專利名稱：：一種重組雞α干擾素基因及其重組載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一種重組雞a干擾素的基因序列及其重組載體，屬于基因工程生物制品領(lǐng)域的產(chǎn)品。與天然的雞a干擾素相比，有更強(qiáng)的抗病毒活性，可針對(duì)性的用于雞的各種病毒性疾病的防制和早期治療。二
背景技術(shù)：
：雞a干擾素(Interferonalpha,IFN-a)是一類具有抗病毒、抗腫瘤、抗增殖作用等功能(OritaniK,MedinaKL,TomiyamaYa/.Limitin:aninterferonlikecytokinethatpreferentiallyinfluencesB21ymphocyteprecursors)的'糖蛋白。1994年，Sekellick等首先克隆得到雞胚成纖維細(xì)胞IFN-a基因，并進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析。1996年Sick，Scultz等對(duì)雞a干擾素基因進(jìn)行了克隆與表達(dá)，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了抗病毒活性的研究。研究表明雞a干擾素是無(wú)內(nèi)含子的多拷貝基因，編碼162個(gè)氨基酸的成熟蛋白，有4個(gè)糖基化位點(diǎn)，推測(cè)其大小為19KD(PeiJ，SekellickMJ,MarcusPI"a/.ChickeninterferontypeIinhibitsinfectionsbronchitisvirusreplicationandassociatedrespiratoryillness[J])。現(xiàn)已證明重組雞a干擾素對(duì)新城疫病毒(NDV)(MarcusPI，HeideLVD，SekellickMJ.InterferonActiononAvianViruses.I.OralAdministrationofChickenInterferondamelioratesNewcastleDisease[J])、禽流感病毒(AIV)、勞氏肉瘤病毒(RSV)等(李鳳華，林云圣，崔麗,等.家禽基因工程干擾素生物學(xué)作用及其在禽病防治中的應(yīng)用[J])都有抵抗作用。近年來(lái)干擾素的研究取得了一些進(jìn)展，已有商品化的豬、犬、雞等重組IFN產(chǎn)品面市，但目前干擾素的研究仍停留在基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)階段，在獸醫(yī)臨床的應(yīng)用上還主要局限于寵物疾病的治療。新型重組干擾素即為一種復(fù)合干擾素(Consensusinterferon,IFN-Con),是一種重組的、非天然的I型干擾素。80年代初，美國(guó)安進(jìn)公司將已知的13種a干擾素序列進(jìn)行比較,把出現(xiàn)頻率最高的氨基酸分配到各自相應(yīng)的位置，并對(duì)個(gè)別位置做了修改，得到復(fù)合干擾素的氨基酸序列，并在大腸桿菌中成功表達(dá)(BlattLM,DavisJM,KleinSB，a/.Thebiologicactivityandmolecularcharacterizationofanovelsyntheticinterferon-alphaspecies,consensusinterferon[J])。體夕卜實(shí)驗(yàn)表明,IFN-Con-1的抗病毒活性、抗增殖活性及誘導(dǎo)NK細(xì)胞的活性均高于IFNa-2a和IFNa-2b，可能與其與更多的細(xì)胞表面受，結(jié)合,且具有更強(qiáng)的親和力有關(guān)。1997年,FDA批準(zhǔn)IFN-Con-1用于慢性丙型肝炎的治療，商品名為干i津。雞的病毒性疾病尤其是烈性傳染性病毒性疾病,如禽流感、新城疫、馬立克氏病等的地區(qū)性流行給養(yǎng)雞業(yè)帶來(lái)數(shù)億計(jì)的損失。因此，急需從多個(gè)角度對(duì)干擾素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，以賦于其新的功能以及大量生產(chǎn)高質(zhì)量的干擾素制劑研制出安全、高效、新型的抗病毒和免疫增強(qiáng)劑用于增強(qiáng)雞體的抵抗力和提高現(xiàn)有疫苗的保護(hù)率。為了進(jìn)一步研究干擾素作用和擴(kuò)大干擾素在生物領(lǐng)域的發(fā)展應(yīng)用，我們進(jìn)行了雞新型復(fù)合干擾素的研究工作設(shè)計(jì)該干擾素時(shí)選擇野生型及抗病力較強(qiáng)的品種的a干擾素亞型為模板；將收集的干擾素氨基酸序列用DANMAN或者LasegeneDNAstar等軟件進(jìn)行比對(duì)分析，以擇量錄取原則，選擇出現(xiàn)頻率最高的氨基酸，拼接出一個(gè)人造干擾素氨基酸序列模板。LasergeneDNAstar分析新干擾素氨基酸結(jié)構(gòu)，與其他表達(dá)或不表達(dá)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較結(jié)構(gòu)越簡(jiǎn)單越有利于表達(dá)；確定好氨基酸序列后，按照偏嗜密碼子的偏嗜性改造新型干擾素基因序列，在偏嗜性差別不大或密碼子出現(xiàn)頻率不很極端的情況下，選擇GC含量高的偏嗜密碼子，使酵母表達(dá)的基因GC含量控制在45y。左右，接近酵母本身基因組的GC含量。確定好新基因序列后根據(jù)其長(zhǎng)度設(shè)計(jì)引物，用PrimerPremier5.0軟件共設(shè)計(jì)了十六條引物，根據(jù)擴(kuò)增長(zhǎng)度按常規(guī)擴(kuò)增條件反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增。由誘生劑誘導(dǎo)產(chǎn)生的雞IFN-a,因來(lái)源少、成本高、純化工藝復(fù)雜等諸多限制而價(jià)格昂貴,極大限制了臨床和科研的應(yīng)用。原核表達(dá)存在著表達(dá)蛋白的產(chǎn)量低,不易于純化以及菌株不穩(wěn)定等問(wèn)題，限制了向規(guī)?；a(chǎn)的轉(zhuǎn)化。而且大腸桿菌表達(dá)的雞干擾素主要以包涵體的形式存在，包涵體在變性、復(fù)性上對(duì)人員技術(shù)及設(shè)備的要求都很高，且工序繁瑣，損失得較多，這些增加了重組雞干擾素工業(yè)產(chǎn)品的成本及生產(chǎn)難度。因此，本試驗(yàn)釆用酵母表達(dá)系統(tǒng)(J丄.Cereghino，J.M.Cregg，HeterologousproteinexpressioninthemethylotrophicyeastPichiapastoris)，這有禾ll于干擾素的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。三
發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的目的在于對(duì)雞a干擾素結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，以賦于其新的功能，研制出安全、高效、新型的抗病毒和免疫增強(qiáng)劑用于增強(qiáng)雞體的抵抗力和提高現(xiàn)有疫苗的保護(hù)率，同時(shí)克服現(xiàn)有技術(shù)中由誘生劑誘導(dǎo)產(chǎn)生雞IFN-a的來(lái)源少、成本高、純化工藝復(fù)雜等諸多限制，以及大腸桿菌表達(dá)的雞干擾素主要以包涵體的形式存在，包涵體在變性、復(fù)性上對(duì)人員技術(shù)及設(shè)備的要求都很高，且s:序繁瑣，損失得較多，這些增加了重組雞干擾素工業(yè)產(chǎn)品的成本及生產(chǎn)難度。因此，我們研究出一種復(fù)合重組雞a干擾素的基因序列的生產(chǎn)方法及其重組表達(dá)載體，達(dá)到高表達(dá)、高穩(wěn)定、高分泌、高活性的生產(chǎn)，可廣泛用于包括新城疫、禽流感在內(nèi)的雞的各種病毒性疾病的防制和早期治療，以及增強(qiáng)雞群的整體免疫力。技術(shù)方案一種重組雞a干擾素基因，其核苷酸序列為SEQIDNO.1，其大小為582bp;上述重組雞a干擾素基因的應(yīng)用，包括(一)含有雞a干擾素基因酵母表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定將人工合成的權(quán)利要求1所述重組雞a干擾素基因SEQIDNO.1加fcoRI和J力al兩個(gè)酶切位點(diǎn)或者將以該基因設(shè)計(jì)引物用PCR擴(kuò)增該雞a干擾素基因SEQIDNO.1的產(chǎn)物與pPICZa-A酵母載體，分別進(jìn)行I和JAal雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，T4DNALigase連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliDH5細(xì)胞得到重組表達(dá)載體，重組表達(dá)載體再進(jìn)行酶為EcoRl和Xbal的雙酶切鑒定，酶切切下大小為582bp的條帶則鑒定為陽(yáng)性載體，并將陽(yáng)性載體送上海英俊公司進(jìn)行DNA序列測(cè)定，序列測(cè)定完全符合SEQIDNO.1，其陽(yáng)性載體即為構(gòu)建的含有雞a干擾素基因酵母表達(dá)載體，命名為pPICZa-A-rChIFN-a;(二)酵母菌感受態(tài)細(xì)胞的制備挑取畢赤酵母X-33菌平板上的一個(gè)單菌落轉(zhuǎn)接于2mLYPD試管中，28'C250rpm恒溫?fù)u過(guò)夜活化12h后，取500pL活化后的畢赤酵母X-33菌液轉(zhuǎn)接于50mL的含有無(wú)菌5mLYPD培養(yǎng)基的三角瓶中，瓶口用三層滅菌紗布扎緊，28。C恒溫?fù)u床250rpin搖蕩培養(yǎng)20h左右，待菌液0D6。。=1.3-1.5時(shí),4°C2500rpm/min離心lmin收獲畢赤酵母X-33菌體，菌體依次用lmL冰預(yù)冷水洗滌兩遍，再用lmL冰預(yù)冷的lmol山梨醇洗漆一次，4°C2500rpm/min離心lmin，最后用0.8mL冰預(yù)冷的lmol山梨醇懸浮菌體，分裝不同的1.5mL的Eppendof管后，置4'C待用，即為為制備的酵母菌畢赤酵母X-33感受態(tài)細(xì)胞；(三)含有雞a干擾素基因酵母表達(dá)載體電轉(zhuǎn)化入酵母菌(1)取經(jīng)Sacl酶線性化后的上述含有雞a干擾素基因的酵母表達(dá)載體10)iL，與80上述感受態(tài)酵母菌畢赤酵母X-33混勻，然后轉(zhuǎn)移到冰預(yù)冷的0.2cm的電轉(zhuǎn)化杯中，冰上放置5min;(2)將電轉(zhuǎn)化杯放在電穿孔儀上用脈沖電流進(jìn)行電擊一次，電擊條件電壓1500V,電容25uF,電阻200Q，時(shí)間5ms;(3)電擊結(jié)束，立即加入lmL冰預(yù)冷的lmol山梨醇，混勻，移入1.5mL的Eppendof管中，置于28"C恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)lh，然后取250pL轉(zhuǎn)化物涂含有100ng/mLZeocin抗性的YPDS培養(yǎng)基平皿上，置28'C恒溫培養(yǎng)2-4天，將在YPDS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的含pPICZa-A-rChlFN-a的載體重組酵母菌落進(jìn)行陽(yáng)性鑒定；(四)含pPICZa-A-rChlFN-a載體重組酵母菌株的陽(yáng)性鑒定(1)提取酵母基因組DNA:將上述YPDS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的pPICZa-A-rChlFN-a載體重組酵母菌落挑至含lOOng/mLZeocin的YPDS液體培養(yǎng)基中，28'C搖床培養(yǎng)36h-48h，然后從該菌液中提取酵母基因組DNA:取IraL的菌菌液放入Eppendof管中，12000rpm/min離心lmin,棄上清，用lmL的滅菌水重懸菌體，重復(fù)兩次，然后加lOOpL的滅菌水，10(TC煮10分鐘，消解酵母菌細(xì)胞壁，然后放入液氮凍30分鐘，IO(TC煮IO分鐘，12000rpm/min離心取上清液，即為酵母基因組DNA;(2)用來(lái)陽(yáng)性鑒定的AOXl引物上游-5'陽(yáng)gactggttccaattgagaagc-3，下游-5，-gcaaatggcattctgacatcc-3，(3)PCR擴(kuò)增鑒定以酵母基因組DNA為模板，以A0X1引物為特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系為10XPCKBuffer5.OpL;10mMdNTPs1.OpL;20pmol/nL5'A0X1引物0.5(iL:基因組DNA模板5.OjxL;20pmol/VL3'A0X1引物0.5|iL;Taq酶0.5)iL;滅菌水補(bǔ)體積至50pL擴(kuò)增程序95。C5min，94。Clmin,54。C1.5min，72。C2.5min,30個(gè)循環(huán)，72。C7min，擴(kuò)增結(jié)束，取5HL反應(yīng)液做瓊脂糖凝膠電泳觀察，獲得擴(kuò)增片段總長(zhǎng)度為U68bp的條帶，則為含有pPICZci-A-rChIFN-a載體的重組酵母陽(yáng)性菌株；(五)高拷貝酵母菌株的篩選將YPDS培養(yǎng)基平皿中長(zhǎng)出的上述含有pPICZa-rChlFN-a載體的重組酵母陽(yáng)性菌落，以影印法依次接種到含Zeocin抗生素濃度梯度為250，500，1000)ig/raL的YPDS固體培養(yǎng)基中，篩選的Zeocin抗性菌株即為含有pPICZa-rChlFN-a基因的高拷貝菌株；(六)含有PPICZa-A-rChlFN-a載體的重組酵母高拷貝菌株的誘導(dǎo)表達(dá)從含有上述高拷貝菌株的YPDS培養(yǎng)基平皿上分別挑取兩株菌株接于25mL的BMGY液體培養(yǎng)基中，經(jīng)28。C搖床培養(yǎng)至0D60O=2-6時(shí)，室溫1500rpm/min離心5min收獲菌體，將收獲的菌體用lOOmL的BMMY培養(yǎng)液懸浮于500mL的三角瓶中，置于28'C搖床進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，每24h向培養(yǎng)基中補(bǔ)加終濃度為體積比1%的甲醇，以保持誘導(dǎo)的持續(xù)表達(dá)，在誘導(dǎo)72h時(shí)收集培養(yǎng)的含有pPICZa-A-rChlFN-a載體的重組酵母菌體表達(dá)的上清備用；(七)含有pPICZa-A-rChlFN-a載體的高表達(dá)酵母菌株表達(dá)產(chǎn)物的獲得將上述收集的含有pPICZa-A-rChlFN-a載體的重組酵母菌體的表達(dá)上清裝入透析袋，用1XPBS進(jìn)行透析除鹽離子，透析后用直徑0.22陶的濾膜進(jìn)行過(guò)濾除菌及雜質(zhì)，即得到了本發(fā)明重組雞a干擾素基因的表達(dá)蛋白；有益效果本發(fā)明雞a干擾素的基因序列及氨基酸序列，是查找了目前GenBank上公布的27種雞a干擾素基因序列，將收集的這27種干擾素的氨基酸序列用DANMAN或者LasergeneDNAstar等軟件進(jìn)行比對(duì)分析，以擇量錄取原則，選擇出現(xiàn)頻率最高的氨基酸，拼接出一個(gè)人造干擾素氨基酸序列模板。用LasergeneDNAstar分析新干擾素氨基酸結(jié)構(gòu)，與其他表達(dá)或不表達(dá)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，結(jié)構(gòu)越簡(jiǎn)單越有利于表達(dá)；確定好氨基酸序列后，按照偏嗜密碼子的偏嗜性進(jìn)行設(shè)計(jì)新干擾素基因序列在偏嗜性差別不大或密碼子出現(xiàn)頻率不很極端的情況下，選擇GC含量高的偏嗜密碼子，使酵母表達(dá)的基因GC含量控制在45%左右，接近酵母本身基因組的GC含量。確定好新基因序列后根據(jù)其長(zhǎng)度設(shè)計(jì)引物，用PrimerPremier5.0軟件共設(shè)計(jì)十六條引物，根據(jù)擴(kuò)增長(zhǎng)度按常規(guī)擴(kuò)增條件反應(yīng)進(jìn)行，設(shè)計(jì)而成。本發(fā)明所用巴氏德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)即巴氏德畢赤酵母X-33菌是已被國(guó)內(nèi)外廣泛用來(lái)表達(dá)外源蛋白質(zhì)的一種公知菌株(齊連權(quán)，人"干擾素在巴士德畢赤酵母中的表達(dá)，2003年軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊；Cereghino等，Heterogousproteinexpressioninthemethylotrophicyeast尸j'c/iapasWs)它能利用甲醇作為唯一碳源大量合成蛋白質(zhì)，主要有以下幾個(gè)生物特性a:利用甲醇作為唯一碳源快速生長(zhǎng)；B:畢赤酵母中存在許多微體細(xì)胞器，它們可以大量?jī)?chǔ)存蛋白質(zhì)，該特點(diǎn)對(duì)表達(dá)外源蛋白質(zhì)非常有利，可以使其免受蛋白酶的降解；C:可以對(duì)表達(dá)的外源蛋白進(jìn)行適度的糖基化等修飾，使外源蛋白能夠最大程度上保持其天然結(jié)構(gòu)U丄.Cereghino，J.M.Cregg,HeterologousproteinexpressioninthemethylotrophicyeastPichiapastoris)。利用巴氏德畢赤酵母表達(dá)載體表達(dá)外源蛋白的優(yōu)點(diǎn)A:高表達(dá)含有醇氧化酶的強(qiáng)啟動(dòng)子，細(xì)胞生長(zhǎng)速度快，能夠較高的表達(dá)外源蛋白；B:高穩(wěn)定該載體不是以自主復(fù)制的形式存在而是整合在酵母菌的染色體上，所以構(gòu)建的重組菌株很穩(wěn)定；C:高分泌1995年RomanosM.等報(bào)道含有a交配因子的分泌和先導(dǎo)序列，可以使外源蛋白分泌到培養(yǎng)上清，而且表達(dá)的外源蛋白的純度達(dá)到75%以上；D:培養(yǎng)成本低，產(chǎn)物易分離純化；E:可以大體積高密度連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)；F:作為真核表達(dá)系統(tǒng)，可對(duì)目的蛋白進(jìn)行翻譯后加工和修飾；G:該表達(dá)系統(tǒng)有多種受體菌和表達(dá)載體供選擇,進(jìn)行胞內(nèi)表達(dá)或分泌表達(dá)，有利于產(chǎn)物的提取和加工。本發(fā)明將新型雞a干擾素的基因序列通過(guò)電轉(zhuǎn)化方式整合到酵母上的特定位置。這株重組菌表達(dá)的干擾素經(jīng)抗病毒活性測(cè)定具有很高的抗病毒活性，本設(shè)計(jì)研制出的干擾素的抗病毒活性與山東某公司的天然a干擾素的工程菌的活性進(jìn)行了比較其活性提高了6.8倍。并且采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源基因，酵母本身蛋白分泌到上清中的很少，這樣就增加了所表達(dá)外源蛋白的純度，有利于該干擾素的規(guī)?；a(chǎn)。我國(guó)是一個(gè)養(yǎng)雞大國(guó)，但目前有多種傳染病嚴(yán)重危害著我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展，影響了我國(guó)雞肉的對(duì)外貿(mào)易。雞的病毒性疾病尤其是烈性傳染性病毒性疾病，如禽流感、新城疫、馬立克氏病等的地區(qū)性流行給養(yǎng)雞業(yè)帶來(lái)數(shù)億計(jì)的損失。因此，急需從多個(gè)角度對(duì)IFN的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，以賦于其新的功能以及大量生產(chǎn)高質(zhì)量的IFN制劑研制出安全、高效、新型的抗病毒和免疫增強(qiáng)劑用于增強(qiáng)雞體的抵抗力和提高現(xiàn)有疫苗的保護(hù)率，這也是本發(fā)明設(shè)計(jì)的目的。本研究采用的畢赤氏酵母基因工程菌生產(chǎn)的新型雞a干擾素與傳統(tǒng)生產(chǎn)的雞a干擾素和用大腸桿菌表達(dá)的a干擾素相比有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)A獲得具有生物活性的重組雞a干擾素方法和程序都簡(jiǎn)單只需收集表達(dá)的上清進(jìn)行透析除鹽、過(guò)濾除菌處理后無(wú)需純化即可投入臨床使用；B無(wú)毒害物質(zhì)酵母不會(huì)分泌向大腸桿菌表達(dá)的外源蛋白那樣附帶一些對(duì)雞體細(xì)胞有毒害的毒素；C純度高酵母表達(dá)的雞a干擾素的SDS-PAGE結(jié)果經(jīng)薄層掃描顯示，重組酵母雞a干擾素的目的條帶占總表達(dá)蛋白量的80%;D廣譜抗病毒作用現(xiàn)國(guó)外資料表明雞干擾素對(duì)雞的各種病毒性疾病的病毒(勞氏肉瘤病毒等等)均有較好的抑制作用，尤其對(duì)一些烈性傳染性病毒性疾病如禽流感、新城疫、馬立克氏病、法氏囊病的早期治療和防制有很好的作用，能在很大程度上遏制各種雞傳染性的病毒性疾病的流行和爆發(fā)；E抗病毒作用強(qiáng)該新型基因組表達(dá)的蛋白經(jīng)過(guò)4365158.3倍稀釋后，能完全抑制100-1000TCID50的水皰性口炎病毒的攻擊。與天然的雞a干擾素相比，有更強(qiáng)的抗病毒作用，其抗病毒作用提高了6.8倍。本試驗(yàn)還測(cè)定經(jīng)lOOOU/mL和100U/mL的新型重組的雞a干擾素處理的雞胚成纖維細(xì)胞中新城疫病毒的滴度分別比對(duì)照降低了1.71Logl0TCID5。和0.87LoglOTCID5。；經(jīng)lOOOU/mL和100U/mL的新型重組的雞a干擾素處理的雞胚成纖維細(xì)胞中禽流感病毒的滴度分別比對(duì)照降低了1.81Logl0TCIDs。和0.90LoglOTCIDM。，高濃度的干擾素作用更明顯；F有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)作用醫(yī)學(xué)臨床把干擾素用于SARS、肝炎以及各種病毒性疾病治療和預(yù)防的成功例子為重組雞a干擾素用于雞群各種病毒性疾病的治療和防制提供了可靠的依據(jù)。近年我國(guó)雞群因爆發(fā)的流行性的病毒性疾病給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)的損失數(shù)以億計(jì)，而且諸如禽流感等病毒性傳染病的局部地區(qū)的流行給養(yǎng)雞業(yè)和人群的安全帶來(lái)很大的威脅，這種損失是難以用金錢來(lái)衡量的。重組酵母雞a干擾素的研制成功并具有較強(qiáng)的抗病毒活性，以及它所具有的一系列的便于工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)，必將給我國(guó)雞病毒性疾病的防制帶來(lái)新的局面。四圖1:重組雞a干擾素基因PCR產(chǎn)物電泳分析1，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；2-9,第一輪PCR產(chǎn)物;10-13，第二輪PCR產(chǎn)物;14-15,第三輪PCR產(chǎn)物;16,第四輪PCR產(chǎn)物，為最終目的片段圖2:pPICZa-A-chlFN-con-a陽(yáng)性克隆載體的酶切鑒定1，空質(zhì)粒酶切對(duì)照；2,EcoRI和Xbal酶切的重組表達(dá)載體；3，4500DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)圖3:重組酵母菌的PCR鑒定1，4500DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；2，未重組上的空酵母X-33對(duì)照；3，陽(yáng)性重組酵母菌圖4:PCR擴(kuò)增示意圖五具體實(shí)施例方式一、試驗(yàn)材料Ssc/en'cWaco//DH5a,酵母菌X-33，pPICZa-A載體購(gòu)自南京天根生化科技公司；新城疫病毒、禽流感病毒購(gòu)自江蘇農(nóng)科院獸醫(yī)所；SPF雞胚購(gòu)自南京乾元浩生物股份有限公司南京生物藥廠；所用化學(xué)試劑均購(gòu)自Takara公司；商品雞天然a干擾素購(gòu)于山東某生物科技有限公司；設(shè)計(jì)該干擾素時(shí)選擇野生型及抗病力較強(qiáng)的品種的a千擾素亞型為模板；將收集的干擾素氨基酸序列用DANMAN或者LasergeneDNAstar等軟件進(jìn)行比對(duì)分析，以擇量錄取原則，選擇出現(xiàn)頻率最高的氨基酸，拼接出一個(gè)人造干擾素氨基酸序列模板。LasergeneDNAstar分析新干擾素氨基酸結(jié)構(gòu)，與其他表達(dá)或不表達(dá)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較結(jié)構(gòu)越簡(jiǎn)單越有利于表達(dá)；確定好氨基酸序列后，按照偏嗜密碼子的偏嗜性改造新型干擾素基因序列，在偏嗜性差別不大或密碼子出現(xiàn)頻率不很極端的情況下，選擇GC含量高的偏嗜密碼子，使酵母表達(dá)的基因GC含量控制在45。/。左右，接近酵母本身基因組的GC含量。確定好新基因序列后根據(jù)其長(zhǎng)度設(shè)計(jì)引物，用PrimerPremier5.0軟件共設(shè)計(jì)了十六條引物，根據(jù)擴(kuò)增長(zhǎng)度按常規(guī)擴(kuò)增條件反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增。二、試驗(yàn)設(shè)計(jì)及生產(chǎn)方法(一)重組到畢赤酵母上的新型雞a干擾素的基因序列的的設(shè)計(jì)及擴(kuò)增(A)在GenBank上查找雞ci干擾素的基因序列，選擇野生型及抗病力較強(qiáng)的品種的a干擾素亞型為模板共27種；(B)通過(guò)DNAStar進(jìn)行基因序列比較，以擇量錄取原則，將出現(xiàn)頻率高的氨基酸進(jìn)行重新組合，拼接出一個(gè)人造干擾素氨基酸序列模板，該氨基酸序列模板為含582bp的新的堿基序列SEQIDNO.l,加兩個(gè)酶切位點(diǎn)及保護(hù)性堿基，共597bp,根據(jù)密碼子偏嗜性，全部換用酵母的偏嗜性密碼子(趙翔霍克克李育陽(yáng)畢赤酵母的密碼子用法分析)。基因GC含量控制在45%左右，接近酵母本身基因組GC含量(GrahamSinclair,FrancisY.M.Choy.Synonymouscodonusagebiasandtheexpressionofhumanglucocerebrosidaseinthemethylotrophicyeast,Pichiapastoris);(C)確定好新基因序列后根據(jù)其長(zhǎng)度設(shè)計(jì)引物，用PrimerPremier5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，共設(shè)計(jì)16條，每條引物之間重疊15-20bp見(jiàn)表1。表l設(shè)計(jì)的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(D)SOE法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，見(jiàn)圖4反應(yīng)體系5XPrimeSTARBuffer10.0|xL;P上游引物1.0;P下游引物1.0|_iL;ddH2033如L;在PCR儀上設(shè)置95°C5min，隨后94'Cl8s,54°C18s，72°C18s，共30個(gè)循環(huán)，結(jié)束循環(huán)后72°C10min;對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定獲得的雞a干擾素基因大小。以上面體系對(duì)引物兩兩進(jìn)行擴(kuò)增，然后回收PCR產(chǎn)物，再以PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行如下體系擴(kuò)增5XPrimeSTARBuffer10.0|_iL;PrimeSTAR0.4;P上游引物0.25nL;dNTP4.0nL;P下游引物0.25模板l2.0nL;模板22.0|iL;ddH2031.1pL;在PCR儀上設(shè)置95。C5min,隨后94。Cl8s，54。C18s,72'Cl8s，共30個(gè)循環(huán)，結(jié)束循環(huán)后72°C10min;對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定獲得的雞a千擾素基因大小。最后擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物的基因片段大小為597bp見(jiàn)圖1;(二)含有雞a干擾素基因酵母表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定將人工合成的重組雞a干擾素基因SEQIDNO.1加￡coRI和Z力al兩個(gè)酶切位點(diǎn)或者將以該基因設(shè)計(jì)引物用PCR擴(kuò)增該雞a干擾素基因SEQIDNO.1的產(chǎn)物與pPICZa-A酵母載體，分別進(jìn)行I和Xfel雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，T4DNALigase連接過(guò)夜,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5a感受態(tài)細(xì)胞得到重組表達(dá)載體，重組表達(dá)載體再進(jìn)行酶為EcoRI和XbaI的雙酶切鑒定，酶切切下大小為582bp的條帶則鑒定為陽(yáng)性載體,對(duì)陽(yáng)性載體送上海英俊公司進(jìn)行DNA序列測(cè)定，序列測(cè)定完全符合SEQIDNO.1，其陽(yáng)性載體即為構(gòu)建的含有雞a干擾素基因酵母表達(dá)載體，命名為pPICZa-A-rChlFN-a;見(jiàn)圖2;(三)酵母菌感受態(tài)細(xì)胞的制備挑取畢赤酵母X-33菌平板上的一個(gè)單菌落轉(zhuǎn)接于2mLYPD試管中，28'C250rpm恒溫?fù)u過(guò)夜活化12h后，取500pL的活化后的畢赤酵母X-33菌液轉(zhuǎn)接于50mL的含有無(wú)菌5mLYPD培養(yǎng)基的三角瓶中，瓶口用三層滅菌紗布扎緊，28'C恒溫?fù)u床250rpra搖蕩培養(yǎng)20h左右，待菌液0D6。。=1.3-1.5時(shí)，4°C2500rpm/min離心lmin收獲畢赤酵母X-33菌體，菌體依次用lmL冰預(yù)冷水洗滌兩遍，再ffllmL冰預(yù)冷的lmol山梨醇洗滌，4'C2500rpm/min離心lmin，最后用0.8mL冰預(yù)冷的lmol山梨醇懸浮菌體，分裝不同的1.5mL的Eppendof管后，置4'C待用，即為為制備的酵母菌畢赤酵母X-33感受態(tài)細(xì)胞；(四)含pPICZa-A-rChlFN-a的表達(dá)載體電轉(zhuǎn)化入酵母菌(1)取經(jīng)SacI酶線性化后的上述含有雞a干擾素基因的酵母表達(dá)載體lOjiL,與80上述酵母菌畢赤酵母X-33感受態(tài)細(xì)胞混勻，然后轉(zhuǎn)移到冰預(yù)冷的0.2cm的電轉(zhuǎn)化杯中,冰上放置5min:(2)將電轉(zhuǎn)化杯放在電穿孔儀上用脈沖電流進(jìn)行電擊一次，電擊條件電壓1500V,電容25uF,電阻200Q,時(shí)間5ms;(3)電擊結(jié)束，立即加入lmL冰預(yù)冷的lmol山梨醇，混勻，移入1.5mL的Eppendof管中，置于28'C恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)lh，然后取250nL轉(zhuǎn)化物涂含有100pg/mLZeocin抗性的YPDS培養(yǎng)基平皿上，置28'C恒溫培養(yǎng)2-4天，將在YPDS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的pPICZa-A-rChIFN-a載體重組酵母菌落進(jìn)行陽(yáng)性鑒定；(五)含pPICZa-A-rChlFN-a載體重組酵母菌株的陽(yáng)性鑒定(1)提取酵母基因組DNA:將上述YPDS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的pPICZa-A-rChIFN-a載體重組酵母菌落挑至含lOOng/mLZeocin的YPDS液體培養(yǎng)基中，28。C搖床培養(yǎng)36h_48h，然后從該菌液中提取酵母基因組DNA:取lmL的菌菌液放入Eppendof管中，12000rpm/min離心lmin,棄上清，用lmL的滅菌水重懸菌體，重復(fù)兩次，然后加lOOpL的滅菌水，IO(TC煮IO分鐘，消解酵母菌細(xì)胞壁，然后放入液氮凍30分鐘，IOO'C煮IO分鐘，12000rpm/niin離心取上清液，即為酵母基因組DNA,以其為模板進(jìn)行PCR陽(yáng)性鑒定(Linder，S.,Schliwa,M.，Kube-Granderath，E.,1996.DirectPCRscreeningof,/。加"》clones.BioTechniques);(2)用來(lái)陽(yáng)性鑒定的AOX1引物上游5，-gactggttccaattgagaagc-3，下游5，-gcaaatggcattctgacatcc-3，(3)PCR擴(kuò)增鑒定以酵母基因組DNA為模板，以A0X1引物為特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系為10XPCRBuffer:5.OpL;10mMdNTPs:l.O(xL;20pmol/VL5'A0X1引物0.5jaL;基因組DNA模板5.0)iL;20pmol/iaL3'A0X1引物0.5pL;T叫酶0.5pL;滅菌水補(bǔ)體積至50nL擴(kuò)增程序95'C5min,94。Clmin，54。C1.5min,72°C2.5min,30個(gè)循環(huán)，72。C7min，擴(kuò)增結(jié)束，取5|xL反應(yīng)液做瓊脂糖凝膠電泳觀察，獲得擴(kuò)增片段總長(zhǎng)度為U68bp的條帶，則為含有pPICZa-A-rChIFN-a載體的重組酵母陽(yáng)性菌株；見(jiàn)圖3;(六)高拷貝酵母菌株的篩選將YPDS培養(yǎng)基平皿中長(zhǎng)出的上述含有pPICZa-A-rChIFN-a載體的重組酵母陽(yáng)性菌落，以影印法依次接種到含Zeocin抗生素濃度梯度為250，500，1000ng/mL的YPDS固體培養(yǎng)基中，篩選的Zeocin抗性菌株即為含有pPICZa-A-rChlFN-a基因的高拷貝菌株；(七)含有pPICZa-A-rChlFN-a載體的重組酵母高拷貝菌株的誘導(dǎo)表達(dá)從含有上述高拷貝菌株的YPDS培養(yǎng)基平皿上分別挑取兩株菌株接于25mL的BMGY液體培養(yǎng)基中，經(jīng)28。C搖床培養(yǎng)至0D6a)=2-6時(shí)，室溫1500rPm/min離心5min收獲菌體，將收獲的菌體用lOOmL的BMMY培養(yǎng)液懸浮于500mL的三角瓶中，置于28'C搖床進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，每24h向培養(yǎng)基中補(bǔ)加終濃度為體積比1%的甲醇，以保持誘導(dǎo)的持續(xù)表達(dá)，在誘導(dǎo)72h時(shí)收集培養(yǎng)的含有pPICZa-A-rChIFN-a載體的重組酵母菌體表達(dá)的上清備用；(八)含有pPICZa-A-rChIFN-a載體高表達(dá)酵母菌株表達(dá)產(chǎn)物的獲得將上述收集的含有pPICZa-A-rChIFN-a載體的重組酵母菌體的表達(dá)上清裝入透析袋，用1XPBS進(jìn)行透析除鹽離子，透析后用直徑0.22陶的濾膜進(jìn)行過(guò)濾除菌及雜質(zhì)，即得到了本發(fā)明重組雞a干擾素基因的表達(dá)蛋白；同時(shí)通過(guò)不同時(shí)段取樣的電泳分析，進(jìn)行SDS-PAGE電泳(U.K.Laemmli,CleavageofstructuralproteinsduringassemblyoftheheadofbacteriophageT4)發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)了72h時(shí)的上清的電泳圖上在31千道爾頓與44千道爾頓之間有一條大約37千道爾頓的明顯的蛋白電泳條帶，比預(yù)測(cè)的分子量大，其原因可能在表達(dá)時(shí)有不同程度的糖基化；(九)酵母表達(dá)的雞a干擾素的生物活性的測(cè)定，并與商業(yè)雞天然a干擾素進(jìn)行活性比較采用微量細(xì)胞病變抑制法(侯云德.分子病毒學(xué)[M])取孵化9-10d的SPF雞胚，去頭、四肢及內(nèi)臟，無(wú)菌狀態(tài)下用PBS洗三遍后，剪碎。吹打成單個(gè)細(xì)胞后上96孔板，生長(zhǎng)約12h使細(xì)胞全部貼壁生長(zhǎng)后，去除生長(zhǎng)液，每孔加入IO倍倍比稀釋的干擾素，用100個(gè)TCID5o的劑量的口泡炎病毒(VSV)進(jìn)行攻毒，細(xì)胞對(duì)照則加無(wú)病毒的營(yíng)養(yǎng)液，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照(只加10倍稀釋的干擾素，不加病毒)、陽(yáng)性對(duì)照(不加干擾素，只加病毒)，空白對(duì)照(不加干擾素，不加病毒)，在倒置顯微鏡下觀察待對(duì)照孔出現(xiàn)75%以上病變的時(shí)候，判斷結(jié)果；商業(yè)雞天然a干擾素進(jìn)行同樣的活性測(cè)定；A、抗水皰性口炎病毒的結(jié)果接入病毒24小時(shí)后觀察可見(jiàn)陽(yáng)性對(duì)照孔完全出現(xiàn)100%嚴(yán)重病變，而加入進(jìn)行10倍倍比稀釋的酵母表達(dá)干擾素的細(xì)胞孔中，106未見(jiàn)任何細(xì)胞病變，在107稀釋的孔中有45%左右的出現(xiàn)輕微病變，陰性對(duì)照孔中的雞胚成纖維細(xì)胞未見(jiàn)異常。從上述結(jié)果得出重組酵母雞a干擾素的生物學(xué)活性為4.43X10eU/mL;商業(yè)雞天然a干擾素的生物學(xué)活性為6.51X105U/mL，重組酵母雞a干擾素的生物學(xué)活性是天然a干擾素的生物學(xué)活性的6.8倍；表.2、pPICZa-A-rChIFN-a與商業(yè)雞天然a干擾素生物學(xué)活性的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>B、重組酵母菌表達(dá)的雞a干擾素的抗NDV、AIV的結(jié)果(1)AIV、NDV的TCIDBo的測(cè)定在96孔細(xì)胞板上，雞胚成纖維細(xì)胞測(cè)定新城疫病毒、禽流感病毒的TCIDs。。；(2)對(duì)病毒的抑制作用(曹瑞兵，周國(guó)棟，周海霞，等.豬e干擾素在畢赤酵母中的分泌表達(dá)及其對(duì)偽狂犬病毒的抑制作用)雞胚成纖維細(xì)胞記數(shù)后用培養(yǎng)液稀釋到適當(dāng)?shù)拿芏?，滴加?4孔板，置于37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中待細(xì)胞貼壁成單層(約12-18h)后。分別加入終濃度為1000U/mL和100U/mL的復(fù)合重組a雞干擾素繼續(xù)培養(yǎng)，每個(gè)處理8個(gè)孔，同時(shí)設(shè)4孔病毒對(duì)照和4孔空白對(duì)照。24h后去上清，用無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞后，每孔加入100TCID5。/mL的AIV、NDVlmL。37'C吸附lh后，棄去病毒液。每孔加入lmL的含2%小牛血清的營(yíng)養(yǎng)液，置于37'C，5%C02的培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)至病毒對(duì)照孔的細(xì)胞出現(xiàn)明顯的病變，當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)明顯病變時(shí)約60h-72h，將24孔板在-20'C凍融2次，各處理分別取3個(gè)樣測(cè)定病毒滴度。(3)抗NDV、AIV的結(jié)果表.3、抗新城疫病毒的結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>分析經(jīng)1000U/mL和100U/mL的新型重組的雞a干擾素處理的雞胚成纖維細(xì)胞中NDV的滴度分別比對(duì)照降低了1.71LoglOTCID50禾Q0.87LoglOTCID50;表.4、抗禽流感病毒的結(jié)果處理方法干擾素濃度病毒滴度(loglOTCID50/mL)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>分析經(jīng)1000U/mL和100U/mL的新型復(fù)合重組的雞a干擾素處理的雞胚成纖維細(xì)胞中AIV的滴度分別比對(duì)照降低了1.81LoglOTCID50禾Q0.90LoglOTCID50;根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)可以說(shuō)明新型復(fù)合重組酵母雞a干擾素己被成功研制出來(lái),其4365158.3倍稀釋便可完全抑制住100TCIDso水皰性口炎病毒的增殖。陰性對(duì)照孔中的細(xì)胞生長(zhǎng)良好，說(shuō)明酵母干擾素上清對(duì)雞體細(xì)胞沒(méi)有明顯毒害。而且該復(fù)合重組酵母雞a干擾素對(duì)AIV和NDV等都具有較強(qiáng)的抑制能力經(jīng)1000U/mL和100U/mL該重組的雞a干擾素處理的雞胚成纖維細(xì)胞中新城疫病毒的滴度分別比對(duì)照降低了1.71Logl0TCID5。和0.87LoglOTCIDs。；經(jīng)lOOOU/mL和lOOU/mL該重組的雞a干擾素處理的雞胚成纖維細(xì)胞中禽流感病毒的滴度分別比對(duì)照降低了1.81Logl0TCIDs。和0.90LoglOTCID5。。結(jié)果表明該基因表達(dá)的蛋白可抑制新城疫病毒和禽流感病毒的增殖，高濃度的干擾素作用更明顯。該研究為重組雞a干擾素的商業(yè)生產(chǎn)及在養(yǎng)雞業(yè)中的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為干擾素在雞病防治應(yīng)用中提供了試驗(yàn)依據(jù)。序列表<110>南京農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>一種重組雞a干擾素基因及其重組載體<130>說(shuō)明書<140>00<141>2008-06-12<160>18<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>582<212>DNA<213>SEQIDNO.3<220><221>雞a干擾素成熟蛋白的基因序列<222>(1)..(582)<223><400>1atggctgttccagcttctccacaacatccaagaggttacggtattttgttgttgactttg60ttgttgaaggctttggctactactgcttctgcttgcaaccaccttcgcccccaggatgcc120accttctctcacgacagcctccagctcctccgggacatggctcccacactaccccagctg180tgcccacagcacaacgcgtcttgctccttcaacgacaccatcctggacaccagcaacacc240cggcaagccgacaaaaccacccacgacatccttcagcacctcttcaaaatcctcagcagc300cccagcactccagcccactggaacgacagccaacgccaaagcctcctcaaccggatccac360cgctacacccagcacctcgagcaatgcttggacagcagcgacacgcgctcccggacgcga420tggcctcgcaaccttcacctcaccatcaaaaaacacttcagctgcctccacaccttcctc480caagacaacgattacagcgcctgcgcctgggaacacgtccgcctgcaagctcgtgcctgg540ttcctgcacatccacaacctcacaggcaacacgcgcacttag582<210>2<211>193<212>PRT<213>人工合成<220><221>雞a干擾素成熟蛋白的氨基酸序列<222>(1)..(193)<223><400>2MetAlaValProAlaSerProGinHisProArgGlyTyrGlylieLeu151015LeuLeuThrLeuLeuLeuLysAlaLeuAlaThrThrAlaSerAlaCys202530AsnHisLeuArgProGinAspAlaThrPheSerHisAspSerLeuGin354045LeuLeuArgAspMetAlaProThrLeuProGinLeuCysProGinHis505560AsnAlaSerCysSerPheAsnAspThrlieLeuAspThrSerAsnThr65707580ArgGinAlaAspLysThrThrHisAsplieLeuGinHisLeuPheLys859095lieLeuSerSerProSerThrProAlaHisTrpAsnAspSerGinArg100105110GinSerLeuLeuAsnArglieHisArgTyrThrGinHisLeuGluGin115120125CysLeuAspSerSerAspThrArgSerArgThrArgTrpProArgAsn130135140LeuHisLeuThrlieLysLysHisPheSerCysLeuHisThrPheLeu145150155160GinAspAsnAspTyrSerAlaCysAlaTrpGluHisValArgLeuGin165170175AlaArgAlaTrpPheLeuHislieHisAsnLeuThrGlyAsnThrArg180185190Thr<210>3<211>59<212>DNA<213>人工合成<220><221>IFN-Pl<222>(1)..(59)<223><400>3gcagaattcatggctgttccagcttctccacaacatccaagaggttacggtattttgtt59<210>4<211>59<212>DNA<213>人工合成<220><221>IFN-P2(43-101):<222>(1)..(59)<223><400>4cagaagcagtagtagccaaagccttcaacaacaaagtcaacaacaaaataccgtaacct59<210>5<211>59<212>DNA<213>人工合成<220><221>IFN-P3(81-139)<222>(1)..(59)<223><400>5ctttggctactactgcttctgcttgcaaccaccttcgcccccaggatgccaccttctct59<210>6<211>59<212>DNA<213>人工合成<220><221>IFN-P4(119-177)<222>(1)..(59)<223><400>6gtgggagccatgtcccggaggagctggaggctgtcgtgagagaaggtggcatcctgggg59<210>7<211>58<212>DNA<213>人工合成<220><221>IFN-P5(157-214)<222>(1)..(58)<223><400>7cctccgggacatggctcccacactaccccagctgtgcccacagcacaacgcgtcttgc58<210>8<211>59<212>DNA<213>人工合成<220><221>IFN-P6(193-251)<222>(1)..(59)<223><400>8cgggtgttgctggtgtccaggatggtgtcgttgaaggagcaagacgcgttgtgctgtgg59<210>9<211>59<212>DNA<213>人工合成<220><221>IFN-P7(232-291)<222>(1)..(59)<223><400>9ctggacaccagcaacacccggcaagccgacaaaaccacccacgacatccttcagcacct59<210>10<211>59<212>DNA<213>人工合成<220><221>IFN-P8(271-329)<222>(1)..(59)<223><400>10cagtgggetggagtgctggggctgctgagga加gaagaggtgctgaaggatgtcgtg59<210>11<211>59<212>DNA<213>人工合成<220><221>IFN-P9(309-368)<222>(1)..(59)<223><400>11ccccagcactccagcccactggaacgacagccaacgccaaagcctcctcaaccggatcc59<210>12<211>59<212>DNA<213>人工合成<220><221>IFN-P10(348-406)<222>(1)..(59)<223><400>12gctgtccaagcattgctcgaggtgctgggtgtagcggtggatccggttgaggaggcttt59<210>13<211>56<22>DNA<213>人工合成<220><221>IFN-P11(386-441)<222>(1)..(56)<223><400>13ctcgagcaatgcttggacagcagcgacacgcgctcccggacgcgatggcctcgcaa56<210>14<211>59<212>DNA<213>人工合成<220><221>IFN-P12(421-479)<222>(1)..(59)<223><400>14tggaggcagctgaagtgttttttgatggtgaggtgaaggttgcgaggccatcgcgtccg59<210>15<2U>59<212>DNA<213>人工合成<220><221>IFN-P13(459-517)<222>(1)..(59)<223><400>15aaaacscttcagctgcctccacaccttcctccaagacaacgattacagcgcctgcgcct59<210>16<211>58<212>DNA<213>人工合成<220><221>IFN-P14<222>(1)..(58)<223><400>16aggaaccaggcacgagcttgcaggcggacgtgttcccaggcgcaggcgctgtaatcgt58<210>17<211>64<212>DNA<213>人工合成<220><221>IFN-P15(534-597)<222>(l).洲<223><400>17gcaagctcgtgcctggttcctgcacatccacaacctcacaggcaacacgcgcacttctag60atga<210>18<211>25<212>DNA<213>人工合成<220><221>IFN-P16(73-597)<222>(1)..(25)<223>40O18tccgttgtgcgcgtgaagatctact2權(quán)利要求1、一種重組雞α干擾素基因，其核苷酸序列為SEQIDNO.1，其大小為582bp。2、權(quán)利要求l所述重組雞a干擾素基因的應(yīng)用，包括(一)含有雞a干擾素基因酵母表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定將人工合成的權(quán)利要求1所述重組雞a干擾素基因SEQIDNO.1加AcoRI和J6al兩個(gè)酶切位點(diǎn)或者將以該基因設(shè)計(jì)引物用PCR擴(kuò)增該雞a干擾素基因SEQIDNO.1的產(chǎn)物與pPICZa-A酵母載體，分別進(jìn)行￡coRI和Jtel雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，T4DNALigase連接過(guò)夜,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliDH5a得到重組表達(dá)載體，重組表達(dá)載體再進(jìn)行酶為EcoRI和XbaI的雙酶切鑒定，酶切切下大小為582bp的條帶則鑒定為陽(yáng)性載體，并將陽(yáng)性載體送上海英俊公司進(jìn)行DNA序列測(cè)定，完全正確的陽(yáng)性載體即為構(gòu)建的含有雞a干擾素基因酵母表達(dá)載體，命名為pPICZa-A-rChIFN-a;(二)酵母菌感受態(tài)細(xì)胞的制備挑取畢赤酵母X-33菌平板上的一個(gè)單菌落轉(zhuǎn)接于2mLYPD試管中，28'C250rpm恒溫?fù)u過(guò)夜活化12h后,取500pL的活化后的畢赤酵母X-33菌液轉(zhuǎn)接于50mL的含有無(wú)菌5mLYPD培養(yǎng)基的三角瓶中，瓶口用三層滅菌紗布扎緊，28'C恒溫?fù)u床250rpm搖蕩培養(yǎng)20h左右，待菌液ODeoo=l.3-1.5時(shí)，4°C2500rpm/min離心lmin收獲畢赤酵母X-33菌體，菌體依次用lmL冰預(yù)冷水洗滌兩遍，再用lmL冰預(yù)冷的lmol山梨醇洗滌，4。C2500rpm/min離心lmin，最后用0.8mL冰預(yù)冷的lmol山梨醇懸浮菌體，分裝不同的1.5mL的Eppendof管后，置4'C待用，即為制備的酵母菌畢赤酵母X-33感受態(tài)細(xì)胞；(三)含有雞a干擾素基因酵母表達(dá)載體電轉(zhuǎn)化入酵母菌感受態(tài)細(xì)胞(1)取經(jīng)Sacl酶線性化后的上述含有雞a干擾素基因的酵母表達(dá)載體10pL，與80上述酵母菌畢赤酵母X-33感受態(tài)細(xì)胞混勻，然后轉(zhuǎn)移到冰預(yù)冷的0.2cm的電轉(zhuǎn)化杯中，冰上放置5min;(2)將電轉(zhuǎn)化杯放在電穿孔儀上用脈沖電流進(jìn)行電擊一次，電擊條件電壓1500V，電容25uF,電阻200Q,時(shí)間5ms;(3)電擊結(jié)束，立即加入lmL冰預(yù)冷的lmol山梨醇，混勻，移入1.5mL的Eppendof管中，置于28'C恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)lh,然后取25(^L轉(zhuǎn)化物涂含有100^ig/mLZeocin抗性的YPDS培養(yǎng)基平皿上，置28'C恒溫培養(yǎng)2-4天，將在YPDS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的含pPICZa-A-rChIFN-a載體的重組酵母菌落進(jìn)行陽(yáng)性鑒定；(四)含pPICZa-A-rChlFN-a載體重組酵母菌株的陽(yáng)性鑒定(1)提取酵母基因組DNA:將上述YPDS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的含pPICZa-A-rChlFN-a載體的重組酵母菌落挑至含100ug/mLZeocin的YPDS液體培養(yǎng)基中，28'C搖床培養(yǎng)36h-48h，然后從該菌液中提取酵母基因組DNA:取lmL的菌菌液放入Eppendof管中，12000rpm/min離心lrain，棄上清，用lmL的滅菌水重懸菌體，重復(fù)兩次，然后加100uL的滅菌水，100'C煮10分鐘，消解酵母菌細(xì)胞壁，然后放入液氮凍30分鐘，IOO'C煮10分鐘，120000rpm/min離心取上清液，即為酵母基因組DNA;(2)用來(lái)陽(yáng)性鑒定的A0X1引物上游-5，-gactggttccaattgagaagc-3，下游.'5，-gcaaatggcattctgacatcc-3，(3)PCR擴(kuò)增鑒定以酵母基因組DNA為模板，以A0X1引物為特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系為:5.OpL;0.5^L;0.5)LlL;10mMd,s基因組DNA模板Taq酶1.OpL;5.OpL;0.5pL;10XPCRBuffer20pmol/pL5'A0X1引物20pmolAiL3'A0X1引物滅菌水補(bǔ)體積至50pL擴(kuò)增程序95。C5min，94。Clmin,54。C1.5min，72。C2.5min，30個(gè)循環(huán)，72。C7min，擴(kuò)增結(jié)束，取5HL反應(yīng)液做瓊脂糖凝膠電泳觀察，獲得擴(kuò)增片段總長(zhǎng)度為U68bp的條帶，則為含有pPICZa-A-rChIFN-a載體的重組酵母陽(yáng)性菌株；(五)高拷貝酵母菌株的篩選將YPDS培養(yǎng)基平皿中長(zhǎng)出的上述含有pPICZa-A-rChlFN-a載體的重組酵母陽(yáng)性菌落，以影印法依次接種到含Zeocin抗生素濃度梯度為250，500，1000嗎/mL的YPDS固體培養(yǎng)基中，篩選的Zeocin抗性菌株即為含有pPICZa-A-rChlFN-a基因的高拷貝菌株；(六)含有pPICZa-A-rChlFN-a載體的重組酵母高拷貝菌株的誘導(dǎo)表達(dá)從含有上述高拷貝菌株的YPDS培養(yǎng)基平皿上分別挑取兩株菌株接于25mL的BMGY液體培養(yǎng)基中，經(jīng)28'C搖床培養(yǎng)至ODeoo-2-6時(shí)，室溫1500rpm/min離心5min收獲菌體，將收獲的菌體用lOOmL的BMMY培養(yǎng)液懸浮于500mL的三角瓶中，置于28'C搖床進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，每24h向培養(yǎng)基中補(bǔ)加終濃度為體積比lX的甲醇，以保持誘導(dǎo)的持續(xù)表達(dá)，在誘導(dǎo)72h時(shí)收集培養(yǎng)的含有pPICZa-A-rChlFN-a載體的重組酵母菌體表達(dá)的上清備用；(七)含有pPICZa-rChlFN-a載體的高表達(dá)酵母菌株表達(dá)產(chǎn)物的獲得將上述收集的含有pPICZa-A-rChlFN-a載體的重組酵母菌體的表達(dá)上清裝入透析袋，用1XPBS進(jìn)行透析除鹽離子，透析后用直徑0.22Mm的濾膜進(jìn)行過(guò)濾除菌及雜質(zhì)，即得到了本發(fā)明重組雞a千擾素基因的表達(dá)蛋白。3、權(quán)利要求2的所述重組雞a干擾素基因的應(yīng)用中所構(gòu)建的酵母表達(dá)載體pPICZa-A-rChIFN-a。4、權(quán)利要求2的所述重組雞a干擾素基因的應(yīng)用中所獲得的含有pPICZa-A-rChIFN-a載體的重組酵母載體的菌株。5、權(quán)利要求2的所述重組雞a干擾素基因的應(yīng)用中所獲得的重組雞a干擾素基因的表達(dá)蛋白。全文摘要本發(fā)明涉及一種新型重組雞α干擾素基因序列，并構(gòu)建其重組表達(dá)載體，屬于用分子生物學(xué)方法獲得的基因工程生物制品。將新設(shè)計(jì)的雞α干擾素的基因序列重組到pPICZα-A載體，然后通過(guò)電轉(zhuǎn)化方式整合到酵母菌上的特定位置。并采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源基因，有利于雞干擾素商業(yè)化生產(chǎn)。該基因組表達(dá)的蛋白經(jīng)過(guò)4365158.3倍稀釋后，能完全抑制100-1000TCID₅₀的水皰性口炎病毒的攻擊。與天然的雞α干擾素相比，有更強(qiáng)的抗病毒作用，其抗病毒作用提高了6.8倍。試驗(yàn)還測(cè)定該基因表達(dá)的蛋白可抑制新城疫病毒和禽流感病毒的增殖，且高濃度的干擾素作用更明顯。文檔編號(hào)C12N15/19GK101338314SQ20081012399公開(kāi)日2009年1月7日申請(qǐng)日期2008年6月16日優(yōu)先權(quán)日2008年6月16日發(fā)明者侯鳳香,珂劉,陳溥言申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)