專利名稱：阿佛曼鏈霉菌種經(jīng)重離子輻照誘變后的高效價菌種的選育工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗生素選育領(lǐng)域，尤其是阿佛曼鏈霉菌種的選育。
背景技術(shù)：
阿維菌素是阿佛曼鏈霉菌經(jīng)液體發(fā)酵后，提取的代謝產(chǎn)物，為十六元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。其制劑可以作為農(nóng)藥、獸藥，具有廣譜、高效、低毒、無殘留、不易產(chǎn)生抗藥性等特點。 在農(nóng)藥方面，阿維菌素是一種農(nóng)用抗生素類殺蟲劑、殺螨劑，屬昆蟲神經(jīng)毒劑，主要干擾害蟲神經(jīng)生理活動，使其麻痹中毒而死亡。無內(nèi)吸性，但有較強的滲透作用，并能在植物體內(nèi)橫向傳導(dǎo)，殺蟲、殺螨活性高，比常用農(nóng)藥高5 50倍，用藥量僅為常用農(nóng)藥的1% 2%。該藥劑對抗藥性害蟲有較好的防效，與有機(jī)磷、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥無交叉互抗性，對天敵較安全。 阿維菌素是當(dāng)今最受關(guān)注的生物殺蟲殺螨劑之一，被農(nóng)業(yè)部作為推薦使用的高效低毒的農(nóng)藥產(chǎn)品。阿維菌素由阿佛曼鏈霉素經(jīng)液體發(fā)酵加工而成的抗生素類生物農(nóng)、獸藥。與傳統(tǒng)的農(nóng)、獸藥相比，具有高效、廣譜、有效期長，不易產(chǎn)生抗藥性，易降解，無殘留等特點，且不易產(chǎn)生耐藥性，與其他殺蟲藥無交叉抗性。在土壤中降解快，光解迅速，對作物安全，不易產(chǎn)生藥害。阿維菌素是世界上第21大暢銷農(nóng)藥，第4大暢銷殺蟲劑，銷售額高達(dá)16億美元。由于阿維菌素是一種新型抗生素類，具有結(jié)構(gòu)新穎、農(nóng)畜兩用的特點，因此，隨著人們生活水平的提高以及對綠色食品的呼喚，這類生物農(nóng)藥在當(dāng)前農(nóng)藥市場備受青睞，阿維菌素也成為當(dāng)前生物農(nóng)藥市場中最受歡迎和最具競爭力的新產(chǎn)品。 天然阿維菌素中含有8個組分，主要有4種即Ala、 A2a、 Bla和B2a，其總含量》80% ;對應(yīng)的4個比例較小的同系物是Alb、A2b、Blb和B2b，其總含量《20%。目前市售阿維菌素農(nóng)藥是以abamectin為主要殺蟲成分(AvermectinBla+Blb，其中Bla不低于90%、Blb不超過5% )，以Bla的含量來標(biāo)定。
AVMBla分子式C48H72014 (R = C2H5)
AVMBla分子量872
2. 3阿維菌素的物化性質(zhì) 阿維菌素為白色或淡黃色結(jié)晶物，熔點為157_162°C ， a (CHC13) = +55. 7在237、245、254nm處均有吸收峰，A max = 244±2nm，阿維菌素溶于甲苯、乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷、乙醇等溶劑，微溶于正己烷和石油醚，在水中的溶解度極低(10i!g/l)，本品應(yīng)在干燥、
密閉、陰涼遮光下保存。本品分子中無酸性或堿性官能團(tuán)，在一般條件下穩(wěn)定，在ra5-9時
不會水解，無腐蝕性，對環(huán)境安全。 影響中國抗生素行業(yè)發(fā)展的主要因素有菌種發(fā)酵效價提升緩慢，甚至長期都得不到突破性的進(jìn)展。 目前，國際國內(nèi)抗生素菌種誘變手段多見化學(xué)誘變方法和普通射線、低能離子的誘變，但都沒有得到理想的發(fā)酵效價，阿維菌素發(fā)酵效價只在4000 g/ml 。近年來隨著中國航天事業(yè)的發(fā)展，出現(xiàn)了太空育種的手段。但條件有限不易實現(xiàn)。該項目采用重離子束輻照的物理誘變方法，具有可控、可調(diào)、可多次重復(fù)的特點，顯著改善了其它輻照手段的隨機(jī)性和不可控性。 我們采用中能重離子束對阿維菌素菌株進(jìn)行輻照處理，為找出適宜阿維菌素菌株誘變的最佳參數(shù)，對輻照物理參數(shù)的計算進(jìn)行了多次優(yōu)化調(diào)整，經(jīng)過4次輻照處理、確定了對阿維菌素菌種的最佳輻照劑量及半致死劑量。然后在試驗室進(jìn)行反復(fù)篩選后，得到生產(chǎn)性能優(yōu)良、穩(wěn)定性好的菌株，再通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，使其發(fā)酵效價達(dá)到了 5800i！ g/ml以上。這些技術(shù)成果已記錄在"阿佛曼鏈霉菌種的重離子輻照誘變及輻照菌種培養(yǎng)方法"中，并進(jìn)行了專利申請。 微生物發(fā)酵一般分為發(fā)酵與提取兩個階段，包括孢子制備、斜面培養(yǎng)、搖瓶培養(yǎng)、種子瓶培養(yǎng)、發(fā)酵瓶發(fā)酵和醪液提取。微生物發(fā)酵的整個工藝流程中，最關(guān)鍵的一步就是發(fā)酵階段，發(fā)酵受到許多因素的影響，我們必須密切注意才能取得預(yù)期的效果， 一些影響發(fā)酵的主要因素有雜菌和噬菌體的污染、添加營養(yǎng)物的補料工藝、最佳產(chǎn)抗pH的全程有效監(jiān)控、溫度的全程有效監(jiān)控、通氣、攪拌以及泡沫控制等，這些決定發(fā)酵成敗的關(guān)鍵條件對不同誘變得到的菌種是不同的，作為一個由重離子輻照誘變得到的菌種也有其專屬的工藝條件，因此我們必須在前段試驗的基礎(chǔ)上作進(jìn)一步的探索，以便獲得最佳的選育工藝條件。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的為提供阿佛曼鏈霉菌種經(jīng)重離子12C+6輻照誘變后的高效價菌種選育工藝，通過該選育工藝，以獲得優(yōu)質(zhì)菌種和降低生產(chǎn)成本。
實現(xiàn)上述發(fā)明目的的工藝條件為 經(jīng)重離子輻照誘變阿佛曼鏈霉菌種的正突變菌株的產(chǎn)抗工藝條件為種子培養(yǎng)基PH 7.0-7.2，發(fā)酵溫度為28士0.6t:、發(fā)酵培養(yǎng)基PH 6. 5_7. 5、調(diào)節(jié)氧溶解度的搖床機(jī)轉(zhuǎn)速220-260r/min、接種量4% 。
試驗內(nèi)容 出發(fā)菌種S. avermitilis ZJAV-y II 經(jīng)12(:+6重離子輻照 輻照劑量50-70Gy 試驗項目包括斜面培養(yǎng)、搖瓶發(fā)酵、測定發(fā)酵溫度、接種種齡、ra值、接種量和控
制溶解氧的搖床機(jī)攪拌速度。
1.溫度 在發(fā)酵溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，菌體生長和代謝加快，發(fā)酵反應(yīng)的速率加快。當(dāng)超過最適溫度范圍以后，隨著溫度的升高，酶很快失活，菌體衰老，發(fā)酵周期縮短，產(chǎn)
量降低。主要考察了 24t:、26t:、28t:三個溫度條件的發(fā)酵，跟蹤比較了營養(yǎng)物的消耗、pH
的變化及效價增幅的差異。 在24t:下發(fā)酵代謝明顯異常，糖耗偏低，菌絲生長速度過緩，pH—直保持在很高
水平，不象其他兩個溫度下出現(xiàn)很強的下降趨勢，這也反映出24t:代謝不活躍。另外，24t:
下，氨基氮一直偏高，這也影響菌體生長。菌體代謝極大異常，導(dǎo)致效價大幅降低，明顯看出
4低溫對發(fā)酵的負(fù)面影響較大。 在26t:下，糖耗開始快于28t:，但菌絲生長差異并不明顯，主要是由于初級代謝
的各條途徑的流量發(fā)生變化。在前期，2『C和26t:下效價增幅差異并不明顯，說明單從阿維菌素的生物合成來說，兩溫度并不產(chǎn)生顯著差異；但到了后期，26t:下效價增幅不如28°C大，而兩個溫度發(fā)酵的糖水平相當(dāng)，因此，兩個溫度下后期產(chǎn)抗的差異可能與菌體的質(zhì)量有關(guān)，故前期糖耗不宜過快，否則會導(dǎo)致菌體產(chǎn)抗持續(xù)時間縮短。 另外，2『C時菌團(tuán)較緊密，而26t:下菌團(tuán)稍顯松散，由于松散的菌團(tuán)在罐里使發(fā)酵
液粘度過高進(jìn)而影響產(chǎn)抗。因此，試驗結(jié)果28t: 士o.6t:為最佳溫度段。 2.溶解氧 氧的供應(yīng)對需氧發(fā)酵來說，是一個關(guān)鍵因素。在發(fā)酵過程中菌種只能利用發(fā)酵液中的溶解氧，因此，必須向發(fā)酵液中連續(xù)補充大量的氧，并要不斷地進(jìn)行攪拌，這樣可以提高氧在發(fā)酵液中的溶解度。阿維菌素發(fā)酵過程中，溶氧常成為限制因素。供氧不足導(dǎo)致菌體生長不良和抗生素產(chǎn)量下降，但其菌絲對剪切很敏感。因此在發(fā)酵中，若控制不當(dāng)很容易菌絲發(fā)散、斷裂、導(dǎo)致粘度過高，一旦出現(xiàn)這種不正常的現(xiàn)象，將不可能得到很高的效價。一般來說，發(fā)酵的前期由于菌形尚未定型，菌絲也較嬌嫩，當(dāng)受到強烈的剪切時容易發(fā)糊；可以說剪切是發(fā)糊的直接原因。 通過調(diào)整旋轉(zhuǎn)搖床機(jī)進(jìn)行強力攪拌(220-260r/min)，提高氧在發(fā)酵液中的溶解度即增加溶氧。經(jīng)過多次試驗結(jié)果表明在阿維菌素發(fā)酵瓶10-11天培養(yǎng)中，不能停下來搖床，不斷觀察發(fā)酵瓶顏色、粘稠度、氣味。停下?lián)u床會降低發(fā)酵瓶溶氧量，影響阿維菌素Bla的含量，降低阿維菌素的產(chǎn)抗能力。最適轉(zhuǎn)速為250r/min。
3.轉(zhuǎn)種種齡 接入種子搖瓶中的種子，隨著培養(yǎng)時間的延長，菌絲量增加，但由于基質(zhì)的消耗、代謝產(chǎn)物的積累及菌絲體的死亡，菌絲量不再增加，而逐漸趨于老化。因此選擇由種子瓶轉(zhuǎn)發(fā)酵瓶的適當(dāng)?shù)慕臃N齡顯得的十分重要。選擇接種齡的菌絲體處于生命力極為旺盛的對數(shù)生長期，且培養(yǎng)液中菌體量還為達(dá)到最高峰時，進(jìn)行接種為最佳，種齡從24小時變化到26小時，ra急劇下降；選擇24小時為種子瓶轉(zhuǎn)發(fā)酵瓶最佳時間。種齡從22小時到24小時低
孢子接種量的情況下，ra緩慢上升，ra下降期延后，而高孢子接種量下，ra值明顯下降，說明高孢子接種量下，ra下降期提前。 在斜面低孢子量接種種子瓶的情況下，選擇26小時為種子瓶轉(zhuǎn)發(fā)酵瓶最佳時間。在斜面高孢子量接種種子瓶的情況下，選擇22小時為種子瓶轉(zhuǎn)發(fā)酵瓶最佳時間。
4.接種量 接種量的大小取決于生產(chǎn)菌種在發(fā)酵搖瓶中生長繁殖的速度。采用較大的接種量可以縮短發(fā)酵搖瓶中菌絲繁殖到達(dá)高峰的時間，使產(chǎn)物的形成提前到來。這是由于種子量多，同時種子液中含有大量體外水解酶類，有利于對基質(zhì)的利用和產(chǎn)物的合成，并且生產(chǎn)菌素迅速占據(jù)了整個培養(yǎng)環(huán)境減少了雜菌生長的機(jī)會。但是，如果接種量過多，往往使菌絲生長過快，培養(yǎng)液黏度增加，造成溶解氧不足，而影響產(chǎn)物的合成。而接種量過小，除了延長發(fā)酵周期外，往往還會引起其他不正常情況，有時候會出現(xiàn)大量菌絲團(tuán)。因此要按發(fā)酵液比例，將接種量控制在4_5%左右為最佳。
5. pH
在微生物的生長過程中必須保持一定的pH值，但發(fā)酵過程往往pH有可能影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收及代謝產(chǎn)物的分泌。此外，PH還會影響培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的分解等。因此，應(yīng)控制發(fā)酵液的pH，試驗結(jié)果表明pH 6. 0-7. 5最佳，過高或過低，都會減低發(fā)酵的能力。斜面ra調(diào)至7.5±0. 1，種子培養(yǎng)基ra調(diào)至7. 2±0. 1，發(fā)酵培養(yǎng)基ra調(diào)至7. 5±0. 1為佳。 綜上所述，在發(fā)酵過程中，嚴(yán)格控制溫度，使其溫度在28°C ±0. 6t:范圍內(nèi)；調(diào)pH
在6. 0-7. 5范圍內(nèi)；在恒溫間培養(yǎng)時要以220-260r/min的轉(zhuǎn)速來調(diào)節(jié)氧在發(fā)酵液中的溶解
度以250r/min為最佳；接種量在4_5%。通過這些發(fā)酵條件的嚴(yán)格控制以及優(yōu)化工藝，使
菌種的生產(chǎn)能力充分表達(dá)。 AVMBla高濃度累積代謝調(diào)控的試驗 微生物在正常生長條件下，可以通過自我調(diào)節(jié)使機(jī)體內(nèi)的代謝途徑與代謝類型互相協(xié)調(diào)與平衡，通常不會過量積累初級代謝產(chǎn)物。但在人為條件的控制下，可以使微生物過量產(chǎn)生各種初級代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物。 各種營養(yǎng)物質(zhì)對微生物生長代謝及產(chǎn)物合成都很重要，但在為微生物提供營養(yǎng)物質(zhì)時，必須嚴(yán)格掌握各種營養(yǎng)物質(zhì)的濃度和比例，這不僅僅是為了維持正常的滲透壓，或是節(jié)約原材料，還在于營養(yǎng)物質(zhì)的濃度和比例直接影響菌體的繁殖和產(chǎn)物的積累。
微生物生長所需的營養(yǎng)主要是碳源和氮源兩大類，他們都是從發(fā)酵培養(yǎng)基中獲得的。阿佛曼鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源一般為淀粉類物質(zhì)；有機(jī)氮源大多是花生餅粉、黃豆餅粉、玉米漿以及蛋白胨等。由于發(fā)酵培養(yǎng)基荷重很大，要消耗大量糧食，增加生產(chǎn)成本，有可能就要尋找代用品。為了延長微生物的生長期，增加產(chǎn)品的產(chǎn)量，我們在前人的基礎(chǔ)上，結(jié)合甘肅的作物資源優(yōu)勢，最終優(yōu)選確定了合適阿維菌素高濃度累積的碳源與氮源。
1.營養(yǎng)物質(zhì)的配方 發(fā)酵液中各種營養(yǎng)物質(zhì)的濃度，特別是碳氮比、無機(jī)鹽和維生素的濃度，會直接影響菌體的生長和代謝產(chǎn)物的積累。 對正突變株生長的代謝曲線和產(chǎn)抗曲線進(jìn)行反復(fù)摸索與試驗研究，根據(jù)菌種的營養(yǎng)代謝特性，結(jié)合作物資源優(yōu)勢，得到了如下發(fā)酵培養(yǎng)配方，使突變株能夠很好地積累阿維菌素目的產(chǎn)物。 1. 1發(fā)酵培養(yǎng)基配方淀粉110g、糊精20g、豆餅粉12g、花生餅粉8g、酵母粉10g、氯化鈷0. 01g、豆油5g、酵母膏5g。 配置順序(l)先量取自來水600ml倒入1號燒杯中煮沸，秤取110g淀粉打成糊狀淀粉倒入沸水中充分糊化；(2)用萬分之一天平準(zhǔn)確稱取氯化鈷0. Olg加入2號燒杯，加水300ml，置磁力攪拌器上攪拌溶解，待氯化鈷充分溶解后再秤取豆餅粉12g、花生餅粉8g、酵母粉10g、糊精20g加入2號燒杯，待充分混勻后移入1號燒杯；(3)用3號小燒杯準(zhǔn)確稱量酵母膏5g加入少量的水用玻璃棒攪拌溶解，溶解完全后加入1號燒杯，加水定容至1000ml，并用玻璃棒不斷攪拌，所用物質(zhì)都混合均勻；(4)用酸度計調(diào)ra至7.5，用電爐加熱煮沸，用磁力攪拌器邊攪拌邊分裝到種子瓶中，每個種子瓶滴加豆油3-4滴，包扎后高壓滅菌(121°C 22min)。 分瓶稱量配制并分別調(diào)ra的傳統(tǒng)配置方法，優(yōu)點是每個發(fā)酵瓶營養(yǎng)物質(zhì)均勻，但費時費力。但每瓶之間的營養(yǎng)物質(zhì)、K1誤差較大。本發(fā)明的方法用磁力攪拌器邊攪拌邊分
6裝克服了營養(yǎng)物質(zhì)沉淀分裝不均勻的缺點，同時各瓶營養(yǎng)物質(zhì)更準(zhǔn)確、統(tǒng)一，ra值均一，省時省力。 1. 2種子瓶培養(yǎng)基配方糊精10g、淀粉15g、豆餅粉12g、花生餅粉8g、酵母粉6g、酵母膏5g、氯化鈷0. 01g、豆油5g。 配置順序(1)先量取自來水600ml倒入1號燒杯中煮沸，秤取15g淀粉打成糊狀淀粉倒入沸水中充分糊化；(2)用萬分之一天平準(zhǔn)確稱取氯化鈷0. Olg加入2號燒杯，加水300ml，置磁力攪拌器上攪拌溶解，待氯化鈷充分溶解后再秤取豆餅粉12g、花生餅粉8g、酵母粉6g、糊精10g加入2號燒杯，待充分混勻后移入1號燒杯；(3)用3號小燒杯準(zhǔn)確稱量酵母膏5g加入少量的水用玻璃棒攪拌溶解，溶解完全后加入1號燒杯，加水定容至1000ml，并用玻璃棒不斷攪拌，所用物質(zhì)都混合均勻；(4)用酸度計調(diào)K1至7.2，用電爐加熱煮沸，用磁力攪拌器邊攪拌邊分裝到種子瓶中，每個種子瓶滴加豆油3-4滴，封口后高壓滅菌(121°C 22min)。與原來配制方法相比，營養(yǎng)物質(zhì)統(tǒng)一配制，統(tǒng)一調(diào)ra值后，分裝種子瓶，避免以往
分瓶配制營養(yǎng)物質(zhì)，調(diào)PH值，各瓶之間營養(yǎng)物質(zhì)和PH值的差異問題，且省時省力。
2.營養(yǎng)物中的微量元素為了使ra值恒定在符合微生物生長或微生物累積次級代謝產(chǎn)物的需要，必須在
培養(yǎng)基內(nèi)加入可以供微生物利用的微量元素，而又能使培養(yǎng)基ra值相對保持的緩沖體系。
試驗證明硫酸銨在營養(yǎng)物中是很好的微量元素的供應(yīng)物，硫酸銨在培養(yǎng)過程中分解為氨和
硫酸，氨可以利用，硫酸又可以降ra值。在上述培養(yǎng)基的配方中硫酸銨添加量為o.o2g。 在阿佛曼鏈霉菌正突變菌株發(fā)酵培養(yǎng)過程中，對上述營養(yǎng)物反復(fù)的試驗與驗證，
發(fā)現(xiàn)突變菌株的最佳產(chǎn)抗ra等生理生化特性與原出發(fā)菌種相比較產(chǎn)生了一定的變化，能
促使誘導(dǎo)產(chǎn)物累積，使突變株生產(chǎn)能力得到很好的表達(dá)。 3.消泡劑 在阿佛曼鏈霉菌發(fā)酵過程中，要對培養(yǎng)基通氣攪拌、阿維的代謝過程及培養(yǎng)基中
某些成分的分解等，都有可能產(chǎn)生泡沫。雖然在發(fā)酵過程中產(chǎn)生一定數(shù)量的泡沫是正?，F(xiàn)象，但過多的持久性泡沫對發(fā)酵是不利的。因為泡沫會占據(jù)發(fā)酵罐的容積，影響通氣和攪拌的正常進(jìn)行，甚至導(dǎo)致代謝異常，必須消除泡沫。 因此，在配制種子、發(fā)酵培養(yǎng)基時要加入消除泡沫的輔料。
4.前體誘導(dǎo)物 某些化合物被加入培養(yǎng)基后，能夠直接在生物合成過程中結(jié)合到產(chǎn)物分子中去，而自身的結(jié)構(gòu)并未發(fā)生太大變化，卻能提高產(chǎn)物的產(chǎn)量，這類小分子物質(zhì)被稱為前體物質(zhì)。
在培養(yǎng)基優(yōu)化過程中，經(jīng)過試驗驗證，在突變株發(fā)酵培養(yǎng)基配方中加入一定量的丙酸鈉等前體物質(zhì)能誘導(dǎo)產(chǎn)物累積，使突變株生產(chǎn)能力得以很好的表達(dá)。
本發(fā)明的有益效果如下 1.阿佛曼鏈霉菌種經(jīng)12C+6重離子輻照誘變后再經(jīng)本發(fā)明提供的選育工藝選育出了高產(chǎn)穩(wěn)定的生產(chǎn)菌種，使阿維菌素發(fā)酵效價穩(wěn)定地達(dá)到5800i！ g/ml以上的高度，創(chuàng)造了目前國內(nèi)外業(yè)界的最高水平。 2.本發(fā)明工藝具有可控、可調(diào)、可多次重復(fù)的特點。 3.結(jié)合當(dāng)?shù)氐馁Y源特點，提供的培養(yǎng)基成本低，資源豐富，具有顯著的社會效益和
7經(jīng)濟(jì)效益。
具體實施例方式
—、配制培養(yǎng)基 1.發(fā)酵瓶培養(yǎng)基 (1)先量取自來水600ml倒入1號燒杯中煮沸，秤取15g淀粉打成糊狀淀粉倒入沸水中充分糊化； (2)用萬分之一天平準(zhǔn)確稱取氯鈷0. Olg加入2號燒杯，加水300ml，置磁力攪拌器上攪拌溶解，待氯化鈷充分溶解后再秤取豆餅粉12g、花生餅粉8g、酵母粉6g、糊精10g加入2號燒杯，待充分混勻后移入1號燒杯； (3)用3號小燒杯準(zhǔn)確稱量酵母膏5g加入少量的水用玻璃棒攪拌溶解，溶解完全后加入1號燒杯，加水定容至1000ml，并用玻璃棒不斷攪拌，所用物質(zhì)都混合均勻；
(4)用酸度計調(diào)ra至7. 5，用電爐加熱煮沸，用磁力攪拌器邊攪拌邊分裝到250ml燒杯(40ml/瓶)，每個種子瓶滴加豆油3-4滴，封口后高壓滅菌(121°C 22min)。
2.種子瓶培養(yǎng)基 (1)先量取自來水600ml倒入1號燒杯中煮沸，秤取110g淀粉打成糊狀淀粉倒入沸水中充分糊化； (2)用萬分之一天平準(zhǔn)確稱取氯鈷0. Olg加入2號燒杯，加水300ml，置磁力攪拌器上攪拌溶解，待氯化鈷充分溶解后再秤取豆餅粉12g、花生餅粉8g、酵母粉10g、糊精20g加入2號燒杯，待充分混勻后移入1號燒杯； (3)用3號小燒杯準(zhǔn)確稱量酵母膏5g加入少量的水用玻璃棒攪拌溶解，溶解完全后加入1號燒杯，并多次用水沖洗小燒杯將沖洗液倒入大燒杯，加水定容至1000ml，并用玻璃棒不斷攪拌，所用物質(zhì)都混合均勻； (4)用酸度計調(diào)ra至7. 2，用電爐加熱煮沸，用磁力攪拌器邊攪拌邊分裝到250ml燒杯(40ml/瓶)，每個種子瓶滴加豆油3-4滴，封口后高壓滅菌(121°C 22min)。
二、發(fā)酵選育 1.經(jīng)12C+6重離子輻照誘變的阿佛曼鏈霉菌種，輻照劑量為50Gy，進(jìn)行發(fā)酵選育，發(fā)酵溫度(28-0. 6) °C ，發(fā)酵液5，搖瓶機(jī)轉(zhuǎn)速220r/min，接種種齡22小時，接種量4% 。
2.經(jīng)12C+6重離子輻照誘變的阿佛曼鏈霉菌種，輻照劑量為50Gy，進(jìn)行發(fā)酵選育，發(fā)酵溫度28°C ，發(fā)酵液0，搖瓶機(jī)轉(zhuǎn)速250r/min，接種種齡24小時，接種量4. 5% 。
3.經(jīng)12C+6重離子輻照誘變的阿佛曼鏈霉菌種，輻照劑量為70Gy，進(jìn)行發(fā)酵選育，發(fā)酵溫度(28+0. 6) °C ，發(fā)酵液PH7. 5，搖瓶機(jī)轉(zhuǎn)速260r/min，接種種齡26小時，接種量5% 。
在上述三種實施例中，培養(yǎng)基加入硫酸銨0. 02g，并視泡沫量加入消泡劑泡敵和前體誘導(dǎo)物丙酸鈉。 以上實施例，均能達(dá)到本發(fā)明的目的。
8
權(quán)利要求
阿佛曼鏈霉菌種經(jīng)重離子輻照誘變后的高效價菌種的選育工藝，其特征為菌種在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵溫度為28±0.6℃，種子培養(yǎng)基PH 7.0-7.2發(fā)酵培養(yǎng)基PH 6.5-7.5，調(diào)節(jié)氧溶解度的搖床機(jī)轉(zhuǎn)速220-260r/min、接種種齡22-26小時，發(fā)酵液中的接種量4-5％。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的阿佛曼鏈霉菌種經(jīng)重離子輻照誘變后的高效價菌種的選育工藝，其特征為搖瓶機(jī)轉(zhuǎn)速為250r/min。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的阿佛曼鏈霉菌種經(jīng)重離子輻照誘變后的高效價菌種的選育工藝，其特征為發(fā)酵培養(yǎng)基含有下列物質(zhì)淀粉、糊精、豆餅粉、花生餅粉、酵母粉、酵母膏、氯化鈷、豆油、水。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的阿佛曼鏈霉菌種經(jīng)重離子輻照誘變后的高效價菌種的選育工藝，其特征為發(fā)酵瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為淀粉110g、糊精20g、豆餅粉12g、花生餅粉8g、酵母粉10g、氯化鈷0. 01g、豆油5g、水1000ml。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的阿佛曼鏈霉菌種經(jīng)重離子輻照誘變后的高效價菌種的選育工藝，其特征為種子瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為淀粉15g、糊精10g、豆餅粉12g、花生餅粉8g、酵母粉6g、酵母膏5g、氯化鈷0. 01g、豆油5g、水1000ml。
全文摘要
本發(fā)明為阿佛曼鏈霉菌種經(jīng)重離子輻照誘變后的高效價菌種的選育工藝，涉及抗生素選育領(lǐng)域，本發(fā)明是對重離子輻照后的進(jìn)一步選育研究，以獲得最佳選育工藝，本發(fā)明提供的工藝為發(fā)酵溫度(28±0.6)℃，發(fā)酵培養(yǎng)基pH6.5-7.5，搖瓶機(jī)轉(zhuǎn)速220-260r/min，接種種齡22-26小時，接種量4-5％，發(fā)酵培養(yǎng)基的組份為淀粉、糊精、豆餅粉、花生餅粉、酵母粉、酵母膏、氯化鈷、豆油和水，本發(fā)明具有發(fā)酵效價高，6000μg/ml以上，工藝可靠、可控、可調(diào)、穩(wěn)定，培養(yǎng)基資源豐富，成本低的有益效果。
文檔編號C12N15/01GK101768586SQ20081018796
公開日2010年7月7日 申請日期2008年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月31日
發(fā)明者劉敬, 李文建, 王曙陽, 陳積紅, 頡紅梅 申請人:中國科學(xué)院近代物理研究所