ile Leu Gly Gly Gly Leu Pro Lys His His Val Cys Asn290 295 300Ala Asn Met Met Arg Asn Gly Ala Asp Phe Ala Val Phe Ile Asn Thr305 310 315 320Ala Gln Glu Phe Asp Gly Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala325 330 335Val Ser Trp Gly Lys Ile Arg Gly Gly Ala Lys Thr Val Lys Val His340 345 350Cys Asp Ala Thr Ile Ala Phe Pro Ile Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala355 360 365Ala Lys Ser Lys Glu Phe Ser Gln Ile Arg Cys Gln Val370 375 380<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>3agtctagaag gtgctcgtcc tgat 24<210>4<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>4gactgcagtc gacatcgatt tttttttttt tttt 34<210>5<211>2272<212>DNA<213>擬南芥屬種(Arabidopsis sp.)<220><221>CDS<222>(68..265，348..536，624..842，979..1065，1154..1258，1575..1862)<400>5gaactcccaa aaccctctac tactacactt tcagatccaa ggaaatcaat tttgtcattc 60gagcaac atg gag gat gat cgt gtt ttc tct tcg gtt cac tca aca gtt 109Met Glu Asp Asp Arg Val Phe Ser Ser Val His Ser Thr Val15 10ttc aaa gaa tcc gaa tca ttg gaa gga aag tgt gat aaa atc gaa gga 157Phe Lys Glu Ser Glu Ser Leu Glu Gly Lys Cys Asp Lys Ile Glu Gly15 20 25 30tac gat ttc aat caa gga gta gat tac cca aag ctt atg cga tcc atg 205Tyr Asp Phe Asn Gln Gly Val Asp Tyr Pro Lys Leu Met Arg Ser Met35 40 45ctc acc acc gga ttt caa gcc tcg aat ctc ggc gaa gct att gat gtc 253Leu Thr Thr Gly Phe Gln Ala Ser Asn Leu Gly Glu Ala Ile Asp Val50 55 60gtc aat caa atg gttcgtttct cgaattcatc aaaaataaaa attccttctt 305Val Asn Gln Met65tttgttttcc tttgttttgg gtgaattagt aatgacaaag ag ttt gaa ttt gta 359Phe Glu Phe Val70ttg aag cta gat tgg aga ctg gct gat gaa act aca gta gct gaa gac 407Leu Lys Leu Asp Trp Arg Leu Ala Asp Glu Thr Thr Val Ala Glu Asp75 80 85tgt agt gaa gag gag aag aat cca tcg ttt aga gag tct gtc aag tgt 455Cys Ser Glu Glu Glu Lys Asn Pro Ser Phe Arg Glu Ser Val Lys Cys90 95 100aaa atc ttt cta ggt ttc act tca aat ctt gtt tca tct ggt gtt aga 503Lys Ile Phe Leu Gly Phe Thr Ser Asn Leu Val Ser Ser Gly Val Arg105 110 115gat act att cgt tat ctt gtt cag cat cat atg gtttgtgatt tttgctttat556Asp Thr Ile Arg Tyr Leu Val Gln His His Met120 125caccctgctt ttttatagat gttaaaattt tcgagcttta gttttgattt caatggtttt616tctgcag gtt gat gtt ata gtc acg aca act ggt ggt gtt gag gaa gat 665Val Asp Val Ile Val Thr Thr Thr Gly Gly Val Glu Glu Asp130 135 140ctc ata aaa tgc ctt gca cct aca ttt aaa ggt gat ttc tct cta cct 713Leu Ile Lys Cys Leu Ala Pro Thr Phe Lys Gly Asp Phe Ser Leu Pro145 150 155gga gct tat tta agg tca aag gga ttg aac cga att ggg aat ttg ctg 761Gly Ala Tyr Leu Arg Ser Lys Gly Leu Asn Arg Ile Gly Asn Leu Leu160 165 170 175gtt cct aat gat aac tac tgc aag ttt gag gat tgg atc att ccc atc 809Val Pro Asn Asp Asn Tyr Cys Lys Phe Glu Asp Trp Ile Ile Pro Ile180 185 190ttt gac gag atg ttg aag gaa cag aaa gaa gag gtattgcttt atctttcctt862Phe Asp Glu Met Leu Lys Glu Gln Lys Glu Glu195 200tttatatgat ttgagatgat tctgtttgtg cgtcactagt ggagatagat 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360tttaatattg gatcattctt gcaggtatac tgtgatgcta ccatagcctt cccattgttg 1932gttgcagaaa catttgccac aaagagagac caaacctgtg agtctaagac ttaagaactg 1992actggtcgtt ttggccatgg attcttaaag atcgttgctt tttgatttta cactggagtg 2052accatataac actccacatt gatgtggctg tgacgcgaat tgtcttcttg cgaattgtac 2112tttagtttct ctcaacctaa aatgatttgc agattgtgtt ttcgtttaaa acacaagagt 2172cttgtagtca ataatccttt gccttataaa attattcagt tccaacaaca cattgtgatt 2232ctgtgacaag tctcccgttg cctatgttca cttctctgcg 2272<210>6<211>362<212>PRT<213>擬南芥屬種(Arabidopsis sp.)<400>6Met Glu Asp Asp Arg Val Phe Ser Ser Val His Ser Thr Val Phe Lys15 10 15Glu Ser Glu Ser Leu Glu Gly Lys Cys Asp Lys Ile Glu Gly Tyr Asp20 25 30Phe Asn Gln Gly Val Asp Tyr Pro Lys Leu Met Arg Ser Met Leu Thr35 40 45Thr Gly Phe Gln Ala Ser Asn Leu Gly Glu Ala Ile Asp Val Val Asn50 55 60Gln Met Phe Glu Phe Val Leu Lys Leu Asp Trp Arg Leu Ala Asp Glu65 70 75 80Thr Thr Val Ala Glu Asp Cys Ser Glu Glu Glu Lys Asn Pro Ser Phe85 90 95Arg Glu Ser Val Lys Cys Lys Ile Phe Leu Gly Phe Thr Ser Asn Leu100 105 110Val Ser Ser Gly Val Arg Asp Thr Ile Arg Tyr Leu Val Gln His His115 120 125Met Val Asp Val Ile Val Thr Thr Thr Gly Gly Val Glu Glu Asp Leu130 135 140Ile Lys Cys Leu Ala Pro Thr Phe Lys Gly Asp Phe Ser Leu pro Gly145 150 155 160Ala Tyr Leu Arg Ser Lys Gly Leu Asn Arg Ile Gly Asn Leu Leu Val
165 170 175Pro Asn Asp Asn Tyr Cys Lys Phe Glu Asp Trp Ile Ile Pro Ile Phe180 185 190Asp Glu Met Leu Lys Glu Gln Lys Glu Glu Asn Val Leu Trp Thr Pro195 200 205Ser Lys Leu Leu Ala Arg Leu Gly Lys Glu Ile Asn Asn Glu Ser Ser210 215 220Tyr Leu Tyr Trp Ala Tyr Lys Met Asn Ile Pro Val Phe Cys Pro Gly225 230 235 240Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Leu Tyr Phe His Ser Phe Arg245 250 255Thr Ser Gly Leu Ile Ile Asp Val Val Gln Asp Ile Arg Ala Met Asn260 265 270Gly Glu Ala Val His Ala Asn Pro Lys Lys Thr Gly Met Ile Ile Leu275 280 285Gly Gly Gly Leu Pro Lys His His Ile Cys Asn Ala Asn Met Met Arg290 295 300Asn Gly Ala Asp Tyr Ala Val Phe Ile Asn Thr Gly Gln Glu Phe Asp305 310 315 320Gly Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys325 330 335Ile Arg Gly Ser Ala Lys Thr Val Lys Val Cys Phe Leu Ile Ser Ser340 345 350His Pro Asn Leu Tyr Leu Thr Gln Trp Phe355 360<210>7<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>7ggtggtgttg aggaagatc 19<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>8ggtgcacgcc ctgatgaagc 20<210>9<211>1660<212>DNA<213>石竹屬種(Dianthus sp.)<220><223>DHS<220><221>CDS<222>(256)..(1374)<400>9gtcattacaa tgcataggat cattgcacat gctaccttcc tcattgcact tgagcttgcc 60atacttttgt ttttgacgtt tgataataat actatgaaaa tattatgttt tttcttttgt 120gtgttggtgt ttttgaagtt gtttttgata agcagaaccc agttgtttta cacttttacc 180attgaactac tgcaattcta aaactttgtt tacattttaa ttccatcaaa gattgagttc 240agcataggaa aaagg atg gag gat gct aat cat gat agt gtg gca tct gcg 291Met Glu Asp Ala Asn His Asp Ser Val Ala Ser Ala15 10cac tct gca gca ttc aaa aag tcg gag aat tta gag ggg aaa agc gtt 339His Ser Ala Ala Phe Lys Lys Ser Glu Asn Leu Glu Gly Lys Ser Val15 20 25aag att gag ggt tat gat ttt aat caa ggt gta aac tat tcc aaa ctc 387Lys Ile Glu Gly Tyr Asp Phe Asn Gln Gly Val Asn Tyr Ser Lys Leu30 35 40ttg caa tct ttc gct tct aat ggg ttt caa gcc tcg aat ctt gga gat 435Leu Gln Ser Phe Ala Ser Asn Gly Phe Gln Ala Ser Asn Leu Gly Asp45 50 55 60gcc att gaa 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1574agagagtaca tttttgaggt aaaaatatag gatttttgtg cgatgcaaat gctggttatt 1634cccttgaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1660<210>10<211>373<212>PRT<213>石竹屬種(Dianthus sp.)<220><223>DHS<400>10Met Glu Asp Ala Asn His Asp Ser Val Ala Ser Ala His Ser Ala Ala15 10 15Phe Lys Lys Ser Glu Asn Leu Glu Gly Lys Ser Val Lys Ile Glu Gly20 25 30Tyr Asp Phe Asn Gln Gly Val Asn Tyr Ser Lys Leu Leu Gln Ser Phe35 40 45Ala Ser Asn Gly Phe Gln Ala Ser Asn Leu Gly Asp Ala Ile Glu Val50 55 60Val Asn His Met Leu Asp Trp Ser Leu Ala Asp Glu Ala Pro Val Asp65 70 75 80Asp Cys Ser Glu Glu Glu Arg Asp Pro Lys Phe Arg Glu Ser Val Lys85 90 95Cys Lys Val Phe Leu Gly Phe Thr Ser Asn Leu Ile Ser Ser Gly Val100 105 110Arg Asp Thr Ile Arg Tyr Leu Val Gln His His Met Val Asp Val Ile115 120 125Val Thr Thr Thr Gly Gly Ile Glu Glu Asp Leu Ile Lys Gly Arg Ser130 135 140Ile Lys Cys Leu Ala Pro Thr Phe Lys Gly Asp Phe Ala Leu Pro Gly145 150 155 160Ala Gln Leu Arg Ser Lys Gly Leu Asn Arg Ile Gly Asn Leu Leu Val165 170 175Pro Asn Asp Asn Tyr Cys 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105 110 115ctt ccc acc gat gaa aat ctg ctg aag cag gtt aaa gat ggg ttc cag 438Leu Pro Thr Asp Glu Asn Leu Leu Lys Gln Val Lys Asp Gly Phe Gln120 125 130gaa gga aag gat ctt gtg gtg tct gtt atg tct gcg atg ggc gaa gag 486Glu Gly Lys Asp Leu Val Val Ser Val Met Ser Ala Met Gly Glu Glu135 140 145cag att aac gcc gtt aag gat gtt ggt acc aag aat tagttatgtc 532Gln Ile Asn Ala Val Lys Asp Val Gly Thr Lys Asn150 155 160atggcagcat aatcactgcc aaagctttaa gacattatca tatcctaatg tggtactttg 592atatcactag attataaact gtgttatttg cactgttcaa aacaaaagaa agaaaactgc 652tgttatggct agagaaagta ttggctttga gcttttgaca gcacagttga actatgtgaa 712aattctactt tttttttttt gggtaaaata ctgctcgttt aatgttttgc aaaaaaaaaa 772aaaaaaaa 780<210>12<211>160<212>PRT<213>番茄屬種(Lycopersicon sp.)<220><223>eif-5A<400>12Met Ser Asp Glu Glu His His Phe Glu Ser Lys Ala Asp Ala Gly Ala15 10 15Ser Lys Thr Phe Pro Gln Gln Ala Gly Thr Ile Arg Lys Asn Gly Tyr20 25 30Ile Val Ile Lys Gly Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser35 40 45Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala Ile Asp50 55 60Ile Phe Asn Gly Lys Lys Leu Glu Asp Ile Val Pro Ser Ser His Asn65 70 75 80Cys Asp Val Pro His Val Asn Arg Thr Asp Tyr Gln Leu Ile Asp Ile85 90 95Ser Glu Asp Gly Phe Val Ser Leu Leu Thr Glu Ser Gly Asn Thr Lys100 105 110Asp Asp Leu Arg Leu Pro Thr Asp Glu Asn Leu Leu Lys Gln Val Lys115 120 125Asp Gly Phe Gln Glu Gly Lys Asp Leu Val Val Ser Val Met Ser Ala130 135 140Met Gly Glu Glu Gln Ile Asn Ala Val Lys Asp Val Gly Thr Lys Asn145 150 155 160<210>13<211>812<212>DNA<213>石竹屬種(Dianthus sp.)<220><223>eif-5A<220><221>CDS<222>(67)..(546)<400>13ctcttttaca tcaatcgaaa aaaaattagg gttcttattt tagagtgaga ggcgaaaaat 60cgaacg atg tcg gac gac gat cac cat ttc gag tca tcg gcc gac gcc 108Met Ser Asp Asp Asp His His Phe Glu Ser Ser Ala Asp Ala15 10gga gca tcc aag act tac cct caa caa gct ggt aca atc cgc aag agc 156Gly Ala Ser Lys Thr Tyr Pro Gln Gln Ala Gly Thr Ile Arg Lys Ser15 20 25 30ggt cac atc gtc atc aaa aat cgc cct tgc aag gtg gtt gag gtt tct 204Gly His Ile Val Ile Lys Asn Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser35 40 45acc tcc aag act ggc aag cac ggt cat gcc aaa tgt cac ttt gtt gcc 252Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala50 55 60att gac att ttc aac ggc aag aag ctg gaa gat att gtc ccc tca tcc 300Ile Asp Ile Phe Asn Gly Lys Lys Leu Glu Asp Ile Val Pro Ser Ser65 70 75cac aat tgt gat gtt cca cat gtc aac cgt gtc gac tac cag ctg ctt 348His Asn Cys Asp Val Pro His Val Asn Arg Val Asp Tyr Gln Leu Leu80 85 90gat atc act gaa gat ggc ttt gtt agt ctg ctg act gac agt ggt gac 396Asp Ile Thr Glu Asp Gly Phe Val Ser Leu Leu Thr Asp Ser Gly Asp95 100 105 110acc aag gat gat ctg aag ctt cct gct gat gag gcc ctt gtg aag cag 444Thr Lys Asp Asp Leu Lys Leu Pro Ala Asp Glu Ala Leu Val Lys Gln115 120 125atg aag gag gga ttt gag gcg ggg aaa gac ttg att ctg tca gtc atg 492Met Lys Glu Gly Phe Glu Ala Gly Lys Asp Leu Ile Leu Ser Val Met130 135 140tgt gca atg gga gaa gag cag atc tgc gcc gtc aag gac gtt agt ggt 540Cys Ala Met Gly Glu Glu Gln Ile Cys Ala Val Lys Asp Val Ser Gly145 150 155ggc aag tagaagcttt tgatgaatcc aatactacgc ggtgcagttg aagcaatagt 596Gly Lys160aatctcgaga acattctgaa ccttatatgt tgaattgatg gtgcttagtt tgttttggaa 656atctctttgc aattaagttg taccaaatca atggatgtaa tgtcttgaat ttgttttatt 716tttgttttga tgtttgctgt gattgcatta tgcattgtta tgagttatga cctgttataa 776cacaaggttt tggtaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 812<210>14<211>160<212>PRT<213>石竹屬種(Dianthus sp.)<220><223>eif-5A<400>14Met Ser Asp Asp Asp His His Phe Glu Ser Ser Ala Asp Ala Gly Ala15 10 15Ser Lys Thr Tyr Pro Gln Gln Ala Gly Thr Ile Arg Lys Ser Gly His20 25 30Ile Val Ile Lys Asn Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser35 40 45Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala Ile Asp50 55 60Ile Phe Asn Gly Lys Lys Leu Glu Asp Ile Val Pro Ser Ser His Asn65 70 75 80Cys Asp Val Pro His Val Asn Arg Val Asp Tyr Gln Leu Leu Asp Ile85 90 95Thr Glu Asp Gly Phe Val Ser Leu Leu Thr Asp Ser Gly Asp Thr Lys100 105 110Asp Asp Leu Lys Leu Pro Ala Asp Glu Ala Leu Val Lys Gln Met Lys115 120 125Glu Gly Phe Glu Ala Gly Lys Asp Leu Ile Leu Ser Val Met Cys Ala130 135 140Met Gly Glu Glu Gln Ile Cys Ala Val Lys Asp Val Ser Gly Gly Lys145 150 155 160<210>15<211>702<212>DNA<213>擬南芥屬種(Arabidopsis sp.)<220><223>eif-5A<220><221>CDS<222>(56)..(529)<400>15ctgttaccaa aaaatctgta ccgcaaaatc ctcgtcgaag ctcgctgctg caacc atg 58
Met1tcc gac gag gag cat cac ttt gag tcc agt gac gcc gga gcg tcc aaa 106Ser Asp Glu Glu His His Phe Glu Ser Ser Asp Ala Gly Ala Ser Lys5 10 15acc tac cct caa caa gct gga acc atc cgt aag aat ggt tac atc gtc 154Thr Tyr Pro Gln Gln Ala Gly Thr Ile Arg Lys Asn Gly Tyr Ile Val20 25 30atc aaa aat cgt ccc tgc aag gtt gtt gag gtt tca acc tcg aag act 202Ile Lys Asn Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys Thr35 40 45ggc aag cat ggt cat gct aaa tgt cat ttt gta gct att gat atc ttc 250Gly Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala Ile Asp Ile Phe50 55 60 65acc agc aag aaa ctc gaa gat att gtt cct tct tcc cac aat tgt gat 298Thr Ser Lys Lys Leu Glu Asp Ile Val Pro Ser Ser His Asn Cys Asp70 75 80gtt cct cat gtc aac cgt act gat tat cag ctg att gac att tct gaa 346Val Pro His Val Asn Arg Thr Asp Tyr Gln Leu Ile Asp Ile Ser Glu85 90 95gat gga tat gtc agt ttg ttg act gat aac ggt agt acc aag gat gac 394Asp Gly Tyr Val Ser Leu Leu Thr Asp Asn Gly Ser Thr Lys Asp Asp100 105 110ctt aag ctc cct aat gat 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權(quán)利要求
1.一種分離的編碼衰老誘導(dǎo)的脫氧海普賴氨酸合成酶的DNA分子，其中，所述DNA分子能在低嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO1和/或SEQ ID NO9雜交，或能與SEQ ID NO1和/或SEQ ID NO9雜交的所述分離的DNA分子的功能性衍生物，其前提是，所述DNA分子不具有SEQ ID NO5的序列。
2.如權(quán)利要求1的分離的DNA分子，其中，所述DNA分子具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO9的核苷酸序列。
3.一種由能在低嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO1和/或SEQ ID NO9雜交的核苷酸序列所編碼的分離的衰老誘導(dǎo)的脫氧海普賴氨酸合成酶，或所述衰老誘導(dǎo)的脫氧海普賴氨酸合成酶的功能性衍生物。
4.如權(quán)利要求3的衰老誘導(dǎo)的脫氧海普賴氨酸合成酶，其中，所述脫氧海普賴氨酸合成酶具有SEQ ID NO2或SEQ ID NO10的氨基酸序列。
5.一種編碼衰老誘導(dǎo)的eIF-5A的分離的DNA分子，其中，所述DNA分子能在低嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO11、SEQ ID NO13和/或SEQ ID NO15雜交，或能與SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、和/或SEQ ID NO15雜交的所述分離的DNA分子的功能性衍生物。
6.如權(quán)利要求5的分離的DNA分子，其中，所述DNA分子具有SEQ ID NO11、SEQ ID NO13或SEQ ID NO15的核苷酸序列。
7.一種用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的載體，包括(a)一種反義核苷酸序列，它基本上互補(bǔ)于(1)編碼衰老誘導(dǎo)的脫氧海普賴氨酸合成酶的DNA分子的一股鏈的相應(yīng)部分，其中，所述編碼衰老誘導(dǎo)的eIF-5A的DNA分子能在低嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO1、SEQ ID NO5或SEQ ID NO9雜交，或(2)由編碼衰老誘導(dǎo)的脫氧海普賴氨酸合成酶的DNA分子所編碼的RNA序列的相應(yīng)部分；知(b)可操作地連接于所述反義核苷酸序列上的調(diào)控序列，以便所述反義核苷酸序列能在用它轉(zhuǎn)化過的植物細(xì)胞中表達(dá)。
8.如權(quán)利要求7的載體，其中，所述調(diào)控序列包括一個(gè)啟動(dòng)子和一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。
9.如權(quán)利要求7的載體，其中，所述調(diào)控序列包括一個(gè)組成型啟動(dòng)子。
10.如權(quán)利要求7的載體，其中，所述調(diào)控序列包括一個(gè)植物組織專一性啟動(dòng)子。
11.如權(quán)利要求7的載體，其中，所述調(diào)控序列包括一個(gè)衰老誘導(dǎo)的植物啟動(dòng)子。
12.如權(quán)利要求7的載體，其中，所述調(diào)控序列包括一個(gè)病毒啟動(dòng)子。
13.如權(quán)利要求12的載體，其中，所述調(diào)控序列還包括一個(gè)組成型啟動(dòng)子。
14.如權(quán)利要求7的載體，還包括(a)一種反義核苷酸序列，它基本上互補(bǔ)于(1)編碼衰老誘導(dǎo)的eIF-5A的DNA分子的一股鏈的相應(yīng)部分，其中，所述編碼衰老誘導(dǎo)的eIF-5A的DNA分子能在低嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO11、SEQ ID NO13和/或SEQ ID NO15雜交，或(2)由編碼衰老誘導(dǎo)的eIF-5A的DNA分子所編碼的RNA序列的相應(yīng)部分；和(b)可操作地連接于所述反義核苷酸序列上的調(diào)控序列，以便所述反義核苷酸序列能在用它轉(zhuǎn)化過的植物細(xì)胞中表達(dá)。
15.一種用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的載體，包括(a)一種反義核苷酸序列，它基本上互補(bǔ)于(1)編碼衰老誘導(dǎo)的eIF-5A的DNA分子的一股鏈的相應(yīng)部分，其中，所述編碼衰老誘導(dǎo)的eIF-5A的DNA分子能在低嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO11、SEQ ID NO13和/或SEQ ID NO15雜交，或(2)由編碼衰老誘導(dǎo)的eIF-5A的DNA分子所編碼的RNA序列的相應(yīng)部分；和(b)可操作地連接于所述反義核苷酸序列上的調(diào)控序列，以便所述反義核苷酸序列能在用它轉(zhuǎn)化過的植物細(xì)胞中表達(dá)。
16.一種編碼RNA分子的反義寡核苷酸或多核苷酸，它基本上互補(bǔ)于(i)植物衰老誘導(dǎo)的脫氧海普賴氨酸合成酶基因的RNA轉(zhuǎn)錄物的相應(yīng)部分，其中，所述植物基因能在低嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO1、SEQID NO5和/或SEQ ID NO9雜交或(ii)植物衰老誘導(dǎo)的eIF-5A基因的RNA轉(zhuǎn)錄物的相應(yīng)部分，其中，所述植物基因能在低嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO11、SEQ ID NO13和/或SEQ ID NO15雜交。
17.如權(quán)利要求16的反義寡核苷酸或多核苷酸，其中，所述寡核苷酸或多核苷酸包括大約6-100個(gè)核苷酸。
18.如權(quán)利要求16的反義寡核苷酸或多核苷酸，其中，所述反義寡核苷酸或多核苷酸基本上互補(bǔ)于所述RNA轉(zhuǎn)錄物的5’非編碼區(qū)的相應(yīng)部分。
19.如權(quán)利要求16的反義寡核苷酸或多核苷酸，其中，所述反義寡核苷酸或多核苷酸基本上互補(bǔ)于所述RNA轉(zhuǎn)錄物的3’末端的相應(yīng)部分。
20.如權(quán)利要求16的反義寡核苷酸或多核苷酸，其中，所述反義寡核苷酸或多核苷酸基本上互補(bǔ)于擬南芥屬衰老誘導(dǎo)的DHS基因的3’末端。
21.如權(quán)利要求19的反義寡核苷酸或多核苷酸，其中，所述反義寡核苷酸或多核苷酸基本上互補(bǔ)于SEQ ID NO23。
22.如權(quán)利要求19的反義寡核苷酸或多核苷酸，其中，所述反義寡核苷酸或多核苷酸基本上互補(bǔ)于SEQ ID NO30。
23.一種含有一種DNA分子的載體，該DNA分子編碼(a)衰老誘導(dǎo)的脫氧海普賴氨酸合成酶，其中，所述DNA分子能在低嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO1、SEQ ID NO5和/或SEQ ID NO9雜交；和(b)可操作地與所述DNA分子連接的調(diào)控序列，使得脫氧海普賴氨酸合成酶能在用它轉(zhuǎn)化過的植物細(xì)胞中表達(dá)。
24.一種含有一種DNA分子的載體，該DNA分子編碼(a)衰老誘導(dǎo)的eIF-5A，其中，所述DNA分子能在低嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO11、SEQ ID NO13和/或SEQ ID NO15雜交；和(b)可操作地與所述DNA分子連接的調(diào)控序列，使得eIF-5A能在用它轉(zhuǎn)化過的植物細(xì)胞中表達(dá)。
25.一種含有一種DNA分子的載體，該DNA分子編碼(a)衰老誘導(dǎo)的脫氧海普賴氨酸合成酶，其中，所述DNA分子能在低嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO1、SEQ ID NO5和/或SEQ ID NO9雜交；(b)衰老誘導(dǎo)的eIF-5A，其中，所述DNA分子能在低嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO11、SEQ ID NO13和/或SEQ ID NO15雜交；(b)可操作地與所述DNA分子連接的調(diào)控序列，使得衰老誘導(dǎo)的脫氧海普賴氨酸合成酶和eIF-5A能在用它轉(zhuǎn)化過的植物細(xì)胞中表達(dá)。
26.一種用權(quán)利要求7、14或15中任一項(xiàng)的載體轉(zhuǎn)化過的細(xì)菌細(xì)胞。
27.一種用權(quán)利要求7、14或15中任一項(xiàng)的載體轉(zhuǎn)化過的植物細(xì)胞。
28.一種植物及其后代，其中，所述植物是由權(quán)利要求7、14或15中任一項(xiàng)的載體轉(zhuǎn)化過的植物細(xì)胞產(chǎn)生的。
29.一種由權(quán)利要求26的植物或后代所產(chǎn)生的植物部分。
30.一種抑制植物細(xì)胞中內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的脫氧海普賴氨酸合成酶、eIF-5A或這兩者表達(dá)的方法，該方法包括(1)將一種載體整合到植物基因組中，該載體包括(A)一種反義核苷酸序列，它基本上互補(bǔ)于(i)編碼內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的脫氧海普賴氨酸合成酶的DNA分子的一股鏈的相應(yīng)部分，其中，所述編碼內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的脫氧海普賴氨酸合成酶的DNA分子能與SEQID NO1、SEQ ID NO5和/或SEQ ID NO9雜交，或(ii)由內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的脫氧海普賴氨酸合成酶基因所編碼的RNA序列的相應(yīng)部分，(iii)編碼內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的eIF-5A的DNA分子的一股鏈的相應(yīng)部分，其中，所述編碼內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的脫氧海普賴氨酸合成酶的DNA分子能與SEQ ID NO11、SEQ ID NO13和/或SEQ ID NO15雜交，或(iv)由所述內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的eIF-5A基因所編碼的RNA序列的相應(yīng)部分，或(v)(i)或(ii)和(iii)或(iv)的組合；和(B)可操作地連接于所述反義核苷酸序列上的調(diào)控序列，以便表達(dá)所述反義核苷酸序列；和(2)生長(zhǎng)所述植物，以便所述反義核苷酸序列被轉(zhuǎn)錄并且結(jié)合在所述RNA序列上，從而抑制所述衰老誘導(dǎo)的脫氧海普賴氨酸合成酶基因、衰老誘導(dǎo)的eIF-5A基因或這兩者的表達(dá)。
31.如權(quán)利要求30的方法，其中，基本上互補(bǔ)于所述反義核苷酸序列的所述DNA部分或所述RNA部分包括5’非編碼序列或3’編碼和/或非編碼序列。
32.如權(quán)利要求30的方法，其中，所述反義核苷酸序列基本上互補(bǔ)于SEQ ID NO23。
33.如權(quán)利要求30的方法，其中，所述反義核苷酸序列基本上互補(bǔ)于SEQ ID NO30。
34.如權(quán)利要求30的方法，其中，所述抑制會(huì)導(dǎo)致植物衰老的改變。
35.如權(quán)利要求30的方法，其中，所述抑制會(huì)導(dǎo)致所述植物對(duì)環(huán)境脅迫誘導(dǎo)的和/或病原體誘導(dǎo)的衰老的抗性的增強(qiáng)。
36.如權(quán)利要求30的方法，其中，所述抑制會(huì)導(dǎo)致所述植物生物量的增加。
37.如權(quán)利要求30的方法，其中，所述抑制會(huì)導(dǎo)致所述植物果實(shí)變軟和腐爛的推遲。
38.如權(quán)利要求30的方法，其中，所述抑制會(huì)導(dǎo)致所述植物種子產(chǎn)量的增加。
39.如權(quán)利要求30的方法，其中，所述調(diào)控序列包括能在所述植物中起作用的組成型啟動(dòng)子。
40.如權(quán)利要求30的方法，其中，所述調(diào)控序列包括能在所述植物中起作用的組織專一性啟動(dòng)子。
41.如權(quán)利要求30的方法，其中，所述調(diào)控序列包括能在所述植物中起作用的衰老誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。
42.如權(quán)利要求30的方法，其中，所述植物選自下列一組結(jié)實(shí)植物、顯花植物、蔬菜、農(nóng)業(yè)作物和林木。
43.如權(quán)利要求30的方法，其中，所述植物是番茄。
44.如權(quán)利要求30的方法，其中，所述植物是顯花植物。
45.一種抑制植物細(xì)胞中內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的脫氧海普賴氨酸合成酶基因表達(dá)的方法，該方法包括(1)將一種載體整合到植物的至少一個(gè)細(xì)胞的基因組中，該載體包括(A)一種編碼外源衰老誘導(dǎo)的脫氧海普賴氨酸合成酶的分離的DNA分子，其中，所述DNA分子能在低嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO1、SEQ ID NO5和/或SEQ ID NO9雜交，或能與SEQ ID NO1、SEQID NO5和/或SEQ ID NO9雜交的所述分離的DNA分子的功能性衍生物；和(B)可操作地連接于所述DNA分子上的調(diào)控序列，以便表達(dá)它所編碼的外源衰老誘導(dǎo)的脫氧海普賴氨酸合成酶；和(2)生長(zhǎng)所述植物，以便所述DNA分子超量表達(dá)，并且由外源衰老誘導(dǎo)的脫氧海普賴氨酸合成酶抑制內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的脫氧海普賴氨酸合成酶基因。
46.如權(quán)利要求45的方法，其中，所述調(diào)控序列包括一種組成型啟動(dòng)子。
47.一種改變植物的與年齡相關(guān)的衰老和/或與環(huán)境脅迫相關(guān)的衰老的方法，該方法包括(1)將一種載體整合到植物基因組中，該載體包括(A)一種反義核苷酸序列，它基本上互補(bǔ)于(i)編碼內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的脫氧海普賴氨酸合成酶的DNA分子的一股鏈的相應(yīng)部分，其中，所述編碼內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的脫氧海普賴氨酸合成酶的DNA分子能與SEQID NO1、SEQ ID NO5和/或SEQ ID NO9雜交，或(ii)由內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的脫氧海普賴氨酸合成酶基因所編碼的RNA序列的相應(yīng)部分，(iii)編碼內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的eIF-5A基因的DNA分子的一股鏈的相應(yīng)部分，其中，所述編碼內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的eIF-5A的DNA分子能與SEQID NO11、SEQ ID NO13和/或SEQ ID NO15雜交，或(iv)由所述內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的eIF-5A基因所編碼的RNA序列的相應(yīng)部分，或(v)(i)或(ii)和(iii)或(iv)的組合；和(B)可操作地連接于所述反義核苷酸序列上的調(diào)控序列，以便表達(dá)所述反義核苷酸序列；和(2)生長(zhǎng)所述植物，以便所述反義核苷酸序列被轉(zhuǎn)錄并且結(jié)合在所述RNA序列上，從而抑制所述衰老誘導(dǎo)的脫氧海普賴氨酸合成酶基因、衰老誘導(dǎo)的eIF-5A基因或這兩者的表達(dá)。
48.一種轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，包括權(quán)利要求7、14、15中任一項(xiàng)的載體或所述載體的組合。
49.一種轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，包括權(quán)利要求23、24、25中任一項(xiàng)的載體或所述載體的組合。
50.一種質(zhì)粒，含有能在原核宿主中起作用的復(fù)制系統(tǒng)和權(quán)利要求16的反義寡核苷酸或多核苷酸。
51.一種質(zhì)粒，含有能在農(nóng)桿菌屬起作用的復(fù)制系統(tǒng)，和權(quán)利要求16的反義寡核苷酸或多核苷酸。
52.一種植物及其后代，其中，所述植物源于具有受到抑制的或減弱了的衰老誘導(dǎo)脫氧海普賴氨酸合成酶、衰老誘導(dǎo)的eIF-5A或這兩者的表達(dá)的細(xì)胞，所述細(xì)胞含有權(quán)利要求7、14和15中任一項(xiàng)的載體。
53.一種植物及其后代，其中，所述植物源于具有受到抑制的或減弱了的衰老誘導(dǎo)脫氧海普賴氨酸合成酶、衰老誘導(dǎo)的eIF-5A或這兩者的表達(dá)的細(xì)胞，其中，所述細(xì)胞是通過以下方法產(chǎn)生的(1)將一種載體整合到植物基因組中，該載體包括(A)一種反義核苷酸序列，它基本上互補(bǔ)于(i)編碼內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的脫氧海普賴氨酸合成酶的DNA分子的一股鏈的相應(yīng)部分，其中，所述編碼內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的脫氧海普賴氨酸合成酶的DNA分子能與SEQID NO1、SEQ ID NO5和/或SEQ ID NO9雜交，或(ii)由內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的脫氧海普賴氨酸合成酶基因所編碼的RNA序列的相應(yīng)部分，(iii)編碼內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的eIF-5A的DNA分子的一股鏈的相應(yīng)部分，其中，所述編碼內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的eIF-5A的DNA分子能與SEQ IDNO11、SEQ ID NO13和/或SEQ ID NO15雜交，或(iv)由所述內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的eIF-5A基因所編碼的RNA序列的相應(yīng)部分，或(v)(i)或(ii)和(iii)或(iv)的組合；和(B)可操作地連接于所述反義核苷酸序列上的調(diào)控序列，以便表達(dá)所述反義核苷酸；和(2)生長(zhǎng)所述細(xì)胞，以便所述反義核苷酸序列被轉(zhuǎn)錄并且結(jié)合在所述RNA序列上，從而抑制所述衰老誘導(dǎo)的脫氧海普賴氨酸合成酶基因、衰老誘導(dǎo)的eIF-5A基因或這兩者的表達(dá)。
54.如權(quán)利要求53的植物和后代，其中，所述植物是番茄。
55.如權(quán)利要求53的植物和后代，其中，所述植物是顯花植物。
56.一種抑制種子衰老的方法，所述方法包括(1)將一種載體整合到植物基因組中，該載體包括(A)一種反義核苷酸序列，它基本上互補(bǔ)于(i)編碼內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的脫氧海普賴氨酸合成酶的DNA分子的一股鏈的相應(yīng)部分，其中，所述編碼內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的脫氧海普賴氨酸合成酶的DNA分子能與SEQID NO1、SEQ ID NO5和/或SEQ ID NO9雜交，或(ii)由內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的脫氧海普賴氨酸合成酶基因所編碼的DNA分子轉(zhuǎn)錄的RNA序列的相應(yīng)部分；和(B)可操作地連接于所述反義核苷酸序列上的調(diào)控序列；和(2)生長(zhǎng)所述植物，以便所述反義核苷酸序列被轉(zhuǎn)錄并且結(jié)合在所述RNA序列上，從而抑制所述衰老誘導(dǎo)的脫氧海普賴氨酸合成酶基因的表達(dá)。
57.如權(quán)利要求56的方法，還包括在所述植物的基因組中整合一種載體，該載體包括(A)一種反義核苷酸序列，它互補(bǔ)于(i)編碼內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的eIF-5A的DNA分子的一股鏈的相應(yīng)部分，其中，所述編碼內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的eIF-5A的DNA分子能與SEQ ID NO11、SEQ ID NO13和/或SEQ ID NO15雜交，或(ii)由所述內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的eIF-5A基因所編碼的DNA分子轉(zhuǎn)錄的RNA序列的相應(yīng)部分；和(B)可操作地連接于所述反義核苷酸序列上的調(diào)控序列。
58.一種抑制種子衰老的方法，所述方法包括(1)將一種載體整合到植物基因組中，該載體包括(A)一種反義核苷酸序列，它基本上互補(bǔ)于(i)編碼內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的脫氧海普賴氨酸合成酶的DNA分子的一股鏈的相應(yīng)部分，其中，所述編碼內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的脫氧海普賴氨酸合成酶的DNA分子能與SEQID NO1、SEQ ID NO5和/或SEQ ID NO9雜交，或(ii)由內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的脫氧海普賴氨酸合成酶基因所編碼的DNA分子轉(zhuǎn)錄的RNA序列的相應(yīng)部分，(iii)編碼內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的eIF-5A的DNA分子的一股鏈的相應(yīng)部分，其中，所述編碼內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的eIF-5A的DNA分子能與SEQ ID NO11、SEQ ID NO13和/或SEQ ID NO15雜交，或(iv)由所述內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的eIF-5A基因所編碼的DNA分子轉(zhuǎn)錄的基本同源的RNA序列的相應(yīng)部分，或(v)(i)或(ii)和(iii)或(iv)的組合；和(B)可操作地連接于所述反義核苷酸序列上的調(diào)控序列；和(2)生長(zhǎng)所述植物，以便所述反義核苷酸序列被轉(zhuǎn)錄并且結(jié)合在所述RNA序列上，從而抑制所述衰老誘導(dǎo)的脫氧海普賴氨酸合成酶基因、eIF-5A基因或這兩者的表達(dá)。
59.一種提高植物種子產(chǎn)量的方法，所述方法包括(1)將一種載體整合到植物基因組中，該載體包括(A)一種反義核苷酸序列，它基本上互補(bǔ)于(i)編碼內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的脫氧海普賴氨酸合成酶的DNA分子的一股鏈的相應(yīng)部分，其中，所述編碼內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的脫氧海普賴氨酸合成酶的DNA分子能與SEQID NO1、SEQ ID NO5和/或SEQ ID NO9雜交，或(ii)由內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的脫氧海普賴氨酸合成酶基因所編碼的DNA分子轉(zhuǎn)錄的RNA序列的相應(yīng)部分；和(B)可操作地連接于所述反義核苷酸序列上的調(diào)控序列；和(2)生長(zhǎng)所述植物，以便所述反義核苷酸序列被轉(zhuǎn)錄并且結(jié)合在所述RNA序列上，從而抑制所述衰老誘導(dǎo)的脫氧海普賴氨酸合成酶基因的表達(dá)。
60.如權(quán)利要求59的方法，還包括在所述植物的基因組中整合一種載體，該載體包括(A)一種反義核苷酸序列，它互補(bǔ)于(i)編碼內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的eIF-5A的DNA分子的一股鏈的相應(yīng)部分，其中，所述編碼內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的eIF-5A的DNA分子能與SEQ ID NO11、SEQ ID NO13和/或SEQ ID NO15雜交，或(ii)由所述內(nèi)源衰老誘導(dǎo)的eIF-5A基因所編碼的DNA分子轉(zhuǎn)錄的RNA序列的相應(yīng)部分；和(B)可操作地連接于所述反義核苷酸序列上的調(diào)控序列。
全文摘要
通過將編碼衰老誘導(dǎo)的脫氧海普賴氨酸合成酶、衰老誘導(dǎo)的eIF－5A的基因或基因片段或它們二者沿反義方向整合到植物基因組中，實(shí)現(xiàn)了對(duì)植物程序性細(xì)胞死亡的表達(dá)，包括衰老的調(diào)控。鑒定了編碼衰老誘導(dǎo)脫氧海普賴氨酸合成酶和衰老誘導(dǎo)的eIF－5A的植物基因，并將每一種基因的核苷酸序列單獨(dú)和組合用于改變轉(zhuǎn)基因植物的衰老。
文檔編號(hào)C12N7/00GK1402790SQ00812538
公開日2003年3月12日 申請(qǐng)日期2000年7月6日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月6日
發(fā)明者J·E·湯普森, T·-W·王, D·L·盧 申請(qǐng)人:森尼斯科公司