專利名稱::提高動(dòng)物飼料利用率和/或生長(zhǎng)速度和/或減少脂肪積累的方法提高動(dòng)物銅料利用率和/或生長(zhǎng)速度和/或減少脂肪積累的方法本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?0100010.1、申請(qǐng)日為2000年1月3日、發(fā)明創(chuàng)造名稱為"提高飼料效率和家畜生長(zhǎng)速度的基因處理"的分案申請(qǐng)。本發(fā)明涉及施用內(nèi)源激素肽,具體地講是涉及施用含有以基因?yàn)榛A(chǔ)的物質(zhì)的內(nèi)源激素肽,以提高詞料效率和家畜的生長(zhǎng)速度。已有許多刺激家畜生長(zhǎng)速度并提高飼料轉(zhuǎn)化效率的方法。這些方法包括使用抗生素、化學(xué)物質(zhì)以及使用像天然或重組生長(zhǎng)激素(GH)或生長(zhǎng)激素釋放因子(GHRF)的生物化合物。這些方法中許多要么有副作用,要么太昂貴以至于不能在現(xiàn)有的農(nóng)場(chǎng)或牧場(chǎng)上實(shí)施。盡管過(guò)去經(jīng)常用抗生素添加物來(lái)提高生長(zhǎng)性能和詞料轉(zhuǎn)化,但由于現(xiàn)代化農(nóng)場(chǎng)管理方面的改進(jìn)和有向包括人在內(nèi)的其它動(dòng)物傳播抗生素抗性的潛在危險(xiǎn),抗生素添加物帶來(lái)的有益效果正逐漸消失。在生物改進(jìn)方面最早的嘗試是注射腦垂體提取物,腦垂體GH就是后來(lái)從中分離并純化出來(lái)的。GH對(duì)身體組織有各種作用,最終導(dǎo)致生長(zhǎng)速度和體重的增加。在體內(nèi),GH刺激蛋白質(zhì)的合成,脂肪的裂解,并刺激骺生長(zhǎng)。這些作用是由生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素例如胰島素樣生長(zhǎng)因子I(IGF-I)的增量調(diào)節(jié)而介導(dǎo)的。腦垂體GH的產(chǎn)生和釋放受兩種下丘腦激素肽的控制。促生長(zhǎng)素抑制素的抑制作用和GHRF的刺激作用調(diào)節(jié)胞質(zhì)GH水平。隨動(dòng)物年齡的增加,GHRF~>GH—IGF-I軸發(fā)生不利的變化。因此,在較老的動(dòng)物包括人中,GH的產(chǎn)生速率降低,IGF-I對(duì)GH和GHRF的減少作出反應(yīng)。這會(huì)引起骨質(zhì)疏松、瘦肉減少以及軀干脂肪沉積的增加。因此,已經(jīng)用從腦垂體提取的GH補(bǔ)充GH的天然減少并促進(jìn)生長(zhǎng)。但是,所述處理還帶來(lái)了偶發(fā)性病原體傳播的危險(xiǎn)。此外,所述處理的主要缺陷是所涉及的費(fèi)用太高。由于GH是一種蛋白質(zhì),所以,很容易被腸酶降解,因此,必須以注射施用。另外,由于GH的血清半衰期短,因此,得每天施用GH。這進(jìn)一步增加了處理費(fèi)用,使其只適用于對(duì)人的治療。重組DNA技術(shù)的發(fā)展和使用象大腸桿菌這樣的微生物以生產(chǎn)哺乳動(dòng)物GH,意味著可以大量生產(chǎn)用于治療的同源GH制品,由此降低成本。另外,通過(guò)在一級(jí)結(jié)構(gòu)中的工程化取代而在蛋白質(zhì)穩(wěn)定化方面取得的最新進(jìn)展和緩釋制劑的發(fā)展已經(jīng)使給藥頻率減少至每周一次或每?jī)芍芤淮?。由于治療成本的降低,因此,在商業(yè)上可用于促進(jìn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。例如,目前在美國(guó)有三分之一的乳牛場(chǎng)在使用重組牛GH來(lái)促進(jìn)牛奶的生產(chǎn)。用豬GH處理豬可提高生長(zhǎng)率,增加屠體蛋白質(zhì),同時(shí)減少脂肪的比例。已由PalmerJ.Holden(Porcinesomatotropin(pST),BiotechnologyInformationSeries(Bio-4),IowaStateUniversity,1993)就豬GH對(duì)豬生長(zhǎng)及有關(guān)安全和經(jīng)濟(jì)方面的益處作了綜述。將二十年來(lái)的研究數(shù)據(jù)做一總結(jié),說(shuō)明注射了GH的豬生長(zhǎng)速度提高15%,而消耗的飼料減少21%,同時(shí),使肌肉蛋白增加并且背部脂肪減少。但是,在生產(chǎn)率方面的這些提高要付出相當(dāng)?shù)拇鷥r(jià)。首先,由于GH的血清半衰期短并且被迅速?gòu)难褐星宄?,所以必須每天注射GH才有效。因此,在為期一至兩個(gè)月的修整期內(nèi),必須每天給豬施用高達(dá)4mg的豬GH蛋白以維持血漿GH水平并促進(jìn)生長(zhǎng)。這就使得每頭豬最終總共獲得了高達(dá)400mg的GH。其次,高劑量可能是有毒的并會(huì)引起某些副作用,例如呼吸困難,參見(jiàn)美國(guó)專利5134120。此外,至今在文獻(xiàn)中所記載的處理方案過(guò)于繁瑣并且對(duì)動(dòng)物來(lái)講是創(chuàng)傷性的。盡管美國(guó)專利5015626和5134120分別記載了使用豬GH來(lái)改善肉的質(zhì)量和促進(jìn)體重增加,但是目前在以GH肽為基礎(chǔ)的生長(zhǎng)促進(jìn)劑方面的技術(shù)還未達(dá)到足以用于商品化農(nóng)業(yè)的水平。生長(zhǎng)激素釋放因子(GHRF)的發(fā)現(xiàn)開(kāi)拓了一種更好地促進(jìn)生長(zhǎng)的方法。GHRF是一種由下丘腦分泌的肽激素,它特異性地刺激垂體前葉促生長(zhǎng)激素細(xì)胞合成和釋放GH。通過(guò)刺激內(nèi)源性GH的生產(chǎn),使所需的有效劑量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于GH的劑量,從而提供了成本更低、更符合生理模式的處理方法。然而,據(jù)我們所知,仍沒(méi)有令人滿意并且經(jīng)濟(jì)的用于家畜的處理方法。例如,在EP0289186中記載了每天施用兩次人GHRF蛋白注射液來(lái)刺激綿羊生長(zhǎng)的方法。但是,長(zhǎng)期注射人GHRF會(huì)引起綿羊的免疫應(yīng)答,對(duì)人蛋白產(chǎn)生中和抗體。這會(huì)降低這種處理方法的效率,并且人力和物力的浪費(fèi)使該方法變得不經(jīng)濟(jì)。GHRF肽注射液曾被用于持續(xù)地刺激豬GH的產(chǎn)生。盡管證實(shí)某些試驗(yàn)在引起體重增加和降低屠體脂肪含量上是成功的,但是快速清除的問(wèn)題意味著需要頻繁地給藥。因此,需要新的用于促進(jìn)生長(zhǎng)的補(bǔ)充GH的方法。'自從第一次證實(shí)了肌肉內(nèi)注射的質(zhì)粒DNA載體可被骨骼肌細(xì)胞吸收并在體內(nèi)表達(dá)數(shù)月,基于骨骼肌的基因治療方法在治療蛋白的全身傳遞方面的前景一直很好。這種可被分泌到循環(huán)系統(tǒng)到達(dá)遠(yuǎn)端靶位點(diǎn)由骨骼肌生產(chǎn)的重組蛋白非常適用于治療因血清蛋白不足而引起的疾病。盡管質(zhì)粒載體在蛋白表達(dá)方面的效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于病毒載體,但其優(yōu)點(diǎn)是免疫原性較低,并且不會(huì)整合到宿主基因組內(nèi)。因此,它們被認(rèn)為更安全一些。從而,質(zhì)粒載體特別適于治療蛋白在低濃度下有效的情況。因此,注射表達(dá)GHRF基因的質(zhì)粒載體是用于長(zhǎng)期補(bǔ)充足以促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)之有效劑量的GHRF的一種理想方法。此外,持續(xù)的GHRF產(chǎn)生可大大減少處理頻率,由此使成本降低至經(jīng)濟(jì)上適用的水平。最近表明,將含有受雞最小骨骼a-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子控制的人GHRF(hGHRF)的質(zhì)粒注射到小鼠肌肉內(nèi)后可引起血清GH水平的升高(Draghia-Akli等,自然生物技術(shù)(NatureBiotechnology),15,pl285-1289)。此外,據(jù)報(bào)道在注射3周后,生長(zhǎng)增加了約15%。但是,該方法引起了免疫應(yīng)答,表現(xiàn)在注射hGHRF基因21和28天后,抗hGHRF的中和抗體的血清水平增加。已證實(shí)注射質(zhì)粒中的基因的原位表達(dá)水平的限制因素是肌肉纖維攝入質(zhì)粒DNA的程度極低。為了提高h(yuǎn)GHRF表達(dá)的水平,Draghia-Akli及其同事在將質(zhì)粒DNA注射到再生的肌肉內(nèi)之前,首先注射丁哌卡因(一種已知的肌毒素物質(zhì))。盡管已經(jīng)證實(shí)了這可以通過(guò)增加肌肉纖維內(nèi)攝入的質(zhì)粒來(lái)提高表達(dá)水平,但是這種技術(shù)既不適宜也不宜用于供人消費(fèi)的飼養(yǎng)動(dòng)物。因此,本發(fā)明的目的是提供了一種通過(guò)施用內(nèi)源激素肽GHRF來(lái)刺激動(dòng)物,特別是家畜的生長(zhǎng)速度并提高詞料轉(zhuǎn)化效率的經(jīng)濟(jì)可行的方法。最起碼,本發(fā)明的目的是給公眾提供一種有用的選擇。因此,提供了一種通過(guò)提高飼料效率和/或動(dòng)物生長(zhǎng)速度和/或減少脂肪積累的方法,該方法包括施用由外源基因序列編碼的內(nèi)源激素肽GHRF以刺激GHRF的產(chǎn)生,所述外源基因序列含有編碼用于基因表達(dá)的DNA序列、編碼GHRF信號(hào)肽的互補(bǔ)DNA(cDNA)序列和編碼GHRF的cDNA序列。本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案是肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的各種啟動(dòng)子變體。根據(jù)本發(fā)明具體優(yōu)選的實(shí)施方案,肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子是骨骼肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。編碼骨骼肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的DNA序列最好含有骨骼肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的全部DNA序列。根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選的實(shí)施方案,所述外源基因序列還包括編碼所述啟動(dòng)子或GHRF3'非翻譯、含多聚腺苷酸信號(hào)區(qū)的DNA序列。根據(jù)本發(fā)明另一優(yōu)選的實(shí)施方案,所述外源基因序列還包括編碼抗生素抗性基因的DNA序列。由所述cDNA序列編碼的GHRF和其信號(hào)肽可以是天然的或重組的或合成的GHRF和其信號(hào)肽,或者是它們的生物活性片段或具有相似活性的類似物。本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案是啟動(dòng)子的DNA序列、編碼GHRF信號(hào)肽的cDNA序列和編碼GHRF的cDNA序列都是種特異性的。刺激GHRF產(chǎn)生的、作為DNA序列的外源手段優(yōu)選與可皮下施用的適宜載體混合。根據(jù)本發(fā)明具體優(yōu)選的實(shí)施方案,外源DNA序列經(jīng)肌肉內(nèi)施用。給每只動(dòng)物施用的剌激GHRF產(chǎn)生的、作為DNA序列的外源手段的量?jī)?yōu)選是每kg動(dòng)物體重1-100ng。本發(fā)明的另一方面是提供剌激GHRF內(nèi)源產(chǎn)生的外源基因序列,以提高飼料效率和/或動(dòng)物的生長(zhǎng)速度和/或減少動(dòng)物的脂肪積累,其中,所述外源基因序列含有編碼用于基因表達(dá)的啟動(dòng)子的DNA序列、編碼GHRF信號(hào)肽的cDNA序列和編碼GHRF的互補(bǔ)DNA(cDNA)序列。本發(fā)明的再一方面是提供制備提高詞料效率和/或動(dòng)物生長(zhǎng)速度和/或減少動(dòng)物脂肪積累的藥物的方法,該方法包括提供編碼用于基因表達(dá)的啟動(dòng)子的DNA序列,連接編碼GHRF信號(hào)肽的cDNA序列,再連接編碼GHRF的cDNA序列,以形成一基因序列,然后將所述肽與適宜的載體混合。從下列描述中,本發(fā)明的其它目的、特征、優(yōu)點(diǎn)和方面對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將是顯而易見(jiàn)^。但是應(yīng)理解,下列描述和具體實(shí)施例,盡管是表明木發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案,但是它們僅僅是說(shuō)明性的。在閱讀下列描述和本發(fā)明公開(kāi)的其它部分后,在公開(kāi)的本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的各種改變和修飾對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將是顯而易見(jiàn)的?,F(xiàn)在利用實(shí)施例并參考附圖來(lái)解釋本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案,其中圖1是pUPAGRF、pGHRF表達(dá)盒的圖示,其中包括啟動(dòng)子、pGHRF編碼區(qū)和多聚腺苷酸化信號(hào)的排列,同時(shí),通過(guò)缺失pGHRF編碼區(qū)得到對(duì)照質(zhì)粒pUPAX。圖2表示構(gòu)建pUPAGRF質(zhì)粒時(shí)的主要步驟,并給出了所用的關(guān)鍵酶。圖3是表示從pUPAGRF構(gòu)建pUPAX的圖示。圖4說(shuō)明在4周的時(shí)間內(nèi),pGHRF基因注射液4個(gè)處理組對(duì)雄性C57BL/6J小鼠平均體重的影響,pUPAGRF質(zhì)粒的劑量為30、100和200^,pUPAX對(duì)照為100nl,在下午2:00和4:00進(jìn)行注射和稱重。圖5表示在用pGHRF基因注射的小鼠中,體重增加百分比的差異。圖6表示pGHRF基因的劑量對(duì)雄性Landrace/Yorkshire/Duroc(LYD)豬的體重增加的影響。圖7表示在pGHRF基因注射后,Landrace/Yorkshire豬中平均背部脂肪厚度的變化。圖7a為GHRF基因處理對(duì)雄性LY豬的平均背部脂肪厚度的影響;圖7b為GHRF基因?qū)Υ菩訪Y豬的平均背部脂肪厚度的影響。優(yōu)選用一質(zhì)粒載體構(gòu)建肌肉特異性GHRF表達(dá)系統(tǒng)。從公開(kāi)的肽一級(jí)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)編碼GHRF信號(hào)肽和GHRF本身的互補(bǔ)DNA(cDNA)序列并優(yōu)化成用于哺乳動(dòng)物的密碼子。用常規(guī)寡核苷酸合成化學(xué)法合成該cDNA。由cDNA序列編碼的GHRF和其信號(hào)肽可以是天然的或重組的或合成的GHRF和其信號(hào)肽,或者是生物活性片段或具有相似活性的類似物。GHRF前導(dǎo)序列在新的GHRF肽中編碼信號(hào)肽,所述信號(hào)肽指導(dǎo)所述GHRF肽從肌肉細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)出來(lái)并以活性形式分泌到總循環(huán)中。通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)分別克隆啟動(dòng)子/增強(qiáng)子元件的DNA序列和啟動(dòng)子/GHRF基因的3'非翻譯的、含多聚腺苷酸化信號(hào)的區(qū)。例如,使用骨骼ot-肌動(dòng)蛋白(skcxa)啟動(dòng)子/增強(qiáng)子,但不應(yīng)認(rèn)為這是對(duì)啟動(dòng)子/增強(qiáng)子選擇的限制。使用全套的肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子,而不是肌動(dòng)蛋白的最小亞單位如Draghia-Akli等人描述。原因是,利用直接基因注射的體內(nèi)研究已表明,與其它截短形式相比,完整骨骼oc-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子在小鼠肌肉中可以得到最高水平的基因表達(dá)(Reecyetal.,AnimalBiotechnology2:101-120,1998)。作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案,肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的DNA序列、編碼GHRF信號(hào)肽的cDNA序列和編碼GHRF的cDNA序列是種特異性的。將這些DNA片段以下列順序插入到pUC質(zhì)粒中肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子;人GHRF信號(hào)肽cDNA;豬GHRF(l-44)cDNA;肌動(dòng)蛋白3'非翻譯區(qū)。所述pUC質(zhì)粒還含有抗生素例如氨芐青霉素抗性基因,所述抗性基因可以在質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌細(xì)菌中后進(jìn)行選擇,以及選擇產(chǎn)生高拷貝數(shù)質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)ColEI。然后,將用GHRF表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌在氨芐青霉素選擇下使之于發(fā)酵罐中生長(zhǎng)。收集細(xì)胞并用堿溶解釋放質(zhì)粒后,用柱色譜將質(zhì)粒DNA與RNA、細(xì)菌DNA與其它細(xì)胞污染物分開(kāi)。通過(guò)限制酶消化/瓊脂糖凝膠電泳和DNA測(cè)序確定純化質(zhì)粒DNA的完整程度。通過(guò)在OD細(xì)/28o測(cè)量吸收值和瓊脂糖凝膠電泳來(lái)確定純度。將分析過(guò)的質(zhì)粒DNA溶解在生理學(xué)可接受的載體中,檢測(cè)熱原水平,調(diào)整劑量,然后經(jīng)肌肉內(nèi)注射施用給動(dòng)物。作為本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案,每只動(dòng)物應(yīng)施用的所述質(zhì)粒DNA的總量應(yīng)為每kg家畜體重1-100fig。在注射到動(dòng)物肌肉內(nèi)后,質(zhì)粒表達(dá)載體作為DNA被攝入到肌肉細(xì)胞內(nèi)。然后質(zhì)粒表達(dá)載體指導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生GHRF肽。所述肽被釋放到循環(huán)系統(tǒng)中,然后在到達(dá)腦垂體后刺激GH的產(chǎn)生。這樣引起循環(huán)系統(tǒng)中總GH水平的升高,從而促進(jìn)生長(zhǎng),使生長(zhǎng)速度加快,增加瘦肉量并使食物轉(zhuǎn)化更好。此外,產(chǎn)生的肉更瘦,脂肪更少,因此具有較高的市場(chǎng)價(jià)值。此外,由于GHRF釋放受組成性肌肉特異性啟動(dòng)子的控制,因此,促生長(zhǎng)素抑制素對(duì)GH的正常負(fù)反饋控制被繞過(guò)了。這樣可以連續(xù)產(chǎn)生GH。提供下列實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明,而不是限制本發(fā)明的實(shí)施方案。實(shí)施例1構(gòu)建pGHRF表達(dá)載體設(shè)計(jì)pGHRF表達(dá)構(gòu)建體以便在轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物肌肉細(xì)胞中后,得到pGHRF肽的最佳生產(chǎn)和分泌(圖1)。骨骼oc-肌動(dòng)蛋白(skaA)啟動(dòng)子是熟知的啟動(dòng)子,已表明在分化后的肌肉纖維細(xì)胞中產(chǎn)生高度特異性的基因表達(dá)(Reecyetal.,Gene180:23-28,1996)。此外,它與人、牛和雞skaoc啟動(dòng)子有著高度的序列同一性,并享有許多轉(zhuǎn)錄因子共同序列結(jié)合位點(diǎn)。這表明該啟動(dòng)子在哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)之間是高度保守的。這一點(diǎn)得到體外研究的支持,體外研究表明了豬skaa啟動(dòng)子在小鼠、大鼠和豬細(xì)胞中賦予肌肉特異性基因表達(dá)的能力。因此,選用該2kb啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)pGHRFcDNA的肌肉特異性表達(dá)。在含有編碼人GHRF信號(hào)肽和豬GHRF成熟肽的DNA序列的開(kāi)放讀碼框前剪接所述豬skcxa啟動(dòng)子。由于得不到編碼豬GHRF的DNA序列,我們通過(guò)逆翻譯已知的肽結(jié)構(gòu)來(lái)設(shè)計(jì)該DNA序列,并根據(jù)哺乳動(dòng)物密碼子偏好來(lái)進(jìn)行優(yōu)化。本發(fā)明的進(jìn)一步修飾包括在編碼區(qū)的下游加入豬骨骼ot-肌動(dòng)蛋白基因的3'非翻譯區(qū)。這樣通過(guò)穩(wěn)定mRNA轉(zhuǎn)錄本并延長(zhǎng)其半衰期可提高pGHRF產(chǎn)物的表達(dá)。在下文詳細(xì)描述構(gòu)建pGHRF表達(dá)載體的方法并總結(jié)于圖2中。PoWA區(qū):從豬腎中純化基因組DNA并用于擴(kuò)增豬基因序列。用PCR擴(kuò)增750bp的skaa基因的3'末端。該區(qū)為已公開(kāi)序列的核苷酸數(shù)2464-3204(GenbankAccessionNo.U16368)并含有3'非翻譯區(qū)和推測(cè)的多聚腺苷酸化信號(hào)。然后用限制酶XbaI和SacII切割所得產(chǎn)物(利用與PCR引物一起導(dǎo)入的切割位點(diǎn)),克隆到質(zhì)粒載體pBluescriptKS+中,翻pSaApA。GHRF編碼區(qū)GHRF編碼區(qū)是一個(gè)開(kāi)放讀碼框(ORF),它含有編碼人GHRF信號(hào)肽的DNA"前導(dǎo)序列",其后接有一框架內(nèi)豬GHRF(l-44)cDNA。從人基因組DNAPCR擴(kuò)增所述前導(dǎo)序列,該前導(dǎo)序列含人GHRF基因的所有外顯子2和部分外顯子3(GenbankAccessionNo.L10034-5)。用下列兩個(gè)序列將豬GHRFcDNA構(gòu)建為兩個(gè)寡核苷酸LGPGRF15'-TACGCCGACGCCATCTTCACCAACAGCTACAGGAAGGTGCLGPGRF2TCTCGCCCTGCTGCCTGCTCATGATGTCCTGCAGCAGC-3'這些寡核苷酸含有一個(gè)重疊,用所述重疊使其彼此退火,然后用Vent聚合酶填平。然后用Vent聚合酶經(jīng)PCR擴(kuò)增退火的產(chǎn)物。將前導(dǎo)序列和豬GHRFcDNA產(chǎn)物均用T4多核苷酸激酶激酶化,然后用聚丙烯酰胺凝膠電泳純化。然后用T4DNA連接酶將產(chǎn)物連在一起并將265bp的連接產(chǎn)物再用聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)一步純化。然后用含XmaI和XbaI限制酶位點(diǎn)的引物,經(jīng)PCR再擴(kuò)增該ORF產(chǎn)物。然后用XmaI和XbaI酶切割ORF,經(jīng)純化得到245bp片段。然后將該片段克隆至UpSaApA中,f尋至UpPGRPpA。啟動(dòng)子區(qū)從豬基因組DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)2kb豬骨骼a肌動(dòng)蛋白(skaa)啟動(dòng)子/增強(qiáng)子。在第一PCR反應(yīng)的1/50后,進(jìn)行嵌套聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)以得到跨豬skaa基因的-1909至+76bp(Reecyetal,Gene180:23-28,1996)的DNA產(chǎn)物。用T4DNA聚合酶將該產(chǎn)物制成平整末端,然后用EcoRI切割。將凝膠純化過(guò)的啟動(dòng)子片段克隆到pPGRFpA的EcoRI和EcoRV位點(diǎn)以得到中間構(gòu)建體pSaAPGRFpA。為了得到最終的構(gòu)建體,用側(cè)翼KpnI和Sacl限制酶切割該表達(dá)盒,然后與質(zhì)粒pUC19相連,命名為pUPAGRF。用XhoI進(jìn)行部分消化,從質(zhì)粒pUPAGRF中除去全部的pGHRF編碼區(qū),得到第二構(gòu)建體(圖3)。用該第二質(zhì)粒pUPAX作為動(dòng)物試驗(yàn)中的對(duì)照。將所述質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌K-12(菌株DH5a)中,然后使之在用150pg/ml氨芐青霉素補(bǔ)充的培養(yǎng)基中于發(fā)酵罐內(nèi)生長(zhǎng)。當(dāng)培養(yǎng)達(dá)到穩(wěn)定期后,收集細(xì)菌細(xì)胞并用經(jīng)典堿溶解法溶解。離心回收質(zhì)粒,然后通過(guò)陰離子交換色譜將其與污染的細(xì)胞DNA、RNA和蛋白質(zhì)分開(kāi)。通過(guò)在260和280nm測(cè)量吸收值來(lái)檢測(cè)純度。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)純化質(zhì)粒DNA的完整性。最后,通過(guò)限制酶消化和DNA測(cè)序確定同一性。將質(zhì)粒DNA沉淀并再溶于無(wú)熱原的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中,通過(guò)測(cè)量在260nm的吸收值來(lái)計(jì)算濃度。完成熱原檢測(cè)后,此時(shí)的DNA可用于動(dòng)物注射。實(shí)施例2為了檢測(cè)pUPAGRF構(gòu)建體促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的能力,我們將該質(zhì)粒注射到小鼠的四頭肌中。從C57BL/6J小鼠的育種群體中,挑選48只體重14.5-18g的雄性小鼠,隨機(jī)分成12只一組的4個(gè)組。給各組的12只小鼠分別注射一次100jil含100pg對(duì)照質(zhì)?;蛘?0、100或200ngGHRF表達(dá)質(zhì)粒(pUPAGRF)的PBS。將小鼠稱重,作趾標(biāo)記用于鑒別,然后在左四頭肌中部進(jìn)行一次注射。在控制氣候、最少疾病環(huán)境和確定的標(biāo)準(zhǔn)大鼠食物和水供應(yīng)的情況下將小鼠保持12小時(shí)的白晝循環(huán)。每周記錄兩次體重。用氯胺酮/賽拉嗪(0.15ml/100g體重)麻醉小鼠以得到血液和組織樣品。通過(guò)心臟針刺,將血液收集到1ml胰島素注射管中,注射管中含30pl0.5MEDTA作為抗凝劑。將收集的血液保持在冰中,直到通過(guò)以6000g離心IO分鐘沉淀細(xì)胞而得到血漿后。將包含注射位點(diǎn)的完整四頭肌切下,然后迅速冷凍于液氮中。還切下肝的右葉并立即冷凍。將所有樣品儲(chǔ)存于-8(TC直到進(jìn)一步分析。結(jié)果在注射后的4周內(nèi),所有4個(gè)處理組中的小鼠均有迅速生長(zhǎng)和體重增加。在注射后(P.1)21天,所有組之間的體重值沒(méi)有顯著差異。盡管在注射后25天,施用30(igpUPAGRF的小鼠體重增加最多,而最高劑量(200fig)組滯后(圖4),但在較高劑量和對(duì)照之間有顯著差異。注射后25天,200、100和30pg組的平均體重分別為26.3、26.5和24.7g,而對(duì)照組的體重為24.5g(p<0.032,單一因素ANOVA)。200和100嗎處理組小鼠在注射后28天的平均體重分別為26.8和26.6g,而30嗎和對(duì)照處理組的分別為24.5和25.0g。另外,與對(duì)照處理小鼠的體重相比亦有顯著差異(p〈0.0045)。在圖5中示出了pUPAGRF注射液對(duì)體重增加百分比的影響。注射質(zhì)粒4周后,對(duì)照處理小鼠體重增加的百分比為48.7%,30和lOO)igpUPAGRF的值為56.6%,而200嗎組的值為68.4%。這些結(jié)果表明注射一次pGHRF產(chǎn)生質(zhì)粒能夠使年輕小鼠的生長(zhǎng)速度有顯著提高。在劑量為100嗎時(shí),有約8%的提高,而200(ig的劑量能夠使體重增加百分比達(dá)到19%。這些結(jié)果與Draghia-Akli用再生小鼠肌肉得到的觀察結(jié)果相同,盡管其注射方法需要先注射肌毒素丁哌卡因以提高質(zhì)粒的攝入和表達(dá)。實(shí)施例3然后,我們檢測(cè)了pGHRF基因處理提高飼養(yǎng)豬的生長(zhǎng)的能力。在本研究中使用Landrace/Yorkshire/Duroc(LYD)三重雜交的雜交豬。將育種場(chǎng)上IO周齡的年輕雄性豬隨機(jī)分到3個(gè)相鄰的欄中。用1.5英寸16號(hào)針頭在臀肌中給豬注射一次質(zhì)粒制品。給A和B欄中的豬分別注射1mg禾n4mg的pUPAGRF,而給C欄中的豬注射4mg對(duì)照質(zhì)粒pUPAX。不限制供給豬的飼料和水,然后每周稱重。結(jié)果在6周的試驗(yàn)期內(nèi),給豬注射一次1mgpUPAGRF可使體重從62.53增加至87.17kg(增加37.8%)。給豬注射4mg,使其平均體重從60.20kg增加至98.28kg(增加44.1%)。在相同的時(shí)間內(nèi),對(duì)照組中的豬從58.59增加至89.33kg(增加34.4%)。因此,6周后,注射pGHRF表達(dá)質(zhì)粒的豬比注射對(duì)照質(zhì)粒的豬的體重增加百分比要高。此外,由于與lmg劑量組相比,4mg劑量組使體重增加量超過(guò)了lmg劑量組的2倍,因此,似乎存在著劑量依賴反應(yīng)的趨勢(shì)。就詞料轉(zhuǎn)化效率而言,1mg劑量組盡管生長(zhǎng)速度中等,但消耗的飼料少了10%(表1)。此外,在對(duì)照和高劑量組之間,消耗的飼料量沒(méi)有差異,因此,lmg和4mg劑量的pUPAGRF均能使飼料轉(zhuǎn)化提高。表1注射質(zhì)粒后LYD豬的平均每天飼料消耗<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>實(shí)施例4本研究是確定給Landrace/Yorkshire(LY)豬注射2mgpUPAGRF質(zhì)粒對(duì)背部脂肪積累的影響。20頭約32周齡、平均體重55kg的LY豬被分成兩組,10頭一組,每組5頭雄性,5頭雌性。一組通過(guò)肌肉內(nèi)注射施用2毫克pUPAGRJF質(zhì)粒。第二組用質(zhì)粒pUPAX同樣處理,作為對(duì)照。用Renco超聲測(cè)量?jī)x每周測(cè)量背側(cè)至最后胸椎的背部脂肪厚度。分別在距最后肋椎骨側(cè)至脊柱中心45mm、65mm和80mm的位置PI、PII和PIII取3個(gè)測(cè)量值,平均后得到平均背部脂肪厚度。結(jié)果結(jié)果總結(jié)于圖7中。在雄性豬中,盡管施用pGHRF表達(dá)質(zhì)粒的豬的背部脂肪增加的較少,但是經(jīng)pGHRF處理和對(duì)照豬的背部脂肪厚度均隨動(dòng)物年齡的增加而逐漸增加。雌性對(duì)照豬的背部脂肪也逐漸增加,但該增加受pGHRF處理的抑制。表2列出了在試驗(yàn)期內(nèi)背部脂肪厚度的相對(duì)增加值。在注射后60天,在雄性和雌性LY豬中,pGHRF處理減少了背部脂肪積累的量。表2注射質(zhì)粒后在LY豬中背部脂肪厚度的相對(duì)增加<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>這些實(shí)施例的結(jié)果表明用pGHRF基因處理能夠?qū)π∈蠛拓i的生長(zhǎng)均產(chǎn)生益處。生長(zhǎng)速度的增加可與進(jìn)行GH處理的方案相媲美,但本發(fā)明的成本更加經(jīng)濟(jì)和有效。每個(gè)動(dòng)物所用的DNA量比文獻(xiàn)中報(bào)道的生長(zhǎng)激素注射液的量至少少100倍。此外,豬的數(shù)據(jù)表明所需的飼料量減少,而且背部脂肪厚度減少。因此,本發(fā)明通過(guò)提高飼料效率和家畜的生長(zhǎng)速度而給家畜工業(yè)帶來(lái)益處。盡管已通過(guò)實(shí)施例詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案,但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的修飾和改變是顯而易見(jiàn)的。但是應(yīng)理解,所述修飾和改變?cè)诒景l(fā)明范圍內(nèi),正如下列權(quán)利要求的范圍內(nèi)。另外,本發(fā)明的實(shí)施方案不應(yīng)被解釋為僅受實(shí)施例的限制。權(quán)利要求1.提高動(dòng)物飼料利用率和/或生長(zhǎng)速度和/或減少脂肪積累的方法,是對(duì)動(dòng)物施用能夠釋放生長(zhǎng)激素釋放因子的表達(dá)載體,所述表達(dá)載體的核苷酸序列中含有依次串聯(lián)的啟動(dòng)子序列、GHRF信號(hào)肽的編碼基因序列和GHRF的編碼基因序列。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法,其特征在于所述肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子為骨骼激動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法,其特征在于所述骨骼激動(dòng)蛋白啟動(dòng)子為豬骨骼激動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法,其特征在于所述豬骨骼激動(dòng)蛋白啟動(dòng)子為豬骨骼a肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。5、根據(jù)權(quán)利要求2-4中任意一項(xiàng)所述的方法,其特征在于所述GHRF的編碼基因序列的3'端還連接有骨骼肌動(dòng)蛋白基因的3'端非翻譯區(qū)序列。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于所述骨骼肌動(dòng)蛋白基因的3'端非翻譯區(qū)序列為豬骨骼肌動(dòng)蛋白基因的3'端非翻譯區(qū)序列。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法,其特征在于所述骨骼肌動(dòng)蛋白基因的3'端非翻譯區(qū)序列為豬骨骼ct肌動(dòng)蛋白基因的3'端非翻譯區(qū)序列。8、根據(jù)權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述的方法,其特征在于所述GHRF信號(hào)肽的編碼基因序列為人GHRF信號(hào)肽的編碼基因序列;所述GHRF的編碼基因序列為豬GHRF的編碼基因序列。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法,其特征在于所述載體的核苷酸序列中還含有抗生素抗性篩選基因。10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法,其特征在于所述表達(dá)載體的用量為每kg動(dòng)物體重l-100(Ig表達(dá)載體.;所述表達(dá)載體與可藥用載體在施用前混合。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種提高動(dòng)物飼料利用率和/或生長(zhǎng)速度和/或減少脂肪積累的方法。該方法,是對(duì)動(dòng)物施用能夠釋放生長(zhǎng)激素釋放因子的表達(dá)載體,所述表達(dá)載體的核苷酸序列中含有依次串聯(lián)的啟動(dòng)子序列、GHRF信號(hào)肽的編碼基因序列和GHRF的編碼基因序列。實(shí)驗(yàn)證明,本發(fā)明的方法能提高飼料效率和生長(zhǎng)速度,并減少脂肪積累,產(chǎn)生更好質(zhì)量的肉。文檔編號(hào)C12N15/16GK101366949SQ20081016690公開(kāi)日2009年2月18日申請(qǐng)日期2000年1月3日優(yōu)先權(quán)日1999年9月17日發(fā)明者衛(wèi)星輝,李?;?譚啟堂申請(qǐng)人:領(lǐng)前基因有限公司