專利名稱：：單增李斯特菌檢測試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及對樣品中單增李斯特菌的檢測裝置及其檢測方法。特別涉及一種單增李斯特菌檢測試劑盒及其檢測方法。
背景技術(shù)：
：-單核細胞增生李斯特氏菌(簡稱單增李斯特菌丄wo朋qytoge/7化LMO)是一種人畜共患致病菌，可使人和動物患腦膜炎、腦炎、敗血癥及造成懷孕婦女流產(chǎn)、死胎等疾病，死亡率高達30%70%。該病廣泛存在于土壤、人和動物的糞便中，很容易污染食品而引起食物中毒和李斯特病大爆發(fā)。近年來已有不少國家報道了由于污染單增李氏菌發(fā)生的食物中毒事件。早在1929年，就有報道該菌對人有致病性，最嚴(yán)重的一次是1985年在美國加里福尼亞地區(qū)，應(yīng)食用乳酪引起的單增李氏菌食物中毒。目前該菌每年在美國已成為由食物污染引起死亡的四大病原菌之一。此外由于該菌在4t:冰箱保存的食品中也可生長繁殖，故其危害性進一步增大。因此世界各國政府部門對其菌越來越重視，紛紛制定一些新的食品安全法規(guī)，并把單增李氏菌納入法定強檢項目。我國每年大量進口水產(chǎn)品，加入WTO以來，進出口貿(mào)易呈直線上升態(tài)勢，傳統(tǒng)的單增李斯特菌檢驗方法，檢驗周期冗長，至少需要5d14d才能得出結(jié)果，步驟繁瑣且檢驗精度低。為了適應(yīng)對外貿(mào)易發(fā)展的新需要，實現(xiàn)與國際檢測技術(shù)接軌，有必要建立一種簡便、快速、準(zhǔn)確的檢出方法，以更好的為檢驗檢疫事業(yè)服務(wù)。近年來，國內(nèi)外的研究人員建立了多種快速檢測食品中單增李斯特菌的方法，包括商海濤等免疫磁性分離一PCR方法(商海濤，等.李斯特氏菌因子血清的制備及食品檢測的免疫磁性分離一PCR(MIPA)方法的建立，中國獸醫(yī)學(xué)報，1999，19(4):339-343.)、寇運同等的免疫磁珠捕集法(ListerTest)寇運同，等.用免疫磁珠捕集法快速檢測食品中的單核細胞增生李斯特菌。檢驗檢疫科學(xué)，2001，11(6):12-13、O'Connor等的PCR/DNA探針方法O，Connor-Letal.Rapidpolymerasechainreaction/DNAprobemember-basedassayfordetectionofListeriaandListeriamonocytogenesinfood,J陽Food-Prot,2000,63(3):337-342、孫煥冬等的半套式PCR等方法孫煥冬等。半套式聚合酶鏈反應(yīng)檢測牛奶中部分腸道致病菌。職業(yè)與健康，2002,18(3):43-44。上述方法樣品均需前增菌，延長了檢出的時間且檢測的靈敏度低。還沒有解決快速檢出該菌的問題。Hudson-JA等的方法雖然能在24h快速檢出該菌，但只對單一的火腿樣品進行了試驗。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明采用先進的IMS/PCR(immunomagneticseparation/polymerasechainreaction)方法，禾U用抗李其j特菌免疫磁性分離技術(shù)(anti-丄/rfen'aimmunomagneticbeads)，其基本原理是抗原抗體反應(yīng)。將包被有抗體的磁珠加至樣品中，緩慢振蕩，如樣品中含李斯特菌，將被吸附在磁珠的抗體上，樣品不需要進行富集，可直接從樣品中濃縮獲LMO,捕獲的磁珠再通過消化、抽提、純化該細菌的DNA，用一對丄.mo"oqytoge"^的fc&ho(yw'"O(hlyA)基因牛寺異性引物和一對"Wct"/<323SrRNA區(qū)域的基因特異型引物分別作為PCR的靶基因，通過復(fù)合PCR得到特異性的700bp和240bp兩個片斷。本發(fā)明的目的是提供一種快速檢測樣品中單增李斯特菌的試劑盒，主要解決現(xiàn)有檢測單增李斯特菌試劑盒存在的檢測樣品單一以及檢測步驟繁瑣、靈敏度底的技術(shù)問題。本發(fā)明可以快速、靈敏、準(zhǔn)確地檢出樣品中單增李斯特菌，適合于各種樣品的檢測。本發(fā)明的技術(shù)方案為一種單增李斯特菌檢測試劑盒，試劑盒由以下試劑組成試劑A:前處理樣品液；試劑B:磁珠；試劑C:DNA提取液；試劑D:PCR反應(yīng)液，其中含有特定兩對引物A08650和A08651;A08653禾口A08654，其序列分別為5'GGGGAACCCACTATCTTTAGTC禾B5'GGGCCTTTCCAGACCGCTTCA;GCCTGCAAGTCCTAAGACGCCAATC和5，CTTGCAACTGCTCTTTAGTAACAGC。試劑DPCR反應(yīng)液中所含的特定引物A08650和A08651;A08653和A08654，每種含量應(yīng)不少于5pmol/L。PCR反應(yīng)液，每管組成為每管單增李斯特菌的50pL擴增反應(yīng)體系組成中含5、L0.025mol/LMgCl2;5pmol/L2對引物A08650和A08651為3pL、A08653禾tlA08654為8^L;PCRbuffre(PCR緩沖液)5^L;200pmol/LdNTP(脫氧核苷三磷酸)lpL;Taq酶(聚合酶)0.5nL;DNA10pL(終濃度為2ng/mL);ddH206.5pL。本發(fā)明所提供的快速檢測樣品中單增李斯特菌的試劑盒的檢測方法包括如下步驟一、前處理樣品1.取待檢樣品25g，加至50mL試劑A;消化20min。棄去沉淀。2.離心機選取參數(shù)1560g,離心2min，棄去沉淀。3.離心機選取參數(shù)1560g，離心20min，棄上清液，重懸沉淀于700pLPBS/Tween20(磷酸鹽緩沖溶液/吐溫20)中。二、磁珠吸附1.加入20抗一Listeria磁珠，慢慢震蕩10min后在磁性架上靜置吸附10min。2.棄去上清液，重懸沉淀于200pLTE緩沖液中。所述的TE緩沖液為Tris-HC1(鹽酸三氨基甲垸)緩沖液和EDTA(乙二胺四乙酸)緩沖液的混合液。配比組成lOmmol/LTris-HC1(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0)。三、樣品中DNA的提取1.在步驟二的TE緩沖液中，加入20i^L溶菌酶，室溫放置5min。2.加入SDS(十二垸基硫酸鈉)12fiL，4pL蛋白酶K，37。C水浴30min。裂解過程中上下混勻幾次，降解完全的樣品應(yīng)為半透明粘稠液體，否則應(yīng)繼續(xù)保溫處理。3.加入236pL的苯酚、氯仿和異戊醇，苯酚:氯仿:異戊醇體積比=25:24:1;混勻10min，離心機選取參數(shù)13800g離心5min。4.棄去有機層，加入236pL的氯仿和異戊醇(氯仿:異戊醇的體積比^24:l)，輕輕混勻，棄去有機層。5.加入24iaL3mol/L醋酸鈉，48pL的冷無水乙醇(一2(TC隔夜)，離心沉淀DNA。6.600pL70X乙醇洗一次，倒置于干凈的濾紙上，室溫干燥。7.待檢樣品DNA用50(iLmilliQ水(超純水)溶解。四、PCR反應(yīng)取lO(aL待檢樣品DNA加入反應(yīng)管D中，混勻后在PCR儀中進行以下反應(yīng):95°C95°C62°C72。C循環(huán)35次72°C8min4°C保存反應(yīng)結(jié)束后，取20^LPCR產(chǎn)物，如出現(xiàn)240bp和700bp的反應(yīng)產(chǎn)物，加2pL溴酚藍混勻后進行確定擴增產(chǎn)物。說明待檢樣品中有單增李斯特菌。如只出現(xiàn)240bp的反應(yīng)產(chǎn)物，說明待檢樣品中有李斯特菌，但不是單增李斯特菌c本發(fā)明的有益效果是，減少了常規(guī)方法中增菌的培養(yǎng)過程?？朔Ｒ?guī)方法耗時長、繁瑣及不夠精確的缺點，直接利用IMS方法，從樣品中抽提DNA，最大程度的提高該致病菌的檢出率及靈敏度。本發(fā)明具有操作簡便、快速、靈敏度高、經(jīng)濟等優(yōu)點，在4h能夠檢出LM0。靈敏度可達15CFU/mL。比以前的試劑盒方法靈敏度大大提高，操作方便，且成本大大降低。圖l為本發(fā)明在模擬樣品豬肉糜中的靈敏性檢測電泳結(jié)果圖1中1.DL2000分子量標(biāo)記；2.單增李斯特菌(ATCC7644);3.英諾克李斯特菌(ATCC33090);4.陰性對照；5.陰性對照；6.10—'稀釋度(標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC7644濃度)；7.10—2稀釋度；8.10—:'稀釋度；9.10—4稀釋度；10.10—5稀釋度；11.l(T稀釋度；12.10—7稀釋度；13.DL2000分子量標(biāo)記。圖2單增李斯特菌、李斯特菌屬及陰性菌株比較圖2中1.DL2000分子量標(biāo)記；2.單增李斯特菌(ATCC54003);3.單增李斯特菌(ATCC19115/413);4.格氏李斯特菌(ATCC700545);5.英諾克李斯特菌(ATCC33090);6.綿羊李斯特菌(ATCC19119);7.依氏李斯特菌；8.斯氏李斯特菌(ATCC35967);9.韋爾希默氏李斯特菌(ATCC35897);10.金黃色葡萄球菌(ATCC51816);ll.金黃色葡萄球菌(ATCC27664);12.枯草桿菌(ATCC6051);13.大腸埃希氏菌(ATCC51813);14.腸炎沙門氏菌(ATCC49214);15.產(chǎn)氣桿菌(ATCC13048);16.蠟樣芽孢桿菌(ATCC6051)17.DL2000分子量標(biāo)記。具體實施方式-模擬樣品:豬肉糜和青菜用快速檢測樣品中單增李斯特菌的試劑盒檢測。試劑盒組成為試劑A:前處理樣品液。其組成為0.1mol/LNaCl，0.02mol/LCaCl2，0.1%Tween,0.05%mg/mL胰蛋白酶，25mg/mL甘露糖，25mg/mL葡萄糖；試劑B:磁珠，直徑為250nm。組成為Anti-Listeria(抗李斯特菌)包被的抗體；試劑C:DNA提取液。其組成為20XSDS，苯酚:氯仿:異戊醇體積比二25:24:1;氯仿:異戊醇體積比=24:1;試劑D:PCR反應(yīng)液，每管單增李斯特菌50^L擴增反應(yīng)體系組成中含5|iL0.025mol/LMgCl2;5pmol/L2對引物A08650禾卩A08651為3|aL、A08653和A08654為8^L;PCRbuffre5pL;200(imol/LdNTP1|iL;Taq酶0.5pL;DNA10(終濃度為2ng/mL);ddH206.5pL;按本發(fā)明所提供的快速檢測樣品中單增李斯特菌的試劑盒的使用方法，先用試劑A均質(zhì)樣品，磁珠吸附，之后提取樣品中的DNA,進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后取20^tL加2)aL溴酚藍混勻后進行2^瓊脂糖凝膠電泳，即可發(fā)現(xiàn)樣品中是否含有單增李斯特菌。整個檢測過程4小時內(nèi)即可完成。把標(biāo)準(zhǔn)菌株單增李斯特菌ATCC7644，接營養(yǎng)肉湯，37°C，24h培養(yǎng)后，分別進行10—110—7菌液稀釋，每個稀釋度添加到滅過菌的豬肉糜中，作模擬樣品的靈敏度實驗，同時相應(yīng)的每一個稀釋度分別涂布平板作為對照。PCR結(jié)果如圖1。由圖1可知，模擬樣品的靈敏度達到10—5稀釋度，相應(yīng)的平板上菌落數(shù)為15CFU/mL，即模擬樣品的靈敏度相當(dāng)于15CFU/mL。方法的特異性實驗引用前面所述單增李斯特菌(LMO)特異性的2對基因引物A08650和A08651、A08653和A08654對LMO進行PCR鑒定檢測。分別對應(yīng)得到240bp和700bp二條擴增條帶。結(jié)果如圖2。由圖2可知，除第2及第3泳道的單增李斯特菌出現(xiàn)240bp和700bp的反應(yīng)產(chǎn)物外，第3及第9泳道的李斯特菌屬只出現(xiàn)240bp的反應(yīng)產(chǎn)物。第10及第16泳道的陰性對照(非李斯特菌屬)沒有特異性反應(yīng)產(chǎn)物條帶。詳見下表l。表1試劑盒所用特異性實驗菌株P(guān)CR結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>權(quán)利要求1.一種單增李斯特菌檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒由以下試劑組成試劑A前處理樣品液；試劑B磁珠；試劑CDNA提取液；試劑DPCR反應(yīng)液，其中含有特定兩對引物A08650和A08651；A08653和A08654，其序列分別為5’GGGGAACCCACTATCTTTAGTC和5’GGGCCTTTCCAGACCGCTTCA；GCCTGCAAGTCCTAAGACGCCAATC和5’CTTGCAACTGCTCTTTAGTAACAGC。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所說的PCR反應(yīng)液特定引物A08650和A08651;A08653和A08654，每種含量應(yīng)不少于5pmol/L。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所說的試劑D:PCR反應(yīng)液，每管組成為每管單增李斯特菌的50pL擴增反應(yīng)體系組成中含5nL0.025mol/LMgCl2，5pmol/L2對引物A08650禾卩A08651為3^L，A08653和A08654為8^L，PCR緩沖液5|aL，200pmol/L脫氧核苷三磷酸liaL，聚合酶0.5^iL，DNAlOpL，ddH206.5pL。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于所說的DNA終濃度為2ng/mL。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單增李斯特菌檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于包括以下步驟前處理樣品步驟取待檢樣品25g，加至50mL試劑A，消化20min，棄去沉淀；離心機選取參數(shù)1560g,離心2min，棄去沉淀；離心機選取參數(shù)1560g，離心20min，棄上清液，重懸沉淀于700磷酸鹽緩沖溶液/吐溫20中；磁珠吸附步驟加入20pL抗一李斯特菌磁珠，慢慢震蕩10min，在磁性架上靜置吸附10min;棄去上清液，重懸沉淀于200pLTE緩沖液中；樣品中DNA的提取步驟在TE緩沖液中，加入20pL溶菌酶，室溫放置5min;加入十二垸基硫酸鈉12^L，4pL蛋白酶K，37。C水浴30min。裂解過程中上下混勻幾次，降解完全的樣品應(yīng)為半透明粘稠液體，否則應(yīng)繼續(xù)保溫處理；加入236pL的苯酚、氯仿和異戊醇，苯酚:氯仿:異戊醇體積比=25:24:1;混勻10min，離心機選取參數(shù)13800g離心5min;棄去有機層，加入236^L氯仿和異戊醇，氯仿:異戊醇體積比=24:1，輕輕混勻，棄去有機層；加入24)LiL3mol/L醋酸鈉，48pL的冷無水乙醇，一20。C隔夜，離心沉淀DNA;用600^L70X乙醇洗一次，倒置于干凈的濾紙上，室溫干燥；待檢樣品DNA用50超純水溶解；PCR反應(yīng)步驟取10|iL待檢樣品DNA加入反應(yīng)管D中，混勻后在PCR儀中進行以下反應(yīng)95。C5min95。C1min^62°C1min」循環(huán)35次72°C172°C8min4°C保存反應(yīng)結(jié)束后，取20PCR產(chǎn)物，加2溴酚藍混勻后進行確定擴增產(chǎn)物。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測方法，其特征在于所述的TE緩沖液為鹽酸三氨基甲烷緩沖液和乙二胺四乙酸緩沖液的混合液，配比組成為10ramol/L鹽酸三氨基甲烷緩沖液與1mmol/L乙二胺四乙酸緩沖液進行混合。全文摘要本發(fā)明涉及對樣品中單增李斯特菌的檢測裝置及其檢測方法。主要解決現(xiàn)有檢測單增李斯特菌試劑盒存在的檢測樣品單一以及檢測步驟繁瑣、靈敏度底的技術(shù)問題。試劑盒由以下試劑組成試劑A前處理樣品液；試劑B磁珠；試劑CDNA提取液；試劑DPCR反應(yīng)液，其中含有特定兩對引物A08650和A08651；A08653和A08654，其序列分別為5’GGGGAACCCACTATCTTTAGTC和5’GGGCCTTTCCAGACCGCTTCA；GCCTGCAAGTCCTAAGACGCCAATC和5’CTTGCAACTGCTCTTTAGTAACAGC。本發(fā)明主要用于對樣品中單增李斯特菌的快速檢測。文檔編號C12Q1/04GK101381777SQ200810201408公開日2009年3月11日申請日期2008年10月20日優(yōu)先權(quán)日2008年10月20日發(fā)明者李曉虹,蔣琴娣,黃逸男申請人:中華人民共和國上海出入境檢驗檢疫局