專利名稱：：一種應(yīng)用懸浮芯片技術(shù)檢測致病性志賀氏菌方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬分子生物學(xué)檢測領(lǐng)域，具體的是一種應(yīng)用懸浮芯片技術(shù)對(duì)致病性志賀氏菌進(jìn)行檢測。技術(shù)背景懸浮芯片技術(shù)是將基因芯片技術(shù)與流式細(xì)胞儀技術(shù)結(jié)合產(chǎn)生的一種新技術(shù)，是一種多重?cái)?shù)據(jù)獲取和分析平臺(tái)，全名為"多功能多指標(biāo)同步分析體系"(FlexibleMultipleAnalyteProfiling,xMap)，也稱為Multi-AnalyteSuspensionArray,有機(jī)整合了熒光編碼微球、激光技術(shù)、微流體技術(shù)、快速信號(hào)處理和數(shù)據(jù)分析系統(tǒng),即保證了信號(hào)質(zhì)量,又提供高通量的新一代分子檢測技術(shù)平臺(tái)。懸浮芯片與傳統(tǒng)的基因芯片最大不同之處在于，傳統(tǒng)的基因芯片點(diǎn)樣在玻片或尼龍膜上，依靠坐標(biāo)定位進(jìn)行尋址，而懸浮芯片將檢測探針共價(jià)交聯(lián)到不同的色標(biāo)微球上，根據(jù)色標(biāo)微球上所帶的熒光素進(jìn)行區(qū)分。懸浮芯片系統(tǒng)主要由三部分組成1、微球直徑5.6iim左右，由聚苯乙烯構(gòu)成的，表面帶有約108個(gè)羧基位點(diǎn)，可與寡核苷酸探針和蛋白以肽鍵耦聯(lián)；2、熒光素微球中標(biāo)記了紅色和橙色熒光素，每種分成10個(gè)濃度梯度，將微球分成可被識(shí)別的100種微球，當(dāng)微球被635nm激光激發(fā)后，能發(fā)射658nm和712nm的熒光；3、檢測儀因微球直徑5.6um，并被熒光標(biāo)記，采用流式細(xì)胞儀技術(shù)原理進(jìn)行檢測。原理每一種色標(biāo)微球可通過羧基，與特定的分析物質(zhì)(寡核苷酸探針、抗原、抗體等)共價(jià)結(jié)合。將標(biāo)記生物探針的微球與待測物進(jìn)行特異性的結(jié)合，再和帶有第三種熒光素的報(bào)告分子反應(yīng)，在一個(gè)反應(yīng)孔內(nèi)可同時(shí)對(duì)一個(gè)樣本中的IOO種不同目的分子進(jìn)行檢測。反應(yīng)后，采用96孔板進(jìn)行進(jìn)樣。檢測儀自動(dòng)將反應(yīng)液吸起加入蠕動(dòng)泵，泵入一個(gè)微細(xì)管中，在鞘液的作用下，單排分布的微球單個(gè)通過檢測通道。檢測通道中設(shè)有兩個(gè)激光探頭，一個(gè)探頭可發(fā)射635nm波長的激光，可激發(fā)標(biāo)記微球的兩種熒光素，從而識(shí)別不同的色標(biāo)微球，進(jìn)行定性檢測；另一激光探頭可激發(fā)報(bào)告分子的熒光素，通過測定微球所帶報(bào)告分子熒光信號(hào)的強(qiáng)度，可進(jìn)行定量檢測。因此，懸浮芯片可進(jìn)行定性定量檢測目標(biāo)分子。當(dāng)樣本中含有目的分子，目的分子與特定的微球所帶的探針吸附在一起時(shí),兩道激光所激發(fā)的熒光均可被檢測到;若樣本中不含目的分子，則僅能檢測到微球所帶的熒光。通過數(shù)字信號(hào)處理器與計(jì)算機(jī)自動(dòng)統(tǒng)計(jì)軟件，分析兩道激光所激發(fā)熒光的波長和信號(hào)強(qiáng)度，從而判斷待檢樣本中幾種至數(shù)十種檢測目標(biāo)物，并通過檢測熒光信號(hào)強(qiáng)度，對(duì)檢測物進(jìn)行定量分析。自動(dòng)加樣器依次將不同樣本加入蠕動(dòng)泵中，樣本之間用一小段氣柱分隔開，這樣在連續(xù)分析過程中不但可以區(qū)分不同樣本，可還以防止樣本間的污染。與其它蛋白質(zhì)和核酸檢測方法相比較，懸浮芯片具獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)1)應(yīng)用范圍廣微球表面的羧基可與核酸探針和蛋白分子耦聯(lián)，能對(duì)目的核酸和蛋白分子進(jìn)行定性定量研究；2)敏感性高以微球作為反應(yīng)載體，增加了反應(yīng)物接觸面積；每個(gè)微球表面帶有約108個(gè)羧基位點(diǎn)，以共價(jià)鍵方式耦聯(lián)寡核苷酸探針、抗體或抗原，探針密度高，產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)；使用熒光檢測，放大了反應(yīng)信號(hào)，敏感性大大提高。3)重復(fù)性好所進(jìn)行的生物反應(yīng)是在液相環(huán)境中進(jìn)行的，利于保持核酸、蛋白等生物分子天然構(gòu)象，克服了傳統(tǒng)芯片空間效應(yīng)的影響，也更利于探針和被檢物質(zhì)的反應(yīng)，提高了檢測的準(zhǔn)確性；4)信噪比低在微細(xì)管中對(duì)單個(gè)微球進(jìn)行檢測，不存在本底影響檢測的問題，無需洗脫去除本底；5)高通量可以同時(shí)對(duì)同一樣本中的多重不同目的分子進(jìn)行定性定量分析，即提高了檢測信息通量，又節(jié)約了樣本用量；6)快速高效大大提高了反應(yīng)速度和檢測速度。由于所進(jìn)行的生物反應(yīng)是在液相環(huán)境中進(jìn)行的，雜交僅需15分鐘即可完成，提高了反應(yīng)速度；在35—60分鐘內(nèi)，可對(duì)96個(gè)不同樣本分別同時(shí)進(jìn)行多達(dá)100種指標(biāo)的檢測；利用96孔板和自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)，可連續(xù)進(jìn)行nX96個(gè)樣品的檢測。7)成本低制備過程無需特殊設(shè)備，只進(jìn)行羧基與氨基間的脫水成肽反應(yīng)即可，簡單易行；由于是液體儲(chǔ)存方式，一次制備可多次使用，平均每個(gè)指標(biāo)檢測成本僅需2.5—5.0元；8)易于標(biāo)準(zhǔn)化基于上述特點(diǎn)，使得該技術(shù)能夠做到標(biāo)準(zhǔn)化，易于試劑盒的研制和推廣。目前，懸浮芯片是美國FDA唯一批準(zhǔn)用于臨床診斷(自身免疫病檢測和人類白細(xì)胞抗原分型)的生物芯片。人類對(duì)志賀氏菌高度敏感，只需少于十個(gè)菌即可引起人的感染，因此其傳染性強(qiáng)，危害性大。志賀氏菌可通過水、食物傳播，引起人類腹瀉及痢疾等。據(jù)國內(nèi)相關(guān)資料顯示，志賀氏菌在我國感染性腹瀉病原菌中居首位；WHO年度報(bào)告指出，在亞非拉各國細(xì)菌性腹瀉病例多達(dá)1.5-2.5億人，死亡65萬。國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局2002年第25號(hào)、26號(hào)令中規(guī)定志賀氏菌為食品中必檢項(xiàng)目。志賀氏菌中70%菌群具致病性，而志賀氏菌的主要檢測方法平板培養(yǎng)、免疫學(xué)方法，只能對(duì)志賀氏菌進(jìn)行檢測，不能鑒定出是否具有致病性。有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)到(PhantouamathB,2003)，致病性志賀氏菌均具有侵襲相關(guān)位點(diǎn)基因(invasionassociatedlocus,Ial)，在分子水平上實(shí)現(xiàn)對(duì)Ial基因的鑒定，可有效鑒定致病性志賀氏菌，為臨床、食品生產(chǎn)、環(huán)境健康提供參考信息。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的旨在提供一種檢測致病性志賀氏菌的懸浮芯片。本發(fā)明的懸浮芯片包括診斷微球和與此微球耦聯(lián)的特異性寡聚核苷酸探針，其中該寡核苷酸探針序列為侵襲相關(guān)位點(diǎn)基因(invasionassociatedlocus,Ial)的一段序列。本發(fā)明還公開了一段寡核苷酸探針序列，該序列為5'-NH2-(CH2)12-AATGTCCATCAAACCCCACTC-3'，如序列表3所示，并在5'進(jìn)行NH2-(CH2),2修飾。此發(fā)明的懸浮芯片還包括一對(duì)特異性的引物，其上游引物為B-Ial-F:5'-Biotin-CTGGATGGTATGGTGAGGTTT-3'(見序列表l，進(jìn)行5'Biotin標(biāo)記)；下游引物為IpaH-R:5'-AGGAGGCCAACAATTATTTCC-3'(見序列表2)。上述引物可擴(kuò)增包含上述探針序列的一段Ial基因的序列。應(yīng)用本發(fā)明懸浮芯片檢測致病性志賀氏菌是通過以下方法進(jìn)行的。根據(jù)致病性志賀氏菌Ial基因設(shè)計(jì)并合成用于PCR擴(kuò)增的特異性引物，如序列表中序列1和2所示，并對(duì)其中一條引物進(jìn)行Biotin修飾；按常規(guī)方法制備待檢樣本基因組DNA作為模板，使用上述特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)使PCR產(chǎn)物帶上Biotin修飾；將PCR產(chǎn)物與制備的懸浮芯片雜交，也就是與耦聯(lián)在微球上的探針進(jìn)行雜交，對(duì)雜交懸浮芯片進(jìn)行鏈霉親和素化藻紅蛋白標(biāo)記，然后通過流式細(xì)胞儀檢測熒光信號(hào)。本發(fā)明的另一目的在于提出一種制備上述懸浮芯片的方法。本發(fā)明所提供的制備懸浮芯片的方法，具體包括以下步驟1)制備寡聚核苷酸探針；2)用純水稀釋氨基修飾的探針；3)將儲(chǔ)備的微球振蕩，然后轉(zhuǎn)移到棕色EP管中；4)離心收集微球，加入MES液進(jìn)行振蕩；5)向懸浮微球中加入上述探針，并振蕩；6)在微球溶液中加入新配制的10mg/mlEDC，振蕩；然后進(jìn)行溫育；7)再次向微球溶液中加入新配置的10mg/mlEDC，振蕩，然后進(jìn)行溫育；8)向微球溶液中加0.02。/。Tween-20，離心收集微球；9)用0."/oSDS重懸微球，離心收集微球；用TE懸浮微球；10)用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算微球的個(gè)數(shù)，2—8。C，避光保存。本發(fā)明的另一目的提供一種克服PCR假陽性的方法。本發(fā)明采用的UNG一Taq酶體系，有效的控制了PCR假陰性產(chǎn)生。具體方法是PCR反應(yīng)體系中，將dTTP量減半，由dUTP替代，并加入0.05U的UNG(尿嘧啶DNA糖苷酶)。PCR產(chǎn)物中被摻入一定量的dUTP,UNG通過打斷核酸鏈上dUTP上的糖苷鍵，使含dUTP的核酸不能作為模板被識(shí)別。在運(yùn)行PCR程序之前先37'C溫育5min，使UNG充分消化PCR產(chǎn)物，94"C模板變性時(shí)，UNG失活，進(jìn)行正常PCR反應(yīng)。圖1特異性試驗(yàn)結(jié)果；圖2靈敏度試驗(yàn)結(jié)果；具體實(shí)施例方式為進(jìn)一步說明本發(fā)明在致病性志賀氏菌檢測中的應(yīng)用，特舉以下較佳實(shí)施例進(jìn)行說明，但本發(fā)明的應(yīng)用并不限于實(shí)施例。實(shí)施例一引物的設(shè)計(jì)和合成1)序列獲得通過對(duì)致病性志賀氏菌進(jìn)行全基因組分析，選取其特異性基因Ial作為靶序列，并從GenBank公共數(shù)據(jù)庫中獲得此基因序列，編號(hào)為AY206439;2)設(shè)計(jì)引物采用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，相關(guān)參數(shù)為Tm值55.0°C—59.0°C，GC值40.0%—60.0%，PCR產(chǎn)物大小為lOObp—500bp，引物大小22±3bp;3)引物選擇將軟件輸出的引物進(jìn)行適當(dāng)?shù)氖謩?dòng)調(diào)節(jié)，增加或減少幾個(gè)堿基，然后在GenBank進(jìn)行在線Blast比對(duì)，選取特異性高的引物，并將其中的一條進(jìn)行5'末端Biotin標(biāo)記。上游引物序列為B-Ial-F:5'誦Biotin-CTGGATGGTATGGTGAGGTTT-3'，下游引物為IpaH國R:5'-AGGAGGCCAACAATTATTTCC-3'，擴(kuò)增片段大小為320bp;4)引物合成上海生工合成下游引物Ial-R，大連TakaRa合成Biotin標(biāo)記的上游引物B-Ial-F。實(shí)施例二探針的設(shè)計(jì)和合成1)序列獲得在上述擴(kuò)增片段非引物區(qū)設(shè)計(jì)探針；2)設(shè)計(jì)探針采用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)探針，選定HybridizationProbes命令，在Anti-sense鏈上設(shè)計(jì)探針，參數(shù)同實(shí)施例一；3)探針選擇將軟件輸出的探針進(jìn)行適當(dāng)?shù)氖謩?dòng)調(diào)節(jié)，增加或減少幾個(gè)堿基，然后在GenBank進(jìn)行在線Blast比對(duì)，選取特異性高的探針，在5'末端進(jìn)行NH2-(CH2)12修飾，選定的探針序列為Ial-Probe:5'-NHr(CH2)12-AATGTCCATCAAACCCCACTC-3，；4)探針合成大連TakaRa合成上述探針。實(shí)施例三懸浮芯片的制備方法一、材料二、方法結(jié)果1.用純水稀釋氨基修飾的探針到lmM(lnanomole/Vl);2.將儲(chǔ)備的微球振蕩20sec;3.取20(^1微球轉(zhuǎn)移到棕色EP管中；4.收集微球，8000g,離心l-2min;5.棄上清，加入50^10.1MMES(2-[N-Morpholino]ethanesulfonicacid，2-(N-嗎啉代)乙磺酸)液pH4.5，振蕩20sec;6.向懸浮微球中加入2pllmM的探針，振蕩20sec;7.準(zhǔn)備新鮮的10mg/mlEDC(l-ethyl-3-[3dimethylaminopropyl]carbodiimidehydrochloride,l-乙基-3-3-二甲基氨丙基碳化二亞胺)，用dH20;8.向微球溶液中加入2.5!al新配置的10mg/mlEDC,振蕩；9.在室溫黑暗條件下溫育30min;10.再次準(zhǔn)備新鮮的10mg/mlEDC，用dH20;11.向微球溶液中加入2.5^1新配置的10mg/mlEDC，振蕩；12.在室溫黑暗條件下溫育30min;13.向微球溶液中加1.0mL0.02%Tween-20;14.8000Xg離心1—2min，收集微球；15.棄上清，用1.0mL0.1。/。SDS重懸微球；16.8000Xg離心1—2min，收集微球；17.用100plTE，pH=8.0，懸浮微球，18.用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算微球的個(gè)數(shù)19.將微球2—8℃,避光保存?zhèn)溆?。?shí)施例四懸浮芯片快速檢測致病性志賀氏菌1)TIANampBacteriaDNAkit試劑盒提取待檢樣本基因組DNA。2)PCR擴(kuò)增目的片段，反應(yīng)條件如下表格1PCR反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃變性3min;運(yùn)行35個(gè)循環(huán)94℃30sec,53℃30sec:72℃40sec;最后，72℃延伸3min。3)雜交雜交液組成33.3ul1.5XTMAC(tetramethylammoniumchloride，氯化四甲銨)，5ul上述PCR產(chǎn)物，加入5000個(gè)與探針耦聯(lián)的微球，1XTE將體積補(bǔ)充到50ul。將雜交液在95℃變性4min，52℃雜交15min以上。4)檢測將上述雜交后的溶液全部轉(zhuǎn)移到96孔濾板中，真空過濾收集微球，用2pg/mlS-R-PE(Streptavidin-R-phycoerythrin，鏈霉親和素化藻紅蛋白)重懸微球，置52℃:10min，Luminex檢測。實(shí)施例五懸浮芯片的特異性鑒定和靈敏度驗(yàn)證特異性試驗(yàn)用本發(fā)明的懸浮芯片對(duì)不同菌株進(jìn)行特異性驗(yàn)證，其檢測范圍包括以下三類菌株a)屬于前述的4株致病性志賀氏菌和一株非致病性志賀氏菌；b)與志賀氏菌親緣關(guān)系較近的大腸桿菌、沙門氏菌；C)其它有關(guān)菌株。菌株具體信息如下_表格2_試驗(yàn)編號(hào)il來源與編號(hào)試驗(yàn)編號(hào)來源與編號(hào)^_枸櫞酸桿菌_CMCC48017_^_PCRBlank針對(duì)上述菌株，按實(shí)施例四中的方法進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果顯示5株志賀氏菌4株呈陽性結(jié)果，可有效鑒定致病性志賀氏菌；非志賀氏菌均呈陰性結(jié)果，特異性達(dá)100%。靈敏度試驗(yàn)按實(shí)施例四中的方法進(jìn)行靈敏度試驗(yàn)，以痢疾志賀CMCC51197研究對(duì)象，將提取的模板進(jìn)行定量，所提模板的量為11.8ng/ml，依次進(jìn)行IO倍稀釋，1213141516171819202122埃希氏大腸桿菌埃希氏大腸桿菌埃希氏大腸桿菌埃希氏大腸桿菌埃希氏大腸桿菌埃希氏大腸桿菌副溶血霍亂弧菌副溶血霍亂弧菌金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌表皮葡萄球菌甲型溶血性鏈球菌乙型溶血性鏈球菌丙型溶血性鏈球菌肺炎克雷伯氏菌陰溝腸桿菌產(chǎn)氣腸桿菌ATCC25922ATCC8739國家CDC分離株國家CDC分離株國家CDC分離株國家CDC分離株ATCC濯8s國家CDC分離株國家CDC分離株國家CDC分離株國家CDC分離株ATCC33847ATCC11802ATCC6538CMCC26003CMCC26069CMCC32213CMCC32210CMCC32206CMCC46117CMCC45301CMCC4510324臘樣芽孢桿菌CMCC6330125甲型副傷寒沙門氏菌CMCC5000126乙型副傷寒沙門氏菌CMCC5009427丙型副傷寒沙門氏菌CMCC5001728痢疾志賀氏菌CMCC5119729痢疾志賀氏菌本室保30福氏志賀氏菌CMCC5106231鮑氏志賀氏菌CMCC5126532宋內(nèi)志賀氏菌CMCC5133433霍亂弧菌Ol86008434霍亂弧菌0139贈(zèng)35嗜肺軍團(tuán)桿菌廣東CDC贈(zèng)36嗜肺軍團(tuán)桿菌廣東CDC贈(zèng)37A型肉毒梭菌62A株38B型肉毒梭菌621株39E型肉毒梭菌619株40A型產(chǎn)氣莢膜本室保41B型產(chǎn)氣莢膜本室保42D型產(chǎn)氣莢膜本室保43綠膿桿菌ATCC卯2744單增李斯特菌本室保45小腸結(jié)腸炎耶爾森氏CMCC52203菌靈敏度試驗(yàn)中加入的模板量分別為L18fg、11.8fg、118fg、U8pg、11.8pg、118pg,以純水做陰性對(duì)照。結(jié)果顯示，靈敏度達(dá)1.18fg(相當(dāng)于2—3個(gè)細(xì)菌數(shù))，可滿足臨床樣本及環(huán)境樣本檢測需要。序列表<110>中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所<120>—種應(yīng)用懸浮芯片技術(shù)檢測致病性志賀氏菌方法<140><141><160>3<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>1CTGGATGGTATGGTGAGGTTT21<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>2AGGAGGCCAACAATTATTTCC21<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>3AATGTCCATCAAACCCCACTC2權(quán)利要求1.一種用于致病性志賀氏菌檢測的懸浮芯片，包括診斷微球和固定在該診斷微球上的寡聚核苷酸探針，其特征是該寡聚核苷酸探針是致病性志賀氏菌侵襲相關(guān)位點(diǎn)基因(invasionassociatedlocus，Ial)上的一段序列。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于致病性志賀氏菌檢測的懸浮芯片，其中寡聚核苷酸探針序列如序列表中序列3所示，在其5'進(jìn)行NH2-(CH2;h2修飾3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述用于致病性志賀氏菌檢測的懸浮芯片，該芯片可鑒定和檢測致病性志賀氏菌。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述志賀氏菌檢測的懸浮芯片，其特征在于包括一對(duì)特異性引物，引物序列如序列表中序列1和2所示，并對(duì)序列1進(jìn)行5'Biotin修飾。5.權(quán)利要求1或2所述用于志賀氏菌檢測的懸浮芯片的制備方法，包括如下步驟制備寡聚核苷酸探針；用純水稀釋氨基修飾的探針；將儲(chǔ)備的微球振蕩，然后轉(zhuǎn)移到棕色EP管中；離心收集微球，加入MES液進(jìn)行振蕩；向懸浮微球中加入上述探針，并振蕩；在微球溶液中加入新配制的EDC溶液，振蕩；然后進(jìn)行溫育；再次向微球溶液中加入新配置的10mg/mlEDC，振蕩，然后進(jìn)行溫育；向微球溶液中加0.02n/。Tween-20，離心收集微球；用0.P/。SDS重懸微球，離心收集微球；用TE懸浮微球；用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算微球的個(gè)數(shù)，2—8'C，避光保存。6.權(quán)利要求1或2所述用于致病性志賀氏菌檢測的懸浮芯片使用方法，包括以下步驟a)根據(jù)致病性志賀氏菌Ial基因設(shè)計(jì)并合成用于PCR擴(kuò)增的特異性引物，并對(duì)其中一條引物進(jìn)行Biotin修飾；b)按常規(guī)方法制備的待檢樣本基因組DNA，并使用步驟a)中的引物對(duì)待檢樣本基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)使PCR產(chǎn)物帶上Biotin修飾；c)將步驟b)中的PCR產(chǎn)物與權(quán)利要求1中所述懸浮芯片雜交；d)對(duì)步驟c)中雜交懸浮芯片進(jìn)行鏈霉親和素化藻紅蛋白標(biāo)記，并對(duì)其檢測熒光信號(hào)。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種檢測致病性志賀氏菌的方法，其特征是上述步驟b)所建立的PCR反應(yīng)體系如下PCR反應(yīng)體系組份加入體積10xPCRBuffer(含MgCl2)2pldGTP、dCTP、dATP(2.5mmo1)各1.6^dTTP、dUTP(2.5mmo1)各O単B-Ial-F(1|xmol/L)1|LllIal誦R(1pmol/L)1pira《DNAPolymerase(5U/|til)0.1|LllUracil國DNAGlycosylase(1U/|li1)0.05|il所提樣本基因組DNA1piddH208,45julTotal20(ilPCR反應(yīng)程序?yàn)?7°C溫育5min;94°C變性3min;運(yùn)行35個(gè)循環(huán)94°C30sec，53。C30sec，72°C40sec;最后，72°C延伸3min。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述使用方法，其中雜交溫度為52°C，雜交時(shí)間為大于15min。全文摘要本發(fā)明涉及一種用于致病性志賀氏菌檢測的懸浮芯片及其檢測方法，該懸浮芯片包括微球載體和固定在載體上的寡聚核苷酸探針，其中該寡聚核苷酸探針是從致病性志賀氏菌篩選的特異性基因侵襲相關(guān)位點(diǎn)(invasionassociatedlocus，Ial)基因中的一段DNA序列。利用設(shè)計(jì)的引物將待檢樣品基因組DNA擴(kuò)增并標(biāo)記后，利用上述懸浮芯片進(jìn)行雜交，根據(jù)雜交熒光強(qiáng)度，可判斷待檢樣品中是否含有致病性志賀氏菌。懸浮芯片檢測靈敏度高，可達(dá)到fg級(jí)基因組DNA水平，可滿足臨床樣本和環(huán)境樣本檢測需要，并具特異性高、操作簡單、成本低等特點(diǎn)，易于推廣。并采用UNG-Taq酶PCR反應(yīng)體系，大大降低了PCR假陽性結(jié)果。文檔編號(hào)C12Q1/04GK101403000SQ20081018050公開日2009年4月8日申請日期2008年11月27日優(yōu)先權(quán)日2008年11月27日發(fā)明者劉艷華,琳康,王景林,趙金銀,姍高申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所