豬鏈球菌噬菌體裂解酶的凍干保護劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了豬鏈球菌噬菌體裂解酶的凍干保護劑，涉及的是生物制品的凍干保存領域。包括如下成分：蔗糖、葡萄糖、山梨酸鉀及濃度為50mM，pH為8.0的磷酸鈉緩沖液，所述的蔗糖、葡萄糖和山梨酸鉀的質量濃度分別為18%、6%、0.3%。本發(fā)明所選用的凍干保護劑組合物能夠減少elysin在冷凍干燥過程中活性降低，可使elysin在冷凍干燥4℃保存7天后維持84.7%的活性；本發(fā)明的凍干保護劑組合物使elysin在4℃條件下保存7天，濁度遞減實驗中elysin的活性維持在84.7%。有效解決elysin不能4℃下不能長期保存，酶活性很快下降的問題。
【專利說明】
豬鏈球菌噬菌體裂解酶的凍干保護劑
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及的是生物制品的凍干保存領域，具體的說是豬鏈球菌噬菌體裂解酶 e 1 y s i η凍干保護劑及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 豬鏈球菌噬菌體裂解酶是一種可以裂解豬鏈球菌細胞壁的水解酶。Elysin(豬鏈 球菌噬菌體裂解酶，專利申請?zhí)?201610021643.3)是通過易錯PCR對裂解酶LySMP進行定向 突變而獲得的對豬鏈球菌菌株SS2-4裂解活性增強的酶_。但該酶在冷藏或冷凍保存時極容 易活力下降，在4°C可保存1周，在-20°C條件下保存期不超過1個月，期間裂解細菌活性也顯 著下降，這就要求elysin在保存和使用過程中盡可能在低溫條件下進行，否則易因保存溫 度不當或保存時間不長而影響該酶的使用效果。
[0003] 冷凍干燥是目前保持微生物、動物組織、細胞及蛋白質等活性物質生物活性的一 個有效的、普遍的方法。制品經(jīng)完全凍結，并在一定的真空條件下使冰晶升華，從而達到低 溫脫水的目的。但干燥過程中容易導致蛋白質失水，使原來與水形成的分子間氫鍵斷開，多 肽鏈展開，造成蛋白質變性而失去生物活性。為防止在凍干過程中蛋白質或細胞的損傷，在 凍干過程中常添加糖、蛋白質、氨基酸等物質來起保護作用。保護劑可以改變生物樣品冷凍 干燥時的物理、化學環(huán)境，減輕或防止冷凍干燥或復水對細胞的損害，盡可能保持原有的各 種生理生化特性和生物活性，從而保證蛋白質或細胞在保藏期間的穩(wěn)定性。常用的凍干保 護劑包括多羥基化合物、糖類、氨基酸、聚合物、蛋白質等。多羥基化合物主要包括、甘油、甘 露醇、山梨醇、肌醇等;糖類常用的有蔗糖、葡萄糖、海藻糖、麥芽糖等;氨基酸類主要有脯氨 酸、甘氨酸、丙氨酸等;聚合物類有聚乙二醇、明膠等;蛋白質類主要有牛血清白蛋白，此外 還有吐溫80、普朗尼克、維生素 C、山梨酸鉀等也可用作凍干保護劑或防腐劑(孫東坡，胡一 橋.蛋白質冷凍干燥制品中的保護劑及其保護機制.藥學進展，2003,27(4):201-205)。本發(fā) 明選用了蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、海藻糖、山梨酸鉀、牛血清白蛋白、甘氨酸、明膠、維生素 C作 為凍干保護劑的候選試劑，通過濁度遞減實驗和正交設計實驗選取了 18%蔗糖、6%葡萄 糖、0.3%山梨酸鉀作為elysin的凍干保護劑，可使elysin在4°C條件下保存7天后，elysin 的活性維持在84.7%。有效解決elysin不能4°C下不能長期保存，酶活性很快下降的問題。
[0004] 對豬鏈球菌噬菌體裂解酶e lys in的凍干保護劑的篩選和應用在國內(nèi)外均未報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種用于冷凍干燥的保護劑組合物。
[0006] -種用于冷凍干燥的保護劑組合物，包括如下成分:蔗糖、葡萄糖、山梨酸鉀及濃 度為50mM，pH為8.0的磷酸鈉緩沖液，所述的蔗糖、葡萄糖和山梨酸鉀的質量濃度分別為 18%、6%、0.3%〇
[0007] 所述的濃度為50mM，pH為8.0的磷酸鈉緩沖液的配方為：NaH2P〇4_12H2〇6.78g， Na2HP〇4_2H2〇 0.17g，用雙蒸餾水定容至lL〇
[0008] 所述的蔗糖的化學性質穩(wěn)定，對阻止蛋白質二級結構改變、凍干處理過程中及貯 藏期內(nèi)蛋白質的伸展和聚集起顯著作用。所述的葡萄糖在凍干過程中可部分保持無定型， 對某些蛋白質具有一定的保護作用。所述的山梨酸鉀是一種常用的防腐劑，其毒性低，能夠 有效地抑制霉菌、酵母菌和好氧性細菌的活性。在本發(fā)明中，三者聯(lián)用可以顯著保持elysin 在凍干以后的活性。
[0009] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備上述組合物的方法。
[0010] 本發(fā)明提供一種用于冷凍干燥的保護劑組合物的制備方法，按照下述步驟進行： 將蔗糖、葡萄糖、山梨酸鉀按照質量比18:6:0.3混勻，用50mM磷酸鈉緩沖液(pH 8.0)溶解， 即得到凍干保護劑的組合物。
[0011] 將上述凍干保護劑組合物與所述的豬鏈球菌噬菌體裂解酶elysin按體積比1:1混 合后用于冷凍干燥。
[0012] 所述的冷凍真空干燥，其條件是:預凍階段最低溫度-50°C，達到最低溫度后維持 3h。主干燥階段，將隔板溫度升至-20°C-15°C，真空度0. lmba，干燥4-6h，終末干燥階段，將 隔板溫度升至15_25°C，真空度0.005mba，保持5-8h。
[0013]所述的豬鏈球菌菌體裂解酶elysin是通過對大腸桿菌BL21原核表達的elysin 進行純化后獲得(見專利：201610021643.3)，該酶的濃度為0.12-0.35mg/mL。
[0014] 所述的方法中，凍干保護劑組合物與豬鏈球菌噬菌體裂解酶elysin混勻后的產(chǎn)物 經(jīng)0.22μπι微孔濾膜過濾除菌。
[0015] 本發(fā)明的有益效果
[0016] 本發(fā)明的優(yōu)點在于：
[0017] 所選用的凍干保護劑組合物能夠減少elysin在冷凍干燥過程中活性降低，可使 ely sin在冷凍干燥4 °C保存7天后維持84.7%的活性；
[0018] 本發(fā)明的凍干保護劑組合物使elysin在4°C條件下保存7天，濁度遞減實驗中 elysin的活性維持在84.7%。有效解決elysin不能4°C下不能長期保存，酶活性很快下降的 問題；
[0019] 本發(fā)明的凍干保護劑在有效保護elysin的情況下，配制方法簡單、成本較低，可以 推廣使用。
【附圖說明】
[0020] 圖1為因素與指標關系趨勢圖，其中ABCD分別為蔗糖、葡萄糖、明膠、山梨酸鉀。
【具體實施方式】
[0021 ]實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0022]實施例1凍干保護劑的選擇與配制
[0023]用50mM磷酸鈉緩沖液(pH 8.0)配制質量濃度為20%蔗糖、20%麥芽糖、6%葡萄 糖、20 %海藻糖、0 · 5 %山梨酸鉀、1 %牛血清白蛋白、1 %甘氨酸、0 · 5 %明膠緩沖液，摩兒濃 度2mmol/L的維生素 C緩沖液，以上9種緩沖液用于篩選elysin的凍干保護劑。
[0024]將以上9種緩沖液分別與elySin(100μg/ml)等體積混合，作為9組實驗組。將未加 上述9種緩沖液的elysin(50μg/ml)作為對照組1。在經(jīng)過冷凍干燥以后，通過對SS2-4的濁 度遞減試驗檢測以上9種凍干保護劑對elysin的保護效果，以未經(jīng)冷凍干燥的elysin(50y g/ml)作為對照組2進行篩選濁度遞減度實驗。
[0025]實施例2濁度遞減試驗
[0026] 將豬鏈球菌SS2-4離心后用roS緩沖液(磷酸鹽緩沖液)調節(jié)OD600至1.0-1.2,將其 加入96孔板中，每孔100μΜ再將實施例1中的9組實驗組與對照組1和2取100yL加入有上述 豬鏈球菌SS2-4的96孔板中，每種純化的裂解酶各做3個重復。37°C反應lh，測定0D 6QQ值，篩 選可使細菌濁度〇D_下降高的實驗組試劑作為候選的凍干保護劑。實驗結果見表1-1。本發(fā) 明選取了 20 %蔗糖、6 %葡萄糖、0.5 %山梨酸鉀和0.5 %明膠作為候選的凍干保護劑用于下 一步的正交實驗設計。
[0027]表1 -1凍干保護劑對e lys in的池度遞減試驗結果
[0029]實施例3不同凍干保護劑的正交試驗設計
[0030]按照L9(34)正交表安排試驗:選取蔗糖、葡萄糖、明膠、山梨酸鉀為四因素（因素 A、 B、C、D)，各因素取三水平(水平1、2、3)，見表1-2。用50mM磷酸鈉緩沖液(pH 8.0)與蔗糖、葡 萄糖、明膠、山梨酸鉀按正交表(表1-3)的設計，配成凍干保護劑組合物，共配制9組。將以上 9組凍干保護劑組合物分別與100yg/mL elysin按1:1體積比混合。具體實驗步驟，見實施例 2,將未加凍干保護劑的50μg/ml elysin作為對照組1。將實驗組和對照組1做冷凍干燥處 理，再將未進行冷凍干燥50μg/ml elysin作為對照組2。隨后，將實驗組以及對照組1和對照 組2按實施例2進行濁度遞減實驗，記錄實驗結果，見表1-4。繪制因素與指標關系趨勢圖，見 圖1。通過趨勢圖獲得最優(yōu)組合為，即18 %蔗糖、6 %葡萄糖、0.3 %山梨酸鉀可獲得 最佳保護效果。
[0031]表1-2凍干保護劑的正交試驗設計
[0033] 表1_3L9(34)正交設計表
[0035] 表1_4L9(34)正交表與濁度遞減實驗結果
[0036]
[0037]
[0038] K1為水平1的結果之和，K2為水平2的結果之和，K3為水平3的結果之和；
[0039] Τ總和，R為極差。
[0040]實施例4凍干保護劑對elysin的4°C保存實驗
[00411將加入凍干保護劑組合物的elysin作為實驗組、未加凍干保護劑的50μg/ml elysin作為對照組1在冷凍干燥后，放4°C保存7天后取出，用雙蒸水融化。將未凍干新鮮的 elysin用50mM磷酸鈉緩沖液(pH 8.0)調節(jié)濃度至50μg/ml，作為對照組2,將實驗組以及對 照組1和對照組2按實施例2進行濁度遞減實驗，記錄實驗結果，見表1-5。
[0042] 表1-5 4°C保存7天后濁度遞減試驗結果
[0044]上表說明，相比未加凍干保護劑的對照組1，實驗組在冷凍干燥4°C保存7天后，可 使細菌濁度0D600的值下降61.0%，可將elysin的裂解效率保存新鮮狀態(tài)的84.7%，而未加 凍干保護劑的對照組1，可使細菌濁度OD600的值下降35.1%，僅可將elysin的裂解效率保存 新鮮狀態(tài)的48.8%。因此，加入凍干保護劑組合物的elysin在4°C的保存效果好于未加凍干 保護劑的elysin，凍干保護劑組合物可應用于elysin的凍干保存，有利于在4°C保存和使用 過程中，酶的活力不會顯著喪失。
【主權項】
1. 一種用于冷凍干燥的保護劑組合物，其特征在于:包括如下成分:蔗糖、葡萄糖、山梨 酸鉀及濃度為50mM，pH為8.0的磷酸鈉緩沖液，所述的蔗糖、葡萄糖和山梨酸鉀的質量濃度 分別為 18%、6%、0.3%。2. 根據(jù)權利要求1所述的一種用于冷凍干燥的保護劑組合物，其特征在于:所述的濃度 為50禮，？!1為8.0的磷酸鈉緩沖液的配方為 :似!^0442!120 6.788，似2冊0411120 0.178，用 雙蒸餾水定容至1L。3. 根據(jù)權利要求1所述的一種用于冷凍干燥的保護劑組合物的制備方法，其特征在于： 按照下述步驟進行:將蔗糖、葡萄糖、山梨酸鉀按照質量比18:6:0.3混勻，用50mM磷酸 鈉緩沖液(pH 8.0)溶解，即得到凍干保護劑的組合物。4. 根據(jù)權利要求3所述的一種用于冷凍干燥的保護劑組合物的制備方法，其特征在于： 將上述凍干保護劑組合物與所述的豬鏈球菌噬菌體裂解酶elysin按體積比1:1混合后 用于冷凍干燥。5. 根據(jù)權利要求3所述的一種用于冷凍干燥的保護劑組合物的制備方法，其特征在于： 所述的冷凍真空干燥，其條件是:預凍階段最低溫度-50°C，達到最低溫度后維持3h;主干燥 階段，將隔板溫度升至_20°C- -15°C，真空度0.1 mba，干燥4-6h，終末干燥階段，將隔板溫度 升至 15- 25°C，真空度0.005mba，保持5-8h。
【文檔編號】C12N9/88GK105950599SQ201610312034
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月12日
【發(fā)明人】王琰, 杜杉杉, 楊世興, 鄭敏, 冷靖, 李禹昕
【申請人】江蘇大學