專利名稱：一種紅細(xì)胞的凍干保護(hù)劑及其在凍干過程中的使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種紅細(xì)胞的凍干保護(hù)劑及其在凍干過程中的使用 方法。在凍干紅細(xì)胞前將凍干保護(hù)劑加入待凍干的紅細(xì)胞中，然后 按照一定的凍干程序進(jìn)行凍干，當(dāng)復(fù)水時(shí)用復(fù)水保護(hù)劑進(jìn)行復(fù)水， 通過本保護(hù)劑能夠明顯的提高凍干后紅細(xì)胞的恢復(fù)率。
背景技術(shù)：
目前大部分血液是在4-C的冰箱中保存的，并且保存的天數(shù)也僅 在20天左右，不能滿足長時(shí)間大量的保存的需要，所以一方面是無 償獻(xiàn)出的血由于保存時(shí)間較短而白白浪費(fèi)掉，而另一方面卻是當(dāng)發(fā) 生重大災(zāi)害(像地震，戰(zhàn)爭(zhēng))時(shí)需要大量的血液時(shí)卻供給不足，因 此探索紅細(xì)胞長期保存技術(shù)是緩解并解決目前日漸突出的臨床用血 矛盾的方法之一。
冷凍干燥技術(shù)是在低溫真空條件下進(jìn)行，蛋白質(zhì)及紅細(xì)胞中熱 敏性成分不易受到破壞損失，干燥時(shí)微生物生長、酶的活性、以水 為介質(zhì)的生化反應(yīng)等都受到抑制，因氧氣極少，易氧化成分不易受 到破壞，生物活性基本不變。
因此凍干保存是最適合紅細(xì)胞長期保存的需要，但是由于紅細(xì) 胞在凍干和復(fù)水過程中都要受到外界的各種影響，所以一直以來紅 細(xì)胞凍干后復(fù)水的恢復(fù)率一直不是太高，目前報(bào)道的紅細(xì)胞凍干回
收率最高僅為58. 8%，因此紅細(xì)胞凍干保存后的高復(fù)水率，成為一個(gè)世界性的難題，

發(fā)明內(nèi)容
為了解決紅細(xì)胞凍干后復(fù)水的高恢復(fù)率這個(gè)問題，本發(fā)明提出 了一種紅細(xì)胞的凍干保護(hù)劑及其在紅細(xì)胞凍干過程中的使用方法。 本發(fā)明采用的技術(shù)方案:
凍干前保護(hù)劑的配制
按照下列的組分和濃度配制，24mM的葡萄糖溶液、0.43mM的腺 嘌呤、33mM的NaCl、 8. 9mM的甘露醇、6.6raM的KCl、 10%~15%的高 分子羥乙基淀粉、2.5%的牛血清白蛋白、3%的檸檬酸鈉水溶液。
凍干后復(fù)水保護(hù)劑溶液配置
按下面的配方141mM海藻糖、5mM抗壞血酸、38. 5mM NaCl、 0.265mM KH2P04、 1. 4mM Na2 HP04 、 11. 25%~12. 5%的葡聚糖、1.9% 的牛血清白蛋白、90mM KC1、 100mM肌苷、5mM腺嘌呤。
以上均用雙蒸水作為溶劑。 紅細(xì)胞的凍干保護(hù)劑及其在凍干過程中的使用方法 (1)細(xì)胞的前處理
先將健康人新鮮血液以2500r/min離心5min，棄去血漿及白膜， 將紅細(xì)胞用等滲pH=7. 4的磷酸鹽緩沖溶液以2500r/min離心5min， 反復(fù)洗滌3次，棄去上清液，得紅細(xì)胞。將得到的洗滌紅細(xì)胞與800mM 的海藻糖溶液以1:1.5的比例混合均勻，通過電脈沖的方法(電壓 300V、脈寬lms、頻率4~6次/min)將海藻糖載入細(xì)胞內(nèi)，使其胞
內(nèi)海藻糖濃度達(dá)到60mM左右，得到載入海藻糖的紅細(xì)胞濃縮液備用。
(2) 紅細(xì)胞的凍干處理 將得到負(fù)載海藻糖的紅細(xì)胞濃縮液和凍干前的保護(hù)劑按照一定
的體積比l: 4混合，使細(xì)胞的壓積為5%左右。
將帶有凍干前保護(hù)劑的紅細(xì)胞在4'C冰箱中預(yù)冷15分鐘左右， 再按照1(TC/分鐘的降溫速率迅速降到-7(TC，并在此溫度下保持2 小時(shí)以上使凍干物凍結(jié)。
然后，開始抽真空， 一次干燥，并使隔板溫度和壓力分別保持 在-45"C和1~3帕左右，時(shí)間為15小時(shí)。
最后，二次干燥，過程中設(shè)定隔板溫度為15°C，壓力也是1~3 帕左右，持續(xù)時(shí)間為10小時(shí)，得凍干的紅細(xì)胞。
(3) 凍干的紅細(xì)胞復(fù)水處理
復(fù)水時(shí)，按照復(fù)水保護(hù)劑體積和凍干前負(fù)載海藻糖的紅細(xì)胞濃 縮液體積的比為2:1進(jìn)行復(fù)水，復(fù)水在常溫下進(jìn)行，當(dāng)凍干的紅細(xì) 胞完全溶于復(fù)水溶液時(shí)即可。 本發(fā)明的技術(shù)效果
本發(fā)明的紅細(xì)胞凍干保護(hù)劑及其在紅細(xì)胞凍干過程中的使用， 通過細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定，恢復(fù)率可高達(dá)71.1%，與目前現(xiàn)有技術(shù)中報(bào)道 的紅細(xì)胞凍干恢復(fù)率最高僅為58. 8%的凍干保護(hù)劑和凍干方法相比 其恢復(fù)率達(dá)到71. 1%，提高了12.3%。
具體實(shí)施例方式
下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)描述，但不限制本發(fā)明。
實(shí)施例
電脈沖儀美國BTX公司BCM-830脈沖儀(電穿孔儀) 紅細(xì)胞的恢復(fù)率的測(cè)定方法
紅細(xì)胞的恢復(fù)率為凍干后的紅細(xì)胞個(gè)數(shù)與凍干之前的紅細(xì)胞
個(gè)數(shù)的比值，即 i ,(。/。)-!x100。/。
及o
式中i ,為凍干處理前由紅細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定的紅細(xì)胞個(gè)數(shù) i o為凍干復(fù)水后由紅細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定的紅細(xì)胞個(gè)數(shù)
凍干前保護(hù)劑的配制
按照下列的組分和濃度配制，24mM的葡萄糖溶液、0. 43mM的腺 嘌呤、33mM的NaCl、 8. 9mM的甘露醇、6. 6mM的KCl、 10%~15%的高 分子羥乙基淀粉、2.5%的牛血清白蛋白、3%的擰檬酸鈉水溶液。 凍干后復(fù)水保護(hù)劑溶液配置
按下面的配方141mM海藻糖、5mM抗壞血酸、38. 5mM NaCl、 0. 265mM KH2P04、 1. 4mM Na2HP04、 11, 25%~12. 5%的葡聚糖、1.9% 的牛血清白蛋白、90mM KC1、 100mM肌苷、5mM腺嘌呤。
以上均用雙蒸水作為溶劑。 紅細(xì)胞的凍干保護(hù)劑及其在凍干過程中的使用方法
(1)細(xì)胞的前處理
先將健康人新鮮血液以2500r/min離心5min，棄去血漿及白膜， 將紅細(xì)胞用等滲pH=7. 4的磷酸鹽緩沖溶液以2500r/min離心5min，
反復(fù)洗滌3次，棄去上清液，得紅細(xì)胞。將得到的洗滌紅細(xì)胞與800rnM 的海藻糖溶液以1:1.5的比例混合均勻，通過電脈沖的方法(電壓 300V、脈寬lms、頻率4 6次/min)將海藻糖載入細(xì)胞內(nèi)，使其胞 內(nèi)海藻糖濃度達(dá)到60mM左右，載入海藻糖的紅細(xì)胞濃縮液備用。
(2) 紅細(xì)胞的凍干處理 將得到負(fù)載海藻糖的紅細(xì)胞濃縮液和凍干前的保護(hù)劑按照一定
的體積比l: 4混合，使細(xì)胞的壓積為5%左右。
將帶有凍干前保護(hù)劑的紅細(xì)胞在4t:冰箱中預(yù)冷15分鐘左右， 再按照lCTC/分鐘的降溫速率迅速降到-70°C，并在此溫度下保持2 小時(shí)以上使凍干物凍結(jié)。
然后，開始抽真空， 一次干燥，并使隔板溫度和壓力分別保持 在-45"C和1~3帕左右，時(shí)間為15小時(shí)。
最后，二次干燥，過程中設(shè)定隔板溫度為15°C，壓力也是1 3 帕左右，持續(xù)時(shí)間為10小時(shí)，得凍干的紅細(xì)胞。
(3) 凍干的紅細(xì)胞復(fù)水處理
復(fù)水時(shí)，按照復(fù)水保護(hù)劑體積和凍干前負(fù)載海藻糖的紅細(xì)胞濃 縮液體積的比為2:1進(jìn)行復(fù)水。復(fù)水在常溫下進(jìn)行，當(dāng)凍干的紅細(xì) 胞完全溶于復(fù)水溶液時(shí)即可。
通過細(xì)胞計(jì)數(shù)儀最終測(cè)定，紅細(xì)胞的恢復(fù)率為71. 1%。
權(quán)利要求
1.一種紅細(xì)胞的凍干保護(hù)劑，包括凍干前保護(hù)劑及凍干后的復(fù)水保護(hù)劑，其特征在于凍干前保護(hù)劑有下列成分組成24mM的葡萄糖溶液、0.43mM的腺嘌呤、33mM的NaCl、8.9mM的甘露醇、6.6mM的KCl、10％～15％的高分子羥乙基淀粉、2.5％的牛血清白蛋白、3％的檸檬酸鈉；凍干后的復(fù)水保護(hù)劑有下列組分組成141mM海藻糖、5mM抗壞血酸、38.5mM NaCl、0.265mM 、1.4mM、11.25％～12.5％的葡聚糖、1.9％的牛血清白蛋白、90mM KCl、100mM肌苷、5mM腺嘌呤；以上所用的溶劑均為雙蒸水。
2、如權(quán)利要求l所述的一種紅細(xì)胞的凍干保護(hù)劑，其特征在于所述的凍干保 護(hù)劑在紅細(xì)胞的凍干過程中使用方法如下 (1)細(xì)胞的前處理將血液以2500r/min離心5min，棄去血漿及白膜，將紅細(xì)胞用等 滲pH二7. 4的磷酸鹽緩沖溶液以2500r/min離心5min，反復(fù)洗滌3次， 棄去上清液，得紅細(xì)胞；將得到的洗滌紅細(xì)胞與800mM的海藻糖溶液以1:1. 5的比例混合 均勻，通過電脈沖的方法將海藻糖載入細(xì)胞內(nèi)，使其胞內(nèi)海藻糖濃度 達(dá)到60mM左右，得載入海藻糖的紅細(xì)胞濃縮液； (2)紅細(xì)胞的凍干處理將得到負(fù)載海藻糖的紅細(xì)胞濃縮液和凍干前的保護(hù)劑按照一定的體積比l: 4混合，使細(xì)胞的壓積為5%左右；將經(jīng)凍干前保護(hù)劑處理的紅細(xì)胞在4-C冰箱中預(yù)冷15分鐘左右，再 按照1(TC/分鐘的降溫速率迅速降到-7(TC，并在此溫度下保持2小時(shí)以 上使凍干物凍結(jié)；開始抽真空， 一次干燥，并使隔板溫度和壓力分別保持在-45-C和 1~3帕左右，時(shí)間為15小時(shí)；再二次干燥，過程中設(shè)定隔板溫度為15°C，壓力1~3帕左右，持續(xù)時(shí)間為10小時(shí)，得凍干的紅細(xì)胞； (3)凍干的紅細(xì)胞復(fù)水處理將復(fù)水保護(hù)劑體積和凍干前負(fù)載海藻糖的紅細(xì)胞濃縮液體積的 比為2:1進(jìn)行復(fù)水。
3、如權(quán)利要求2所述的一種紅細(xì)胞的凍干保護(hù)劑，其特征在于所述的凍干保 護(hù)劑在紅細(xì)胞的凍干過程中使用方法中，細(xì)胞的前處理中電脈沖參數(shù)為電 壓 300V、脈寬lms、頻率4 6次/min。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人體紅細(xì)胞的凍干保護(hù)劑及其在凍干過程中的使用方法，凍干前保護(hù)液配方葡萄糖溶液、腺嘌呤、NaCl、甘露醇、KCl、高分子羥乙基淀粉、牛血清白蛋白、檸檬酸鈉；凍干后的復(fù)水保護(hù)劑配方海藻糖、抗壞血酸、NaCl、KH₂PO₄、Na₂HPO₄、葡聚糖、牛血清白蛋白、KCl、肌苷、腺嘌呤，將凍干前保護(hù)液與紅細(xì)胞懸濁液按體積比4∶1混合，經(jīng)冷凍干燥得到凍干的紅細(xì)胞，再將其用復(fù)水保護(hù)劑進(jìn)行復(fù)水。本發(fā)明的紅細(xì)胞凍干保護(hù)劑及其在紅細(xì)胞凍干過程中的使用后，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定，恢復(fù)率可高達(dá)71.1％，與目前現(xiàn)有技術(shù)中報(bào)道的最高僅為58.8％的凍干保護(hù)劑和凍干方法相比其恢復(fù)率提高了12.3％。
文檔編號(hào)C12N5/08GK101368172SQ20081020077
公開日2009年2月18日 申請(qǐng)日期2008年10月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月6日
發(fā)明者劉寶林, 劉建峰, 周國燕, 周新麗, 今 張, 玉 張, 陳唯靜 申請(qǐng)人:上海理工大學(xué)