專利名稱：：定向進(jìn)化構(gòu)建的耐熱型肌氨酸氧化酶及其基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及到一個(gè)耐熱型肌氨酸氧化酶及基因；該酶可以應(yīng)用于臨床測定肌酐。
背景技術(shù)：
：肌酐是人體代謝的一種重要產(chǎn)物，它主要是由機(jī)體通過腎臟的過濾從血液進(jìn)入尿液而排出體外，健康腎臟的這一功能可保證將代謝過程中形成的肌酐不斷地排出體外，而使血液中的肌酐始終保持在一個(gè)較低的水平。如果腎臟發(fā)生病變，將不能有效地清除所形成的肌酐，造成肌酐在血液中積累。因此血液和尿液的肌酐含量可反映腎臟的排泄功能，在臨床測定中，血清中的肌酐濃度是一項(xiàng)判斷腎功能的重要指標(biāo)。目前肌酐的測定方法主要有化學(xué)方法、酶促方法以及建立在酶促反應(yīng)基礎(chǔ)上的電氣化學(xué)方法?；瘜W(xué)測定法由于其固有的缺陷，正在被發(fā)展起來的酶促方法所代替。而在各種酶促肌酐測定方法中，以肌酐水解酶、肌酸水解酶、肌氨酸氧化酶酶促催化反應(yīng)為基礎(chǔ)的測定方法日漸成熟并得到廣泛使用。該方法是通過肌酐水解酶(creatinineamidohydrolaseorcreatininaseEC3.5.2.10，簡稱Crn)、肌酸7JC解酶(creatineamidinohydrolaseorcreatinaseEC3.5.3.3，簡稱Cre)、肌氨酸氧化酶(sarcosineoxidaseEC1.5.3.1，簡稱S0X)或肌氨酸脫氫酶(sarcosinedehydrogenaseEC1.5.9.9)降解肌酐，測定其代謝產(chǎn)物&02或甲醛的酶法測定系統(tǒng)。其原理是肌酐+H20<肌畫鵬〉肌酸肌酸+H20〉尿素+肌氨酸肌氨酸+1￥)+02肌執(zhí)酸氧化喊脫氧酶〉甘氨酸+甲醛+HA此法具有酶反應(yīng)的專一性強(qiáng)和靈敏度高等特點(diǎn)，肌氨酸氧化酶是測定過程中的關(guān)鍵酶之一，其質(zhì)量的好壞直接影響到測定結(jié)果的的可靠性。肌氨酸氧化酶(sarcosineoxidaseEC1.5.3.1，簡稱SOX)是肌酐降解酶系中研究相對較多的一個(gè)酶。許多研究者已經(jīng)從多種微生物如真菌、放線菌、細(xì)菌中分離得到SOX，對其理化性質(zhì)和分子生物學(xué)方面也做了較多的研究。根據(jù)SOX的亞基數(shù)可分為單聚體和多聚體肌氨酸氧化酶。不同來源的肌氨酸氧化酶其性質(zhì)有較大差異，現(xiàn)將SOX的性質(zhì)總結(jié)于表l。如表l所示，不同來源的SOX在pH穩(wěn)定性方面沒有很大差異，但熱穩(wěn)定性方面則有較大差異，單亞基的整體上優(yōu)于多亞基的SOX。其中熱穩(wěn)定最高的肌氨酸氧化酶由及sp.NS-129等菌株產(chǎn)生，為55'C。表l、不同來源肌酸氧化酶的酶學(xué)性質(zhì)<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>注表l中的"一"表示未知。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種熱穩(wěn)定性高的肌氨酸氧化酶。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一個(gè)由芽孢桿菌基因sox改造成的蛋白質(zhì)，其具有SEQIDNO:1SEQIDNO:5其中任意一個(gè)所示的氨基酸序列。作為本發(fā)明的芽孢桿菌基因sox編碼的蛋白質(zhì)的改進(jìn)其氨基酸序列還包括在SEQIDNO:1SEQIDNO:5其中任意一個(gè)所示的氨基酸序列中添加、取代、插入和缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸所生成的衍生物。本發(fā)明還同時(shí)提供了一種編碼上述蛋白質(zhì)的基因，該基因具有SEQIDNO:6SEQID.NO:IO其中任意一個(gè)所示的核苷酸序列。作為本發(fā)明的基因的改進(jìn)其核苷酸序列還包括在SEQIDNO:6SEQIDNO:10其中任意一個(gè)所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸所生成的突變體、等位基因和衍生物。本發(fā)明還同時(shí)提供了一種肌氨酸氧化酶，其為包含上述核酸的轉(zhuǎn)基因生物細(xì)胞。本發(fā)明是針對以肌氨酸氧化酶、肌酸水解酶及肌酐水解酶組成的測定體系進(jìn)行酶促肌酐測定方法所作的改進(jìn)。發(fā)明人利用了現(xiàn)有的一株產(chǎn)肌氨酸氧化酶的芽孢桿菌BSD-8(5fld//^sp.BSD-8)，對該肌氨酸氧化酶的基因(其核苷酸序列如SEQIDNO:12所示，編碼的蛋白質(zhì)具有SEQIDNO:ll所示的氨基酸序列)進(jìn)行了改造，從而使所得的酶的熱穩(wěn)定性進(jìn)一步提高。發(fā)明人利用了定向進(jìn)化這種近二十年發(fā)展起來的蛋白質(zhì)改造新技術(shù)，該技術(shù)可以在試管中使蛋白質(zhì)分子朝著預(yù)定的方向進(jìn)化，是改善酶性能最有效的途徑之一，己被用于許多酶性能的改善，其中蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性改善是定向進(jìn)化試驗(yàn)的一個(gè)重要目標(biāo)。本發(fā)明首先運(yùn)用易錯(cuò)PCR方法構(gòu)建肌氨酸氧化酶的突變基因文庫，對該基因進(jìn)行定向進(jìn)化，獲得多個(gè)不同的熱穩(wěn)定性顯著提高的突變體。之后通過定點(diǎn)突變的方法對突變體合并以獲得熱穩(wěn)定性進(jìn)一步提高的肌氨酸氧化酶。采用本發(fā)明方法所獲得的突變酶soxM2有三個(gè)氨基酸被替換，熱穩(wěn)定性比原S^"/msp.BSD-8所產(chǎn)生的野生酶高5°C(由6(TC提高到65°C),是目前已知的熱穩(wěn)定性最高的肌氨酸氧化酶。下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)說明。圖1是定向進(jìn)化構(gòu)建肌氨酸氧化酶突變文庫的策略圖。圖2是突變菌株S0X熱穩(wěn)定性CK:野生SOX的對比圖中CK為野生酶；A-1，A-2，A-3，B-l，B-2為單點(diǎn)突變后的酶；A為A-1、A-2及A-3復(fù)合突變酶；B為B-l及B-2復(fù)合突變酶。圖3是組合突變菌株S0X熱穩(wěn)定性CK:野生SOX的對比圖中CK為野生酶；A-2，B-l，C為單點(diǎn)突變后的酶；B-l+C為B-l及C復(fù)合突變酶；B-1+C+A-2為B-1，C及A-2復(fù)合突變酶。圖4是溫度對SOxM2穩(wěn)定性的影響圖中A對應(yīng)的是10min，畫對應(yīng)的是30min。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、易錯(cuò)PCR建立突變文庫及突變基因的篩選易錯(cuò)PCR是在標(biāo)準(zhǔn)PCR條件的基礎(chǔ)上進(jìn)行以下修改以增加突變率(1)MgCl2濃度增加到7mM以穩(wěn)定非互補(bǔ)的堿基對；(2)加入0.05-0.5mMMnCl2以降低聚合酶對模板的特異性；(3)dCTP和dTTP的濃度增加到lmM以促進(jìn)錯(cuò)誤滲入；(4)DNA聚合酶量增加到5U以促進(jìn)延伸鏈在堿基錯(cuò)配位置后得以繼續(xù)；(5)PCR擴(kuò)增時(shí)不需要進(jìn)行熱啟動，循環(huán)結(jié)束也不要延長延伸時(shí)間。事實(shí)上反應(yīng)體系中的Mn"濃度高低與DNA聚合酶保真性能直接相關(guān)?？梢酝ㄟ^調(diào)節(jié)Mn2+濃度來控制反應(yīng)體系的突變頻率。經(jīng)過設(shè)置Mn2+濃度梯度，最終確定Mn2+濃度為0.lmM，突變頻率大約為每1Kb突變1-3個(gè)堿基。艮口，易錯(cuò)PCR條件具體如下反應(yīng)體系組成為(50uL體系)10Xbuffer(不含Mg20Mg2+(25mM)Mn2+(5mM)dCTPaOraM)dTTP(lOmM)dATP(10mM)dGTP(10mM)上游引物(20uM)下游引物(20uM)模板Taq酶MiniQ水5.0"14.OuL5.OuL5.OuLl.OnLl.OliL2.OuL2.0uL2.5ng1"124反應(yīng)程序94'C預(yù)變性3min94。C變性30sec、56。C退火lmin30個(gè)循環(huán)72。C延伸70sec」72。C延伸10min其中所用模板SEQIDNO:12所示的DNA片段，所用引物為上游引物5'GACTAGTTGGGTACCAATGAGCACGCATTTTGATG3'下游引物5'GAGAAGAGCTCCACGTACTTATTTTGCTGCT3'經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，易錯(cuò)PCR體系中PCR擴(kuò)增效率低于標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)。上述易錯(cuò)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收以后，用限制性內(nèi)切酶原wl、5scl進(jìn)行雙酶切，37'C酶切4h，與同樣酶切的載體pBluscriptKS(+)11連接，16。C過夜，轉(zhuǎn)化coh'DH-5a,轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂至含24ug/mLIPTG、40iig/mLX-gal、100ug/mLAmp的LB平板上，構(gòu)建一系列的帶有突變的肌氨酸氧化酶基因片段的重組質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化fcoh'DH-5a后，載體因含有藍(lán)白斑篩選標(biāo)記，陽性克隆子顯白色，陰性為藍(lán)色，因此易于挑選；無需加誘導(dǎo)物IPTG，非誘導(dǎo)條件下就有較高的本底表達(dá)。節(jié)省了大量的工作量。經(jīng)過烘箱65"C30min熱處理，96孔板酶熱穩(wěn)定性篩選后，將還有酶活的菌株的拷貝劃線分離，超聲波破壁，水浴65°C30min后，用標(biāo)準(zhǔn)測酶活方法測其剩余酶活，在挑選了約11000個(gè)菌落后，最終挑選了三株熱穩(wěn)定性提高的突變菌株，分別命名為A、B、C。經(jīng)測序，突變菌株酶基因中的堿基替換及推導(dǎo)出的氨基酸替換結(jié)果如表2所示。表2、熱穩(wěn)定性突變菌株的堿基替換及推導(dǎo)出的氨基酸替換結(jié)果突變株堿基替換氨基酸替換AA221G(A-1)、T1003C(A-2)、A1145G(A-3)Y74C、S335P、K382RBT928C(B-1)、G1108T(B-2)F310L、D370NCA971GE324G實(shí)施例2、SOX基因的定點(diǎn)突變經(jīng)過易錯(cuò)PCR建立突變文庫，篩選到的三株突變菌株A、B、C，其中菌株C只有一個(gè)氨基酸發(fā)生改變，因此SOX基因的C位點(diǎn)與酶熱穩(wěn)定性直接相關(guān)。然而菌株A、B的SOX基因中不止一個(gè)氨基酸發(fā)生了改變，為了確認(rèn)是具體某一個(gè)還是幾個(gè)氨基酸的改變導(dǎo)致的突變菌株SOX熱穩(wěn)定性提高，對突變株A、B酶基因的單個(gè)位點(diǎn)A-1、A-2、A-3、B-1、B-2分別進(jìn)行了定點(diǎn)突變(定點(diǎn)突變可以利用市售的試劑盒進(jìn)行)。單個(gè)位點(diǎn)突變后的菌株依次命名為A-1、A-2、A-3、B-1、B-2，對其S0X進(jìn)行熱穩(wěn)定性驗(yàn)證菌株劃線分離，轉(zhuǎn)接液體培養(yǎng)基37'C培養(yǎng)過夜，收集菌體用超聲波破壁，離心15min，用標(biāo)準(zhǔn)方法測其酶活。然后取一定量的上清酶液進(jìn)行熱處理，分別64。C、65。C水浴30min后，測其剩余酶活，結(jié)果如圖2。由圖2可以看出菌株A-2、B-1的酶熱穩(wěn)定性較好于野生的，由此可以推測突變菌株A的A-2位點(diǎn)、菌株B的B-1位點(diǎn)與酶的熱穩(wěn)定性提高直接相關(guān)。因此決定以野生酶基因?yàn)槟０?，將S0X氨基酸序列的A-2位點(diǎn)、B-1位點(diǎn)以及C位點(diǎn)通過定點(diǎn)突變的方式聚合在一起。因?yàn)锽-1、C位點(diǎn)酶熱穩(wěn)定性的影響比較顯著，因此首先將其整合在一起，整合后的突變SOX命名為soxMl,然后再將A-2位點(diǎn)整合到一起，整合后的突變S0X命名為soxM2，進(jìn)行熱穩(wěn)定性試驗(yàn)，分別64°C、65'C水浴30min后，結(jié)果如圖3所示。由圖3顯而易見突變位點(diǎn)整和一起而得到的突變酶soxMl、soxM2熱穩(wěn)定性比單個(gè)突變位點(diǎn)的突變酶熱穩(wěn)定性顯著增加。實(shí)施例3、構(gòu)建pET-soxM2表達(dá)載體及突變酶的熱穩(wěn)定性為了研究其純酶的確切熱穩(wěn)定性情況，將含有三個(gè)有效突變位點(diǎn)的S0X基因(即soxM2基因)插入表達(dá)載體pET15b，構(gòu)建pET-soxM2表達(dá)載體，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)，進(jìn)行Ni-IDA層析柱一步純化后，得到純酶soxM2。在pH8.0焦磷酸鹽緩沖液中不同溫度分別處理10min、30min后，測定突變酶soxM2的活力，結(jié)果如圖4所示。該酶在65'C處理10min還可保留80y。以上的酶活力，比野生酶的熱穩(wěn)定性提高了5'C。實(shí)施例4、以實(shí)施例1及3等同的方法進(jìn)行定點(diǎn)突變，構(gòu)建pET-A-2表達(dá)載體，并進(jìn)行A-2突變酶的表達(dá)。表達(dá)后的酶于pH8.0焦磷酸鹽緩沖液中在64度及65度分別處理30min后，測定剩余酶活結(jié)果如圖3所示，其剩余酶活是原酶的2.3及4倍。實(shí)施例5、以實(shí)施例1及3等同的方法進(jìn)行定點(diǎn)突變，構(gòu)建pET-B-l表達(dá)載體，并進(jìn)行B-1突變酶的表達(dá)。表達(dá)后的酶于pH8.0焦磷酸鹽緩沖液中在64度及65度分別處理30min后，測定剩余酶活結(jié)果如圖3所示，其剩余酶活是原酶的6.5及3.3倍。實(shí)施例6、以實(shí)施例1及3等同的方法進(jìn)行定點(diǎn)突變，構(gòu)建pET-C表達(dá)載體，并進(jìn)行C突變酶的表達(dá)。表達(dá)后的酶于pH8.0焦磷酸鹽緩沖液中在64度及65度分別處理30min后，測定剩余酶活結(jié)果如圖3所示，其剩余酶活是原酶的4.5及1.4倍。實(shí)施例7、以實(shí)施例1及3等同的方法進(jìn)行定點(diǎn)突變，構(gòu)建pET-Bl+C表達(dá)載體，并進(jìn)行該突變酶的表達(dá)。表達(dá)后的酶于pH8.0焦磷酸鹽緩沖液中在64度及65度分別處理30min后，測定剩余酶活結(jié)果如圖3所示，其剩余酶活是原酶的13及17倍。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。GlyAlaGlySerMet15序列表SEQIDNO:1突變酶A-2的氨基酸序列MetSerThrHisPheAspVallieValVal510GlyMetAlaAlaGlyTyrTyrLeuAlaLysGinGlyValLysThr202530LeuLeuValAspSerPheAspProProHisThrAsnGlySerHis354045HisGlyAspThrArglielieArgHisAlaTyrGlyGluGlyArg505560GluTyrValProPheAlaLeuArgAlaGinGluLeuTrpTyrGlu657075LeuGluLysGluThrHisHisLysliePheThrGinThrGlyVal808590LeuValPheGlyAlaLysGlyGluSerAspPheValAlaGluThr95100105MetGluAlaAlaLyslieHisSerLeuGluHisGluLeuPheGlu110115120GlyLysGinLeuThrGluArgTrpAlaGly125130AsnTyrGluAlaliePheGluProAsnSer140145GluAsnCyslieGinAlaTyrArgGluLeu155160AlaLysValLeuThrTyrAlaProValGlu170175ValGluValProGlu135GlyValLeuPheSer150AlaGluAlaHisGly165AspPheGluValSer180GluAspLeuValCyslieGinThrAlaLysGlyLeuTyrThrAla185190195AsnLysLeulieValSerMetGlyAlaTrpAsnSerLysLeuLeu200205210SerLysLeuGlyValGlulieProleuGinProTyrArgGinVal215220225VslAhTyrPheGluCysAsnGluGluLysTyrSerAsnAsnVal230235240HisTyrProAlaPheMetValGluValAlaAsnGlylieTyrTyr245250255GlyPheProSerPheGlyGlySerGlyLeuLyslieGlyTyrHis260265270ThrTyrGlyGinGlulieAspProAspThrlieSanArgGluPhe275280285GlyAlaTyrProGluAspGluAlaAsnLeuArgLysPheLeuGlu290295300LysTyrMetProGluAlaAsnGlyGluPheLysLysGlyAlaVal310315CysMetTyrThrLysThrproAspGluHisPheVallieAspLeu320325330HisProLysTyrProAsnValVallieGlyAlaGlyPheSerGly335340345HisGlyPheLysPheSerSerAlaValGlyGluThrLeuAlaGin350355360LeuAlaValThrGlyLysThrGluHisAsplieSerliePheSer365370375LeuAsnArgAspAlaLeuLysLysGluAlaLys380385GlyAlaGlySerMet15SEQIDNO:2突變酶B-l的氨基酸序列MetSerThrHisPheAspVallieValVal510GlyMetAlaAlaGlyTyrTyrLeuAlaLysGinGlyValLysThr202530LeuLeuValAspSerPheAspProProHisThrAsnGlySerHis354045HisGlyAspThrArglielieArgHisMaTyrGlyGluGlyArg505560GluTyrValProPheAlaLeuArgAlaGinGluLeuTrpTyrGlu657075LeuGluLysGluThrHisHisLysliePheThrGinThrGlyVal808590LeuValPheGlyAlaLysGlyGluSerAspPheValAlaGluThr95100105MetGluAlaAlaLyslieHisSerLeuGluHisGluLeuPheGlu110115120GlyLysGinLeuThrGluArgTrpAlaGly125130AsnTyrGluAlaliePheGluProAsnSer140145GluAsnCyslieGinAlaTyrArgGluLeu155160AlaLysValLeuThrTyrAlaProValGluValGluValProGlu135GlyValLeuPheSer150AlaGluAlaHisGly165AspPheGluValSer<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>LeuAsnArgAspAlaLeuLysLysGluAlaLys380385SEQIDNO:3突變酶C的氨基酸序列MetSerThrHisPheAspVallieValValGlyAlaGlySerMet51015GlyMetAlaAlaGlyTyrTyrLeuAlaLysGinGlyValLysThr202530LeuLeuValAspSerPheAspProProHisThrAsnGlySerHis354045HisGlyAspThrArglielieArgHisAlaTyrGlyGluGlyArg505560GluTyrValProPheAlaLeuArgAlaGinGluLeuTrpTyrGlu657075LeuGluLysGluThrHisHisLysliePheThrGinThrGlyVal808590LeuValPheGlyAlaLysGlyGluSerAspPheValAlaGluThr95100105MetGluAlaAlaLyslieHisSerLeuGluHisGluLeuPheGlu110115120GlyLysGinLeuThrGluArgTrpAlaGlyValGluValProGlu125130135AsnTyrGluAlaliePheGluProAsnSerGlyValLeuPheSer140145150GluAsnCyslieGinAlaTyrArgGluLeuAlaGluAlaHisGly155160165AlaLysValLeuThrTyrAlaProValGluAspPheGluValSer170175180GluAspLeuValLyslieGinThrAlaLysGlyLeuTyrThrAla185190195AsnLysLeulieValSerMetGlyAlaTrpAsnSerLysLeuLeu200205210SerLysLeuGlyValGlulieProleuGinProTyrArgGinVal215220225ValAlaTyrPheGluCysAsnGluGluLysTyrSerAsnAsnVal230235240HisTyrProAlaPheMetValGluValAlaAsnGlylieTyrTyr245250255GlyPheProSerPheGlyGlySerGlyLeuLyslieGlyTyrHis260265270ThrTyrGlyGinGlulieAspProAspThrlieSanArgGluPhe275280285GlyAlaTyrProGluAspGluAlaAsnLeuArgLysPheLeuGlu290295300LysTyrMetProGluAlaAsnGlyGluPheLysLysGlyAlaVal305310315CysMetTyrThrLysThrproAspGlyHisPheVallieAspLeu320325330HisProLysTyrSerAsnValVallieGlyAlaGlyPheSerGly335340345HisGlyPheLysPheSerSerAlaValGlyGluThrLeuAlaGin350355360LeuAlaValThrGlyLysThrGluHisAsplieSerliePheSer365370375LeuAsnArgAspAlaLeuLysLysGluAlaLys380385SEQIDNO:4SoxMl(突變位點(diǎn)B-1及C)的氨基酸序列MetSerThrHisPheAspVallieValVal510GlyMetAlaAlaGlyTyrTyrUuAlaLys2025LeuLeuValAspSerPheAspProProHis3540HisGlyAspThrArglielieArgHisAla5055GluTyrValProPheAlaLeuArgAlaGin6570LeuGluLysGluThrHisHisLysliePhe8085AlaLysGlyGluSerAsp95100LyslieHisSerLeuGlu110115ThrGluArgTrpAlaGly125130liePheGluProAsnSer140145GinAlaTyrArgGluLeu155160LeuValPheGlyMetGluAlaAlaGlyLysGinLeuAsnTyrGluAlaGluAsnCyslieGlyAlaGlySerMet15GinGlyValLysThr30ThrAsnGlySerHis45TyrGlyGluGlyArg60GluLeuTrpTyrGlu75ThrGinThrGlyVal90PheValAlaGluThr105HisGluLeuPheGlu120ValGluValProGlu135GlyValLeuPheSer150AlaGluAlaHisGly165AlaLysValLeuThrTyrAlaProValGluAspPheGluValSer170175180GluAspLeuValLyslieGinThrAlaLysGlyLeuTyrThrAla185190195AsnLysLeulieValSerMetGlyAlaTrpAsnSerLysLeuLeu200205210SerLysLeuGlyValGlulieProleuGinProTyrArgGinVal215220225ValAlaTyrPheGluCysAsnGluGluLysTyrSerAsnAsnVal230235240HisTyrProAlaPheMetValGluValAlaAsnGlylieTyrTyr245250255GlyPheProSerPheGlyGlySerGlyLeuLyslieGlyTyrHis260265270ThrTyrGlyGinGlulieAspProAspThrlieSanArgGluPhe275280285GlyAlaTyrProGluAspGluAlaAsnLeuArgLysPheLeuGlu290295300LysTyrMetProGluAlaAsnGlyGluLeuLysLysGlyAlaVal305310315CysMetTyrThrLysThrproAspGlyHisPheVallieAspLeu320325330HisProLysTyrSerAsnValVallieGlyAlaGlyPheSerGly335340345HisGlyPheLysPheSerSerAlaValGlyGluThrLeuAlaGin350355360LeuAlaValThrGlyLysThrGluHisAsplieSerliePheSer365370375LeuAsnArgAspAlaLeuLysLysGluAlaLys380385SEQIDNO:5soxM2(突變位點(diǎn)B-1、C及A-2)的氨基酸序列MetSerThrHisPheAspVallieValValGlyAlaGlySerMet51015GlyMetAlaAlaGlyTyrTyrLeuAlaLysGinGlyVal!>ysThr202530LeuLeuValAspSerPheAspProProHisThrAsnGlySerHis354045HisGlyAspThrArglielieArgHisAlaTyrGlyGluGlyArg505560GluTyrValProPheAlaLeuArgAlaGinGluLeuTrpTyrGlu657075LeuGluLysGluThrHisHisLysliePheThrGinThrGlyVal808590LeuValPheGlyAlaLysGlyGluSerAspPheValAlaGluThr95100105MetGluAlaAlaLyslieHisSerLeuGluHisGluLeuPheGlu110115120GlyLysGinLeuThrGluArgTrpAlaGlyValGluValProGlu125130135AsnTyrGluAlaliePheGluProAsnSerGlyValLeuPheSer140145150GluAsnCyslieGinAlaTyrArgGluLeuAlaGluAlaHisGly155160165AlaLysValLeuThrTyrAlaProValGluAspPheGluValSer170175180GluAspLeuValLyslieGinThrAlaLysGlyLeuTyrThrAla185190195AsnLysLeulieValSerMetGlyAlaTrpAsnSerLysLeuLeu200205210SerLysLeuGlyValGlulieProleuGinProTyrArgGinVal215220225ValAlaTyrPheGluCysAsnGluGluLysTyrSerAsnAsnVal230235240HisTyrProAlaPheMetValGluValAlaAsnGlylieTyrTyr245250255GlyPheProSerPheGlyGlySerGlyLeuLyslieGlyTyrHis260265270ThrTyrGlyGinGlulieAspProAspThrlieSanArgGluPhe275280285GlyAlaTyrProGluAspGluAlaAsnLeuArgLysPheLeuGlu290295300LysTyrMetProGluAlaAsnGlyGluLeuLysLysGlyAlaVal305310315CysMetTyrThrLysThrproAspGlyHisPheVallieAspLeu320325330HisProLysTyrProAsnValVallieGlyAlaGlyPheSerGly335340345HisGlyPheLysPheSerSerAlaValGlyGluThrLeuAlaGin35035536019LeuAlaValThrGlyLysThrGluHisAsplieSerliePheSer365370375LeuAsnArgAspAlaLeuLysLysGluAlaLysSEQIDNO:6突變酶A-2的DNA序列3tg3gC3CgC3ttttg3tgt犯ttgt3gttggtgCtgg3tC33tgggg3tggC3gC3gg360tattatttagctaagc犯ggcgttaaaacattattagtggactcatttgatccgccgcat120acaaacggaagccatcatggagatactcgcattatccgtcatgcttatggtg犯ggaaga180gagtatgtgccgtttgcattaagagcacaagaattatggtatgaactagagaaagaaaca240caccata犯atttttacacaaacaggagtattagtatttggggctaaaggggaatcggat300ttcgttgcagagacgatggaggctgcaaag已ttcactctttagaacatgaactgtttgaa360ggc33gc朋tt朋ctg犯cgctgggctggggtsg朋gttcctg朋朋tt3tg33gc犯tt420ttcgagccgaactcaggcgtgttattcagtgaaaattgtatccaagcatatcgtgaatta480gctgaagcacatggtgctaaagttttaacat已tgcaccagttgBggattttgaggtttct540gaagacttggtgaaaatccaaacagctaaaggtttatettsictgcaaat犯attaattgta600agtatgggagcctgg犯cagcaaacttctttct犯attgggtgttgagattccatteicag660ccatatcgtcaggttgtagcatactttgaatgcaatgaggaaaaatatagcaataatgtt720cactatcctgcatttatggtcgaagttgcsaatggtatttactacggattcccgagcttt780ggcggaagcggattgaaaataggttaccatacttacggtcaggaaattgacccagataca840attaaccgtgagtttggagcatatccagaagacgaagcaaatcttcgtaaatttttagaa900aaatacatgccagaggcaaatggagagtttaaaaaaggcgcagtctgcatgtacacaaaa960acgccagatgagcattttgtaattgatttacatccaaagtacgctaatgttgtcattgga1020gctggcttctctggacatgggtttaaattctcaagtgcagttggtgaaactttagcgcaa1080ttagctgtaactggtaagacagaacatgatatttccattttctcacttaaccgtgatgcg1140tt朋aaa朋gaagcagcaaa3taa1164SEQIDNO:7突變酶B-1的DNA序列atgagcacgcattttgatgtaattgtagttggtgctggatcaatggggatggcagcagga60tattatttagctaagcaaggttattagtggactcatttgatccgccgcat120ac犯acgg犯gccatcatggagatactcgcattatccgtcatgcttatggtgaagga卿180gagtatgtgccgtttgcattaag8gc3caagasttatggtga犯gaaaca240tttttac3catt3gt3tttggggCt犯3gggg犯tCgg3t300ttCgttgC3g卿cgatggsggCtgC犯Elgattcactctttagaac已tgaactgtttgaa360ggcaagcaattaactgaacgctgggctgggg"tagaagttc420ttcgagccgaactcaggcgtgttattcagtg33aattgt3tccaagcatatcgtgaatta■gctgaagcscatggtgctaatatgcaccagttgaggattttgaggtttct540g犯gacttggtg￡L￡taatCC￡LggtttatatactgcaaEitaa600agtetgg卵gcctgg犯cagcaaacttctttct朋3ttgggtgttg柳ttccattacag660ccatatcgtc鄉(xiāng)ttgtagcatactttgaatgc犯tg鄉(xiāng)caataatgtt720cactatxctgcatttatggtcgaagttgcsactacggattcccgagcttt780ggcgg犯gcgg已ttgaa犯taggttaccatacttacggtccccagataca840attaaccgtgagtttggagcgacgELagcaaatcttcgtaaatttttsg犯■aaatacatgccaLgaggc犯3tggag鄉(xiāng)tt犯a犯aggcgcagtctgcat960agcattttgtcstcca^igtactctaatgttgtcattgga1020gctggcttctctggeic3tgggttt己朋ttctcaagtgcagttggtg朋3Cttt3gcgc犯1080ttagctgtaactggtaagacag犯catgatatttccattttctcacttgiELccgtgatgcg1140tta犯犯a^gat犯1164SEQIDNO:8突變酶C的DNA序列atgagcacgcattttgatgtaattgtagttggtgct哪tCELBtggggSLtggCELgC鄉(xiāng)2L60tatt3tttagctaagceiaggtt已ttagtggsctxatttgatccgccgcat120gccatC3tggag3tactcgcattatccgtc3tgcttatgg180gagtatgtgccgtttgcatt犯gsgcac3ag犯ttatggt240tttttacacattagtatttggggctaaaggggaatcggat300ttcgttgceig卿cgatggaggctgcaaagattC8ictct"tactgtttgaa360ggcaagcaattaactgaacgctgggctggggtag犯gttcCtg犯犯tt3tgaagcaatt420ttcgagccgaactcaggcgtgttattcagttccaagcatatcgtgaatta480gCtg犯gC3Catggtgctaaagttttaacatstgcaccagttgaggattttgaggtttct540g3卿Cttggggttt3t3t3600agtatgggagcctgg犯cagcaaacttctttctaaattgggtgttg卿ttccattac3g660ccatatcgtcaggttgtagcatactttgaLatgcaatgaggcaeLtaatgtt720cactatcc"tgcatttatggtcgaagttgcaaatggtatttactacggattcccgagcttt780ggcgg犯gcggsttgaa^taggttaccatacttacggtc840attaaccgtgagtttggagc8t6Ltccagaag￡LCga_agc33atcttcgtaa3ttttt3g^900aaatacatgctgg卿gttta犯aa3ggcgcagtctgcat9603CgCC3g3tgggC3ttttgtC3tCC犯3gt3Ctct犯tgttgtC3ttgg31020gctggcttctctggacatgggttta^3ttctcaagtgcagttggtg^acttteigcgcaa1080ttagctgtaactggtaagacccgtgett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