專利名稱：：線粒體琥珀酸脫氫酶基因突變檢測(cè)方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體地，本發(fā)明涉及線粒體琥珀酸脫氫酶(SDH)基因突變檢測(cè)方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
：頭頸部家族性副神經(jīng)節(jié)瘤是頭頸部非嗜鉻組織的良性腫瘤，最常見(jiàn)的部位是頸動(dòng)脈體。作為化學(xué)感受器，頸動(dòng)脈體可感知循環(huán)中的低氧刺激，進(jìn)而產(chǎn)生一系列的全身性反應(yīng)，而慢性缺氧可導(dǎo)致頸動(dòng)脈體細(xì)胞增生。哺乳動(dòng)物細(xì)胞在缺氧時(shí)的適應(yīng)性反應(yīng)依賴于線粒體的功能，通過(guò)增加活性氧簇(ROS)的產(chǎn)生進(jìn)而在低氧誘導(dǎo)因子-l(HIF-l)的作用下，激活促紅細(xì)胞生成素(EPO)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和糖酵解酶的轉(zhuǎn)錄，最終增加氧的輸送，促進(jìn)酵解ATP的產(chǎn)生。因此，線粒體的功能與頭頸部家族性副神經(jīng)節(jié)瘤的發(fā)生有關(guān)。該瘤易感基因位于llq23，而線粒體SDH的亞單位SDHD基因就位于此。已經(jīng)有研究證實(shí)，SDH的缺陷是頸動(dòng)脈體腫瘤，也稱為化學(xué)感受器瘤的原因，而SDHD基因就是其易感基因。嗜鉻細(xì)胞瘤和頸動(dòng)脈體瘤可同時(shí)出現(xiàn)在一個(gè)家系或一個(gè)個(gè)體中，表明二者在發(fā)病機(jī)制中可能有一定聯(lián)系。許多研究已發(fā)現(xiàn)在家族性和散發(fā)性嗜鉻細(xì)胞瘤中存在SDHD、SDHB基因突變。據(jù)報(bào)道，與頭頸部副神經(jīng)節(jié)瘤和嗜鉻細(xì)胞瘤有關(guān)的SDHD和SDHB基因突變的分布中，SDHD基因靠近5'端部分的胚系突變多表現(xiàn)為單發(fā)或家族性嗜鉻細(xì)胞瘤或至少有嗜鉻細(xì)胞瘤的多發(fā)副神經(jīng)節(jié)瘤，而在3'端部分的突變則出現(xiàn)頭頸部副神經(jīng)節(jié)瘤。嗜鉻細(xì)胞瘤SDHB基因突變位于外顯子27，而頭頸部副神經(jīng)節(jié)瘤SDHB基因突變則在靠近5'端的外顯子2和3上。對(duì)一例攜帶SDHB基因胚系突變R46Q的散發(fā)性惡性嗜鉻細(xì)胞瘤患者的發(fā)現(xiàn)，線粒體SDH的電子傳遞鏈活性完全喪失，EPAS1、VEGF、VEGFR21、VEGFR22表達(dá)增高。表明嗜鉻細(xì)胞瘤57)/f5基因突變與頭頸部家族性副神經(jīng)節(jié)瘤SD/ZZ)基5因突變的后果類似，可使腫瘤組織低氧反應(yīng)基因表達(dá)增加而促進(jìn)血管形成?？梢?jiàn)，SDHD錨定區(qū)和SDHB酶接觸中心對(duì)維持線粒體SDH的活性都是必需的。異位、復(fù)發(fā)及惡性嗜鉻細(xì)胞瘤與SD7/S突變明顯相關(guān)，在有SDHB基因突變的腫瘤中，其血管結(jié)構(gòu)顯示典型的惡性特征，因此，SDHB基因的突變應(yīng)視為惡性和復(fù)發(fā)的高危因素。現(xiàn)有一些研究報(bào)道見(jiàn)InternalMedicineofChina,Apr.2007，Vol2，No.2，254-256;國(guó)際泌尿系統(tǒng)雜志，2006年1月第26巻第l期，68-72;上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，Vol26No.1，Jan2006，30-33。目前，對(duì)于基因變異的檢測(cè)較為常用的技術(shù)仍然是PCR技術(shù)，然而，對(duì)于SDHB和SDHD的擴(kuò)增而言，由于通常以待測(cè)個(gè)體的血樣基因組DNA為模板，復(fù)雜度較高，很難得到理想的目的基因片段。因此，對(duì)于SDHB和SDHD基因突變的檢測(cè)還有待于進(jìn)一步優(yōu)化。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一類對(duì)于線粒體琥珀酸脫氫酶基因(特別是B亞單位和D亞單位)突變檢測(cè)特別有用的引物，以及一種優(yōu)化的線粒體琥珀酸脫氫酶基因突變檢測(cè)方法。在本發(fā)明的第一方面，提供一種檢測(cè)樣品中是否存在線粒體琥珀酸脫氫酶(SDH)基因變異的試劑，其特征在于，所述的試劑是引物對(duì)，選自下組SEQIDNO:1和SEQIDNO:2(特異性擴(kuò)增SDHB基因外顯子1);SEQIDNO:3和SEQIDNO:4(特異性擴(kuò)增SDHB基因外顯子2);SEQIDNO:5和SEQIDNO:6(特異性擴(kuò)增SDHB基因外顯子3);SEQIDNO:7和SEQIDNO:8(特異性擴(kuò)增SDHB基因外顯子4);SEQIDNO:9和SEQIDNO:10(特異性擴(kuò)增SDHB基因外顯子5);SEQIDNO:ll和SEQIDNO:12(特異性擴(kuò)增SDHB基因外顯子6);SEQIDNO:13和SEQIDNO:14(特異性擴(kuò)增SDHB基因外顯子7);SEQIDNO:15和SEQIDNO:16(特異性擴(kuò)增SDHB基因外顯子8);SEQIDNO:17和SEQIDNO:18(特異性擴(kuò)增SDHD基因外顯子l);SEQIDNO:19和SEQIDNO:20(特異性擴(kuò)增SDHD基因外顯子2);SEQIDNO:21和SEQIDNO:22(特異性擴(kuò)增SDHD基因外顯子3);禾口/或SEQIDNO:23和SEQIDNO:24(特異性擴(kuò)增SDHD基因外顯子4)。在另一優(yōu)選例中，所述的線粒體琥珀酸脫氫酶基因包括線粒體琥珀酸脫氫酶B亞單位(SDHB基因)，線粒體琥珀酸脫氫酶D亞單位(SDHD基因)。在本發(fā)明的第二方面，提供一種檢測(cè)樣品中是否存在線粒體琥珀酸脫氫酶基因變異的試劑盒，所述的試劑盒中含有選自前述的一種或多種引物對(duì)。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中含有SEQIDNO:l-24的引物。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還含有PCR擴(kuò)增試劑(包括但不限于dNTP，DNA聚合酶)；核酸提取試劑；和/或使用說(shuō)明書和/或核酸序列分析軟件。在本發(fā)明的第三方面，提供一種獲得線粒體琥珀酸脫氫酶基因(片段)擴(kuò)增產(chǎn)物的方法，所述的方法包括以核酸樣品為模板，利用選自前述的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。在另一優(yōu)選例中，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，PCR熱循環(huán)步驟如下(a)94士rC進(jìn)行30士5秒；(b)59士4。C退火45士5秒；(c)72士rC進(jìn)行45士5秒;重復(fù)步驟(a)-(c)30±5次。在另一優(yōu)選例中，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，若以SEQIDNO:1和SEQIDN0:2為引物，退火溫度是58士1。C;若以SEQIDNO:3和SEQIDNO:4為引物，退火溫度是56士廠C;若以SEQIDNO:5和SEQIDNO:6為引物，退火溫度是62土rC;若以SEQIDNO:7和SEQIDNO:8為引物，退火溫度是58士rC;若以SEQIDNO:9和SEQIDNO:10為引物，退火溫度是60土rC;若以SEQIDNO:ll和SEQIDNO:12為引物，退火溫度是58士rC;若以SEQIDNO:13和SEQIDNO:14為引物，退火溫度是60土rC;若以SEQIDNO:15和SEQIDNO:16為引物，退火溫度是58士rC;若以SEQIDNO:17和SEQIDNO:18為引物，退火溫度是58士rC;若以SEQIDNO:19和SEQIDNO:20為引物，退火溫度是56土rC;若以SEQIDNO:21和SEQIDNO:22為引物，退火溫度是58±1°。；或若以SEQIDNO:23和SEQIDNO:24為引物，退火溫度是60士1。C。在另一優(yōu)選例中，在進(jìn)行PCR熱循環(huán)前，還包括模板變性步驟95士rc進(jìn)行3±2(較佳的是3±1)分鐘；和在進(jìn)行PCR熱循環(huán)后，還包括延伸步驟72士rC進(jìn)行10土2(較佳的是10±1)分鐘。在另一優(yōu)選例中，在PCR擴(kuò)增體系中，還加入二甲基亞砜(DMSO)，其在PCR擴(kuò)增體系中的終濃度按照體積為3-10y。；較佳的是3-8%;更佳的是4-6%，如5%。在本發(fā)明的第四方面，提供一種確定待測(cè)核酸樣品中是否存在線粒體琥珀酸脫氫酶基因變異的方法，所述的方法包括(1)采用所述的方法從待測(cè)核酸樣品中擴(kuò)增線粒體琥珀酸脫氫酶基因片段；(2)分析(l)擴(kuò)增產(chǎn)物中線粒體琥珀酸脫氫酶基因片段的序列，并與野生型線粒體琥珀酸脫氫酶基因中對(duì)應(yīng)的序列進(jìn)行比較；如果存在不同，則表明測(cè)核酸樣品中存在線粒體琥珀酸脫氫酶基因變異。在另一優(yōu)選例中，所述的野生型線粒體琥珀酸脫氫酶基因SDHB的序列參見(jiàn)GenBank登錄號(hào)NTJ)04610.18，所述的野生型線粒體琥珀酸脫氫酶基因SDHD參見(jiàn)GenBank登錄號(hào)NTJ)33899.7。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。圖1顯示了采用本發(fā)明優(yōu)化的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果。其中，泳道1-9分別表示DNAMarker,以及利用表1中SDHB-1、SDHB-2、SDHB-3、SDHB-4、SDHB-5、SDHB-6、SDHB-7、SDHB-8相應(yīng)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果。圖2顯示了采用本發(fā)明優(yōu)化的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果。其中，泳道l-5分別表示DNAMarker、以及利用表1中SDHD-1、SDHD-2、SDHD-3、SDHD-4相應(yīng)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果。圖3顯示了采用其它引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果。其中，泳道l-13分別表示DNAMarker,以及利用表2中SDHB-l-a、SDHB-2-a、SDHB-3-a、SDHB-4-a、SDHB-5-a、SDHB-6-a、SDHB-7-a、SDHB-8-a、SDHD-l-a、SDHD-2-a、SDHD-3-a、SDHD-4-a相應(yīng)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果。具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，找到了一類特別適合于擴(kuò)增線粒體琥珀酸脫氫酶(SDH)基因(包括SDHB基因或SDHD基因)的引物，所述引物經(jīng)過(guò)合理的設(shè)計(jì)、優(yōu)選而獲得，用于PCR擴(kuò)增時(shí)特異性良好，且擴(kuò)增效率高。本發(fā)明人還優(yōu)化了PCR擴(kuò)增反應(yīng)，進(jìn)一步提高了擴(kuò)增效率。SDH基因線粒體琥珀酸脫氫酶(SDH)是三羧酸循環(huán)和有氧電子傳遞呼吸鏈中的關(guān)鍵酶之一，包含A、B、C、D4個(gè)亞單位。亞單位A(SDHA，黃素蛋白)和B(SDHB，鐵硫蛋白)形成酶接觸中心，而亞單位C(SDHC)和D(SDHD)組成線粒體膜內(nèi)復(fù)合酶II錨定區(qū)，4個(gè)亞單位分別由4個(gè)基因編碼。SDHA基因定位于5pl5，基因組DNA包含38kb，編碼黃素蛋白。SDHB基因定位于lp36.1-p35，基因組DNA包含近40kb，8個(gè)外顯子，編碼鐵硫蛋白亞單位，有252個(gè)氨基酸。SDHC基因定位于lq21，基因組DNA包含近50kb，6個(gè)外顯子，編碼琥珀酸2輔酶Q氧化還原酶中細(xì)胞色素b大亞單位(cybL)，有140個(gè)氨基酸。SDHD基因定位于llq23，基因組DNA包含19kb，4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，4個(gè)外顯子堿基對(duì)分別為52bp、117bp、145bp、163bp，編碼琥珀酸-輔酶Q氧化還原酶中細(xì)胞色素b小亞單位(cybS)，有103個(gè)氨基酸。SDH的各亞單位中，SDHB基因和SDHD基因的變異與嗜鉻細(xì)胞瘤和頸動(dòng)脈體瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。并且，也已發(fā)現(xiàn)，SDHB基因或SDHD基因在患病人群中變異率很高；而在正常人群中變異率很低。因此，本發(fā)明中，除非另外說(shuō)明，所述的SDH基因是指SDHB基因(或基因片段)或SDHD基因(或基因片段)。9SDH基因變異的檢測(cè)試劑或試劑盒基于SDHB基因和SDHD基因與嗜絡(luò)細(xì)胞瘤和頸動(dòng)脈體瘤的密切相關(guān)性，可以通過(guò)分析SDHB基因或SDHD基因的變異情況(i)進(jìn)行嗜鉻細(xì)胞瘤和頸動(dòng)脈體瘤的鑒別診斷、和/或易感性分析；(ii)早期評(píng)估相關(guān)人群嗜鉻細(xì)胞瘤和頸動(dòng)脈體瘤的患病風(fēng)險(xiǎn)，早期監(jiān)測(cè)早期防治。可采用各種技術(shù)來(lái)檢測(cè)SDHB基因或SDHD基因變異位點(diǎn)，較為方便的是用SDHB基因或SDHD基因特異的引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，對(duì)SDHB基因或SDHD基因進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，從而判斷是否發(fā)生變異。該技術(shù)也可檢測(cè)SDHB基因或SDHD基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。在檢測(cè)SDHB基因或SDHD基因變異時(shí)，檢測(cè)可以針對(duì)cDNA，也可針對(duì)基因組DNA。本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)SDHB基因或SDHD基因突變時(shí)，利用一般的引物，PCR擴(kuò)增時(shí)的特異性差，擴(kuò)增效率低下。因此，需要設(shè)計(jì)和篩選特異性好的引物。經(jīng)過(guò)大量的試驗(yàn)和比較，本發(fā)明人找到了分別對(duì)應(yīng)于SDHB基因的8個(gè)外顯子和SDHD基因的4個(gè)外顯子的引物，經(jīng)驗(yàn)證所述引物獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物既包含了SDHB基因或SDHD基因各外顯子上盡可能完整的序列，且特異性非常好，PCR擴(kuò)增成功率接近100。/。，特別適用于復(fù)雜體系的PCR擴(kuò)增。各引物的核苷酸序列及其較佳的退火溫度如表l所示。表l引物核苷酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>本發(fā)明還提供了用于在分析物中檢測(cè)含有SDHB基因或SDHD基因變異的試劑盒，該試劑盒包括裝在適當(dāng)容器中的、用于特異性擴(kuò)增SDHB基因或SDHD基因的引物，并且用所述引物擴(kuò)增出的擴(kuò)增產(chǎn)物含有SDHB基因或SDHD基因相關(guān)外顯子上疾病相關(guān)的變異部位。所述的試劑盒中含有選自表l的至少一對(duì)引物，用于獲得相關(guān)的SDHB基因或SDHD基因外顯子上包含變異位點(diǎn)的序列。最佳的，所述的試劑盒中含有表l中所有的引物對(duì)，這樣更有利于完整地分析SDHB基因和SDHD基因各外顯子序列的變異情況。此外，所述的試劑盒中還可包括用于提取DNA、PCR擴(kuò)增等所需的各種試劑，包括但不限于抽提液、擴(kuò)增液、雜交液、酶、洗液等。這些試劑均是本領(lǐng)域人員所了解的。此外，所述的試劑盒中還可包括使用說(shuō)明書和/或核酸序列分析軟件等，便于本領(lǐng)域人員使用和分析。獲得SDH基因擴(kuò)增產(chǎn)物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明人還提供了一種優(yōu)化的從核酸樣品中獲得SDH基因擴(kuò)增產(chǎn)物的方法，所述的方法包括以核酸樣品為模板，利用選自表1的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。利用所述的引物，采用常規(guī)的PCR擴(kuò)增方法即可獲得較為理想的擴(kuò)增結(jié)果。一種可選的PCR擴(kuò)增方法中，PCR熱循環(huán)步驟如下(a)94士l。C進(jìn)行30土5秒；(b)59士4。C退火45士5秒；(c)72±1。C進(jìn)行45土5秒；重復(fù)步驟(a)-(c)30±5次。進(jìn)行PCR熱循環(huán)前的模板變性步驟可根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)的方法。較佳的方法如下95士rC進(jìn)行3土2;更佳的是95士0.5。C進(jìn)行3士1分鐘。進(jìn)行PCR熱循環(huán)后后的序列延伸步驟可根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)的方法。較佳的方法如下72士rC進(jìn)行10士2分鐘；較佳的是72"進(jìn)行10士1分鐘。除了采用本發(fā)明的引物，本發(fā)明對(duì)PCR擴(kuò)增體系中其它各成分及其終濃度沒(méi)有特別的限制，本領(lǐng)域人員可根據(jù)常規(guī)建立PCR體系時(shí)采用的一般成分及其濃度來(lái)建立PCR擴(kuò)增體系。用于PCR擴(kuò)增的模板(如基因組DNA)也可采用本領(lǐng)域的常規(guī)方法提取獲得。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，在PCR擴(kuò)增體系中，還加入二甲基亞砜(DMSO)，其在PCR擴(kuò)增體系中的終濃度按照體積為3-10y。；較佳的是3-8%;更佳的是4-6%。DMSO的應(yīng)用可一定程度地降低反應(yīng)體系中引物二聚體的形成或錯(cuò)配的形成。采用本發(fā)明的獲得SDHB基因或SDHD基因擴(kuò)增產(chǎn)物的方法，擴(kuò)增效率和特異性均非常理想，且特別適合于復(fù)雜體系的PCR擴(kuò)增，例如以血樣基因組DNA作為PCR模板的擴(kuò)增。本發(fā)明還提供了一種確定待測(cè)核酸樣品中是否存在SDH基因變異的方法，所述的方法包括采用前述的方法從待測(cè)核酸樣品中擴(kuò)增SDH基因片段，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；以及分析擴(kuò)增產(chǎn)物中SDH基因片段的序列，并與野生型SDH基因中對(duì)應(yīng)的序列進(jìn)行比較；如果存在不同，則表明測(cè)核酸樣品中存在SDH基因變異。12通過(guò)判斷SDH基因變異的情況，可進(jìn)一步得知受試者嗜鉻細(xì)胞瘤或頸動(dòng)脈體瘤的患病風(fēng)險(xiǎn)，從而達(dá)到早期監(jiān)領(lǐng)IJ早期防治的目的。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(1)首次針對(duì)SDHB基因和SDHD基因的多個(gè)外顯子設(shè)計(jì)了合適的引物，所述引物在用于PCR擴(kuò)增時(shí)特異性良好，擴(kuò)增效率高。(2)優(yōu)化了獲得SDH基因擴(kuò)增產(chǎn)物的方法，所述方法精確、快速、穩(wěn)定，成功率高。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例l利用優(yōu)化的引物測(cè)定散發(fā)性嗜鉻細(xì)胞瘤患者基因突變情況1、獲取待測(cè)者血樣基因組DNA采集散發(fā)性嗜鉻細(xì)胞瘤患者的外周抗凝血5ml，使用U-geneBloodDNAKit進(jìn)行血液基因組DNA的抽提，具體步驟(1)在1.5ml離心管中加入250ul全血樣品。(2)加入250y1的XY緩沖液(U-gene)，振蕩混合均勻。(3)再加入20yl的蛋白酶K(10mg/ml)，劇烈振蕩混合均勻。(4)56"溫浴過(guò)夜。(5)加入260lU的無(wú)水乙醇，振蕩混合，12000rpm離心1分鐘，使溶液中的固體沉淀物甩至管底。(6)將DNA分離柱置于一個(gè)2ml的收集管中，將上步得到溶液倒入柱子中，8000rpm離心1min，棄去該收集試管和流出液。(7)分離柱放于另一新的收集管，加入700"1的乙醇稀釋的DNA洗滌緩沖液(U-gene)洗滌，8000rmp離心lmin，保留該收集管，棄去流出液。(8)重復(fù)(7)—次。(9)使用同上的收集管，用12000rmp離心2min以甩干柱子。(10)將分離柱置于新的1.5ml離心管中，在空氣中放置5min左右以待乙醇?xì)馕断?，同時(shí)預(yù)熱DNA洗脫液(U-gene)以備用。(11)將200nl的DNA洗脫液加入柱子中，并在室溫中放置3min，12000rpm離心3min。(12)重復(fù)(ll)一次。(13)棄去分離柱，獲取DNA洗脫液，其中含待測(cè)者的基因組DNA，作為PCR模板。2、PCR實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備緩沖液必須全部融化，振蕩均勻；dNTP融化后需放入冰塊中；Taq酶(申能博采TaqDNA聚合酶)需要放入冰塊中，避免手指接觸和長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中；模板(待測(cè)者的基因組DNA)完全融化后，放入冰塊中。3、PCR反應(yīng)體系10X緩沖液2UL;TaqDNA酶0.2UL;dNTP:0.4yL;正向引物1PL;反向引物1tiL;模板1HL;ddH20:14.4UL;20liL。4、PCR操作過(guò)程(1)制備預(yù)混液一般先加入ddH20，然后加入引物、緩沖液、DMSO(加入DMSO后振蕩混勻)，加入dNTP，最后加入Taq酶，立即振蕩混和均勻；(2)把模板加入到PCR薄壁管的底部，最后一管加入ddH20作為陰性對(duì)照；(3)將PCR預(yù)混液分裝到每一個(gè)PCR反應(yīng)管中；(4)全部溶液加完后，離心以保證管壁上沒(méi)有殘留PCR反應(yīng)液。PCR反應(yīng)的一般程序95°C3min，變性；94°C30sec，表l相應(yīng)退火溫度下45sec，72°C45sec，進(jìn)行30循環(huán)。72°C10min，延伸；22°C保存。利用上述的方法、表1引物及其優(yōu)化的溫度進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后分析擴(kuò)增產(chǎn)物中相關(guān)的序列，確定102例散發(fā)性嗜鉻細(xì)胞瘤患者的血樣中SDHB和SDHD的基因突變情況。102例散發(fā)性嗜鉻細(xì)胞瘤患者中，腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤91人(89%)，副神經(jīng)節(jié)細(xì)胞瘤10人(10%)，腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤合并副神經(jīng)節(jié)細(xì)胞瘤1人(1%)。其中惡性16人(16%)，平均年齡(43.85士13.92)歲。每份標(biāo)本使用SDHB基因8個(gè)外顯子和SDHD基因4個(gè)外顯子的不同引物，分別進(jìn)行測(cè)序分析，并測(cè)定其堿基序列。本組標(biāo)本的PCR測(cè)序結(jié)果共發(fā)現(xiàn)4個(gè)突變，分別是(1)在SDHB基因2號(hào)外顯子，第287位由C—T，導(dǎo)致相應(yīng)的密碼子由QGA—IGA，使編碼精氨酸Arg的CGA變?yōu)榻K止密碼子IGA，R46X;(2)在SDHB基因3號(hào)外顯子，第419位由C—T，導(dǎo)致相應(yīng)的密碼子由QGA—IGA，使編碼精氨酸Arg的CGA變?yōu)榻K止密碼子IGA，R90X;(3)在SDHB基因7號(hào)外顯子，第876位由G—A，導(dǎo)致相應(yīng)的密碼子由CQC—CAC，導(dǎo)致氨基酸由精氨酸變成組氨酸，R242H;(4)在SDHD基因3號(hào)外顯子，第228位由A—G，導(dǎo)致相應(yīng)的密碼子由AGT—QGT，導(dǎo)致氨基酸由絲氨酸變成甘氨酸，S73G。注上述基因和蛋白的位點(diǎn)編號(hào)基于整個(gè)SDH基因及其編碼的整條肽鏈，所涉及基因和蛋白的Genbank號(hào)分別為SDHB:NM—003000.2和NP—002991.2;SDHD:NM—003002.1和NP—002993.1。采用表1的各引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增SDHB或SDHD，擴(kuò)增的成功率接近100。/。，幾乎沒(méi)有非特異性擴(kuò)增或擴(kuò)增產(chǎn)物特別少的情況。實(shí)施例2PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化以1例散發(fā)性嗜鉻細(xì)胞瘤患者的血樣基因組DNA為模板，分別采用表l中所示的引物擴(kuò)增SDHB和SDHD外顯子，PCR擴(kuò)增方法和條件與實(shí)施例l相同，獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果見(jiàn)圖l-2?？梢?jiàn)，各PCR反應(yīng)產(chǎn)物呈單一的目的基因片段的條帶，且條帶亮度強(qiáng)、明顯且清晰，無(wú)雜帶。同樣以前述1例散發(fā)性嗜鉻細(xì)胞瘤患者的血樣基因組DNA為模板，采用以下表2所列的引物(所述引物是根據(jù)SDHB和SDHD序列設(shè)計(jì)但不同于表1中的引物)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增方法和條件與實(shí)施例l相同。表2引物核苷酸序列引物序列(5，—3，)SEQIDNO:退火溫度rc)SDHB-lF-aAGTCCCCTTTCTGAACGTCC2558SDHB-lR-aTCCCCTTTCTGAGAAGGTCA26SDHB-2F-aTCCTGAGTGGCTGGGATTACA2756SDHB-2R-aTATTCATCCAGAGCTCCCTGT28SDHB-3F-aTGGACAAGCATAAGTGCCAGA2962SDHB-3R-aAAACAAAAACTCGGCCACTG30SDHB-4F-aTAGGCGTTTATCTTCTGCCA358SDHB-4R-aTAACCTCAAGGTTGCCACAT32SDHB陽(yáng)5F-aATGGAGTAGCCACACAGCAA3360SDHB-5R-aTGGTGTTTTCAAGGGCAGAA34SDHB-6F-aACCAGGCAAACGGAAATACA3558SDHB-6R-aTTGAATCTCTCCCGTCTTGA36SDHB-7F-aATGGGTTCCTGTGCATCCTTA3760SDHB-7R陽(yáng)aTCAGAGACAGCAAGTCCAGC3816<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>同樣，對(duì)采用表2引物PCR擴(kuò)增后獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果見(jiàn)圖3。由結(jié)果可見(jiàn)，其中一些引物擴(kuò)增得到了非特異性的產(chǎn)物(即產(chǎn)生多于一條的電泳條帶)；一些目的基因片段的條帶顯示很不明顯，可能是獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物少，擴(kuò)增效率低下。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表<110>上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院〈120〉線粒體琥珀酸脫氫酶基因突變檢測(cè)方法和試劑盒<130>082593<160>48<170〉Patentlnversion3.3〈210〉1〈211〉18<212>腿<213>人工序列<220〉<221〉misc—feature〈223>引物<400>1cgccgctactgcgctatt18<210〉2<211〉20<212>DNA<213>人工序列<220〉<221〉misc_feature<223>引物<400>2tgtcctttcctcacccatcc20<210〉3<211〉20<212>DNA〈213〉人工序列<220〉<221〉misc_feature<223〉引物<400〉3gcatgtccctaaatcaaatc20<210〉4<211〉18<212>DNA<213〉人工序列<220><221〉misc—feature<223〉引物<400〉4ctttcccaacagtatcgc18<210>5<211>20<212〉畫<213〉人工序列<220><221>misc—feature<223>引物<400〉5agcccaacaggaatgaaatg20<210〉6<211>20<212〉DNA<213〉人工序列<220><221>misc一feature<223〉引物<400〉6cagggatgctccgcttagta20<210>7<211〉18<212〉腿<213〉人工序列<220〉<221>misc一feature<223〉引物<400〉7ggtcctcctcctgccata18<210>8<211>19<212〉DNA<213>人工序列<220><221>misc—feature<223>引物<400>8gccattagaaccacattcg<210>9<211>18<212〉DNA<213〉人工序列<220><221〉misc_featu:re<223〉引物<400〉9aaagcaggacggtggtag<210〉10<211〉18<212〉DNA<213>人工序列<220〉<221〉misc一feature<223>引物<400〉10tggcatagagtggacgag<210〉11<211〉19<212〉腿<213〉人工序列<220〉<221>misc一feature<223〉引物<400〉11caatgcaaccaattaccct<210〉12<211>19<212〉DNA<213〉人工序列<220><221>misc—feature<223>引物191818<400〉12cgtggatttaagaaccctg<210>13<211〉18<212>DNA<213>人工序列<220〉<221>misc—feature<223>引物<400〉13aaatgcgagcaggaagag<210>14<211〉18<212>腿<213〉人工序列<220><221〉misc—feature<223〉引物<400>14ttgagttgagccagggtg<210〉15<211>21<212〉DNA<213>人工序列<220><221>misc—feature<223〉引物<400>15tgagtgttcagaataagtgcc<210〉16<211〉19<212>廳<213〉人工序列<220><221>misc—feature<223>引物<400〉16gaaggagtttcacccaaga說(shuō)明書第17/25頁(yè)19181821<210>17<211〉19<212>DNA<213>人工序列<220><221〉misc—feature<223>引物<400〉17agtaaactgcgccttctgc<210〉18<211〉19<212〉DNA<213〉人工序列<220><221〉misc一feature<223〉引物<400〉18ccttcgggtaaacatctgg<210>19<211〉18<212〉DNA<213〉人工序列<220><221>misc—feature<223>引物<400>19ataggatttggcgattga<210〉20<211>18<212〉腿<213〉人工序列<220〉<221>misc—feature<223>引物<400>20ctagagcccagaaagcag<210〉211822〈212>DNA<213〉人工序列<220><221>niisc_feature<223>引物<400>21cctggaccactaacttacat<210〉22<211>19<212>DNA<213>人工序列<220〉<22]〉niisc—feature<223>引物<400〉22caatcaacttctccctcat<210〉23<211〉18<212>DNA<213>人工序列<220〉<221〉misc—feature<223>引物<400〉23tggagtggcaaatggaga<210>24<211〉18<212〉DNA<213〉人工序列<220><221〉misc一feature<223〉引物<400>24aagcagaggcaaagaggc<210〉25<211>20<212〉腿<213〉人工序列說(shuō)明書第19/25頁(yè)201918<220><221〉misc—feature<223〉引物<400>25agtcccctttctgaacgtcc<210>26<211>20<212〉DNA<213>人工序列<220〉<221>misc一feature<223〉引物<400〉26tcccctttctgagaaggtca<210〉27<211〉21<212>DNA<213>人工序列<220〉<221>misc一feature<223〉引物<400〉27tcctgagtggctgggattaca〈210〉28<211>21<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc一feature<223〉引物<400>28tattcatccagagctccctgt<210〉29<211>21<212>DNA<213>人工序列<220〉<221〉misc一feature說(shuō)明書第20/25頁(yè)202021<223〉引物<400〉29tggacaagcat.aagtgccaga<210〉30<211>20<212〉DNA<213〉人工序列<220><221>iiiisc—feature<223〉引物<400>30aaacaaaaactcggccactg<210>31<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc—feature<223〉引物<400〉31taggcgtttatcttctgcca<210〉32<211>20〈212〉DNA<213>人工序列<220〉<221>misc—feature<223>引物<400〉32taacctcaaggttgccacat<210〉33<211〉20<212〉DNA<213〉人工序列<220><221>misc一feature<223>引物<400〉33212020atggagtagccacacagcaa<210〉34<211>20<212>DNA〈213〉人工序列<220〉<221〉misc—feature<223〉引物<400>34tggtgttttcaagggcagaa<210>35<211>20<212〉DNA<213〉人工序列<220><221〉misc一feature<223〉引物<400〉353ccaggcaa3cggaaat3C3<210>36〈211〉20<212〉DNA<213〉人工序列<220><221〉misc一feature<223〉引物<400〉36ttgaatctctcccgtcttga<210〉37<211〉21<212>DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc—feature<223〉引物<400>37atgggttcctgtgcatcctta<210>38<212>腿<213>人工序列<220><221〉misc_feature<223〉引物<400〉38tcagagacagcaagtccagc<210〉39<211>19<212>薩<213〉人工序列<220〉<221〉misc一feature〈223〉引物<400〉39tcagttccacggctcatca<210〉40<211〉21<212〉DNA<213>人工序列<220〉<221〉misc一feature<223〉引物<400〉40tgggcctgtttacctgttaga<210〉41<211〉19<212>DNA<213〉人工序列<220〉<221〉raise—feature<223〉引物<400>41aactccgcttcatcggctt<210〉42〈211〉21<212〉DNA說(shuō)明書第23/25頁(yè)20192127<221>misc—feature<223〉引物<400>42cagagggagctctctttctga<210〉43<211>20<212〉腿<213〉人工序列<220〉<221〉misc一feature<223〉引物<400>43aaagaatgcctgaggtgtca<210>44<211〉20<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc一feature<223〉引物<400〉44aggttgcagtgagccgagat<210>45<211〉21<212>DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc一feature<223〉引物<400>45aggcattgagatacccttgtg<210〉46<2U〉21<212〉DNA<213>人工序列<220〉28<223>引物<400〉46agagtgcaggaggaacagat<210>47<211〉20<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc—feature<223>引物<400>47acagaatcccctaaagaagc<210〉48<211>20<212>DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc—feature<223〉引物<400〉48tctgaaaataatcttgtgat說(shuō)明書第25/25頁(yè)212029權(quán)利要求1.一種檢測(cè)樣品中是否存在線粒體琥珀酸脫氫酶基因變異的試劑，其特征在于，所述的試劑是引物對(duì)，選自下組SEQIDNO1和SEQIDNO2；SEQIDNO3和SEQIDNO4；SEQIDNO5和SEQIDNO6；SEQIDNO7和SEQIDNO8；SEQIDNO9和SEQIDNO10；SEQIDNO11和SEQIDNO12；SEQIDNO13和SEQIDNO14；SEQIDNO15和SEQIDNO16；SEQIDNO17和SEQIDNO18；SEQIDNO19和SEQIDNO20；SEQIDNO21和SEQIDNO22；和/或SEQIDNO23和SEQIDNO24。2.如權(quán)利要求l所述的試劑盒，其特征在于，所述的線粒體琥珀酸脫氫酶基因包括線粒體琥珀酸脫氫酶B亞單位，或線粒體琥珀酸脫氫酶D亞單位。3.—種檢測(cè)樣品中是否存在線粒體琥珀酸脫氫酶基因變異的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中含有選自權(quán)利要求l的一種或多種引物對(duì)。較佳的，所述的試劑盒中含有SEQIDNO:l-24的引物。4.如權(quán)利要求l所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中還含有PCR擴(kuò)增試劑；核酸提取試劑；核酸序列分析軟件；和/或使用說(shuō)明書。5.—種獲得線粒體琥珀酸脫氫酶基因擴(kuò)增產(chǎn)物的方法，其特征在于，所述的方法包括以核酸樣品為模板，利用選自權(quán)利要求1的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，PCR熱循環(huán)步驟如下(a)94土rC進(jìn)行30土5秒;(b)59士4。C退火45土5秒；(c)72土1。C進(jìn)行45土5秒;重復(fù)步驟(a)-(c)30土5次。7.如權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，若以SEQIDNO:1和SEQIDN0:2為引物，退火溫度是58土rC;若以SEQIDNO:3和SEQIDNO:4為引物，退火溫度是56士rC;若以SEQIDNO:5和SEQIDNO:6為引物，退火溫度是62士rC;若以SEQIDNO:7和SEQIDNO:8為引物，退火溫度是58士rC;若以SEQIDNO:9和SEQIDNO:10為引物，退火溫度是60土1。C;若以SEQIDNO:U和SEQIDNO:12為引物，退火溫度是58土1"C;若以SEQIDNO:13和SEQIDNO:14為引物，退火溫度是60±1°〇；若以SEQIDNO:15和SEQIDNO:16為引物，退火溫度是58士rC;若以SEQIDNO:17和SEQIDNO:18為引物，退火溫度是58土rC;若以SEQIDNO:19和SEQIDNO:20為引物，退火溫度是56土rC;若以SEQIDNO:21和SEQIDNO:22為引物，退火溫度是58土rC;或若以SEQIDNO:23和SEQIDNO:24為引物，退火溫度是60士rC。8.如權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于，在進(jìn)行PCR熱循環(huán)前，還包括模板變性步驟95士rC進(jìn)行3土2分鐘；或在進(jìn)行PCR熱循環(huán)后，還包括延伸步驟72土rC進(jìn)行10士2分鐘。9.如權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于，在PCR擴(kuò)增體系中，還加入二甲基亞砜，其在PCR擴(kuò)增體系中的終濃度按照體積為3-1(T/0。10.—種確定待測(cè)核酸樣品中是否存在線粒體琥珀酸脫氫酶基因變異的方法，其特征在于，所述的方法包括(1)采用權(quán)利要求5所述的方法從待測(cè)核酸樣品中擴(kuò)增線粒體琥珀酸脫氫酶基因片段；(2)分析(l)擴(kuò)增產(chǎn)物中線粒體琥珀酸脫氫酶基因片段的序列，并與野生型線粒體琥珀酸脫氫酶基因中對(duì)應(yīng)的序列進(jìn)行比較；如果存在不同，則表明測(cè)核酸樣品中存在線粒體琥珀酸脫氫酶基因變異。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了檢測(cè)樣品中是否存在線粒體琥珀酸脫氫酶(SDH)基因變異的試劑，以及包含所述試劑的試劑盒，所述的試劑或試劑盒可用于進(jìn)行嗜鉻細(xì)胞瘤的易感性分析。本發(fā)明還公開(kāi)了優(yōu)化的獲得SDH基因擴(kuò)增產(chǎn)物的方法，以及確定待測(cè)核酸樣品中是否存在SDH基因變異的方法。文檔編號(hào)C12N15/10GK101684486SQ20081020034公開(kāi)日2010年3月31日申請(qǐng)日期2008年9月24日優(yōu)先權(quán)日2008年9月24日發(fā)明者周薇薇,蕾姜,光寧,斌崔,王衛(wèi)慶,蘇颋為,袁文祺,鄭旭磊申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院