專利名稱：一種針對蜱傳病原的懸浮芯片多重非診斷性檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種針對蜱傳病原的懸浮芯片多重非診斷性檢測方法。
背景技術：
聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術，也是目前核酸檢測的主流技術，PCR產(chǎn)物的檢測判定方法為瓊脂糖凝膠電泳，而瓊脂糖凝膠僅可區(qū)分相差約IOObp的DNA片段。片段長度相差不大或者相等的PCR產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳將無能無力。另外，瓊脂糖凝膠電泳通過紫外光激發(fā)熒光染料產(chǎn)生熒光來判斷是否存在PCR產(chǎn)物，檢測靈敏度相對較低。且瓊脂糖凝膠電泳通過片段的大小對產(chǎn)物進行判斷，特異性差，對非特異擴增的大小相似的片段不能區(qū)分。而且電泳時常用的染料如溴化乙錠等具有致癌性，常接觸對身體健康不利。蜱是一種寄生在動物體表的吸血寄生蟲，作為最重要的醫(yī)學媒介之一，蜱種類多、分布廣、生活習性多樣，能侵襲鳥類、爬行類、哺乳動物等多種宿主，并且能傳播多種病原體，其中大多數(shù)是重要的自然疫源性疾病和人獸共患病，且大部分都沒有有效的疫苗，給人類健康及畜牧業(yè)帶來重大危害。應進一步加強對蜱傳疾病的非診斷性檢測方法的研究，而一種簡便有效，高靈敏高特異的蜱傳疾病多重非診斷性檢測方法的建立也成為了目前必要之需。以往的研究都是針對一種病原體檢測，且有些非診斷性檢測方法靈敏度不夠高，不能夠早期發(fā)現(xiàn)蜱傳傳染病的流行；此外，從 生物學分類角度來看，蜱傳病原體涉及細菌、病毒及立克次體、螺旋體等多種微生物學，目前蜱傳病原檢測大多僅是針對單種致病原，不同病原體分類專業(yè)人員分別從自身專業(yè)領域進行檢測，浪費人力、財力，且各專業(yè)獨力實施，不利于高效、綜合采取防治措施。因而，對于蜱傳病原的檢測應當綜合多重考慮。懸浮芯片(suspensionarray)也稱液相芯片(liquid array, liquid chip),是一種非常靈活的多功能技術平臺，可以進行蛋白、核酸等生物大分子檢測、受體和配體識別分析等研究。懸浮芯片主要通過可偶聯(lián)探針的熒光編碼微球與兩束激光檢測，對被測物的定性和定量分析，一個反應孔內(nèi)可以完成100種不同的生物學反應，從而實現(xiàn)對核酸的多重檢測。但傳統(tǒng)的懸浮芯片的非診斷性檢測方法耗時長，步驟繁瑣，在多重檢測中，由于多重探針的存在，雜交溫度的選擇也是一個技術開發(fā)時的瓶頸。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測靈敏度高，特異性好的針對蜱傳病原的懸浮芯片多重非診斷性檢測方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明一種針對蜱傳病原的懸浮芯片多重非診斷性檢測方法，具體為:I)根據(jù)PCR擴增區(qū)域內(nèi)的核苷酸序列設計特異性檢測引物，并提交GENEBANK檢測引物的特異性，合成時將上游引物5’末端連接特異Tag，下游引物5’末端進行生物素標記；
2) PCR反應結束后將反應產(chǎn)物分別與相應的編碼微球雜交；3)微球上的Ant1-Tag在一定的條件下特異的捕獲PCR產(chǎn)物上的Tag序列；4)加入鏈霉親和素一藻紅蛋白與微球上捕獲的PCR產(chǎn)物上的生物素結合，利用懸浮芯片LUMINEX系統(tǒng)進行檢測，通過激發(fā)微球基質(zhì)上的紅色分類熒光和微球表面經(jīng)特異性反應結合上的藻紅蛋白，對待檢測物進行定性和定量分析；其中，所涉及的引物序列為:
權利要求
1.一種針對蜱傳病原的懸浮芯片多重非診斷性檢測方法，具體為: 1)根據(jù)PCR擴增區(qū)域內(nèi)的核苷酸序列設計特異性檢測引物，并提交GENEBANK檢測引物的特異性，合成時將上游引物5’末端連接特異Tag，下游引物5’末端進行生物素標記； 2)PCR反應結束后將反應產(chǎn)物分別與相應的編碼微球雜交； 3)微球上的Ant1-Tag在一定的條件下特異的捕獲PCR產(chǎn)物上的Tag序列； 4)加入鏈霉親和素一藻紅蛋白與微球上捕獲的PCR產(chǎn)物上的生物素結合，利用懸浮芯片LUMINEX系統(tǒng)進行檢測，通過激發(fā)微球基質(zhì)上的紅色分類熒光和微球表面經(jīng)特異性反應結合上的藻紅蛋白，對待檢測物進行定性和定量分析； 其中，所涉及的引物序列為:
2.如權利要求1所述的非診斷性檢測方法，其特征在于，所述引物上游引物5’端需要人工添加一段標簽并且之間用間隔序列相連，下游引物5’端經(jīng)生物素標記。
3.如權利要求1所述的非診斷性檢測方法，其特征在于，所述雜交中同時加入微球，PCR擴增產(chǎn)物，SA-PE，條件為40°C進行雜交，同時此條件下可以進行鏈霉親和素一藻紅蛋白與微球上捕獲的PCR產(chǎn)物上的生物素結合。
4.一種改進的針對蜱傳病原的懸浮芯片多重非診斷性檢測方法，其特征在于，所述非診斷性檢測方法包括以下步驟: 1)PCR擴增待檢樣品； 2)加入相應的微球與PCR產(chǎn)物雜交； 3)上機對雜交后的微球進行檢測； 其中，根據(jù)待檢測的病毒，設計檢測所用的特異引物，上游引物5’末端連接特異Tag，弓丨物與Tag之間連接C9或C18作為加臂，下游引物5’末端進行生物素標記。
5.如權利要求4所述的非診斷性檢測方法，其特征在于，所述非診斷性檢測方法所涉及的引物序列為:
6.如權利要求5所述的非診斷性檢測方法，其特征在于，所述引物上游引物5’端需要人工添加一段標簽并且之間用間隔序列相連，下游引物5’端經(jīng)生物素標記。
7.如權利要求4所述的 非診斷性檢測方法，其特征在于，所述雜交中同時加入微球，PCR擴增產(chǎn)物，SA-PE，條件為40°C進行雜交，同時此條件下可以進行鏈霉親和素一藻紅蛋白與微球上捕獲的PCR產(chǎn)物上的生物素結合。
8.如權利要求4所述的非診斷性檢測方法，其特征在于，所述擴增條件為:
全文摘要
本發(fā)明公開了一種針對蜱傳病原的懸浮芯片多重非診斷性檢測方法，具體為1)根據(jù)PCR擴增區(qū)域內(nèi)的核苷酸序列設計特異性檢測引物，并提交GENEBANK檢測引物的特異性，合成時將上游引物5’末端連接特異Tag，下游引物5’末端進行生物素標記；2)PCR反應結束后將反應產(chǎn)物分別與相應的編碼微球雜交；3)微球上的Anti-Tag在一定的條件下特異的捕獲PCR產(chǎn)物上的Tag序列；4)加入鏈霉親和素－藻紅蛋白與微球上捕獲的PCR產(chǎn)物上的生物素結合，利用懸浮芯片LUMINEX系統(tǒng)進行檢測，通過激發(fā)微球基質(zhì)上的紅色分類熒光和微球表面經(jīng)特異性反應結合上的藻紅蛋白，對待檢測物進行定性和定量分析。本發(fā)明利用懸浮芯片系統(tǒng)作為平臺，檢測靈敏度高，特異性好，是一種高通量的檢測方法。
文檔編號C12Q1/70GK103173567SQ20131010209
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月27日 優(yōu)先權日2013年3月27日
發(fā)明者王靜, 楊宇, 王旺, 劉麗娟, 劉鍵, 趙婷婷, 徐寶梁 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院