專利名稱：可在乳酸乳球菌表面展示表達(dá)異源基因的載體及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種可在乳酸乳球菌中表達(dá)外源蛋白、且使表達(dá)蛋白展示于菌體表面的表達(dá)載體，同時還涉及該載體的制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前，對于一些消化道病原體感染，例如幽門螺桿菌(Helicobacter pylori, H.pylori)感染，由于采用抗菌素治療可使細(xì)菌耐藥性增加、且對重復(fù)感染無預(yù)防作用，故對這類疾病更有效的防治只能寄希望于疫苗的研究成功。在疫苗研究中，口服疫苗以其免疫途徑安全、合理、方便等優(yōu)點(diǎn)而受到關(guān)注[Levine MM. 〃IDEAL〃vaccines for resource poorsettings. Vaccine, 2011,29 Suppl 4:D116_25.]。但是，目前口服疫苗研究發(fā)展因缺乏理 想的疫苗載體而受到制約[Zhang S，Moise L, Moss SF. H. pylori vaccines:why we stilldon’t have any. Hum Vaccin, 2011, 7 (11) : 1153-7. ] 現(xiàn)有研究多米用減毒傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)作為口服疫苗載體[Becher D, Deutscher ME, SimpfendorferKR, Wijburg 0L, Pederson JS, Lew AM, Strugnell RA, Walduck AK. Local recallresponses in the stomach involving reduced regulation and expanded helpmediate vaccine-induced protection against Helicobacter pylori in mice. Eur JImmunol, 2010, 40 (10) : 2778-2790.]，結(jié)果顯示，雖然此類候選疫苗株在動物體內(nèi)可產(chǎn)生較好的免疫效果，但由于存在安全性問題，而不適用于嬰幼兒、老年人及免疫缺陷者。探討更安全有效的口服疫苗載體是該領(lǐng)域研究的發(fā)展趨勢，對口服疫苗的研制起關(guān)鍵性作用。乳酸乳球菌(Lactococcus lactis, L. lactis)是乳酸菌類的一個菌種，在食品加工中的應(yīng)用已有悠久的歷史，屬于食品級益生菌，安全性十分可靠，而且其生長迅速，易于培養(yǎng)，遺傳背景和調(diào)控機(jī)制相對清楚，具有用作口服疫苗載體的很大潛力[Morello E, Bermudez-Humardn LG,Llull D, et al.Lactococcus lactis,anefficient cell factory for recombinant protein production and secretion.J Mol Microbiol Biotechnol, 2008，14 (1-3) : 48-58.]。目前應(yīng)用最為廣泛的乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)是 NICE (Ni s in-control led expression)系統(tǒng)[Ribeiro LA, Azevedo V, LeLoirY, et al. Production and targeting of the Brucella abortus antigen L7/L12in Lactococcus lactis: a first step towards food-grade live vaccines againstbrucellosis. Appl Environ Microbiol, 2002, 68 (2) : 910-916.]。在此系統(tǒng)中，NisK是敏感激酶，NisR是反應(yīng)蛋白，當(dāng)有微量的乳酸鏈球菌素nisin加入該表達(dá)系統(tǒng)時，即可被蛋白激酶NisK識別并與之結(jié)合,而結(jié)合nisin的NisK通過磷酸化激活NisR,激活的NisR蛋白即誘導(dǎo)連接于nisA啟動子后的目的基因表達(dá)。為了使用NICE系統(tǒng)進(jìn)行基因表達(dá)，受體蛋白和反應(yīng)因子基因即nisK和nisR被分離并整合到合適宿主菌的基因組中，而nisA啟動子基因則整合到質(zhì)粒上，當(dāng)目的基因克隆到啟動子下游且質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入nisKR陽性菌株中，在宿主菌生長至對數(shù)生長期時加入微量nisin即可誘導(dǎo)目的基因表達(dá)[Mierau I, KleerebezemM.IOyears of the nisin-controlled gene expression system(NICE)in Lactococcuslactis. Appl Microbiol Biotechnol, 2005，68 (6) :705-17. ]。NICE 表達(dá)系統(tǒng)具有以下優(yōu)點(diǎn)誘導(dǎo)劑nisin在食品工業(yè)中作為防腐劑應(yīng)用已有多年，被認(rèn)為是具有食品級安全性的添加劑；nisin價格低廉,而且用量很小；加入nisin后目的蛋白能達(dá)到較高的表達(dá)水平。[Kuipers OP, de Ruyter PG, Kleerebezem M, et al. Controlled overproduction ofproteins by lactic acid bacteria. Trends Biotechnol, 1997，15 (4) : 135-140.]。正是由于NICE系統(tǒng)的上述優(yōu)點(diǎn)，該系統(tǒng)已成為乳酸菌類最有前途的誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)之一。在NICE表達(dá)系統(tǒng)中，PNZ8149與pNZ8110為常用的兩個表達(dá)載體，采用的宿主菌NZ3900染色體基因組含有的nisK和nisR基因，載體pNZ8110和pNZ8149均含有nisA啟動子PnisA。應(yīng)用pNZ8110或pNZ8149為載體，將外源基因整合到啟動子PnisA下游后，加入誘導(dǎo)劑即可誘導(dǎo)外源蛋白在乳酸乳球菌胞內(nèi)或分泌表達(dá)，但不具有在菌體表面展示表達(dá)外源蛋白的功能[Sanchez B，Lopez P, Gonzalez-Rodrguez I, Suarez A, MargollesA,Urdaci MC.A f Iage11 in-producing Lactococcus strain:interactions with mucinand enteropathogens. FEMS Microbiol Lett, 2011, 318(2):101-7. //Zhang XJ, Duan G, Zhang R, Fan Q. Optimized expression of Helicobacter pylori ureB gene inthe Lactococcus lactis nisin-controlled gene expression (NICE)system andexperimental study of its immunoreactivity. Curr Microbiol. 2009, 58(4):308-14. //Chen S, Zhang R, Duan G, Shi J. Food-grade express ion of Helicobacterpylori ureB subunit in Lactococcus lactis and its immunoreactivity.CurrMicrobiol. 2011，62(6) : 1726-31.]。近年研究表明，作為口服疫苗載體，若能將表達(dá)的抗原展示于菌體表面則更有利于刺激胃腸黏膜免疫系統(tǒng)，而產(chǎn)生更好的免疫效果[翟偉強(qiáng).減毒傷寒沙門氏菌作為表面展示疫苗載體的應(yīng)用研究.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，碩士學(xué)位論文，2011. 6，中國學(xué)術(shù)文獻(xiàn)網(wǎng)絡(luò)出版總庫]。因此，作為口服疫苗抗原表達(dá)載體，PNZ8110或PNZ8149無表面展示表達(dá)外源蛋白功能，是一種技術(shù)缺陷。這不僅影響了該乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用范圍，也對亟需疫苗載體的口服疫苗研究發(fā)展不利。應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，將PNZ8110或pNZ8149改造成具有在菌體表面展示表達(dá)外源蛋白功能的新載體，是口服疫苗研制中技術(shù)發(fā)展的需要。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述問題，本發(fā)明的目的提供了一種可表面展示表達(dá)外源蛋白的乳酸乳球菌表達(dá)載體。同時，本發(fā)明的目的還提供了該載體的構(gòu)建方法與應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案采用了一種乳酸乳球菌表達(dá)載體，其核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列，或與SEQ ID NO. I所示核苷酸序列存在至少95%同源性，或與SEQ ID NO. I所示核苷酸序列存在至少90%同源性。本發(fā)明提供的乳酸乳球菌表達(dá)載體pNZ8110_lysM(SEQ ID NO. I)，其含有以下元件來自乳酸乳球菌NZ3900基因組的IysM基因序列(SEQ ID NO. 2)和來自菌株乳酸乳球菌表達(dá)載體pNZ8110(SEQ ID NO. 3)的啟動子Pnis、分泌信號肽序列ssusp45、多克隆酶切位點(diǎn)、復(fù)制子repC和repA及氯霉素抗性基因cm。
IysM元件是乳酸乳球菌自溶素(AcmA)錨定區(qū)基因序列，具有SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。外源基因插入表達(dá)載體pNZ81 IO-IysM多克隆位點(diǎn)后,可與分泌信號肽序列ssusp45、IysM基因融合表達(dá)。ssusp45序列編碼的信號肽可引導(dǎo)融合蛋白分泌至胞外,而IysM基因編碼的錨定肽具有與細(xì)胞壁結(jié)合功能，因此融合蛋白可與細(xì)胞壁結(jié)合，而實(shí)現(xiàn)外源蛋白在菌體表面的展示表達(dá)。本發(fā)明的技術(shù)方案還采用了一種DNA序列，包含有SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列。本發(fā)明的技術(shù)方案還采用了一種大腸埃希氏菌(Escherichia coli)MC1061/pNZ8110-lysM，于2012年5月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO. 6116。另外，本發(fā)明的技術(shù)方案還米用了一種乳酸乳球菌表達(dá)載體pNZ8110_lysM的構(gòu)建方法，包括以下步驟
I)提取乳酸乳球菌NZ3900菌株的基因組DNA，根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫IysM基因序列(Genbank:AM406671. I)設(shè)計(jì)PCR引物，PCR擴(kuò)增得到IysM基因；2)分別雙酶切IysM及表達(dá)載體pNZ8110，回收純化酶切片段，并用T4DNA連接酶進(jìn)行定向連接，連接產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌Escherichia coli MC1061 ；3)通過氯霉素抗性篩選和PCR、酶切及測序鑒定，得到陽性轉(zhuǎn)化菌株；4)培養(yǎng)得到的陽性轉(zhuǎn)化菌，提取重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒即為構(gòu)建的乳酸乳球菌表達(dá)載體，將其命名為pNZ8110-lysM。本發(fā)明提供的乳酸乳球菌表達(dá)載體的構(gòu)建方法中，用于擴(kuò)增IysM基因的PCR引物是根據(jù) GenBank 數(shù)據(jù)庫中 L. lactis NZ3900 菌株的 IysM 基因序列(Genbank: AM406671. I),應(yīng)用生物軟件Primer 5. 0設(shè)計(jì)的，上游引物Pl的核苷酸序列為5’ -ACATGCATGCGACGGACGGAGCTTCTTCAGC-3’ (SEQ ID NO. 4);下游引物 P2 的核苷酸序列為:5，-GCTCTAGATTATGAACCACCTGAATTTGTAGAAG-3’ (SEQ ID NO. 5)。在上游引物5，端含Sph I酶切位點(diǎn)，在下游引物5，端含Xba I酶切位點(diǎn)。本發(fā)明提供的L. Iactis表達(dá)載體的構(gòu)建方法中，所述的分別雙酶切IysM和表達(dá)載體pNZ8110所采用的內(nèi)切酶為Sph I和Xba I。本發(fā)明提供的L. Iactis表達(dá)載體pNZ8110_lysM的構(gòu)建方法中，所述的用IysM與pNZ8110連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli MC1061菌株的方法為常規(guī)大腸桿菌CaCl2轉(zhuǎn)化法[J.薩姆布魯克和D. W拉塞爾著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002];用含氯霉素(10 u g/ml)的LB培養(yǎng)基篩選陽性轉(zhuǎn)化菌，從平板上刮取陽性轉(zhuǎn)化菌菌落，培養(yǎng)并提取質(zhì)粒進(jìn)行限制性酶切及測序鑒定，鑒定結(jié)果顯示序列正確的重組質(zhì)粒，即為構(gòu)建的L. Iactis表達(dá)載體，將其命名為pNZ8110-lysM，本發(fā)明中將含有pNZ8110_lySM的E. coli菌株命名為Escherichia coli MC1061/pNZ8IIO-IysM0為鑒定表達(dá)載體pNZ8110-lysM的表面展示表達(dá)外源蛋白的功能，在實(shí)施例3中，以質(zhì)粒PIRES2-EGFP(美國BD Biosciences Corporation)為模板，采用PCR方法擴(kuò)增得到增強(qiáng)型綠色突光蛋白(Enhanced green florescence protein, EGFP)基因，通過限制性酶切和定向連接的方法，將EGFP基因與表達(dá)載體pNZ81 IO-IysM連接，并用連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化感受態(tài)L. lactis NZ3900菌株。經(jīng)過氯霉素抗性篩選和限制性酶切、PCR及測序鑒定，獲得攜帶EGFP基因的L. lactis重組菌，將其命名為Lactococcus lactis NZ3900/pNZ81IO-EGFP-IysM0該重組菌經(jīng)培養(yǎng)和乳酸鏈球菌素nisin誘導(dǎo)表達(dá)后，取菌液涂片，用熒光顯微鏡檢測EGFP的表達(dá)。結(jié)果顯示，在熒光顯微鏡下可以清楚地觀察到菌株L. IactisNZ3900/pNZ81IO-EGFP-IysM 所產(chǎn)生綠色熒光。在實(shí)施例3中，擴(kuò)增EGFP基因的PCR引物是根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫中EGFP基因序列(GenBank:JN255744. I)，應(yīng)用生物軟件Primer 5. 0設(shè)計(jì)的，上游引物P3的核苷酸序列為5-ATAGCCGGCATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3，(SEQ ID NO. 6),其 5’端含 Nae I 酶切位點(diǎn)；下游引物 P4 核苷酸序列為 5-ACAT GCATGCCTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3，(SEQ ID NO. 7)，其 5’端含Sph I酶切位點(diǎn)。本發(fā)明具有的有益效果由于表面展示表達(dá)疫苗抗原的疫苗株的口服免疫效果顯著優(yōu)于目前常用的胞內(nèi)表達(dá)抗原的疫苗株，因此，作為疫苗載體，本發(fā)明提供的能夠在L. Iactis表面展示表達(dá) 疫苗抗原的L. Iactis表達(dá)載體pNZ8110-lysM，比不具有表面展示表達(dá)功能的表達(dá)載體PNZ8110或pNZ8149，在理論上更為合理，在技術(shù)上有實(shí)質(zhì)性進(jìn)步，可以使疫苗產(chǎn)生更好的免疫效果，因而pNZ8110-lysM作為疫苗抗原表達(dá)載體，在口服疫苗制備中具有很大應(yīng)用價值。本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)證明以L. lactis NZ3900為表達(dá)宿主菌、以pNZ81 IO-IysM為表達(dá)載體的表達(dá)系統(tǒng)能表面展示表達(dá)外源蛋白，例如，表達(dá)EGFP。在口服疫苗研制中，此表達(dá)系統(tǒng)比目前常用的以減毒傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)為宿主菌的表達(dá)系統(tǒng)安全性更可靠；同時又比現(xiàn)有的以L. lactis NZ3900為表達(dá)宿主菌、以pNZ8110為表達(dá)載體的表達(dá)系統(tǒng)，在技術(shù)上有顯著進(jìn)步，因?yàn)閼?yīng)用以L. lactis NZ3900為宿主菌、pNZ81 IO-IysM為表達(dá)載體的表達(dá)系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)將外源蛋白在菌體表面展示表達(dá)，可以提高免疫效果[翟偉強(qiáng).減毒傷寒沙門氏菌作為表面展示疫苗載體的應(yīng)用研究.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，碩士學(xué)位論文，2011. 6，見于中國學(xué)術(shù)文獻(xiàn)網(wǎng)絡(luò)出版總庫]。因此，本發(fā)明提供的以L. lactis NZ3900為宿主菌、以pNZ8110-lysM為表達(dá)載體的表達(dá)系統(tǒng)以其安全高效為明顯優(yōu)勢和特點(diǎn)，在口服疫苗的制備中有非常大的應(yīng)用價值。采用以L. lactis NZ3900為宿主菌、pNZ81 IO-IysM為表達(dá)載體構(gòu)建的抗幽門螺桿菌等消化道病原體的口服疫苗菌株，不僅可用于疫苗的制備，還可以作為發(fā)酵菌株，用于乳制品或食品加工，可望產(chǎn)生具有巨大社會和經(jīng)濟(jì)效益。總之，在目前口服疫苗研制亟需安全有效疫苗載體的情況下，本發(fā)明提供的乳酸乳球菌表達(dá)載體PNZ81 IO-IysM及應(yīng)用該載體構(gòu)建的乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng)具有深遠(yuǎn)應(yīng)用前
旦
o


圖I為L. Iactis表達(dá)載體pNZ8110_lysM構(gòu)建示意圖；圖2為IysM基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；圖中第I泳道為陰性對照，第2 5泳道為IysM基因擴(kuò)增產(chǎn)物，第6泳道為DNA Marker ；圖3為重組質(zhì)粒pNZ8110_lysM的酶切鑒定圖；圖中泳道I為pNZ8110用Xba I酶切，泳道2為pNZ81 IO-IysM用Xba I酶切，泳道3為pNZ81 IO-IysM用Sph I和XbaI雙酶切,泳道4為IysM的PCR產(chǎn)物，泳道5為DNA Marker ；圖4為L. Iactis表達(dá)載體pNZ8110_EGFP_lysM構(gòu)建示意圖；圖5為EGFP基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；圖中I 4為EGFP基因片段的擴(kuò)增產(chǎn)物，5 為 DNAMarker ；圖6為重組菌株MC1061/pNZ81 IO-EGFP-IysM的菌液PCR產(chǎn)物電泳圖；圖中I為陰性對照，2 5為EGFP基因片段擴(kuò)增產(chǎn)物，6為DNAMarker ；
·
圖7為L. lactis NZ3900/pNZ81IO-EGFP-IysM中重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物電泳圖；圖中I 為 Sph I 酶切 pNZ8110，2 為 Sph I 酶切 pNZ8110_EGFP_lysM，3 為 Sph I 與 Nae I 雙酶切pNZ8110-EGFP-lysM，4 為 EGFP 基因片段的 PCR 產(chǎn)物，5 為 DNA ladder ；圖8 為重組菌株 L. lactis NZ3900/pNZ81IO-EGFP-IysM 中 EGFP 的表達(dá)分析；圖中A和C分別是熒光顯微鏡綠色光源下觀察到的重組菌株NZ3900/pNZ81IO-EGFP-IysM和陰性對照NZ3900菌株；B和D分別是熒光顯微鏡白色光源下觀察到的的重組菌株NZ3900/pNZ81IO-EGFP-IysM和陰性對照NZ3900菌株；表面表達(dá)EGFP的重組菌株與陰性對照菌株存在明顯差異；證實(shí)重組菌株L. lactis NZ3900/pNZ81IO-EGFP-IysM構(gòu)建成功。
具體實(shí)施例方式(一)本發(fā)明實(shí)驗(yàn)中使用的細(xì)菌菌株和質(zhì)粒L. lactis NZ3900 菌株(lacF, pepN: :nisRnisK)購自荷蘭 NIZO FoodResearch (Kernhemseweg，Netherlands) o 也可從德國 Mobitec 公司(Gottingen,Germany)購得。采用含150ml/L甘油的GM17培養(yǎng)基于_80°C保存L. lactis NZ3900菌種。L. Iactis 表達(dá)載體 pNZSllO 購自荷蘭 NIZO Food Research (Kernhemseweg,Netherlands) 0其核苷酸序列為SEQ ID NO. 3所示，含啟動子Pnis、分泌信號肽序列ssusp45、多克隆酶切位點(diǎn)、復(fù)制子repC和repA及氯霉素抗性基因cm等元件。pNZ8110為大腸桿菌-乳酸乳球菌穿梭載體(Shuttle vector)。質(zhì)粒pIRES2_EGFP 是美國 BD Biosciences Corporation 公司銷售產(chǎn)品。PIRES2-EGFP內(nèi)含增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP基因。E.coli MClO6I 菌株(r araD139A (ara-leu) 7696 galE15 galK16 A (Iacc) X74rprpsL(Strr)hsdR2 (rK_ mK+)mcrA mcrBl)是常用基因工程菌株，屬于公知技術(shù),可于美國Boca Scientific Inc.公司或 Sigma-Aldrich 公司購得。( 二)本發(fā)明實(shí)驗(yàn)中使用的培養(yǎng)基及其配制⑴LB培養(yǎng)基LB液體培養(yǎng)基稱取I. Og胰蛋白胨,0. 5g酵母浸粉,I. Og氯化鈉，溶于IOOml蒸餾水中，用10mol/LNa0H調(diào)pH值至7. 2，121 °C高壓滅菌20min，置4°C保存?zhèn)溆?。LB固體培養(yǎng)基稱取I. Og胰蛋白胨，0. 5g酵母浸粉，I. Og氯化鈉，I. 5g瓊脂粉，溶于IOOml蒸餾水中，用10mol/L NaOH調(diào)pH值至7. 2，121 °C高壓滅菌20min，冷卻至約50°C時傾注平板備用。⑵乳酸菌培養(yǎng)基GM17培養(yǎng)基稱取4. 25g M17培養(yǎng)基，溶于80ml蒸餾水中，用10mol/LNa0H調(diào)pH值至7. 2，定容至100ml，121 °C高壓滅菌20min，冷卻后加入葡萄糖至終濃度為5. 0g/L。
GM17培養(yǎng)基平板稱取4. 25g GM17培養(yǎng)基，I. 5g瓊脂粉，溶于80ml蒸餾水中，用10mol/LNa0H調(diào)pH值至7. 2，定容至100ml，121 °C高壓滅菌20min，冷卻至約60°C時加入葡萄糖至終濃度為5. Og/L，混勻后將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，制成培養(yǎng)基平板。GSGM17培養(yǎng)基 稱取85. 50g蔗糖，12. 50g甘氨酸，18. 63g M17培養(yǎng)基，溶于400ml蒸餾水中，用lOmol/LNaOH調(diào)pH值至7. 2，定容至500ml，高壓滅菌。冷卻后加入葡萄糖至終濃度為5. 0g/L。GM17MC 恢復(fù)培養(yǎng)基稱取 3. 73g M17 培養(yǎng)基，0. 19g MgCl2, 0. 02g CaCl2，溶于 80ml蒸餾水中，用lOmol/LNaOH調(diào)pH至7. 2，定容至100ml，高壓滅菌。冷卻后加入葡萄糖至終濃度為5. 0g/L。(三)本發(fā)明實(shí)驗(yàn)中涉及的主要試劑M17培養(yǎng)基(青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)、氯霉素(美國Amresco公司)、T4DNA連接酶和限制性內(nèi)切酶Xba I和Sph I等(美國Fermentas公司)、凝膠回收試劑盒(杭州愛思進(jìn)(AxyGen)生物技術(shù)有限公司)、質(zhì)粒提取試劑盒和DNA Marker III (北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)、RNA酶(RNase A)和PCR反應(yīng)試劑盒(北京天根生化科技有限公司)、其他常用試劑均為國產(chǎn)分析純級試劑。未作特別說明的實(shí)驗(yàn)材料與方法屬于公知技術(shù)，在生物技術(shù)領(lǐng)域常用工具書，例如，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(J薩姆布魯克和D. W拉塞爾著，第三版，科學(xué)出版社，2002)，中可查到。實(shí)施例1L. Iactis表達(dá)載體pNZ8110_lysM的構(gòu)建L. Iactis表達(dá)載體pNZ8110_lysM的構(gòu)建參見圖I.I. L. lactis IysM 基因的制備I. 1L. lactis NZ3900 菌株基因組 DNA 的提?、艔腳80°C冰箱取出L. lactis NZ3900菌種保存管，從中取100 菌液接種到5mlGM17培養(yǎng)基中，于30°C、5%C02培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)12h 14h，取I. 5ml 3ml菌液，5000r/min離心5min，收集菌體。⑵用500 u I TE 緩沖液(IOmM Tris-Cl, ImM EDTA, pH8. 0)洗滌菌體一次。⑶用50iU TE緩沖液重懸菌體，加入溶菌酶至終濃度為10mg/ml，37°C水浴60mino⑷加入蛋白酶K至終濃度50 u g/ml，混勻后加入SDS溶液至終濃度10g/L，37°C水浴2h。(5)補(bǔ)充300 U I TE緩沖液，依次分別用等體積的苯酚、酚氯仿(苯酚與氯仿等體積混合物)、氯仿各抽提蛋白一次，10000r/min,離心15min。(6)加入2倍體積的無水乙醇和1/10體積的2. 5mol/L乙酸鈉，輕柔顛倒離心管數(shù)次至出現(xiàn)絮狀沉淀。(7) 10000r/min離心5min收集DNA，將沉淀用70%乙醇洗滌。(8)自然干燥后，用50 ill TE緩沖液溶解DNA。(9)用終濃度為50 u g/ml的RNaseA在37°C水浴中處理30min，得到基因組DNA。I. 2引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank核酸數(shù)據(jù)庫中乳酸菌的IysM基因序列(Genbank:AM406671. 1)，利用生物軟件Primer 5. O設(shè)計(jì)PCR引物，上游引物Pl序列為5’ -ACATGCATGCGACGGACGGAGCTTCTTCAGC-3’ (SEQ ID NO. 4);下游引物 P2 序列為:5’ -GCTCTAGATTATGAACCACCTGAATTTGTAGAAG-3’ (SEQ ID NO. 5)。在上游引物5’端含Sph I限制性酶切位點(diǎn)(下劃線部分)，在下游引物5’端含Xba I限制性酶切位點(diǎn)(下劃線部分)。由上海捷瑞生物工程有限公司合成。I. 3基因片段IysM的PCR擴(kuò)增⑴PCR反應(yīng)體系按PCR反應(yīng)試劑盒(北京天根生化科技公司)說明，配制50 U I反應(yīng)體系20iiM的上游引物liil，20iiM的下游引物liil，2XTaq PCR Master Mix25iil，NZ3900基因組DNA模板2iil，加去離子水至50 yl。⑵PCR循環(huán)條件95°C預(yù)變性2min，95°C變性30s，56 V退火30s，72°C延伸45s，共40個循環(huán)，最后72°C延伸5min。⑶PCR產(chǎn)物分析取3 ill PCR反應(yīng)產(chǎn)物，于20g/L瓊脂糖凝膠中電泳，電壓為5V/ cm,用DNAMarker做分子量標(biāo)記，電泳20min,用凝膠圖像掃描儀分析。2. IysM基因及表達(dá)載體pNZ8110的雙酶切分別將IysM基因和表達(dá)載體pNZ8110用限制性內(nèi)切酶Sph I和Xba I進(jìn)行雙酶切。酶切體系質(zhì)粒 PNZ8110 或 IysM基因 25 ii I，10XBuffer 5 ii I，SphI I u I,XbaI I u I,去離子水18ul。37°C酶切12h，65°C水浴20min滅活內(nèi)切酶。取IysM基因雙酶切產(chǎn)物5 yl于20gL的瓊脂糖凝膠中電泳，取質(zhì)粒PNZ8110雙酶切產(chǎn)物5 ill用IOgL的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。4. IysM基因與質(zhì)粒pNZ8110酶切產(chǎn)物的回收用凝膠回收試劑盒(杭州愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司)回收純化酶切片段，參照產(chǎn)品說明，步驟如下⑴取50 U I雙酶切產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中電泳20min，依據(jù)DNA Marker條帶的相應(yīng)位置，在紫外燈下切下含有目的片段的瓊脂糖凝膠，用濾紙將凝膠表面液體吸干，然后裝入I. 5ml的EP管中，稱其重量，根據(jù)凝膠的重量估算凝膠體積(IOOmg的凝膠按100 U I體積估算)；⑵加入3個凝膠體積的溶液DE-A，混合均勻后于75°C水浴，間斷混合，直到凝膠完
全熔化。⑶加入0. 5個Buffer DE-A體積的Buffer DE-B,混合均勻(在處理IysM基因雙酶切產(chǎn)物時，需再加I個凝膠體積的異丙醇)。⑷將步驟三的混合液轉(zhuǎn)移到DNA制備管中，12000r/min離心Imin,棄濾液。(5)將制備管置回2ml離心管,加500 ii I Buffer Wl, 12000r/min離心30s,棄濾液。(6)將制備管置回2ml離心管，加700 u I Buffer W2, 12000r/min離心30s，棄濾液。以同樣的方法再用700 ii I Buffer W2洗漆一次，12000r/min離心lmin。⑴將制備管置回2ml離心管中，12000r/min離心lmin。⑶將制備管置于I. 5ml離心管中，在制備膜中央加30iil去離子水，室溫靜置lmin。12000r/min 離心 2min 洗脫 DNA, DNA 置 _20°C保存。5. IysM基因與表達(dá)載體pNZ8110的連接將凝膠回收得到的IysM基因與表達(dá)載體pNZ8110的雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接。連接反應(yīng)體系10XBuffer 2 u I, T4 DNA 連接酶 I yl，IysM 基因 8 yl，pNZ8110 載體 2 yl，去離子水7 ill。于16°C進(jìn)行連接反應(yīng)16h。6. E. coli MC1061感受態(tài)細(xì)胞的制備6. I從培養(yǎng)E. coli MC1061菌株16h的LB培養(yǎng)板上取單菌落，接種于5ml LB培養(yǎng)液中，220r/min搖振，37°C培養(yǎng)16h。6. 2取Iml菌液加入100ml LB培養(yǎng)液中，37°C，220r/min搖振培養(yǎng)至對數(shù)生長期(約 I. 5h 2h)。6. 3無菌條件下，將菌液轉(zhuǎn)移至兩個用冰預(yù)冷的無菌50ml離心管中，冰水中放置IOmin06. 4 于 4°C，4000r/min 離心 lOmin，倒出上清，用 IOml 冰預(yù)冷的 0. lmol/L CaCl2 重懸菌體沉淀，置冰水中放置30min。 6. 54°C, 4000r/min離心IOmin,倒出上清,將管倒置lmin,使液體流盡。6. 6每管加2ml 0. lmol/L用冰預(yù)冷的CaCl2，重懸沉淀，分裝感受態(tài)細(xì)胞，每I. 5mlEp管中200iil，4°C貯存12h 24h使用。7. E. coli MC1061感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化7. I取IysM基因與載體pNZ8110的連接產(chǎn)物10 iil，加入裝有200 ill E.coliMC1061感受態(tài)細(xì)胞的I. 5ml Ep管中，混勻后于冰水中放置30min。7. 2將此1.5ml Ep管靜置于42°C水浴中，90s。將Ep管快速轉(zhuǎn)移到冰浴中，冷卻3min。7. 3每管加800 u I LB液體培養(yǎng)基，37°C水浴IOmin后，將管放入搖床，120r/min振蕩培養(yǎng)45min使細(xì)菌復(fù)蘇。7. 44000r/min離心5min，吸出800 U I液體培養(yǎng)基，剩余液體混勻后涂含氯霉素(10 u g/ml)的LB固體培養(yǎng)板。室溫放約30min，待菌液被吸收后，倒置培養(yǎng)基平板，于培養(yǎng)箱中，37°C培養(yǎng)16h。8.陽性轉(zhuǎn)化菌的鑒定(I)菌液特異PCR鑒定從LB培養(yǎng)基上挑取單菌落過夜搖菌，以菌液為PCR模板，采用引物Pl和P2，PCR擴(kuò)增IysM基因，PCR體系:20iiM的上游引物liil，20iiM的下游引物liil，2XTaqPCRMasterMix 25 iil，菌液2 iil，加去離子水至50 ill。PCR反應(yīng)條件95°C預(yù)變性4min，95°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸45s，共40個循環(huán)，最后72°C延伸5min。用20g/L瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。(2)重組質(zhì)粒的酶切鑒定應(yīng)用常規(guī)大腸桿菌質(zhì)粒提取法(堿裂解法)從E. coli轉(zhuǎn)化菌中提取質(zhì)粒[J.薩姆布魯克和D. W拉塞爾著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002]，分別采用XbaI單酶切和SphI、XbaI雙酶切鑒定提取的質(zhì)粒，37°C酶切12h，65°C滅活20min，用20g/L瓊脂糖凝膠電泳。(3)重組質(zhì)粒的測序鑒定重組質(zhì)粒由上海捷瑞生物工程有限公司測序，將測序結(jié)果和GenBank上公布的IysM 基因序列(Genbank:AM406671. I)進(jìn)行 BLAST 比對。結(jié)果如下
I. L. lactis IysM基因序列的PCR擴(kuò)增結(jié)果L. lactis IysM基因序列的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖2，擴(kuò)增片段長度與預(yù)期長度一致，結(jié)果表明IysM基因的PCR擴(kuò)增成功。2. E. coli陽性轉(zhuǎn)化菌的菌液PCR鑒定E. coli陽性轉(zhuǎn)化菌的菌液為模板，PCR擴(kuò)增IysM基因得到的片段長度與預(yù)期長度一致。3. E. coli陽性轉(zhuǎn)化菌的酶切鑒定取經(jīng)過PCR鑒定為陽性轉(zhuǎn)化菌的菌液，用堿裂解法提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果顯示質(zhì)粒單酶切產(chǎn)物片段長度和雙酶切產(chǎn)物片段長度均與預(yù)期片段長度一致(圖3)。 4. E.coli陽性轉(zhuǎn)化菌的測序鑒定對從E. coli陽性轉(zhuǎn)化菌中提取的重組質(zhì)粒中IysM基因測序的結(jié)果為SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，將該序列與Genbank上公布的IysM基因序列(Genbank:AM406671. I)進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果顯示，二者相同。證實(shí)此重組質(zhì)粒即為構(gòu)建成功的L. Iactis表達(dá)載體，將其命名為pNZ81 IO-IysM,將含有pNZ81 IO-IysM的E. coliMC1061 重組菌命名為 E. coli MC1061/pNZ8110-lysM(保藏編號為 CGMCC NO. 6116)。采用含150ml/L甘油和10 u g/ml氯霉素的LB培養(yǎng)基于_80°C保存該菌株。實(shí)施例2重組菌株L. lactis NZ3900/pNZ8110的構(gòu)建重組菌株L. lactis NZ3900/pNZ8110既可以按照菌株L. lactis NZ3900銷售方荷蘭NIZO Food Research或德國Mobitec公司提供的技術(shù)方法制備,也可以采用如下方法制備I.制備 L. lactis NZ3900 感受態(tài)細(xì)胞I. I從-80°C貯存的L. lactis NZ3900菌種保存管中取200 U I菌液接種于5ml液體GSGM17培養(yǎng)基中，放入CO2培養(yǎng)箱，30°C、5%C02靜置培養(yǎng)過夜(本說明書中，過夜指時長為 12h 14h)。I. 2取5ml菌液加入50ml GSGM17培養(yǎng)基中，30°C、5%C02靜置培養(yǎng)12h。I. 3取50ml菌液轉(zhuǎn)種于400ml GSGM17培養(yǎng)基中，30°C、5%C02靜置培養(yǎng)至OD6tltl約為0. 3。1.4將菌液 40001'/1^11、41離心20111111，收集菌液；I. 5用冰冷的400ml的洗液I (0. 5mol/L蔗糖，100ml/L甘油)洗滌一次，4000r/min、4°C離心20min,收集菌液；I. 6 用冰冷的 200ml 洗液 II (0. 5mol/L 蔗糖，100ml/L 甘油，50mM EDTA)重懸菌體，冰上靜置15min ;4000r/min、4°C離心20min,收集菌體；I. 7再用冰冷的洗液1(0. 5M蔗糖，100ml/L甘油)100ml重懸菌體，4000r/min、4°C離心20min，收集菌體；I. 8用4ml冰冷的洗液I (0. 5M蔗糖，100ml/L甘油)懸浮菌體，分裝入事先冰浴的0.5ml EP管中，每管40 iil，儲存于-80°C。2.電轉(zhuǎn)化L. lactis NZ3900菌株感受態(tài)細(xì)胞取IiU 購置的表達(dá)載體 pNZ8110(10 20ng)與 40 y 1L. lactis NZ3900 感受態(tài)細(xì)胞混合，轉(zhuǎn)入冰浴的0. 2cm電轉(zhuǎn)化杯中，設(shè)置電擊參數(shù)為2. 0KV、25ii F、200Q，用紙巾擦干電轉(zhuǎn)化杯金屬電極片上水分，然后將轉(zhuǎn)化杯置于電擊槽中電擊。電擊后立即加入SOOiilGM17MC恢復(fù)培養(yǎng)基，冰浴5min后轉(zhuǎn)入I. 5ml EP管中，恢復(fù)培養(yǎng)2h，將菌液涂布于含氯霉素(10 u g/ml)的GM17培養(yǎng)板上，待菌液吸收完全后，于30°C、5%C02靜止培養(yǎng)40h，篩選陽性轉(zhuǎn)化菌。3. L. Iactis陽性轉(zhuǎn)化菌的鑒定3. 1L. Iactis陽性轉(zhuǎn)化菌中質(zhì)粒的提取采用質(zhì)粒小提試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，參照產(chǎn)品說明，步驟如下
(I)從上一步篩選陽性轉(zhuǎn)化菌的GM17培養(yǎng)板上挑取單菌落接種于5ml GM17培養(yǎng)基，放入CO2培養(yǎng)箱，30°C、5%C02靜止12h。(2)取3ml菌液,加入離心管中，13000r/min離心lmin,棄上清。(3)向菌體沉淀中加入250 u I Buffer Pl和100 u I 100g/L的溶菌酶，用渦旋振
蕩器懸浮細(xì)菌沉淀。(4)向離心管中加入250 U I Buffer P2，溫和地上下顛倒混勻4 6次，使菌體充分裂解。此時菌液應(yīng)變得粘稠。所用時間不應(yīng)超過5min，以免質(zhì)粒受損傷。(5)向離心管中加入350iil Buffer N3，上下顛倒混勻4_6次，此時出現(xiàn)白色絮狀沉淀。(6) 13000r/min 離心 IOmin,吸取上清，加入到已裝入 Collection Tube 的 SpinColumn CM中，注意不要吸出沉淀。(7) 13000r/min 離心 30_60s,倒掉 Collection Tube 中的廢液,將 Spin Column CM放回 Collection Tube 中。(8)向 Spin Column CM 加入 500iil Buffer PB, 13000r/min 離心 30_60s,倒掉Collection Tube 中的廢液,將 SpinColumn CM 重新放回 Collection Tube 中。(9)向 Spin Column CM 中加入 700iil Buffer PW, 13000r/min 離心 30_60s,倒掉Collection Tube 中的廢液,將 Spin Column CM 重新放回收 Collection Tube 中。(10)向 Spin Column CM 中加入 500iil Buffer PW, 13000r/min 離心 lmin,倒掉Collection Tube 中的廢液,將 Spin Column CM 重新放回收 Collection Tube 中。(11) 13000r/min離心lmin,倒掉廢液。將Spin Column CM置于室溫數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附膜上殘余的Buffer PW。(12)將Spin Column CM置于一個新的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50 u I Buffer EB,室溫放置I 2min, 13000r/min離心lmin,將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。3. 2分別用NaeI和Sph I單酶切提取的質(zhì)粒。NaeI酶切體系為NaeI lul,IOXBuffer 2 yl、質(zhì)粒10 yl、去離子水9 yl。37 °C酶切4h。Sph I酶切體系為SphI I Iu IUOXBuffer 2 yl、質(zhì)粒10 yl、去離子水9 yl。37°C酶切4h。酶切產(chǎn)物用10g/L的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。結(jié)果顯示從篩選的陽性轉(zhuǎn)化菌中提取的質(zhì)粒經(jīng)酶切得到片段長度與預(yù)期片段長度3459bp符合，證明該陽性轉(zhuǎn)化菌為構(gòu)建正確的重組L. Iactis菌株，將其命名為L. lactis NZ3900/pNZ8110。采用含 150ml/L甘油和 10 y g/ml 氯霉素的 GM17 培養(yǎng)基于-80°C保存該菌株。
實(shí)施例3構(gòu)建表面展示表達(dá)EGFP的L. Iactis表達(dá)載體表面展示表達(dá)EGFP的L. Iactis表達(dá)載體的構(gòu)建參見圖4I EGFP基因的PCR擴(kuò)增根據(jù)Genbank核酸數(shù)據(jù)庫中EGFP基因序列(GenBank: JN255744. I)，應(yīng)用生物軟件Primer5. 0 設(shè)計(jì) PCR 引物，上游引物 P3 序列為 5-ATAGCCGGCATG GTGAGCAAGGGCGAGG-3’ (SEQID NO. 6)，在其5’端引入Nae I限制件酶切位點(diǎn)下游引物P4序列為5-ACATGCATGCCTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3’ (SEQ ID NO. 7)，在下游引物5’端引入Sph I限制性酶切位點(diǎn)。PCR反應(yīng)體系以質(zhì)粒pIRES2_EGFP(美國BD Biosciences Corporation)為模板，配制反應(yīng)體系20iiM的上游引物liil，20iiM的下游引物liil，2XTaq PCR Master Mix25 u 1，pIRES2-EGFP 質(zhì)粒 Iu I，加去離子水至 50u I0PCR循環(huán)條件97°C預(yù)變性 5min，94°C變性 45s，62°C退火 45s，72°C延伸 60s，共 30 個循環(huán)，最后72°C延伸IOmin。PCR產(chǎn)物分析取3 ill PCR反應(yīng)產(chǎn)物，于I. 0%瓊脂糖凝膠中電泳，電壓為5V/cm，用DNA Marker做分子量標(biāo)記，電泳20min,用凝膠圖像分析儀進(jìn)行分析。2. EGFP基因及表達(dá)載體pNZ81 IO-IysM的雙酶切用Nael+SphI分別雙酶切EGFP基因和表達(dá)載體pNZ8110_lysM。酶切體系質(zhì)粒pNZ81 IO-IysM 或 EGFP 基因 25 ii I，10XBuffer 5 u I, Sph I I u I, Nae I liU，去離子水18 u I037°C酶切12h，65°C水浴20min滅活內(nèi)切酶。采用10g/L瓊脂糖凝膠對EGFP基因和pNZ81 IO-IysM雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析。3.參照凝膠回收試劑盒(杭州愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司)說明回收EGFP基因和質(zhì)粒pNZ81 IO-IysM的雙酶切產(chǎn)物。4.￡6 基因與口似8110-178] 的連接將凝膠回收的EGFP基因與載體pNZ8110-lysM的酶切產(chǎn)物用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接。連接反應(yīng)體系10 X Buffer 2 yl，T4DNA 連接酶 I yl，EGFP 基因 8 iil，pNZ8110-lysM載體2iil，去離子水7iil。于16°C進(jìn)行連接反應(yīng)16h。5. E. coli MC1061菌株感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化采用的技術(shù)方法與實(shí)施例I相同。6. E. coli陽性轉(zhuǎn)化菌的PCR鑒定從LB培養(yǎng)基上挑取單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)約14h，取菌液為PCR模板。PCR反應(yīng)體系20iiM EGFP上游引物I iil，20 ii M EGFP下游引物I yl，2XTaq PCRMaster Mix 25 yl，菌液2 yl，加去離子水至50 iU。產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖電泳。PCR反應(yīng)條件97°C預(yù)變性5min，94°C變性45s，62。。退火45s，72。。延伸60s，共30個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。用10g/L的瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。7. L. lactis NZ3900菌株的轉(zhuǎn)化與陽性轉(zhuǎn)化菌的鑒定取經(jīng)PCR鑒定為構(gòu)建正確的E. coli陽性轉(zhuǎn)化菌的菌液，采用常規(guī)大腸桿菌質(zhì)粒提取法(堿裂解法)提取質(zhì)粒[J.薩姆布魯克和D. W拉塞爾著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002]，將Iiil提取的質(zhì)粒與40 ill L. lactis NZ3900感受態(tài)細(xì)胞混合，進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，電擊參數(shù)為2. 0KV,25 u F、200 Q，電擊后立即加入800 U I恢復(fù)培養(yǎng)基，恢復(fù)培養(yǎng)2h，取適量菌液涂于含氯霉素(10 U g/ml)的GM17培養(yǎng)板上，待菌液吸收完全后，于30°C、5%C02培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)40h，篩選鑒定陽性轉(zhuǎn)化菌。挑取單菌落接種于含氯霉素(IOi1 g/ml)的GM17液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h。取菌液按照實(shí)施例2所述的L. Iactis陽性轉(zhuǎn)化菌中質(zhì)粒提取方法提取質(zhì)粒，取10 ii I質(zhì)粒用Sph I進(jìn)行單酶切，另取10 ii I質(zhì)粒,用Nae I和Sph I進(jìn)行雙酶切，37°C酶切12h，65°C滅活20min，用10g/L的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。取酶切鑒定結(jié)果為構(gòu)建正確的質(zhì)粒，送交北京華大基因公司，對質(zhì)粒中EGFP基因進(jìn)行測序。結(jié)果如下以pIRES2-EGFP質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增EGFP基因，取擴(kuò)增產(chǎn)物3iil于10g/L的瓊脂糖凝膠中電泳。結(jié)果顯示，擴(kuò)增的片段長度與預(yù)期的長度723bp符合(圖5)。E. coli陽性轉(zhuǎn)化菌的菌液PCR鑒定結(jié)果顯示，擴(kuò)增片段長度與預(yù)期長度723bp符 合(圖6)。從培養(yǎng)的L. Iactis轉(zhuǎn)化菌中提取重組質(zhì)粒，并進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切產(chǎn)生的片段大小均與預(yù)期大小一致(圖7);對該重組質(zhì)粒中EGFP基因進(jìn)行測序的結(jié)果顯示，該重組質(zhì)粒中含有SEQ ID NO. 8所示的核苷酸序列，該核苷酸序列與報道的EGFP基因序列(GenBank:JN255744. I) 一致，證明此重組質(zhì)粒即為構(gòu)建成功的可表面展示表達(dá)EGFP的L. Iactis表達(dá)載體，將此表達(dá)載體命名為pNZ8110-EGFP_lysM，將含有pNZ81 IO-EGFP-IysM 的乳酸乳球菌命名為 L. lactis NZ3900/pNZ81IO-EGFP-IysM0 采用含150ml/L甘油和10 u g/ml氯霉素的GM17培養(yǎng)基于_80°C保存該菌株。實(shí)施例4L. lactis NZ3900/pNZ81IO-EGFP-IysM 的誘導(dǎo)表達(dá)I. L. lactis NZ3900/pNZ81 lO-EGFP-lysM 的活化取-80°C 凍存的菌株 L. lactis NZ3900/pNZ8110-EGFP-lysM,劃線接種于含10 U g/ml氯霉素的GM17培養(yǎng)基平板上，在30°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約40h。挑取單菌落接種于4ml含IOii g/ml氯霉素GM17液體培養(yǎng)基中，30°C、5%C02培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)12h，即成為活化種子菌液。2. L. lactis NZ3900/pNZ81IO-EGFP-IysM 菌株的誘導(dǎo)表達(dá)取活化種子菌液400 ill轉(zhuǎn)種于IOml含IOii g/ml氯霉素的GM17液體培養(yǎng)基，30°C、5%C02培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)至OD6tltl為0. 3 0. 4時，加入誘導(dǎo)劑Nisin至終濃度為40ng/ml，誘導(dǎo) 5h。同時以菌株 L. lactis NZ3900 和 L. lactis NZ3900/pNZ8110 為陰性對照。3. L. lactis NZ3900/pNZ8110-EGFP_lysM 菌株表達(dá) EGFP 的鑒定取100 U I 菌體,4°C, 3000r/min,離心 IOmin,菌體沉淀用 PBS( IOmM Na2HPO4, 2. 7mMKCl,137mM NaCl，2mM KH2PO4, pH 7. 4)洗滌 3 次，菌體重懸于 100 yl PBS 中，涂 Iyl 于載玻片上，突光顯微鏡下觀察。結(jié)果如下在熒光顯微鏡下觀察L. lactis NZ3900/pNZ8110-EGFP_lysM有明顯的綠色熒光出現(xiàn)，而陰性對照菌株無明顯熒光出現(xiàn)(圖8)，證實(shí)以L. lactis NZ3900為宿主菌、pNZ81 IO-IysM為表達(dá)載體的表達(dá)系統(tǒng)可以表面展示表達(dá)外源蛋白。序列表SEQUENCE LISTING<110> 鄭州大學(xué)
權(quán)利要求
1.一種可在乳酸乳球菌表面展不表達(dá)異源基因的載體，其特征在于包含有SEQ IDNO. I所示的核苷酸序列。
2.—種DNA序列，其特征在于包含有SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列。
3.一種大腸埃希氏菌(Escherichia coli)MC1061/pNZ8110_lysM,其特征在于保藏編號為 CGMCC NO. 6116。
4.一種如權(quán)利要求I所述可在乳酸乳球菌表面展示表達(dá)異源基因的載體的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟 1)以乳酸乳球菌NZ3900菌株基因組DNA為PCR模板，應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增乳酸乳球菌自溶素(AcmA)錨定區(qū)基因lysM，IysM具有序列表中SEQ ID NO. 2所述的核苷酸序列； 2)分別將IysM基因與表達(dá)載體pNZ8110(SEQID NO. 3)進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)回收純化后用于定向連接； 3)用IysM與載體pNZ8110的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Escherichiacoii MC1061菌株； 4)通過氯霉素抗性篩選和PCR、酶切、測序鑒定，得到陽性轉(zhuǎn)化菌株； 5)培養(yǎng)得到的陽性轉(zhuǎn)化菌株，提取質(zhì)粒，得到可在乳酸乳球菌表面展示表達(dá)異源基因的載體，將其命名為pNZ8110-lysM。
5.一種如權(quán)利要求I所述乳酸乳球菌表達(dá)載體在表達(dá)外源蛋白中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述乳酸乳球菌表達(dá)載體在表達(dá)外源蛋白中的應(yīng)用，其特征在于所述外源蛋白的編碼基因是幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)基因，包括采用PCR方法以幽門螺桿菌DNA為模板擴(kuò)增得到的基因或基因片段。
7.一種利用如權(quán)利要求I所述的乳酸乳球菌表達(dá)載體的乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng)，其特征在于以所述乳酸乳球菌表達(dá)載體為外源蛋白表達(dá)載體，以L. lactis NZ3900菌株為表達(dá)宿主菌。
8.—種如權(quán)利要求7所述的乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng)在表達(dá)外源蛋白方面的應(yīng)用。
9.一種如權(quán)利要求3所述的大腸桿菌重組菌(Escherichia coli)MC1061/pNZ8110-lysM在用于從培養(yǎng)的細(xì)菌中提取乳酸乳球菌表達(dá)載體pNZ8110-lysM方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種可在乳酸乳球菌表面展示表達(dá)異源基因的載體及其制備方法與應(yīng)用。該載體具有序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，含啟動子Pnis、lysM基因、分泌信號肽序列ssusp45、多克隆酶切位點(diǎn)、復(fù)制子repA和repC元件。該載體的構(gòu)建方法應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增乳酸乳球菌NZ3900菌株自溶素(AcmA)錨定區(qū)基因lysM，將lysM與載體pNZ8110經(jīng)酶切后進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化E.coli MC1061菌株，陽性轉(zhuǎn)化菌經(jīng)酶切和測序鑒定后，提取重組質(zhì)粒，得到本發(fā)明提供的表達(dá)載體。該載體功能將外源基因與該載體連接，轉(zhuǎn)入乳酸乳球菌NZ3900中，經(jīng)乳酸鏈球菌素(nisin)誘導(dǎo)可實(shí)現(xiàn)外源基因的表達(dá)和表達(dá)蛋白與宿主細(xì)胞壁的結(jié)合。該載體可用于包括疫苗抗原在內(nèi)的外源蛋白的表達(dá)，具有廣泛的應(yīng)用范圍。
文檔編號C12N15/66GK102796756SQ20121021828
公開日2012年11月28日 申請日期2012年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月28日
發(fā)明者段廣才, 張榮光, 程文濱, 范清堂, 張衛(wèi)東, 郗園林, 陳帥印 申請人:鄭州大學(xué)