国产精品1024永久观看,大尺度欧美暖暖视频在线观看,亚洲宅男精品一区在线观看,欧美日韩一区二区三区视频,2021中文字幕在线观看

  • <option id="fbvk0"></option>
    1. <rt id="fbvk0"><tr id="fbvk0"></tr></rt>
      <center id="fbvk0"><optgroup id="fbvk0"></optgroup></center>
      <center id="fbvk0"></center>

      <li id="fbvk0"><abbr id="fbvk0"><dl id="fbvk0"></dl></abbr></li>

      用于治療組織炎癥和癌變的鳥苷酸環(huán)化酶受體激動(dòng)劑的制作方法

      文檔序號(hào):1263148閱讀:365來源:國(guó)知局
      用于治療組織炎癥和癌變的鳥苷酸環(huán)化酶受體激動(dòng)劑的制作方法
      【專利摘要】本發(fā)明涉及用于治療組織炎癥和癌變的鳥苷酸環(huán)化酶受體激動(dòng)劑。本發(fā)明公開在哺乳動(dòng)物中治療組織發(fā)炎,癌變前或癌變的方法。該治療涉及施用至少一種鳥苷酸環(huán)化酶的肽激動(dòng)劑和/或其他增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)cGMP產(chǎn)量的小分子的組合物。該鳥苷酸環(huán)化酶的肽激動(dòng)劑可以單獨(dú)施用或同抑制依賴cGMP的磷酸二酯酶的抑制劑聯(lián)合施用。抑制劑可為小分子、肽、蛋白質(zhì)或其他抑制cGMP降解的其他化合物。不需要特定作用機(jī)制,該治療可以重建受治療者上皮細(xì)胞群中增殖和凋亡的平衡,并抑制癌變。因此,該方法可用于治療包括胃腸道炎癥、普通器官發(fā)炎和哮喘的炎癥和肺、胃腸道、膀胱、睪丸、前列腺和胰腺的癌變,或息肉。
      【專利說明】用于治療組織炎癥和癌變的鳥苷酸環(huán)化酶受體激動(dòng)劑
      [0001]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
      [0002]本發(fā)明要求以下美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)的權(quán)益:2001年3月29日提交的60/279,438 ;2001年3月29日提交的60/279,437 ;2001年6月27日提交的60/300,850 ;2001年7月10日提交的 60/303,806 ;2001 年 7 月 25 日提交的 60/307,358 ;2002 年 1 月 17 日提交的 60/348,646.發(fā)明領(lǐng)域
      [0003]本發(fā)明涉及鳥苷酸環(huán)化酶受體激動(dòng)劑作為提高細(xì)胞內(nèi)cGMP產(chǎn)量的方法,在治療上的用途。該激動(dòng)劑可以單獨(dú)使用或者與cGMP-特異的磷酸二酯酶的抑制劑聯(lián)合使用,以預(yù)防或治療癌變的、癌變前的以及轉(zhuǎn)移性的腫瘤生長(zhǎng),尤其是在胃腸道及肺部。除此以外,該激動(dòng)劑還可以用于治療炎癥,如潰瘍性結(jié)腸炎和哮喘。
      [0004]發(fā)明背景
      [0005]尿鳥苷蛋白、鳥苷蛋白和細(xì)菌ST肽是在結(jié)構(gòu)上相關(guān)的肽,它們與鳥苷酸環(huán)化酶受體結(jié)合并刺激細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生環(huán)化鳥嘌呤核苷單磷酸(cGMP)(l-6)。這導(dǎo)致了囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白(CFTR)的激活,CFTR是一個(gè)頂端膜通道,用于氯從沿腸道排列的腸細(xì)胞外排(1-6)。CFTR的激活以及隨后的氯的跨上皮分泌的增加導(dǎo)致激發(fā)鈉和水向腸腔內(nèi)的分泌。因此,cGMP受體激動(dòng)劑通過作為CFTR的旁分泌調(diào)控因子,可以調(diào)控胃腸道內(nèi)液體和電解質(zhì)的運(yùn)輸(1-6,美國(guó)專利5,489,670)。
      [0006]上皮的更新過程包括胃腸道細(xì)胞在胃腸腔內(nèi)的增殖、遷移、分化、衰老以及最終的喪失(7,8)。根據(jù)上皮細(xì)胞的增殖指數(shù),胃腸粘膜可以分為三個(gè)明顯的區(qū)帶。其中的一個(gè)區(qū)帶一增殖區(qū)帶,由未分化的干細(xì)胞組成,這些干細(xì)胞提供新生細(xì)胞的持續(xù)來源。干細(xì)胞向腸腔方向遷移,并被擠壓進(jìn)入腸腔。在遷移時(shí),細(xì)胞失去其分裂的能力,并分化為執(zhí)行胃腸粘膜特異功能的細(xì)胞(9)。胃腸粘膜的更新非常`迅速,其在24到48小時(shí)以內(nèi)完全更新一次
      (9)。在這一過程中,突變的和不需要的細(xì)胞被新的細(xì)胞補(bǔ)充。因此,胃腸粘膜的穩(wěn)態(tài)由增殖速率和細(xì)胞凋亡速率之間的平衡的連續(xù)維來調(diào)控(8)。
      [0007]消化道上皮細(xì)胞的細(xì)胞增殖速率和凋亡速率可以由于多種不同的情況被增加或降低,例如對(duì)于生理刺激如衰老、炎癥信號(hào)、激素、肽、生長(zhǎng)因子、化學(xué)物質(zhì)和飲食習(xí)慣的反應(yīng)。除此以外,提高的增殖速率常常與全更新時(shí)間的減少和增殖區(qū)帶的擴(kuò)張有關(guān)(10)。據(jù)觀察,增殖指數(shù)在潰瘍性結(jié)腸炎和其他胃腸疾病的病理情況下要高很多(11)。因此,腸增生是胃腸炎癥和癌癥發(fā)生的主要促進(jìn)原因。
      [0008]尿鳥苷蛋白和鳥苷蛋白除了具有對(duì)腸內(nèi)液體和離子分泌的調(diào)節(jié)作用以外,這些肽還可能參與胃腸道粘膜的持續(xù)更新。以前在wOOl/25266中公開的數(shù)據(jù)提示,具有尿鳥苷蛋白活性結(jié)構(gòu)域的肽可能具有結(jié)腸息肉生長(zhǎng)抑制劑的功能,并可能成為結(jié)腸癌的一種治療方法。但是,該功能出現(xiàn)所依據(jù)的機(jī)制還不能確定,因?yàn)閣OOl/25266中教導(dǎo)尿鳥苷蛋白拮抗肽與稱為GC-C的鳥苷酸環(huán)化酶受體特異結(jié)合,該鳥苷酸環(huán)化酶受體最早被描述為大腸桿菌(E.coli)中熱穩(wěn)定的腸毒素(ST)受體(4)。缺失這個(gè)鳥苷酸環(huán)化酶受體的基因敲除小鼠在腸內(nèi)對(duì)ST表現(xiàn)出抗性,但在腎臟體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,尿鳥苷蛋白和ST的作用沒有受到影響
      (3)。這些結(jié)果受到下面事實(shí)的進(jìn)一步支持:鳥苷蛋白引起的膜的去極化被酪氨酸激酶抑制劑一染料木黃酮(5,7,4'-三羥基異黃酮)阻斷,而尿鳥苷蛋白引起的膜的超極化不受影響(12,13)。這些數(shù)據(jù)一起,提示尿鳥苷蛋白也與一個(gè)目前還不清楚的、與GC-C不同的受體結(jié)合?
      [0009]另外一些文章也報(bào)道了在癌變?cè)缙诘慕Y(jié)腸息肉和腫瘤組織中,尿鳥苷蛋白和鳥苷蛋白的產(chǎn)量顯著降低(14-17)。除此以外,還發(fā)現(xiàn)編碼尿鳥苷蛋白和鳥苷蛋白的基因定位在常常與人結(jié)腸腫瘤中雜合性的喪失有關(guān)的基因組區(qū)域內(nèi)(18-20)。這些發(fā)現(xiàn)一起表明尿鳥苷蛋白、鳥苷蛋白以及其他有相似活性的肽可以用于結(jié)腸異常性生長(zhǎng)的預(yù)防和治療。這個(gè)提議得到了最近一項(xiàng)研究的支持,該研究證明了鳥苷蛋白的口服給藥抑制了小鼠中息肉的形成(15,16)。
      [0010]尿鳥苷蛋白和鳥苷蛋白肽看起來也通過控制細(xì)胞的離子流而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡的改變與腫瘤發(fā)展為轉(zhuǎn)移性表型有關(guān)。原發(fā)性的胃腸癌只限于小腸、結(jié)腸和直腸,但癌變可以轉(zhuǎn)移并擴(kuò)張至骨、淋巴結(jié)、肝臟、肺、腹膜、卵巢、大腦等部位。通過提高鉀離子的外流和鈣離子的內(nèi)流,尿鳥苷蛋白和相關(guān)肽可以促進(jìn)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的死亡,從而抑制癌變轉(zhuǎn)移。
      [0011]降低的CFTR活性的一項(xiàng)臨床表現(xiàn)是呼吸道的炎癥(21)。這一結(jié)果可能歸因于CTFR調(diào)控NF-kB、趨化因子和細(xì)胞因子的表達(dá)(22-25)。最近的報(bào)道也提示CFTR通道與還原型谷胱甘肽的運(yùn)輸和維持有關(guān)。還原型谷胱甘肽是抗氧化劑,在防止因氧化脅迫而產(chǎn)生的炎癥方面起著重要 作用(39)。通過激活鳥苷酸環(huán)化酶或抑制cGMP特異的磷酸二酯酶這兩條途徑而產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)cGMP水平的提高,可預(yù)計(jì)對(duì)這些炎癥刺激有減量調(diào)節(jié)的作用。因此,尿鳥苷蛋白型的激動(dòng)劑應(yīng)該在肺(如哮喘)、腸[如潰瘍性結(jié)腸炎和節(jié)段性回腸炎(克羅恩氏病)]、胰腺和其他器官炎癥的預(yù)防和治療中有用。
      [0012]總之可以得出結(jié)論,鳥苷酸環(huán)化酶受體的激動(dòng)劑如尿鳥苷蛋白,在多種炎癥、癌癥(特別是結(jié)腸癌)的治療中以及作為抗轉(zhuǎn)移藥物,都具有潛在的治療價(jià)值。因此,新型激動(dòng)劑的開發(fā)在臨床上具有實(shí)質(zhì)的重要性。
      [0013]發(fā)明概述
      [0014]本發(fā)明基于新型鳥苷酸環(huán)化酶受體激動(dòng)劑的開發(fā)和天然存在的激動(dòng)劑的新用途。這些激動(dòng)劑是尿鳥苷蛋白的類似物,其中許多具有很優(yōu)良的性質(zhì),在低pH下具有提高的受體激活能力、穩(wěn)定性、活性或者降低的副作用。這些肽可以用于治療任何對(duì)細(xì)胞內(nèi)提高的cGMP水平反應(yīng)的情況。提高細(xì)胞內(nèi)cGMP的產(chǎn)量和/或通過cGMP特異的磷酸二酯酶抑制cGMP的降解都可以提高細(xì)胞內(nèi)的cGMP水平。在能夠被預(yù)防或治療的具體情況中有炎癥、癌癥、息肉和癌轉(zhuǎn)移。
      [0015]首先,本發(fā)明針對(duì)基本由SEQ ID NO:2-21中任意一個(gè)氨基酸序列組成的肽以及含有這些肽的治療用組合物。術(shù)語“基本由...組成”包括肽,其序列與上面列舉的帶有標(biāo)識(shí)序號(hào)的序列相同以及在結(jié)構(gòu)或功能上與這些序列沒有根本區(qū)別的其他序列。對(duì)于本申請(qǐng)的目的,如果一個(gè)肽在結(jié)構(gòu)上相對(duì)于SEQ ID NO:2-21中的肽有三個(gè)以上氨基酸的變化,或者其激活細(xì)胞內(nèi)cGMP產(chǎn)生的能力有50%的增加或減少,則該肽有根本的區(qū)別。優(yōu)選,基本相似的肽不應(yīng)該有兩個(gè)以上氨基酸的差異,并且在激活cGMP產(chǎn)生方面的差異不應(yīng)該大于25%。最優(yōu)選的肽是具有SEQ ID NO:20序列的雙環(huán)肽。[0016] 這些肽可以與一或多種賦形劑一起,以單位劑量形式出現(xiàn)在藥物組合物中。術(shù)語“單位劑量形式”指一個(gè)單一給藥實(shí)體,如片劑、膠囊、溶液或吸入制劑。加入的肽量應(yīng)該為在給患者用藥時(shí),足以產(chǎn)生有效的治療作用(一般在100微克與3克之間)?!坝行У闹委熥饔谩钡慕⑷Q于被治療的特定情況,而且包括本領(lǐng)域技術(shù)人員容易識(shí)別的狀況的任何顯著改善。例如,有效的治療作用可以包括炎癥的減少、息肉或腫瘤的縮小、轉(zhuǎn)移性損害的減少等等。
      [0017]本發(fā)明還包含了聯(lián)合療法,使用鳥苷酸環(huán)化酶受體激動(dòng)劑單獨(dú)給藥或與cGMP依賴的磷酸二酯酶的抑制劑、抗炎癥藥劑或抗癌藥劑一起給藥。這些藥劑的量應(yīng)當(dāng)是本領(lǐng)域內(nèi)已知的給患者服用后有治療效果的量。抗腫瘤藥劑可以包括烷基化試劑、表鬼白毒素、亞硝基脲、抗代謝物、長(zhǎng)春花生物堿、蒽環(huán)類抗生素、氮芥試劑以及類似的物質(zhì)。具體的抗腫瘤藥劑可以包括三苯氧胺(它莫西芬)、紫杉醇、表鬼白毒素吡喃葡糖苷和5-氟尿嘧啶。在設(shè)計(jì)適合于患者具體需要的治療方案時(shí),抗病毒和單克隆抗體療法可以與包括至少一種鳥苷酸環(huán)化酶受體激動(dòng)劑的化療組合物聯(lián)合使用。
      [0018]另一方面,本發(fā)明針對(duì)通過給患者服用含有效量鳥苷酸環(huán)化酶受體激動(dòng)劑一優(yōu)選合成的鳥苷酸環(huán)化酶受體激動(dòng)劑的組合物來預(yù)防、治療或減緩受治療者的癌癥,特別是上皮細(xì)胞癌癥或息肉發(fā)作的方法。術(shù)語“有效量”是指能夠可測(cè)量地提高細(xì)胞內(nèi)cGMP水平的足量的激動(dòng)劑。術(shù)語“合成的”是指制造的與鳥苷酸環(huán)化酶受體結(jié)合的肽,但該肽含有某些在已知的內(nèi)源鳥苷酸環(huán)化酶激動(dòng)劑一如尿鳥苷蛋白中不存在的氨基酸序列替換。該激動(dòng)劑應(yīng)當(dāng)選自由SEQ ID NO:2-21限定的,并且列在表2和表3中的肽。本發(fā)明還包括了通過給患者服用有效劑量的選自尿鳥苷蛋白、鳥苷蛋白和大腸桿菌ST肽的肽來治療原發(fā)性癌癥而非原發(fā)性結(jié)腸癌的方法。盡管優(yōu)選使用人類的肽,但是任何已知形式的尿鳥苷蛋白或鳥苷蛋白都可以用于此目的。
      [0019]本發(fā)明還包括預(yù)防或治療來源于原發(fā)性腫瘤塊的腫瘤轉(zhuǎn)移。依據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的肽可以靶向具有鳥苷酸環(huán)化酶受體的轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中,在胃腸癌細(xì)胞上和源自這些癌的轉(zhuǎn)移細(xì)胞上,會(huì)發(fā)現(xiàn)被靶向的受體。這種受體一般是跨膜蛋白,具有細(xì)胞外配基結(jié)合結(jié)構(gòu)域,跨膜結(jié)構(gòu)域和具有鳥苷酸環(huán)化酶活性的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。盡管本發(fā)明沒有任何特殊作用機(jī)制的限制,但是一般認(rèn)為這些肽通過與這些細(xì)胞受體相結(jié)合并引發(fā)細(xì)胞凋亡而發(fā)生作用。轉(zhuǎn)移性的腫瘤也可以通過給藥任意已知形式的尿鳥苷蛋白或鳥苷蛋白(優(yōu)選人源的)或給藥大腸桿菌ST肽進(jìn)行治療。
      [0020]肽可以單獨(dú)給藥或者與一或多種cGMP依賴的磷酸二酯酶的抑制劑一起給藥。cGMP依賴的磷酸二酯酶的抑制劑的例子有suldinac砜,苯氮嘌呤酮和motapizone??梢灾委煹陌┌Y形式包括乳腺癌、直腸癌,肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌和睪丸癌。可以施用根據(jù)本發(fā)明的組合物通過抑制癌變?cè)缙谥蹦c息肉的發(fā)育而預(yù)防結(jié)腸癌的發(fā)生??梢哉J(rèn)為這些肽對(duì)治療結(jié)腸癌和預(yù)防結(jié)腸腫瘤轉(zhuǎn)移應(yīng)該非常有效。
      [0021]第三方面,本發(fā)明針對(duì)通過施用含有可以提高細(xì)胞內(nèi)cGMP產(chǎn)量的鳥苷酸環(huán)化酶受體激動(dòng)劑的組合物來治療、防治或延緩受治療者器官炎癥(如與胃腸道、哮喘、腎炎、肝炎、胰腺炎、支氣管炎或囊腫性纖維化有關(guān)的炎癥)發(fā)作的方法。優(yōu)選的肽激動(dòng)劑選自表2和表3所示的SEQID NO:2-21定義的肽,或者是尿鳥苷蛋白、鳥苷蛋白或大腸桿菌ST肽。這些肽可選與一或多種cGMP依賴的磷酸二酯酶的抑制劑,如suldinac砜,苯氮嘌呤酮或motapizone 一起給患者服用。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,本發(fā)明針對(duì)治療哺乳動(dòng)物的胃腸道炎癥的方法。炎癥可以歸為發(fā)炎性腸部疾病,更為具體地可以是節(jié)段性回腸炎(克羅恩氏病)或潰瘍性結(jié)腸炎。給藥方式可以是腸溶性的,并使用適于靶向腸細(xì)胞的制劑。
      [0022]從更廣義的意義上講,本發(fā)明包括通過給患者施用有效量的具有SEQ ID NO:2-21中任一序列的肽,或者尿鳥苷蛋白、鳥苷蛋白或大腸桿菌ST肽來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法。在這一意義上,“有效量”的肽所指足以在目標(biāo)組織中提高細(xì)胞凋亡的量。例如,在腫瘤生長(zhǎng)中可以給予足量的肽以誘導(dǎo)提高速率的細(xì)胞死亡。
      [0023]最優(yōu)選用于上述方法的肽是SEQ ID NO:20所限定的肽。其序列如下(也請(qǐng)參見表3):
      [0024]Asn1Asp2Glu3Cys4Glu5Leu6Cys7ValsAsn9Val10Ala11Cys12Thr13Gly14Cys15Leu16
      [0025]氺氺氺氺氺氺
      [0026]且其中在第4位的半胱氨酸和第12位的半胱氨酸之間有一個(gè)二硫鍵;第二個(gè)二硫鍵位于第7位的半胱氨酸和第15位的半胱氨酸之間(SEQ ID NO:20)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)由于該肽對(duì)于鳥苷酸環(huán)化酶受體提高的結(jié)合常數(shù),作為cGMP產(chǎn)生的激動(dòng)劑,它具有增強(qiáng)的生物活性。在溫度和蛋白酶穩(wěn)定性方面以及在大腸中生理適宜pH值(pH6-7)時(shí)的生物活性方面,該肽優(yōu)于尿鳥苷蛋白。
      [0027]上述方法中使用的鳥苷酸環(huán)化酶受體激動(dòng)劑可以口服、全身或局部方式給藥。劑量形式包括吸入或注射的制劑、溶液、懸浮液、乳劑、片劑、膠囊、局部軟膏和洗劑、透皮組合物,其他已知的肽劑型和pegylated肽類似物。組合物的有效劑量一般在約1微克到約10毫克每千克體重之間,優(yōu)選在約10微克到5毫克每千克體重之間。使用本領(lǐng)域的常規(guī)方法并依據(jù)具體的組合物和臨床的考慮調(diào)整劑量。激動(dòng)劑可以以單一活性藥劑的形式給藥,或者與其他藥物如cGMP依賴的磷酸二酯酶的抑制劑一起給藥。在所有情況下,其他藥物的給藥劑量應(yīng)當(dāng)以本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)為指導(dǎo)的治療有效劑量??梢砸詥我唤M合物或逐一給藥的方式給藥。`
      [0028]發(fā)明詳述
      [0029]本發(fā)明建立在多種原理上。首先是依賴cGMP的機(jī)制,其調(diào)控細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡之間的平衡,并且由于尿鳥苷蛋白/鳥苷蛋白的缺乏和/或cGMP特異的磷酸二酯酶的激活而導(dǎo)致的cGMP水平的降低,這是腫瘤轉(zhuǎn)化中早期且至關(guān)重要的一步。第二個(gè)原理是花生四烯酸從膜磷脂上的釋放將導(dǎo)致在發(fā)炎過程中cPLA2、C0X-2及可能還有5-脂氧合酶的激活,該釋放受到依賴cGMP機(jī)制的負(fù)調(diào)控,這會(huì)導(dǎo)致前列腺素和白三烯水平的降低,并且提高胞內(nèi)的cGMP水平因此可以產(chǎn)生抗炎癥反應(yīng)。除此以外,依賴cGMP的機(jī)制被認(rèn)為參與促炎過程的調(diào)控。因此,升高胞內(nèi)cGMP水平可以用作治療和控制腸部發(fā)炎性疾病如潰瘍性結(jié)腸炎和節(jié)段性回腸炎(克羅恩氏病)及其他器官炎癥(例如與哮喘、腎炎、肝炎、胰腺炎、支氣管炎、囊腫性纖維化有關(guān)的炎癥)的一種方法。
      [0030]并非局限于任何理論,預(yù)想離子跨細(xì)胞膜的運(yùn)輸可以被證明是細(xì)胞增殖和凋亡之間平衡的重要調(diào)控因子,這個(gè)平衡會(huì)受到能夠改變cGMP濃度的組合物的影響。已有證據(jù)顯示尿苷蛋白刺激胃腸道中鉀離子外流,鈣離子內(nèi)流以及水的運(yùn)輸(3)。此外,已發(fā)現(xiàn)心房肽(ANP),一個(gè)也可以與特異的鳥苷酸環(huán)化酶受體結(jié)合的肽,誘導(dǎo)大鼠血管系膜細(xì)胞的凋亡,并通過依賴cGMP的機(jī)制誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的凋亡(26-29)。可以認(rèn)為本發(fā)明的激動(dòng)劑與鳥苷酸環(huán)化酶受體的結(jié)合刺激cGMP的產(chǎn)生。這種配基-受體相互作用,通過激活依賴cGMP的蛋白激酶和CFTR的級(jí)聯(lián)作用,預(yù)期會(huì)誘導(dǎo)目標(biāo)細(xì)胞的凋亡。因此,施用如表2和表3中所示的SEQ ID NO:2-21所限定的新型肽,或者尿鳥苷蛋白、或鳥苷蛋白或大腸桿菌ST肽,預(yù)期會(huì)消除,或至少延緩,胃腸道炎癥的發(fā)作和普通器官發(fā)炎(如哮喘、腎炎、肝炎、胰腺炎、支氣管炎和囊腫性纖維化)。
      [0031]在第二方面,本發(fā)明針對(duì)通過施用含有有效量的鳥苷酸環(huán)化酶受體激動(dòng)劑的組合物,優(yōu)選合成的鳥苷酸環(huán)化酶受體激動(dòng)劑,來治療、防治或延緩受治療者的癌癥,特別是上皮細(xì)胞癌癥發(fā)作的方法。術(shù)語“有效量”指可以使胞內(nèi)cGMP水平產(chǎn)生可測(cè)量增加的足量的激動(dòng)劑。術(shù)語“合成的”指制造出來與鳥苷酸環(huán)化酶受體結(jié)合的肽,卻含有某些已知的內(nèi)源鳥苷酸環(huán)化酶激動(dòng)劑一如尿鳥苷蛋白中不存在的氨基酸序列替換。該激動(dòng)劑應(yīng)當(dāng)是選自SEQ ID NO:2-21所限定的,及在表2和表3中列出的肽。本發(fā)明還包括了通過施用有效劑量的選自尿鳥苷蛋白、鳥苷蛋白和大腸桿菌ST肽的肽,來治療除原發(fā)性結(jié)腸癌以外的原發(fā)癌癥的方法。盡管優(yōu)選使用人源的肽,但是任何已知形式的尿鳥苷蛋白或鳥苷蛋白都可以用于此目的。
      [0032]調(diào)控轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞增殖和凋亡之間平衡的依賴cGMP的機(jī)制可以作為靶向和治療轉(zhuǎn)移性腫瘤的機(jī)制。肝臟是最常見的從原發(fā)性結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的位置。在癌癥的后期,結(jié)直腸的轉(zhuǎn)移性細(xì)胞也可以侵襲身體的其他部位。應(yīng)重點(diǎn)注意的是來源于胃腸道中原發(fā)位點(diǎn)的轉(zhuǎn)移性細(xì)胞一般會(huì)繼續(xù)表達(dá)鳥苷酸環(huán)化酶受體,因此,這些細(xì)胞應(yīng)當(dāng)對(duì)由腸部鳥苷酸環(huán)化酶受體介導(dǎo)的凋亡療法敏感。具有尿鳥苷蛋白活性的肽,在單獨(dú)使用或與cGMP-磷酸二酯酶的特異抑制劑一起使用時(shí),也會(huì)通過cGMP介導(dǎo)的機(jī)制,恢復(fù)細(xì)胞增殖和凋亡間的健康平衡,而延緩消化道上皮的癌癥發(fā)生。
      [0033]這里使用的術(shù)語“鳥苷酸環(huán)化酶受體”指位于任何細(xì)胞類型上的鳥苷酸環(huán)化酶受體,在此所述的發(fā)明的激動(dòng)劑肽或天然激動(dòng)劑與這些受體結(jié)合。
      [0034]這里使用的術(shù)語“鳥苷酸環(huán)化酶受體-激動(dòng)劑”指與鳥苷酸環(huán)化酶受體結(jié)合并刺激cGMP產(chǎn)生的肽和/或其他化合物。該術(shù)語還包括所有這樣的肽,它們具有與包含SEQ IDNO:1的3-15號(hào)氨基酸殘基結(jié)合結(jié)構(gòu)`域的至少一部分基本上相同的序列。該術(shù)語還涵蓋了與鳥苷酸環(huán)化酶受體結(jié)合并刺激cGMP產(chǎn)生的片段和前肽。術(shù)語“基本上相同”指具有與結(jié)合結(jié)構(gòu)域相同氨基酸序列的肽,序列中某些殘基可以被刪除,或被其他氨基酸替代而不影響該肽結(jié)合鳥苷酸環(huán)化酶受體并刺激cGMP產(chǎn)生的能力。
      [0035]新型鳥苷酸環(huán)化酶受體激動(dòng)劑的策略和設(shè)計(jì)
      [0036]尿鳥苷蛋白由杯狀突和其他排列為胃腸粘膜的上皮細(xì)胞以功能上無活性的尿鳥苷蛋白原的形式分泌。人類的肽原隨后在腸腔內(nèi)通過內(nèi)源蛋白酶的作用被轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苌嫌谢钚缘?,由SEQ ID N0:1所表示的16氨基酸肽(人尿鳥苷蛋白序列,參見表2)。因?yàn)槟蝤B苷蛋白是一種耐熱、耐酸和耐蛋白酶水解的肽,在治療方法中可以有效地采用這種肽和/或其他與SEQ ID NO:1的序列相似的功能上有活性的16氨基酸肽的口服或全身性給藥。
      [0037]下面討論與尿鳥苷蛋白相似但不同的肽,包括一些具有優(yōu)異的cGMP增強(qiáng)性質(zhì),和/或其他與以前知道的尿鳥苷蛋白肽相比有利的性質(zhì)。這些肽可以用于抑制胃腸炎癥,以及治療或預(yù)防與消化道炎癥有關(guān)的息肉形成。也可以治療易于形成癌細(xì)胞的上皮組織。這里描述的鳥苷酸環(huán)化酶受體激動(dòng)劑具有表2和3中所示的氨基酸序列。激動(dòng)劑-受體相互作用的“結(jié)合結(jié)構(gòu)域”包含SEQ ID NO:1的3-15號(hào)氨基酸殘基。
      [0038]應(yīng)用分子模擬設(shè)計(jì)新型的鳥苷酸環(huán)化酶受體激動(dòng)劑,具體方法見(30)。分子模擬設(shè)計(jì)包括對(duì)三個(gè)已知與鳥苷酸環(huán)化酶受體相互作用的化合物的能量計(jì)算,這三個(gè)化合物為人尿鳥苷蛋白,雙環(huán)[4,12 ;7,15]
      [0039]Asn1-Asp2-Asp3-Cys4-Glu5-Leu6-Cys7-Val8-Asn9-Val10-Ala11-Cys12-Thr13-Glv14-Cys15-Leu16(UG, SEQ ID NO:1)、人鳥苷蛋白,雙環(huán)[4,12 ;7,15]
      [0040]Pro1-Gly2-Thr3-Cys4-Glu5-1le6-Cys7-Ala8-Tyr9-Ala10-Ala11-Cys12-Thr13-Gly14-Cys15(⑶,SEQ ID NO:22)、和大腸桿菌小的熱穩(wěn)定腸毒素,三環(huán)[6,10 ;7,15 ill-lSjAsn'-Ser2-Ser3-Asn4-Tyr5-Cys6-Cys7-Glu8-Leu9-Cys10-Cysn-Asn12-pro13-Ala14-Cys15-Thr16-Gly17-Cvs18--Thr19-(ST,SEQ ID NO:23)。對(duì)這三個(gè)化合物所有可能的低能量構(gòu)象進(jìn)行幾何比較,以揭示出作為生物活性構(gòu)象(即在與受體相互作用的過程中GU,UG和ST所采用的構(gòu)象)“模板”的共有的3-D結(jié)構(gòu)。分子模型設(shè)計(jì)允許在以其他低能量構(gòu)象為代價(jià)的情況下,通過選擇對(duì)于多種氨基酸殘基的單獨(dú)替代,設(shè)計(jì)具有生物活性構(gòu)象顯著增加的構(gòu)象群體的新型類似物。
      [0041]利用堆積(build-up)步驟進(jìn)行能量計(jì)算(30)。用平面順式肽鍵(包括ST中的Pro 13的平面順式肽鍵)用剛性化合價(jià)幾何結(jié)構(gòu),使用ECEPP/2勢(shì)場(chǎng)(31,32)。Pro13的ω角允許變動(dòng)。脂肪族和芳香族的氫-般被包括在01?類型的聯(lián)合原子中心中;對(duì)α氫原子和酰胺的氫進(jìn)行明確的描述。
      [0042]主要的計(jì)算方案涉及許多相連續(xù)的步驟。首先要考慮兩個(gè)單環(huán)的模型片段(對(duì)于ST是三個(gè)片段),Ac-環(huán)(Cys1-...-CysJ) -NMe的序列,其中除了 Cys、Gly和Pro以外的所有殘基都由丙氨酸替代;i和j的值與GU、UG和ST的序列對(duì)應(yīng)。在這一步,要考慮每一個(gè)氨基酸殘基對(duì)肽骨架的局部最小量的所有可能組合,即對(duì)Ala殘基,E,F(xiàn),C,D,A和A*類型[按照(33)中的符號(hào)系統(tǒng)]的Rama chandran圖中的最小量;對(duì)Gly殘基,E*,F(xiàn)*,C*,D*,A,E,F(xiàn),C,D,和A*類型的Rama chand ran圖中的最小量;對(duì)卩ro殘基,F(xiàn),C和A類型的Rama chandran圖中的最小量。對(duì)于每一個(gè)骨架構(gòu)象,通過檢查D_Cy s殘基沿二面角xl旋轉(zhuǎn)的能量性質(zhì),找到使用ECEPP/2力場(chǎng)內(nèi)在的拋物線勢(shì)能函數(shù)關(guān)閉環(huán)的最適可能性。
      [0043]總計(jì),對(duì)每一個(gè)環(huán)部分,至少考慮大約180,000個(gè)構(gòu)象。然后,滿足E_Emin<AE=15kcal/mol標(biāo)準(zhǔn),且在任意骨架二面角的至少一個(gè)值上有40°以上差異的構(gòu)象(對(duì)不同的模型片段,從約3000到8000個(gè)構(gòu)象中)被挑選出來。在下一步,將相配的單環(huán)片段中所選出來的構(gòu)象進(jìn)行疊加,以產(chǎn)生雙環(huán)模型片段的可能構(gòu)象(對(duì)于ST是三環(huán)片段)。這一步一般得到20,000到30,000個(gè)構(gòu)象。所有這些構(gòu)象進(jìn)入新一輪能量計(jì)算的循環(huán),產(chǎn)生出對(duì)于ST模型片段滿足E-Emin <Δ E=20kcal/mol標(biāo)準(zhǔn)的191個(gè)構(gòu)象和對(duì)于⑶/UG模型片段滿足同樣條件的6,965個(gè)構(gòu)象。此后,恢復(fù)在模型片段中漏掉的側(cè)鏈,再次進(jìn)行能量計(jì)算,在能量最小化之前,利用前述算法(34),對(duì)側(cè)鏈基團(tuán)的二面角值(除了 Cys殘基的xl角以外)和骨架末端基團(tuán)的二面角值進(jìn)行優(yōu)化,以達(dá)到這些基團(tuán)最適宜的空間排列。對(duì)于UG4-15片段,632個(gè)構(gòu)象滿足Λ E=20kcal/mol的標(biāo)準(zhǔn);其中162個(gè)滿足更為嚴(yán)格的Λ E=12kcal/mol的標(biāo)準(zhǔn),這符合已接受的lkcal/mol/殘基的標(biāo)準(zhǔn)(30)。接下來由UG4-15片段向3_16片段的延長(zhǎng),以及延長(zhǎng)為整個(gè)UG分子,以同樣的堆積步驟進(jìn)行。最終找到滿足Λ E=16kcal/mol標(biāo)準(zhǔn)的31個(gè)UG的骨架構(gòu)象。[0044]用以下方法對(duì)每一個(gè)構(gòu)象進(jìn)行幾何比較。根據(jù)(35),確定一個(gè)構(gòu)象對(duì)中原子中心重疊的最適度,以檢查兩個(gè)構(gòu)象之間幾何相似性的水平。幾何相似性的標(biāo)準(zhǔn)是rms值,對(duì)于一對(duì)構(gòu)象A和B, rsm值計(jì)算如下:
      [0045]rns=(l/N) Σ [ (xVx^) 2+(yVy^) 2+(zVz^) 2] 1/2,
      [0046]其中N是選擇用于重疊的α碳原子對(duì)的數(shù)目,X、y和ζ是笛卡爾坐標(biāo)。根據(jù)rms< 2.0 i的幾何相似性標(biāo)準(zhǔn),剛性構(gòu)象片段UG4-15的低能量構(gòu)象歸入七個(gè)構(gòu)象家族。其中的一個(gè)家族由與1UYA和1ETN都相似的相同的六個(gè)構(gòu)象組成;該家族還包含UG的最低能量構(gòu)象。(1UYA和1ETN由實(shí)驗(yàn)限定為UG和ST分別的3D結(jié)構(gòu),已知它們具有高生物活性(36,37);從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中可以獲得3D結(jié)構(gòu)。)
      [0047]表1在UG的“模板”構(gòu)象中,肽骨架的二面角(用度表示)值
      [0048]
      【權(quán)利要求】
      1.由SEQID NO:20的氨基酸序列組成的肽。
      2.單位劑量的組合物,其包含由SEQID NO:20的氨基酸序列組成的鳥苷酸環(huán)化酶受體激動(dòng)劑肽。
      3.單位劑量形式的組合物,其包含:a)由SEQID NO:20的氨基酸序列組成的鳥苷酸環(huán)化酶受體激動(dòng)劑肽;和b)選自如下組的至少一種化合物,所述組由依賴cGMP的磷酸二酯酶抑制劑、抗炎藥劑、抗病毒藥劑和抗癌藥劑組成。
      4.權(quán)利要求2或3的組合物,其中所述單位劑量形式選自如下組,所述組由片劑、膠囊、溶液和吸入劑型組成。
      5.權(quán)利要求2或3的組合物,進(jìn)一步包含一或多種賦形劑。
      6.肽偶聯(lián)物,其包含 連接于由氨基酸序列SEQID NO:20組成的肽的聚乙二醇(PEG)。
      【文檔編號(hào)】A61P15/00GK103641892SQ201310447292
      【公開日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2002年3月28日 優(yōu)先權(quán)日:2001年3月29日
      【發(fā)明者】K·沙魯布海, G·尼克夫維茨, G·S·雅克布 申請(qǐng)人:藥物協(xié)和公司
      網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
      • 還沒有人留言評(píng)論。精彩留言會(huì)獲得點(diǎn)贊!
      1