基于耐熱核酸酶hii的單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明提出了一種基于耐熱核酸酶HII的單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)方法，使用耐熱核酸酶HII切斷帶有核糖核苷酸的分子信標(biāo)，將熒光信號(hào)積累下來(lái)，檢測(cè)雙鏈DNA；其中，所述帶有核糖核苷酸的分子信標(biāo)為中間帶有一個(gè)核糖核酸，兩側(cè)的核苷酸彼此配對(duì)，兩側(cè)分別用熒光發(fā)射基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)標(biāo)記，整個(gè)分子信標(biāo)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，無(wú)熒光釋放出來(lái)。本發(fā)明的檢測(cè)方法可以檢測(cè)雙鏈核酸并放大檢測(cè)信號(hào)，靈敏度較高。
【專利說(shuō)明】基于耐熱核酸酶HI I的單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是指一種基于耐熱核酸酶HII的單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]核酸檢測(cè)和SNP分析已經(jīng)是一個(gè)很大的產(chǎn)業(yè)。這些技術(shù)不僅在科學(xué)研究上獲得廣泛的應(yīng)用，在臨床診斷、食品檢測(cè)、法醫(yī)鑒定等領(lǐng)域的重要性也越來(lái)越明顯?，F(xiàn)今的核酸檢測(cè)和SNP分析技術(shù)種類多樣，其基本核心是核酸雜交檢測(cè)技術(shù)、核酸序列分析技術(shù)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。檢測(cè)通量與靈敏度高，以及操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短是基因和SNP檢測(cè)的發(fā)展方向。 [0003]分子信標(biāo)(molecular beacon)為DNA的恒溫檢測(cè)提供了可能，已成功用于檢測(cè)多種致病微生物。分子信標(biāo)是一種短的寡核苷酸單鏈構(gòu)成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。寡核苷酸鏈一端為熒光基團(tuán)標(biāo)記，另一端為淬滅基團(tuán)標(biāo)記。由于兩端的核苷酸序列互補(bǔ)，其熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)相互靠近發(fā)生能量共振，被激發(fā)后熒光基團(tuán)產(chǎn)生的光子被淬滅基團(tuán)淬滅。如果被檢測(cè)的核酸分子能夠與分子信標(biāo)的單鏈環(huán)區(qū)域雜交，分子信標(biāo)的莖結(jié)構(gòu)遭到破壞，增加了熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)之間的空間距離，不能產(chǎn)生熒光能量共振轉(zhuǎn)移，就能夠檢測(cè)被激發(fā)后熒光基團(tuán)產(chǎn)生的熒光信號(hào)。但是在整個(gè)檢測(cè)過(guò)程中，熒光信號(hào)的強(qiáng)弱依賴于被檢測(cè)的DNA分子的含量，不存在信號(hào)放大，因此直接用分子信標(biāo)雜交目標(biāo)核酸的檢測(cè)技術(shù)，其靈敏度不理想。
[0004]RNase HII是一種核糖核酸內(nèi)切酶，它能夠特異性地水解雜交到DNA鏈上的RNA磷酸二酯鍵，能分解RNA/DNA雜交體系中的RNA鏈。該酶不能消化單鏈或雙鏈DNA。J.Rizzo等人在2002年首次運(yùn)用分子信標(biāo)方法來(lái)檢測(cè)核糖核酸酶動(dòng)力學(xué)和酶切機(jī)制[Molecularand Cellular Probes, 2002，16:277 - 283]。但是目前為止未見(jiàn)關(guān)于核糖核酸酶HII結(jié)合分子信標(biāo)來(lái)檢測(cè)核酸分子的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提出一種基于耐熱核酸酶HII的單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法可以檢測(cè)雙鏈核酸并放大檢測(cè)信號(hào)，靈敏度較高。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的:
[0007]一種基于耐熱核酸酶HII的單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)方法，使用耐熱核酸酶HII ()切斷帶有核糖核苷酸的分子信標(biāo)，將熒光信號(hào)積累下來(lái)，檢測(cè)雙鏈DNA ;其中，所述帶有核糖核苷酸的分子信標(biāo)為中間帶有一個(gè)核糖核酸，兩側(cè)的核苷酸彼此配對(duì)，兩側(cè)分別用熒光發(fā)射基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)標(biāo)記，整個(gè)分子信標(biāo)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，無(wú)熒光釋放出來(lái)。分子信標(biāo)中間帶有核糖核苷酸，耐熱核酸酶HII可以切斷分子信標(biāo)，放大熒光信號(hào)。核酸酶HII來(lái)源于耐熱微生物，因此檢測(cè)反應(yīng)可以在高溫下以熱循環(huán)的形式進(jìn)行，可以有效的檢測(cè)雙鏈DNA樣本。
[0008]作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述的檢測(cè)方法還包括與PCR擴(kuò)增偶聯(lián)，檢測(cè)反應(yīng)與核酸擴(kuò)增反應(yīng)耦合在一起，提高了檢測(cè)靈敏度。
[0009]作為優(yōu)選的技術(shù)方案,所述的分子信標(biāo)長(zhǎng)33個(gè)核苷酸，中間帶有一個(gè)核糖核苷酸，中間的21個(gè)核苷酸與檢測(cè)樣本DNA配對(duì)，兩側(cè)的6個(gè)核苷酸彼此配對(duì)。[0010]作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述的熒光發(fā)射基團(tuán)可以用FAM，TET等；所述的熒光淬滅基團(tuán)可以用DACBYL等。
[0011]作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述分子信標(biāo)為
[0012]Amp-T:
[0013]5， FAM-CGCGCCAGTAAGGGAAruAGGAAGTACTGGCGCG-DABCYL、
[0014]Amp-A:
[0015]5， FAM-CGCGCCAGTAAGGGAAraAGGAAGTACTGGCGCG-DABCYL、
[0016]Amp-C:
[0017]5，F(xiàn)AM-CGCGCCAGTAAGGGAArcAGGAAGTACTGGCGCG-DABCYL、或
[0018]Amp-G:
[0019]5，F(xiàn)AM-CGCGCCAGTAAGGGAArgAGGAAGTACTGGCGCG-DABCYL。
[0020]作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述檢測(cè)方法具體包括:
[0021]步驟I，制備中間帶一個(gè)核糖核苷酸的分子信標(biāo)；
[0022]步驟II，檢測(cè)反應(yīng)體系的建立；
[0023]將擴(kuò)增目標(biāo)DNA的引物序列、dNTP、Taq DNA聚合酶、Tth核酸酶HI1、分子信標(biāo)和檢測(cè)樣本DNA加入Taq酶催化的反應(yīng)體系中，配制反應(yīng)混合物；
[0024]步驟III，熒光信號(hào)放大反應(yīng)；
[0025]將步驟II中的反應(yīng)混合物，放入熒光定量PCR儀中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增和基因分型檢測(cè)；
[0026]步驟IV，確定基因多態(tài)性；
[0027]根據(jù)不同樣本間熒光信號(hào)的差異，確定檢測(cè)樣本待測(cè)位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性。
[0028]本發(fā)明的檢測(cè)方法可以檢測(cè)雙鏈核酸并放大檢測(cè)信號(hào)，其主要通過(guò)耐熱核酸酶HII將中間帶有一個(gè)核糖核苷酸的分子信標(biāo)在中間切斷，將熒光信號(hào)累積下來(lái)，達(dá)到信號(hào)放大的作用。該方法可以用于核酸檢測(cè)和基因分型測(cè)定。與熒光定量PCR儀結(jié)合在一起，可以實(shí)現(xiàn)在線高通量檢測(cè)。該方法可以進(jìn)行食品污染微生物、環(huán)境微生物、病原微生物等的分子檢測(cè)，重要遺傳病的分子檢測(cè)診斷，以及HLA基因分型等。
[0029]本發(fā)明與現(xiàn)有的基因分子信標(biāo)的核酸檢測(cè)和基因分型技術(shù)相比有顯著的進(jìn)步。主要優(yōu)點(diǎn)如下:
[0030](I)本發(fā)明的分子信標(biāo)中間帶有一個(gè)核糖核苷酸，可以切斷分子信標(biāo)，放大熒光信號(hào);
[0031](2)本發(fā)明的檢測(cè)反應(yīng)與核酸擴(kuò)增反應(yīng)耦合在一起，提高了檢測(cè)靈敏度；
[0032](3)核酸酶HII來(lái)源于耐熱微生物，因此檢測(cè)反應(yīng)可以在高溫下以熱循環(huán)的形式進(jìn)行，可以有效的檢測(cè)雙鏈DNA樣本。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0033]為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0034]圖1為本發(fā)明一種基于耐熱核酸酶HII的單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)方法示意圖；
[0035]1、第一突光信號(hào)放大環(huán)路，2、第二突光信號(hào)放大環(huán)路。
[0036]圖2為本發(fā)明四種分子信標(biāo)的檢測(cè)信號(hào)。
【具體實(shí)施方式】
[0037]下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0038]本發(fā)明方法如圖1所示，首先設(shè)計(jì)合成中間帶有一個(gè)核糖核苷酸的分子信標(biāo)，利用耐熱的核酸酶HII切斷帶有核糖核苷酸的分子信標(biāo)，將熒光信號(hào)積累下來(lái)，達(dá)到信號(hào)放大的作用。檢測(cè)反應(yīng)體系的建立:在反應(yīng)體系中加入、測(cè)定樣本DNA、PCR組分、分子信標(biāo)和核酸酶HII。熒光信號(hào)放大反應(yīng):在熒光定量PCR儀中進(jìn)行檢測(cè)，確定樣本的單核苷酸多態(tài)性。
[0039]第一步，PCR擴(kuò)增待檢目標(biāo)核酸區(qū)；第二步，分子信標(biāo)與目標(biāo)核酸雜交配對(duì)形成雙鏈配對(duì)區(qū)，熱穩(wěn)定性核糖核酸酶HII在核糖核苷酸處切斷分子信標(biāo)，分子信標(biāo)釋放出熒光信號(hào)；第三步，斷裂的分子信標(biāo)3’端半分子從單鏈DNA模板上解離下來(lái)，游離的單鏈DNA模板可以指導(dǎo)下一輪的分子信標(biāo)酶切反應(yīng)(熒光信號(hào)放大環(huán)路I);同時(shí)，斷裂的分子信標(biāo)5’端半分子的3’端為自由羥基,與單鏈DNA模板結(jié)合的半分子可以延伸成帶3’長(zhǎng)末端的雙鏈DNA，下一輪PCR后生成短的平末端雙鏈DNA，這兩條雙鏈DNA均可以指導(dǎo)下一輪的分子信標(biāo)酶切反應(yīng)(熒光信號(hào)放大環(huán)路2)。若分子信標(biāo)的核糖核苷酸與目標(biāo)核酸的對(duì)應(yīng)堿基形成錯(cuò)配堿基對(duì)，則熱穩(wěn)定性核糖核酸酶HII切斷分子信標(biāo)的能力大大減低，最終結(jié)果是只有極少量的分子信標(biāo)被切斷，與正確配對(duì)的分子信標(biāo)相比此時(shí)釋放出的熒光信號(hào)極弱，因此可以通過(guò)釋放的熒光信號(hào)強(qiáng)度差異來(lái)確定SNP種類。
[0040]實(shí)施例1
[0041]針對(duì)氨芐抗性基因，利用設(shè)計(jì)的核糖核苷酸分子信標(biāo)和Tth的核酸酶HII，進(jìn)行氨芐抗性基因多態(tài)性分型檢測(cè)，具體實(shí)施步驟如下:
[0042]第一步，制備中間帶一個(gè)核糖核苷酸的分子信標(biāo)。分子信標(biāo)長(zhǎng)33個(gè)核苷酸，中間帶有一個(gè)核糖核苷酸，中間的21個(gè)核苷酸與氨芐抗性基因DNA的300-321位核苷酸配對(duì)，兩側(cè)的6個(gè)核苷酸彼此配對(duì)，兩側(cè)分別用熒光發(fā)射基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)標(biāo)記，整個(gè)分子信標(biāo)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，無(wú)熒光釋放出來(lái)。4條分子信標(biāo)如下:
[0043]Amp-T:
[0044]5， FAM-CGCGCCAGTAAGGGAAruAGGGAAGTACTGGCGCG-DABCYL
[0045]Amp-A:
[0046]5， FAM-CGCGCCAGTAAGGGAAraAGGAAGTACTGGCGCG-DABCYL
[0047]Amp-C:[0048]5’ FAM-CGCGCCAGTAAGGGAArcAGGAAGTACTGGCGCG-DABCYL
[0049]Amp-G:
[0050]5， FAM-CGCGCCAGTAAGGGAArgAGGAAGTACTGGCGCG-DABCYL
[0051]第二步，檢測(cè)反應(yīng)體系的建立。涉及合成擴(kuò)增氨芐抗性基因的引物序列，并將dNTP,Taq DNA聚合酶，Tth核酸酶HI1、1種分子信標(biāo)、DNA樣本加入Taq酶催化的反應(yīng)體系中，配制反應(yīng)混合物。4條分子信標(biāo)分別加入含有檢測(cè)樣本DNA的反應(yīng)體系，一個(gè)樣本對(duì)應(yīng)4個(gè)反應(yīng)。引物序列如下:
[0052]Amp -F:5’ atgagtattc aacatttccg t
[0053]Amp-R:5， cgtcaatacg ggataatacc
[0054]第三步，熒光信號(hào)放大反應(yīng)。將第二步中的針對(duì)檢測(cè)樣本的4個(gè)反應(yīng)混合物，放入熒光定量PCR儀中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增和基因分型檢測(cè)。
[0055]第四步，確定基因多態(tài)性。定量4個(gè)檢測(cè)反應(yīng)的熒光信號(hào)，根據(jù)4個(gè)反應(yīng)體系和分子信標(biāo)的序列特異性，確定檢測(cè)樣本 待測(cè)位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性(如圖2所示)。
[0056]上述分子信標(biāo)的熒光發(fā)射基團(tuán)還可以使用TET，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的替代方式，在此不做贅述。
[0057]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種基于耐熱核酸酶HII的單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)方法，其特征在于，使用耐熱核酸酶HII切斷帶有核糖核苷酸的分子信標(biāo)，將熒光信號(hào)積累下來(lái)，檢測(cè)雙鏈DNA ;其中，所述帶有核糖核苷酸的分子信標(biāo)為中間帶有一個(gè)核糖核酸，兩側(cè)的核苷酸彼此配對(duì)，兩側(cè)分別用熒光發(fā)射基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)標(biāo)記，整個(gè)分子信標(biāo)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，無(wú)熒光釋放出來(lái)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于耐熱核酸酶HII的單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)方法，其特征在于，所述檢測(cè)方法還包括與PCR擴(kuò)增偶聯(lián)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種基于耐熱核酸酶HII的單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)方法，其特征在于，所述熒光發(fā)射基團(tuán)為FAM或TET ;所述熒光淬滅基團(tuán)為DACBYL。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種基于耐熱核酸酶HII的單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)方法，其特征在于，所述分子信標(biāo)長(zhǎng)33個(gè)核苷酸，中間帶有一個(gè)核糖核苷酸，中間的21個(gè)核苷酸與檢測(cè)樣本DNA配對(duì)，兩側(cè)的6個(gè)核苷酸彼此配對(duì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種基于耐熱核酸酶HII的單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)方法，其特征在于，所述分子信標(biāo)為
Amp-T:
5，F(xiàn)AM-CGCGCCAGTAAGGGAAruAGGAAGTACTGGCGCG-DABCYL、
Amp-A:
5，F(xiàn)AM-CGCGCCAGTAAGGGAAraAGGAAGTACTGGCGCG-DABCYL、
Amp-C:
5 ’ FAM-CGCGCCAGTAAGGGAArcAGGAAGTACTGGCGCG-DABCYL、或
Amp-G:
5，F(xiàn)AM-CGCGCCAGTAAGGGAArgAGGAAGTACTGGCGCG-DABCYL 0
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于耐熱核酸酶HII的單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)方法，其特征在于，所述檢測(cè)方法具體包括: 步驟I，制備中間帶一個(gè)核糖核苷酸的分子信標(biāo)； 步驟II，檢測(cè)反應(yīng)體系的建立； 將擴(kuò)增目標(biāo)DNA的引物序列、dNTP、Taq DNA聚合酶、Tth核酸酶HI1、分子信標(biāo)和檢測(cè)樣本DNA加入Taq酶催化的反應(yīng)體系中，配制反應(yīng)混合物； 步驟III，熒光信號(hào)放大反應(yīng)； 將步驟II中的反應(yīng)混合物，放入熒光定量PCR儀中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增和基因分型檢測(cè)； 步驟IV，確定基因多態(tài)性； 根據(jù)不同樣本間熒光信號(hào)的差異，確定檢測(cè)樣本待測(cè)位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103571932SQ201210260940
【公開(kāi)日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2012年7月25日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月25日
【發(fā)明者】李玉占 申請(qǐng)人:上海賽弗生物科技有限公司