專利名稱：無血清制備重組人類凝血因子ix的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬基因治療技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于作為檢測標(biāo)準(zhǔn)樣品或血友
病B治療藥物的重組hFIX (人凝血因子IX)的制備與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
血友病是一組遺傳性出血性疾病，是由于血液中某些凝血因子的缺乏而導(dǎo) 致的嚴(yán)重凝血功能障礙。其中包括血友病A (因子VII、 AHG缺乏)，血友病B (因 子IX、 PTC缺乏)及血友病C (因子XI、 PTA缺乏)。
血友病B(hemophilia B)是人凝血因子IX (human clotting factor IX, hFIX)缺乏所引起的一種嚴(yán)重凝血功能障礙性疾病。編碼hFIX的基因(hFIX)位 于人X染色體長臂遠(yuǎn)端，被定位于Xd27. 1區(qū)域，全長34 kb，由8個(gè)外顯子和7 個(gè)內(nèi)含子組成，cDNA全長2802bp,編碼區(qū)1383bp。 (NM_000133)該病臨床表現(xiàn) 為自發(fā)性出血,嚴(yán)重者可導(dǎo)致關(guān)節(jié)變形或殘疾。血友病B嚴(yán)重威脅著人類健康， 為X染色體隱性遺傳疾病，在男性中的發(fā)病率為三萬分之一。血友病不僅給患者 帶來身體和精神上的痛苦，也使之承受著沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
血友病A多見(l-2/萬)，約為血友病B的七倍左右。由于患者血漿中缺乏 某種凝血因子，患者的血管破裂后，血液較正常人不易凝結(jié)，因而會(huì)流去更多 的血。體表的傷口所引起的出血通常并不嚴(yán)重，而內(nèi)出血?jiǎng)t嚴(yán)重得多。內(nèi)出血 一般發(fā)生在關(guān)節(jié)、組織和肌肉內(nèi)部。當(dāng)內(nèi)臟出血或顱內(nèi)出血發(fā)生時(shí)，常常危及 生命。關(guān)節(jié)出血在血友病患者中是很常見的。血液淤積到患者的關(guān)節(jié)腔后，會(huì) 使關(guān)節(jié)活動(dòng)受限，使其功能暫時(shí)喪失，關(guān)節(jié)反復(fù)出血?jiǎng)t可導(dǎo)致滑膜炎和關(guān)節(jié)炎， 造成關(guān)節(jié)畸形，因此很多血友病患者有不同程度的殘疾。
因凝血因子的活性水平也不同，據(jù)此可將血友病患者分為重型、中型和輕型。重度血友病患者的血漿中所缺乏的凝血因子的活性程度達(dá)不到正常人的3%, 一個(gè)月內(nèi)可數(shù)次出血，出血常常在沒有明顯原因的情況下發(fā)生，稱為自發(fā)出血。 關(guān)節(jié)出血很普遍。中度血友病患者的因子活性程度為正常人的3%至6%，他們的 出血常常由小創(chuàng)傷導(dǎo)致，例如運(yùn)動(dòng)損傷。關(guān)節(jié)出血一般在外傷后發(fā)生。
輕度血友病患者的因子活性程度為正常人的6%至25°/。， 一般只在外科手術(shù)、 拔牙或嚴(yán)重外傷后出血不止。關(guān)節(jié)出血較少。血友病的治療分為局部止血治療 與替代療法。前者一般包括局部壓迫、放置冰袋、局部用血漿、止血粉、凝血 酶或明膠海綿貼敷等。替代療法包括輸血漿為輕型血友病的首選有效療法， 新鮮血漿和新鮮冰凍血漿含有所有的凝血因子。目前替代療法依然是血友病最 有效以及在緊急情況下可行的方法。
血友病作為一種出血性疾病嚴(yán)格意義上講是止血障礙。臨床治療就是在緊 急情況下為病人止血以挽救生命。但是，血友病標(biāo)準(zhǔn)的治療應(yīng)該是預(yù)防性治療， 病人可以依據(jù)具體情況一周使用2-3次血液替代品，從而可以完全恢復(fù)正常生 活以及防止出現(xiàn)嚴(yán)重慢性并發(fā)癥。
盡管目前的狀態(tài)是血液制品依然占據(jù)主流，但是重組制劑以其安全性日益 獲得醫(yī)療體系和病人的認(rèn)同。拜科奇于2000年獲得美國FDA和歐盟EMEA批準(zhǔn)， 目前已在超過54個(gè)國家被批準(zhǔn)使用。拜耳醫(yī)藥保健的血友病治療藥物"拜科奇" (基因重組人凝血因子VID)已獲得國家食品藥品監(jiān)督管理局(SFDA)批準(zhǔn)在中
國上市。這是目前在國內(nèi)上市的第一個(gè)基因重組人凝血因子vm。事實(shí)上，在發(fā)
達(dá)國家，血友病的預(yù)防和治療用藥是一個(gè)頗具規(guī)模的市場，除了拜耳先靈之外，
全球還有美國百特和美國惠氏也生產(chǎn)基因重組人凝血因子vin，其中，百特的銷 售額與拜耳的旗鼓相當(dāng)。
血液制品的安全性隱患是重組VIII因子與重組FIX因子治療血友病的發(fā)展 趨勢的基本原因，其次供求關(guān)系也是一個(gè)重要的因素。這兩個(gè)因素在可以預(yù)期 的將來沒有緩解的可能，可能越來越嚴(yán)重。缺血已經(jīng)是一個(gè)曰常的醫(yī)療課題， 而HIV， HBV, HCV在我國日益嚴(yán)重的事態(tài)也是的血液制品的安全性難于改善。
這構(gòu)成了對(duì)重組因子的剛性需求的源泉。另一方面，隨人民收入水平提高，國 家富強(qiáng)，無論是國家還是家庭都有充分治療這些可以治療的病人的能力與需求。所以，可以預(yù)見病人的就診率與充分治療率都將上升，從而^f吏治療水平達(dá)到水 解平均水平，并且逐步達(dá)到發(fā)達(dá)國家水平。國內(nèi)市場在可以預(yù)期的將來是一個(gè) 穩(wěn)定成長的市場。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明屬生物技術(shù)和基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及重組人類凝血因子IX的 制備與應(yīng)用。首先構(gòu)建CMV (巨細(xì)胞病毒)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)人類凝血因子IX (hFIX)的質(zhì)粒，用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CH0-K1細(xì)胞(中國倉鼠卵巢細(xì)胞K1抹)，篩選 穩(wěn)定高表達(dá)hFIX的細(xì)胞抹，擴(kuò)增培養(yǎng)高表達(dá)細(xì)胞系，并且收集細(xì)胞培養(yǎng)上清， 使用免疫層析純化hFIX，蛋白經(jīng)電泳和質(zhì)譜分析確定純度達(dá)到99%,保存于10% 蔗糖生理鹽水溶液中并凍干，使用前用無菌水溶解。該重組hFIX蛋白與人類血 液來源的hFIX有相同的分子組成和生物活性。用于血友病B小鼠模型可以獲得 緩解。該重組hFIX蛋白可以用作臨床檢測hFIX等試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)品，也可以治療 血友病B等需要補(bǔ)充hFIX的疾病。
具體而言，本發(fā)明涉及一種全程無動(dòng)物蛋白體系的制備重組hFIX蛋白質(zhì)的 方法，其包括如下步驟首先，進(jìn)行無血清馴化CH0-K1細(xì)胞；其次構(gòu)建CMV啟 動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)人類凝血因子IX的質(zhì)粒，用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CH0-K1細(xì)胞，篩選穩(wěn) 定高表達(dá)hFIX的細(xì)胞抹，擴(kuò)增培養(yǎng)高表達(dá)細(xì)胞系，并且收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，嫂二 用免疫層析純化hFIX,蛋白經(jīng)電泳和質(zhì)譜分析確定純度達(dá)到99%,保存于10% 蔗糖生理鹽水溶液中并凍干，使用前用無菌水溶解。
本發(fā)明還涉及一種采用上述方法制備得到的重組hFIX蛋白。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種上文所述的重組hFIX蛋白> 其中所述的重組hFIX 蛋白與人類血液來源的hFIX有相同的分子組成和生物活性。
本發(fā)明還涉及上文所述的重組hFIX蛋白在制備治療和檢驗(yàn)血友病藥物中 的應(yīng)用。
本發(fā)明的主要內(nèi)容在于提供一種無血清發(fā)酵制備重組人類凝血因子IX。 1.無血清馴化CHO-Kl細(xì)胞
從ATCC購買CHO-Kl細(xì)胞，直接用無血清培養(yǎng)基常規(guī)復(fù)蘇培養(yǎng)，傳代消化時(shí)使用重組胰蛋白酶消化，然后繼續(xù)作有限稀釋無血清培養(yǎng)，篩選狀態(tài)良好的
適應(yīng)無血清生長條件的細(xì)胞作為無血清馴化CH0-K1細(xì)胞種子細(xì)胞，常規(guī)無血清 凍存。
2. 采用hFIX基因轉(zhuǎn)染無血清CH0-K1細(xì)胞以及種子庫構(gòu)建 常規(guī)4吏用無血清條件用lipofect2000介導(dǎo)pRBS-CMVhFIX轉(zhuǎn)染CH0-K1、
G418篩選、有限稀釋后挑去24個(gè)單個(gè)克隆、擴(kuò)增并取培養(yǎng)基上清用免疫酶標(biāo) 方法檢測不同克隆hFIX分泌水平。將高表達(dá)克隆進(jìn)一步擴(kuò)增建立一級(jí)種子庫。 一級(jí)種子庫擴(kuò)增到109形成生產(chǎn)種子庫并-196。C保存。
3. hFIX表達(dá)與純化
采用無血清貼壁培養(yǎng)，收集上清常規(guī)SD除毒，離心除細(xì)胞，直接上注到交 聯(lián)又抗hFIX單克隆抗體H4B5 (參見復(fù)旦學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2000年03期， 邱信芳等)的argarose樹脂柱，常規(guī)洗脫，通過超濾置換為10%濕糖生理鹽水 保存液，hFIX定量分析，過濾除菌，分裝凍干保存。
4. 重組hFIX用于檢測凝血因子FIX檢測和治療血友病B.
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了 一種新的無血清發(fā)酵制備重組人類凝血因
子IX的方法，該方法全程無動(dòng)物蛋白體系，從而降低了可能存在的污染性，提
高了制備產(chǎn)率，產(chǎn)品治療穩(wěn)定，效果應(yīng)用良好。
下面將結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步詳述本發(fā)明的技術(shù)方案 本發(fā)明所用的試劑、細(xì)胞、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均為商業(yè)化購得，所采用的實(shí)驗(yàn)方法、
效果評(píng)價(jià)方法也均為本領(lǐng)域常用的常規(guī)方法，其應(yīng)當(dāng)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，
因此在此不再贅述。


圖1為重組hFIX制備工藝圖。其中左側(cè)方框內(nèi)為主要工藝程序，右側(cè)文字 為對(duì)應(yīng)工藝過程的主要結(jié)果，箭頭代表工藝的順序關(guān)系。 圖2為表達(dá)質(zhì)粒pRBS-CMVhFIX圖譜。
圖3為種子細(xì)胞篩選結(jié)果。其中圖3A為hFIX標(biāo)準(zhǔn)稀釋曲線；圖3B為24個(gè)克隆的hFIX表達(dá)檢測，表現(xiàn)為細(xì)胞林表達(dá)物與標(biāo)準(zhǔn)稀釋hFIX免疫酶標(biāo)掃描 數(shù)據(jù)。
圖4為重組hFIX蛋白純度檢測，顯示HPLC檢測重組hFIX純度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 圖5為重組hFIX用于治療血友病B療效觀察結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
1. 無血清別化CHO-Kl
CH0-K1細(xì)胞(中國倉鼠卵巢細(xì)胞Kl抹)購自美國典型培養(yǎng)物保存中心 (CCL-61 ,CH0-K1)。凍存細(xì)胞"。C水浴解凍，細(xì)胞用無血清清洗，直接用 5ml無血清培養(yǎng)基(無血清培養(yǎng)基購于Gibco, CHO-S-SFM)在"。C , 5%0)2條 件下培養(yǎng)，隔天換相同培養(yǎng)基，在有明顯克隆群落時(shí)用重組胰蛋白酶(Promga) 消化，稀釋細(xì)胞到103/ml,分別接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待克隆形成后，在顯 微鏡下篩選生長快，細(xì)胞體積大以及無中毒顆粒的細(xì)胞作為CH0-K1無血清適宜 細(xì)胞，并擴(kuò)增保存。
2. CH0-K1轉(zhuǎn)hFIX基因修飾
表達(dá)hFIX的質(zhì)粒(pRBS-CMVhFIX)由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，其構(gòu)建方法是本領(lǐng)域 普通技術(shù)人員熟知的常規(guī)載體構(gòu)建方法，其特點(diǎn)是hFIX表達(dá)框架中在相當(dāng)于 第一于第二外顯子對(duì)應(yīng)的序列中間插入一個(gè)內(nèi)含子序列，從而提高h(yuǎn)FIX在細(xì)胞 中的表達(dá)水平(具體方法參見"中國科學(xué)"，C輯，1998，28巻，5期，張克中等)。 表達(dá)框架由CMV啟動(dòng)字驅(qū)動(dòng)，以適應(yīng)在細(xì)胞中高效表達(dá)，在CMV啟動(dòng)子前面附 加RBE序列，可以配合rep蛋白介導(dǎo)在人類細(xì)胞定點(diǎn)整合。質(zhì)粒常規(guī)用Qiagen
的無內(nèi)毒素抽提試劑盒完成。
pRBECMV-hFIX轉(zhuǎn)染CH0-K1細(xì)胞采用Invitrogen的lipofect2000試劑按 相關(guān)說明常規(guī)完成。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)加G418至最終濃度500ng/ml培養(yǎng)，直到培 養(yǎng)板上出現(xiàn)單個(gè)〉40細(xì)胞的獨(dú)立克隆。用接種針刮去單克隆轉(zhuǎn)移到含有G418 的24孔板繼續(xù)培養(yǎng)。能繼續(xù)生長的克隆被認(rèn)定為穩(wěn)定地整合克隆。用于進(jìn)一步 鑒定與篩選hFIX表達(dá)細(xì)胞克隆。
73 .穩(wěn)定高表達(dá)hFIX細(xì)胞克隆分離鑒定與種子庫建立
由G418篩選的穩(wěn)定細(xì)胞抹從24孔板用重組胰蛋白酶消化，轉(zhuǎn)移到6孔板 繼續(xù)培養(yǎng)，在細(xì)胞長到占底部70%左右開始48小時(shí)取培養(yǎng)基用酶聯(lián)免疫反應(yīng)測 定細(xì)胞分泌hFIX的水平(中國科學(xué)，C輯，1998，28巻，5期，張克中等)，而細(xì) 胞繼續(xù)擴(kuò)增儀構(gòu)建地一級(jí)種子庫。表達(dá)達(dá)到hFIX〉 500ng/ml的細(xì)胞抹被認(rèn)為是 穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞抹，對(duì)應(yīng)的細(xì)胞抹進(jìn)一步擴(kuò)增到107細(xì)胞，構(gòu)成一級(jí)種子冷凍 保存。
最高表達(dá)水平的5抹細(xì)胞各取一只保存細(xì)胞復(fù)蘇，分別擴(kuò)增到1010細(xì)胞。 收集所有細(xì)胞培養(yǎng)基用于檢測hFIX表達(dá)于探索純化條件，細(xì)胞風(fēng)別凍存。構(gòu)成 二級(jí)種子庫。二級(jí)種子庫的細(xì)胞直接提供生產(chǎn)使用。
4. 生產(chǎn)性表達(dá)
二級(jí)種子庫中的最高表達(dá)細(xì)胞林常規(guī)擴(kuò)增，以l: 2傳代的方法擴(kuò)增細(xì)胞， 一般在細(xì)胞長到70%后48小時(shí)傳代，同時(shí)收集培養(yǎng)基用于純化，暫時(shí)不純化的 培養(yǎng)基-70。C保存。同時(shí)檢測hFIX表達(dá)水平變化。當(dāng)培養(yǎng)基hFIX水平低于450 時(shí)丟棄相應(yīng)的細(xì)胞。
5. 從維持轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的培養(yǎng)基中純化hFIX
收集合格生產(chǎn)性(400ng/ml)表達(dá)細(xì)胞培養(yǎng)基，4°C 1S000rpm離心30分 鐘，收集上清液，通過0. 45um孔徑的濾膜后加樣到10cm/10ml的預(yù)制argarose-抗FIX抗體H4B5柱，磷酸鹽pH梯度洗脫，實(shí)時(shí)監(jiān)控蛋白洗脫情況。常規(guī)SD 除病毒處理消除可能的病毒污染。
用超濾管(Mircom， 3000D)濃縮重組hFIX并用10°/。蔗糖生理鹽水置換磷 酸鹽洗脫液。用班氏試劑檢測總蛋白質(zhì)含量，用酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測hFIX含量。 調(diào)解重組蛋白濃度到5000ng/ml。
濃縮重組蛋白通過025um孔徑的除菌濾膜，清除可能的細(xì)菌污染。分裝， 冷凍干燥。低溫(-20。C)保存。
86，重組hFIX治療血友病B的試驗(yàn)
用重組hFIX 100ng/g尾靜脈注射以及用等體積10%蔗糖生理鹽水空白對(duì)照 處理FIX KO血友病B模型小鼠。計(jì)數(shù)鼠尾部分剪除出血時(shí)間愈出血量以評(píng)價(jià)療 效。確定重組hFIX生物活性。并觀察急性免疫反應(yīng)。確定推薦治療劑量。實(shí)驗(yàn) 結(jié)果參見圖5所示。
該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，按照本發(fā)明方法制備得到的重組hFIX能有效的治療和檢 驗(yàn)血友病。
權(quán)利要求
1、一種全程無動(dòng)物蛋白體系的制備重組hFIX蛋白質(zhì)的方法，其包括如下步驟首先，進(jìn)行無血清馴化CHO-K1細(xì)胞；其次構(gòu)建CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)人類凝血因子IX的質(zhì)粒，用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞，篩選穩(wěn)定高表達(dá)hFIX的細(xì)胞株，擴(kuò)增培養(yǎng)高表達(dá)細(xì)胞系，并且收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，使用免疫層析純化hFIX，蛋白經(jīng)電泳和質(zhì)譜分析確定純度達(dá)到99％，保存于10％蔗糖生理鹽水溶液中并凍干，使用前用無菌水溶解。
2、 如權(quán)利要求l所述的方法制備得到的重組hFIX蛋白。
3、 如權(quán)利要求2所述重組hFIX蛋白，其中所述的重組hFIX蛋白與人類血 液來源的hFIX有相同的分子組成和生物活性。
4、 如權(quán)利要求2或3所述的重組hFIX蛋白在制備治療和檢驗(yàn)血友病藥物中 的應(yīng)用。
5、 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其中所述血友病為血友病B。
全文摘要
本發(fā)明涉及重組人類凝血因子IX的制備與應(yīng)用。該重組hFIX蛋白與人類血液來源的hFIX有相同的分子組成和生物活性。用于血友病B小鼠模型可以獲得緩解。該重組hFIX蛋白可以用作臨床檢測hFIX等試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)品，也可以治療血友病B等需要補(bǔ)充hFIX的疾病。
文檔編號(hào)C12N15/12GK101481692SQ200810155140
公開日2009年7月15日 申請日期2008年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月23日
發(fā)明者萬里明, 薛京倫, 陳金中 申請人:無錫萬順生物技術(shù)有限公司