一種干細胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術中細胞培養(yǎng)領域，特別是指一種干細胞的大規(guī)模培養(yǎng)的方法。
【背景技術】
[0002]干細胞(stem cell)是一類具有自我復制能力的多潛能細胞。在一定條件下，它可以分化成多種功能細胞。根據(jù)干細胞所處的發(fā)育階段分為胚胎干細胞和成體干細胞。根據(jù)干細胞的發(fā)育潛能分為三類:全能干細胞(、多能干細胞和單能干細胞。干細胞是一種未充分分化，尚不成熟的細胞，具有再生各種組織器官和人體的潛在功能，醫(yī)學界稱為“萬用細胞。
[0003]為了充分運用到干細胞的各項潛能，從而，干細胞的培養(yǎng)成為一個關鍵，傳統(tǒng)的干細胞培養(yǎng)有多種方式，雖然在實驗室中都能夠較好的達到培養(yǎng)的目的，但當轉(zhuǎn)入到工業(yè)運行后，則出現(xiàn)了許多弊端，一個非常大的問題即是，傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法針對干細胞培養(yǎng)時是貼壁生長的特性，從而培養(yǎng)時，比如滾筒培養(yǎng)，干細胞僅能在滾筒的壁上貼附一層，且這一層還不能太厚，從而極大的制約了干細胞往更大規(guī)模的培養(yǎng)，也就限制了干細胞的大量產(chǎn)出。因此，為了提高干細胞的大規(guī)模培養(yǎng)，需要對培養(yǎng)的方法進行改進。
[0004]水凝膠3D細胞培養(yǎng)是在傳統(tǒng)2D細胞培養(yǎng)的基礎上，以水凝膠(hydrogel)或者固體支架的形式增加一個維度，使細胞像在體內(nèi)一樣生長在三維空間里。3D相對于2D細胞培養(yǎng)的優(yōu)勢非常明顯:更接近細胞的體內(nèi)狀態(tài)；能夠提高細胞因子、抗體及其他生物分子等的產(chǎn)量，細胞在3D環(huán)境中比在2D環(huán)境中生長更健康；在3D細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，干細胞能夠有序分化；實驗數(shù)據(jù)更可靠，如基因表達譜、細胞活動等與體內(nèi)研宄的數(shù)據(jù)更吻合；能夠降低新藥研發(fā)的成本和周期；可以替代一部分動物實驗。而且能夠改進細胞培養(yǎng)效率，使干細胞大規(guī)模培養(yǎng)成為現(xiàn)實。
[0005]為此，市場上已經(jīng)出現(xiàn)有納米纖維支架和多孔支架用于干細胞的3D培養(yǎng)，不過，由于本身納米纖維支架和多孔支架的材質(zhì)的原因，一方面成本較高，另一方面，與細胞的相容性等都尚欠缺。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提出一種干細胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法，能夠?qū)崿F(xiàn)干細胞的大規(guī)模培養(yǎng)，適于干細胞培養(yǎng)的工業(yè)化應用，極具推廣價值。
[0007]一種干細胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法，其特征在于:培養(yǎng)過程中采用了 PNIPAAm (聚N異丙基丙烯酰胺)。
[0008]進一步，所述PNIPAAm在培養(yǎng)過程中作為干細胞生長的載體基質(zhì)。
[0009]進一步，培養(yǎng)過程中，設置不同的溫度梯度，所述PNIPAAm在不同的溫度梯度處于不同的相態(tài)。
[0010]進一步，所述PNIPAAm至少包括固態(tài)和液態(tài)兩種相態(tài)。
[0011]進一步，所述PNIPAAm在37°C時呈牛奶狀凝膠固態(tài)，室溫25°C時是透明水狀溶液液態(tài)。
[0012]進一步，所述PNIPAAm在固態(tài)時作為干細胞生長的支撐基質(zhì)，液態(tài)時用于收集和分咼。
[0013]所述聚N異丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)為溫度敏感型水凝膠，其能夠感知外面環(huán)境微小變化以及具有良好的生物相容性，當環(huán)境溫度高于最低臨界溫度(LCST)時，其體積會突然劇烈收縮，此時其表面是疏水的，細胞可以黏附生長，當細胞長到一定密度后，降低溫度到LCST下，使水凝膠表面親水，這樣細胞就會脫離水凝膠，而不用傳統(tǒng)的酶消化，很好的保持了細胞表面的結構與功能，避免了酶消化細胞的操作繁瑣，大大減少了工作量。
[0014]聚N異丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)的大分子鏈上同時具有親水性的酰氨基和疏水性的異丙基，水溶液具有最低臨界溫度(LCST) 32°C，能夠在37°C交聯(lián)成水凝膠，在常溫下則為線型的水溶液。利用PNIPAAm在LCST附近發(fā)生可逆相轉(zhuǎn)變的特性，可以將PNIPAAm設計成分子開關，結合干細胞培養(yǎng)，用聚N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)的溫度敏感性，使細胞在臨界溫度之上時貼附在材料表面生長，溫度在臨界溫度以下時細胞脫附，改變了傳統(tǒng)的酶解脫附細胞的方法。且細胞在水凝膠三維空間里，細胞生長狀態(tài)良好且狀態(tài)培養(yǎng)效率升尚O
[0015]進一步，培養(yǎng)過程包括以下步驟:
1、干細胞專用培養(yǎng)液培養(yǎng)干細胞。
[0016]稱取一定量的聚N-異丙基丙烯酰胺粉末于15ml離心管中，加入適量的干細胞專用培養(yǎng)液將它溶解。
[0017]2、胰蛋白酶消化:小心吸去舊培養(yǎng)液，用PBS清洗2-3遍，加入適量胰蛋白酶液，37°C消化2-3分鐘，顯微鏡下觀察細胞，細胞胞質(zhì)回縮，不再連接成片，表明細胞消化適度，加入等量的培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)終止消化。用槍將已經(jīng)消化好的細胞吹打成懸液，加入15ml離心管中，離心，棄去上清，加入培養(yǎng)液將細胞吹打均勻，計數(shù)。
[0018]3、將適量干細胞加入已配好的含PNIPAAm的干細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，放在37°C，含有5%C02細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。同時用不含有PNIPAAm培養(yǎng)基培養(yǎng)干細胞作為對照。
[0019]4、24小時后換液。培養(yǎng)皿從培養(yǎng)箱中拿出來放置室溫下5-6分鐘，至水凝膠由牛奶狀態(tài)完全變?yōu)橥该魉疇詈?，將細胞轉(zhuǎn)移到15ml離心管中離心，棄去上清，加入干細胞專用培養(yǎng)液將細胞吹打均勻，后接種于培養(yǎng)皿中，放置37°C含5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0020]本發(fā)明的有益效果為:
1、PNIPAAm生物相容性好，不用酶消化而收獲細胞，避免細胞表面蛋白受到損害。
[0021]2、水凝膠三維培養(yǎng)，增加了細胞生長空間，提高了培養(yǎng)效率。
[0022]3、與傳統(tǒng)的納米纖維支架和多孔支架相比，水凝膠支架交聯(lián)網(wǎng)絡中含有大量水分，可以很好地供給細胞養(yǎng)分，同時還可以交聯(lián)生物活性因子調(diào)節(jié)細胞的生長和分化，因此水凝膠支架可以更好地模擬細胞生長所需的類組織樣物理和空間結構，并且可塑性高、制作工藝相對簡單、臨床應用方便
4、在37 °〇培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)時，由于低于臨界溶解溫度，此時培養(yǎng)皿表面的PNIPAAm處于分子收縮的狀態(tài)，，不影響細胞正常貼壁生長；在25°C左右，由于PNIPAAm分子吸水溶脹，對細胞的吸附力減弱，促使細胞脫落下來。
【具體實施方式】
[0023]下面將結合本發(fā)明的具體實施例，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0024]實施例1、人臍帶間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)儀器:共聚焦顯微鏡
主要試劑:聚N-異丙基丙稀酰胺(PNIPAAm)，從sigma公司購買材料:人臍帶間充質(zhì)干細胞
1、間充質(zhì)干細胞專用培養(yǎng)液培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細胞至80%。
[0025]稱取一定量的聚N-異丙基丙烯酰胺粉末于15ml離心管中，加入適量的間充質(zhì)干細胞專用培養(yǎng)液將它溶解。(一般是1ml的培養(yǎng)液加入2g聚N-異丙基丙烯酰胺，不同細胞略微有差異)
人臍帶間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)液配制:10%FBS+2%L-Glutamine + DMEM-F12+青霉素濃度為100u/ml+鏈霉素溶液濃度為100ug/ml
2、胰蛋白酶消化:小心吸去舊培養(yǎng)液，用PBS清洗2-3遍，加入適量胰蛋白酶液(1cm培養(yǎng)皿加入Iml胰蛋白酶)，37°C消化2-3分鐘，顯微鏡下觀察細胞，細胞胞質(zhì)回縮，不再連接成片，表明細胞消化適度，加入等量的培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)終止消化。用槍將已經(jīng)消化好的細胞吹打成懸液，加入15ml離心管中，轉(zhuǎn)速是1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心4分鐘，棄去上清，加入含有PNIPAAm間充質(zhì)干細胞專用培養(yǎng)液將細胞吹打均勻，計數(shù)。
[0026]3、6孔板培養(yǎng)皿中加入3ml已配好的間充質(zhì)干細胞專用培養(yǎng)液(含PNIPAAm)，細胞數(shù)量在1-5X 105/ml，放置37°C含5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。同時用不含有PNIPAAm間充質(zhì)干細胞專用培養(yǎng)液培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞作為對照。
[0027]4、24小時后用預熱的培養(yǎng)液換液。6孔板培養(yǎng)皿從培養(yǎng)箱中拿出來放置室溫下5-6分鐘，至水凝膠由牛奶狀態(tài)完全變?yōu)橥该魉疇詈螅瑢⒓毎D(zhuǎn)移到15ml離心管中離心，轉(zhuǎn)速是1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心4分鐘，棄去上清，加入Iml間充質(zhì)干細胞專用培養(yǎng)液將細胞吹打均勻，人臍帶間充質(zhì)干細胞接種于6孔板培養(yǎng)皿中，加入3ml已配好的間充質(zhì)干細胞專用培養(yǎng)液(含PNIPAAm)，放置37°C含5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0028]5、五天后細胞計數(shù)觀察，發(fā)現(xiàn)加了 PNIPAAm的細胞數(shù)量是不加PNIPAAm細胞數(shù)量的將近2倍。
[0029]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權項】
1.一種干細胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法，其特征在于:培養(yǎng)過程中采用了 PNIPAAm。2.如權利要求1中所述干細胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法，其特征在于:所述PNIPAAm在培養(yǎng)過程中作為干細胞生長的載體基質(zhì)。3.如權利要求1或2中所述干細胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法:其特征在于:培養(yǎng)過程中，設置不同的溫度梯度，所述PNIPAAm在不同的溫度梯度處于不同的相態(tài)。4.如權利要求3中所述干細胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法，其特征在于:所述PNIPAAm至少包括固態(tài)和液態(tài)兩種相態(tài)。5.如權利要求3中所述干細胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法，其特征在于:所述PNIPAAm在37°C時呈固態(tài)，室溫25 °C時是液態(tài)。6.如權利要求4或5中所述干細胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法，其特征在于:所述PNIPAAm在固態(tài)時作為干細胞生長的支撐基質(zhì)，液態(tài)時用于收集和分離。7.如權利要求6中所述干細胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法，其特征在于，包括以下步驟: a、干細胞專用培養(yǎng)液培養(yǎng)干細胞； b、胰蛋白酶消化: c、將適量干細胞加入已配好的含PNIPAAm的培養(yǎng)液培養(yǎng)。8.如權利要求6中所述干細胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法，其特征在于:步驟c中，培養(yǎng)的環(huán)境溫度為37°C，并在含有5%C02細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24小時后換液。
【專利摘要】一種干細胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法，培養(yǎng)過程中采用了PNIPAAm，聚N異丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)的大分子鏈上同時具有親水性的酰氨基和疏水性的異丙基，水溶液具有最低臨界溫度(LCST)32℃，能夠在37℃交聯(lián)成水凝膠，在常溫下則為線型的水溶液。利用PNIPAAm在LCST附近發(fā)生可逆相轉(zhuǎn)變的特性，可以將PNIPAAm設計成分子開關，結合干細胞培養(yǎng)，用聚N-異丙基丙烯酰胺（PNIPAAm）的溫度敏感性，使細胞在臨界溫度之上時貼附在材料表面生長，溫度在臨界溫度以下時細胞脫附，改變了傳統(tǒng)的酶解脫附細胞的方法，且細胞在水凝膠三維空間里，細胞生長狀態(tài)良好且狀態(tài)培養(yǎng)效率升高。
【IPC分類】C12N5/0775, C12N5/0735, C12N5/074
【公開號】CN104894063
【申請?zhí)枴緾N201510274892
【發(fā)明人】曾令文, 梅婷, 王斗, 王琳
【申請人】中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院
【公開日】2015年9月9日
【申請日】2015年5月27日