專利名稱：分支桿菌的鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域臨床分子診斷技術(shù)，尤其涉及一種使用PCR測(cè)序 的分支桿菌的鑒定方法。
背景技術(shù)：
分支桿菌的數(shù)量目前有110種左右，它是許多統(tǒng)稱為分支桿菌病的疾病的 起因。因此，分支桿菌的分類鑒定引起了廣大的科研工作者的重視。?，F(xiàn)有技術(shù) 中，分支桿菌的鑒定技術(shù)分為三類。
一類是采用常規(guī)生化指標(biāo)鑒定分支桿菌，例如專利CN1298023所描述的。 這種方法也是目前檢驗(yàn)科常用的方法，這種方法鑒定時(shí)間長(zhǎng)(需要1-2周)， 鑒定的結(jié)果受人為觀察的影響，準(zhǔn)確性不是很高。
第二類采用抗原抗體的方法進(jìn)行血清學(xué)診斷，例如專利CN1388378就是采
用這種方法，該方法能夠檢測(cè)的分支桿菌數(shù)量同樣比較少，而且每種菌需要一 種抗體進(jìn)行;險(xiǎn)測(cè)，因此不能鑒定臨似目關(guān)的所有分支桿菌。
第三類采用芯片雜交技術(shù)(寡核苷酸雜交檢測(cè)技術(shù)，即利用相關(guān)突變的寡核 苷酸與受檢對(duì)象DNA進(jìn)行雜交來確定突變類型)。專利CN1724681 ， CN1896280 ， CN1071955都是此類技術(shù)，此類技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求高，結(jié)果不穩(wěn)定，分型的 種類較少，每種需要用一個(gè)探針。因此不利于臨床標(biāo)準(zhǔn)化應(yīng)用。而且芯片雜交 的方法檢測(cè)的分支桿菌數(shù)量有限。
因此本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)一種鑒定種類多，結(jié)果穩(wěn)定，結(jié)果分析方便準(zhǔn)確， 便于臨床操作和結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化的分支桿菌鑒定方法

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種鑒定 種類多，結(jié)果穩(wěn)定，結(jié)果分析方便準(zhǔn)確，便于臨床操作和結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化的分支桿菌鑒定方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，提供了一種分支桿菌的鑒定方法，其特征在于，包括如
下步驟獲取多種分支桿菌的多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)rDNA序列，以生成分支桿菌序列凄史據(jù)庫。 對(duì)所述多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)rDNA序列進(jìn)行比對(duì)，得到這些rDNA序列共有的保守區(qū)段。根 據(jù)所述保守區(qū)段制備一對(duì)PCR引物。使用所述PCR引物對(duì)待測(cè)分支桿菌的DM 溶液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而得到所述待測(cè)分支桿菌的擴(kuò)增產(chǎn)物。對(duì)所述擴(kuò)增產(chǎn)物 進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，得到測(cè)序產(chǎn)物。對(duì)所述測(cè)序產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，得到待測(cè)分支 桿菌的rDNA序列。通過比較所述待測(cè)序列和所述分支桿菌序列數(shù)據(jù)庫中的標(biāo)準(zhǔn) 序列，確定所述待測(cè)分支桿菌的類型。
較佳地，還包括使得所述引物的3 '端的石威基與所述多種分支桿菌的rDNA 序列匹配。 -
4交佳:t也，所述一》于PCR引物包4舌上游PCR引物agagtttgatcctggctcag和下 游PCR引物Ugtcgcgttgttcgtgaaa。
較佳地，還包括對(duì)所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化。
較佳地，，將所述上游PCR引物的濃度稀釋到luM,對(duì)所述純化產(chǎn)物進(jìn)行測(cè) 序反應(yīng)。
較佳地，，還包括對(duì)所述經(jīng)測(cè)序反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行乙醇沉淀。 較佳地，，還包括對(duì)所述經(jīng)乙醇沉淀的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行曱酰胺變性。 較佳地，通過毛細(xì)管電泳進(jìn)行所述測(cè)序分析，得到所述待測(cè)分支桿菌的測(cè) 序圖譜。
較佳地，還包括將所述測(cè)序圖譜轉(zhuǎn)換為與所述分支桿菌序列數(shù)據(jù)庫中的標(biāo) 準(zhǔn)rDNA序列的格式相同的格式。
較佳地，所述比較所述待測(cè)序列和所述分支桿菌序列數(shù)據(jù)庫中的標(biāo)準(zhǔn)序列， 確定所述待測(cè)分支桿菌的類型還包括如下步驟
獲得所述分支桿菌序列數(shù)據(jù)庫中與所述對(duì)待測(cè)序列最匹配的所述標(biāo)準(zhǔn)序 列。獲得待測(cè)序列與標(biāo)準(zhǔn)序列的共享減基的百分比，所述百分比定義為匹配度。 根據(jù)所述匹配度對(duì)所述分支桿菌序列數(shù)據(jù)庫中的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行序，匹配度排序 第一的序列判定為待測(cè)分支桿菌的類型。
較佳地，還包括獲得相鄰兩位匹配度排序的兩條標(biāo)準(zhǔn)序列共享堿基數(shù)的差，所述差定義為確信度；并且根據(jù)所述確信度對(duì)所述匹配度進(jìn)行校正。
由于根據(jù)多種分支桿菌的標(biāo)志序列的保守區(qū)段設(shè)計(jì)PCR引物，因此所有的 PCR和測(cè)序只需一對(duì)引物，大大減少了實(shí)驗(yàn)種所需要的寡核苷酸的數(shù)量。


圖l為分支桿菌的PCR引物序列示意圖； 圖2為結(jié)果序列示意圖； 圖3為序列鑒定結(jié)果的示意圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說 明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn) 方法，通常按照常規(guī)條件如分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Sambrook等人，New York: Cold Spring Harbor Laboratoiy Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建 議的條件。
目前，分支桿菌的數(shù)量目前只有110種左右，本實(shí)施例中，獲取其中105 種分支桿菌的文^格式的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)16srDNA序列，由此獲得分支桿菌序列數(shù)據(jù) 庫。
此后，分支桿菌序列數(shù)據(jù)庫中的多種分支桿菌樣的16srDNA序列進(jìn)行對(duì)比， 找到相似度最大區(qū)段，即保守區(qū)段。接著，根據(jù)所述保守區(qū)段，設(shè)計(jì)所述多種 分支桿菌可公用的一對(duì)16srDNA引物。具體的，使所述引物的3 '端的#與 所述多種分支桿菌的16srDM序列匹配。如圖1所示，本實(shí)施例的所迷一對(duì)引 物為方才匡內(nèi)的上游引物agagtttgatcctggctcag和方才匡內(nèi)的下游引物 ttgtcgcgttgttcgtgaaa。
現(xiàn)描述如何獲取待測(cè)分支桿菌的DNA溶液。本實(shí)施例中，待測(cè)分支桿菌的 數(shù)量為12種，但并不限于此數(shù)量。首先，對(duì)12例不同分支桿菌感染的標(biāo)本(從 上海市肺科醫(yī)院檢驗(yàn)科處獲得)用標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)方法進(jìn)行分支桿菌培養(yǎng)，隨后取 少量菌落放入無菌水中作為本發(fā)明鑒定方法的樣本。然后，使用DNA抽提試劑 盒(貨號(hào)W6511,上海華舜生物工程有限公司)按照操作流程對(duì)所述12例標(biāo)本進(jìn)行分支桿菌標(biāo)本的DNA抽提工作，由此得到12例樣本的DNA溶液。所迷 DNA溶液在后續(xù)步驟中用作DNA溶液模板。
此后，對(duì)所獲得的各樣本DNA溶液作PCR擴(kuò)增。首先，按照如下的體系 配置20ul的擴(kuò)增體系10 x buffer, dNTP 2uM，引物10uM， Taq酶1個(gè)單位。 具體的，所述20ul擴(kuò)增體系包含8.7ul無菌水，5ul分支桿菌DNA溶液模板， 0.3ulHotstartaq酶(Qiagen公司購買)，lul上游引物f (10uM), lul下游引物r (IOuM)， 2uldNTP (promega公司)和2ulPCR酶的緩沖液(qiagen公司)。
H20 buffer dNTP 引物f 引物r 才莫板DNA Taq 8. 7ul2ul2ul lul lul 5ul 0. 3ul
接著，將所述擴(kuò)增體系放置在PCR儀(ABI的2720 )的孔板(96孔板)上按照 如下的PCR條件在所述PCR儀上設(shè)置熱循環(huán)條件，對(duì)所述PCR擴(kuò)增體系進(jìn)行 反應(yīng)。16srDNA引物的退火溫度為53°C，具體的反應(yīng)條件為95度5分鐘， 35個(gè)熱循環(huán)步驟設(shè)置為95度30秒，53度30秒，72度40秒，熱循環(huán)結(jié)束后， 設(shè)置72度5分鐘進(jìn)行總延伸，然后4度無窮。由此，得到與所述樣本溶液扭對(duì) 應(yīng)的16srDNA的擴(kuò)增產(chǎn)物?？砂葱枰獙?duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量控制，例如，擴(kuò)增 產(chǎn)物需要條帶單一 (可過柱純化)，濃度在30 - 100ng之間(可稀釋)。
擴(kuò)增結(jié)束后，使用SAP (promega公司)和exol (epicentre公司)對(duì)所述擴(kuò) 增產(chǎn)物進(jìn)行純化。純化體系為濃度7.633U/ul的SAP加濃度20U/ul的exol。具 體的，在2ulPCR產(chǎn)物中添加0.05ulSAP、 0.125ul exol以及5.825ul ddH20 。純 化條件為在37。C下純化60分鐘，80。C下純化15分鐘，然后4。C無窮。由此， 得到經(jīng)純化的擴(kuò)增產(chǎn)物。
此后，使用上游引物對(duì)上一步驟中經(jīng)純化的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。具體 的，先將10uM的所述上游引物稀釋到luM,然后按照如下體系混合各種試劑 測(cè)序反應(yīng)的體系包含4ulBigdye3.1 (美國(guó)ABI公司)，2ul上游引物(luM)， 2ul 上一步驟中得到的經(jīng)乙醇沉淀的擴(kuò)增產(chǎn)物以及2ul無菌水。按照如下的PCR條 件在所述PCR儀上設(shè)置熱循環(huán)條件，96度10秒，25個(gè)熱循環(huán)設(shè)置為96度10 秒，50度5秒，60度4分鐘，熱循環(huán)后設(shè)置60度4分鐘，4度無窮。由此，得 到帶有測(cè)序熒光標(biāo)記的一系列擴(kuò)增產(chǎn)物，這些產(chǎn)物所攜帶的熒光能夠在測(cè)序儀 上讀出并且變成最后的序列信息。此后，每孔加入70%乙醇50pL左右于室溫進(jìn)行沉淀，時(shí)間15分鐘以上， 不得超過24小時(shí)。3800轉(zhuǎn)/分，4。C離心30分鐘。輕輕倒去上清液，將96孔板 倒置離心，達(dá)1300轉(zhuǎn)/分即停。然后，甩干乙醇。室溫下^L置十分鐘左右讓乙醇 揮發(fā)干凈。經(jīng)過乙醇沉淀后，去除了所述擴(kuò)增產(chǎn)物的雜質(zhì)和多余染料。
此后，對(duì)所述經(jīng)乙醇沉淀的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Hidi (甲酰胺)變性。具體的， 在每孔加入10|iL的Hidi溶液，95度變性4分鐘以上，取出立即放入水水中， 置5分鐘。經(jīng)所述Hidi變性后，所述PCR產(chǎn)物中的DNA被拉伸成單鏈，保證 毛細(xì)管電泳時(shí)候大小不等的片斷電泳速度不同。
最后，將在上一步驟中經(jīng)甲酰胺變性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳。所述毛細(xì) 管電泳過程中，將測(cè)序產(chǎn)物所帶的熒光信號(hào)通過CCD的檢測(cè)，變成變成可讀的 光學(xué)序列。本實(shí)施例中，將所述擴(kuò)增產(chǎn)物i認(rèn)遺傳分析儀(3130x1 )的樣品托盤， 進(jìn)行測(cè)序的參數(shù)設(shè)置后，全自動(dòng)的進(jìn)行測(cè)序分析，它的自動(dòng)化的過程就是一個(gè) 在毛細(xì)管中跑電泳的過程，并且由所述遺傳分析儀自動(dòng)將光學(xué)信號(hào)變成圖語輸 出來。由此，得到12個(gè)樣本的測(cè)序圖鐠。
對(duì)于所獲得的測(cè)序圖譜，需將其轉(zhuǎn)換為使用文本格式的結(jié)果序列。本實(shí)施 例中，采用ABI公司的sequence analysis 5.3.1對(duì)其進(jìn)行分析，從而得到文本才各 式的序列。
由此，對(duì)比所獲得的12個(gè)樣本的文本格式的16srDNA結(jié)果序列和所述分支 桿菌序列數(shù)據(jù)庫中的文本格式的16srDNA序列，從而確定所測(cè)的分支桿菌的類f。
現(xiàn)將詳細(xì)描述如何比較所述測(cè)序反應(yīng)的結(jié)果序列與所述數(shù)據(jù)庫中的序列， 從而確定待測(cè)分支桿菌的類型。
對(duì)于待測(cè)的每一條文本序列，依次與所述分支桿菌序列數(shù)據(jù)庫中的每一條 分枝桿菌的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)。本實(shí)施例中，序列比對(duì)使用的是 Needleman-Wunsch算法。對(duì)于兩個(gè)序列，首先定義匹配得分函數(shù)，即如果巧個(gè) 堿基匹配則得分+1,如果兩個(gè)堿基不匹配則得分為0。 為了得到兩個(gè)序列的最 高的分匹配，采用動(dòng)態(tài)規(guī)劃法。具體的，令Fij為A序列的第i個(gè)堿基于B序列 的第j個(gè)磁碁對(duì)齊后的得分，則可以寫出如下遞歸式Fij = max(Fi - l,j — 1 + S(Ai，Bj),Fi，j - 1 + d，F(xiàn)i - l,j + d)
其中S(Ai，Bj)為匹配得分函數(shù)，d為插入空格數(shù)。得到最高得分以后，回溯 最右匹配方案。
其次，得到比對(duì)結(jié)果以后，計(jì)算待測(cè)序列和比對(duì)結(jié)果的序列共享堿基的百 分比，所得百分比即為匹配度。
然后對(duì)所述分支桿菌序列數(shù)據(jù)庫中的序列共享石威基百分比進(jìn)行排序，匹配 度排序第 一位和排序第二位的兩條序列共享堿基數(shù)的差距就是確信度。
將匹配度排序第 一 的序列判定為待測(cè)分支桿菌的類型。
參見圖3,具體描述將上述判定算法以軟件方法實(shí)現(xiàn)的具體分析和評(píng)價(jià)。圖 3中，匹配度為94.5313,即表示威基的匹配百分比為94.5313%，有部分不匹配 是因?yàn)闇y(cè)序序列堿基判讀的問題或者測(cè)序序列質(zhì)量問題導(dǎo)致，這些問題可以用 確信度進(jìn)行校正。圖3中14就代表與最匹配的Mycobacterium_chelonae序列以 及第二匹配的序列其堿基匹配數(shù)的差異為14，該指標(biāo)很好的反映了測(cè)序結(jié)果的 可信性，因?yàn)槿绻谝慌c第二匹配的序列差異太小即有可能是測(cè)序質(zhì)量或堿基 判讀問題導(dǎo)致的軟件結(jié)杲誤判。
根據(jù)發(fā)明的分支桿菌鑒定方法具有如下優(yōu)點(diǎn)。
(1) 由于4艮據(jù)多種分支桿菌的標(biāo)志序列的保守區(qū)賴::沒計(jì)PCR引物，因此所 有的PCR和測(cè)序只需一對(duì)引物，大大減少了實(shí)驗(yàn)種所需要的寡核苷酸的數(shù)量。
(2) 本發(fā)明的這對(duì)引物選擇的105種分支桿菌基本覆蓋了目前所有的分支 桿菌類型，而且16srDNA是高度保守區(qū)域。由此，若數(shù)據(jù)庫中的分支桿菌如果 有增加， 一般情況下，這對(duì)引物也可以把他們擴(kuò)增出來，因此所述引物的普適 性很好。
(3 )將測(cè)序圖譜轉(zhuǎn)換為文本格式，通過判定其與分支桿菌標(biāo)準(zhǔn)序列的匹配 度及確信度來鑒定待測(cè)分支桿菌的類型，省略了需要有生物學(xué)基礎(chǔ)和生物信息 學(xué)分析能力的通過對(duì)測(cè)序圖譜需行比對(duì)、判斷來判定分支桿菌的類型。使得一 般工作人員也可進(jìn)行分支桿菌的鑒定。
(4)通過算法來實(shí)現(xiàn)待測(cè)序列與標(biāo)準(zhǔn)序列的快速鑒定，還通過確信度對(duì)鑒 定結(jié)果進(jìn)行可靠性的分析。因此，本發(fā)明的鑒定方法適合應(yīng)用于臨床。(5)該方法培養(yǎng)后只需1天時(shí)間進(jìn)行鑒定實(shí)驗(yàn)，比原來做生化指標(biāo)的鑒定 提高了效率，縮短了鑒定時(shí)間，有利于臨床檢驗(yàn)
本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)清楚，本發(fā)明可以以許多其他具體的形式實(shí)現(xiàn)而 不脫離發(fā)明的精神或范圍。具體的，應(yīng)理解本發(fā)明可以以下列形式實(shí)現(xiàn)。
實(shí)施例中，DNA序列不限于沉降系數(shù)為16s的rDNA,而是可為其他DNA 序列。
實(shí)施例中，構(gòu)成分支桿菌序列數(shù)據(jù)庫中的分支桿菌的數(shù)量并不限于105種， 而可為其j也數(shù)量。
實(shí)施例中，并不一定需要將測(cè)序圖語轉(zhuǎn)換成文本格式，其要其格式與所述 分支桿菌序列數(shù)據(jù)庫的rDNA序列灼格式一致。
在此的例子及實(shí)施例應(yīng)認(rèn)為是說明性的而非限制性的，并且本發(fā)明不限于 在此給出的細(xì)節(jié)，而是可在附屬權(quán)利要求的范圍之內(nèi)進(jìn)行修改。序列表
<110>上海天昊生物科技有限公司 <120>分支桿菌的鑒定方法
<130> 090430
<160> 3
<170> Patentln version 3.1
<210> 1
<211> 828
<212> DM
<213> mycobacteri咖 <400> 1
ttttgtttggagagtttgatcctggctcaggacg犯cgctggcggcgtgcttaacacatg60
caagtcgaacggaaaggtctcttcggagatactcgagtggcgaacgggtgagtaacacgt120
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權(quán)利要求
1. 一種分支桿菌的鑒定方法，其特征在于，包括如下步驟a)獲取多種分支桿菌的多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)rDNA序列，以生成分支桿菌序列數(shù)據(jù)庫；b)對(duì)所述多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)rDNA序列進(jìn)行比對(duì)，得到這些rDNA序列共有的保守區(qū)段；c)根據(jù)所述保守區(qū)段制備一對(duì)PCR引物；d)使用所述PCR引物對(duì)待測(cè)分支桿菌的DNA溶液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而得到所述待測(cè)分支桿菌的擴(kuò)增產(chǎn)物；e)對(duì)所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，得到測(cè)序產(chǎn)物；f)對(duì)所述測(cè)序產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，得到待測(cè)分支桿菌的rDNA序列；g)通過比較所述待測(cè)序列和所述分支桿菌序列數(shù)據(jù)庫中的標(biāo)準(zhǔn)序列，確定所述待測(cè)分支桿菌的類型。
2. 如權(quán)利要求1所述的分支桿菌的鑒定方法，其特征在于，步驟c)中，所述 制備包括使得所述引物的3 '端的磁基與所述多種分支桿菌的rDNA序列匹配。
3. 如權(quán)利要求2所述的分支桿菌的鑒定方法，其特征在于，所述一對(duì)PCR引物 包^舌上游PCR SI物agagtttgatcctggctcag和下游PCR S1物ttgtcgcgttgttcgtgaaa。
4. 如權(quán)利要求l所述的分支桿菌的鑒定方法，其特征在于，步驟(d)中，還包 括對(duì)所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化。
5. 如權(quán)利要求l所述的分支桿菌的鑒定方法，其特征在于，步驟(e)中，將所 述上游PCR引物的濃度稀釋到luM，對(duì)所述純化產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。
6. 如權(quán)利要求5所述的分支桿菌的鑒定方法，其特征在于，步驟e)中，還包 括對(duì)所述經(jīng)測(cè)序反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行乙醇沉淀。
7. 如權(quán)利要求6所述的分支桿菌的鑒定方法，其特征在于，步驟e)中，還包 括對(duì)所述經(jīng)乙醇沉淀的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)^f亍甲酰胺變性。
8. 如權(quán)利要求7所述的分支桿菌的鑒定方法，其特征在于，步驟f)中，通過毛 細(xì)管電泳進(jìn)行所述測(cè)序分析，得到所述待測(cè)分支桿菌的測(cè)序圖譜。
9. 如權(quán)利要求8所述的分支桿菌的鑒定方法，其特征在于，步驟f)還包括將所 述測(cè)序圖語轉(zhuǎn)換為與所述分支桿菌序列數(shù)據(jù)庫中的標(biāo)準(zhǔn)rDNA序列的格式相 同的才各式。
10. 如權(quán)利要求1所述的分支桿菌的鑒定方法，其特征在于，步驟g)包括如下 步驟(1) 獲得所述分支桿菌序列數(shù)據(jù)庫中與所述對(duì)待測(cè)序列最匹配的所 述標(biāo)準(zhǔn)序列；(2) 獲得待測(cè)序列與標(biāo)準(zhǔn)序列的共享石咸基的百分比，所述百分比定 義為匹配度；(3 ) 根據(jù)所述匹配度對(duì)所述分支桿菌序列數(shù)據(jù)庫中的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行 序，匹配度排序第 一的序列判定為待測(cè)分支桿菌的類型。
11. 如權(quán)利要求10所述的分支桿菌的鑒定方法，其特征在于，步驟(3)還包括 獲得相鄰兩位匹配度排序的兩條標(biāo)準(zhǔn)序列共享威基數(shù)的差，所述差定義為確 信度；并且根據(jù)所述確信度對(duì)所述匹配度進(jìn)行校正。
全文摘要
本發(fā)明揭露了一種分支桿菌的鑒定方法，包括如下步驟獲取多種分支桿菌的多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)序列，以生成分支桿菌序列數(shù)據(jù)庫。對(duì)所述多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)，得到這些序列共有的保守區(qū)段。根據(jù)所述保守區(qū)段制備一對(duì)PCR引物。使用所述PCR引物對(duì)待測(cè)分支桿菌的DNA溶液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而得到所述待測(cè)分支桿菌的擴(kuò)增產(chǎn)物。對(duì)所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，得到測(cè)序產(chǎn)物。對(duì)所述測(cè)序產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，得到待測(cè)分支桿菌的序列。通過比較所述待測(cè)序列和所述分支桿菌序列數(shù)據(jù)庫中的標(biāo)準(zhǔn)序列，確定所述待測(cè)分支桿菌的類型。由于根據(jù)多種分支桿菌的標(biāo)志序列的保守區(qū)段設(shè)計(jì)PCR引物，因此所有的PCR和測(cè)序只需一對(duì)引物，大大減少了實(shí)驗(yàn)種所需要的寡核苷酸的數(shù)量。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101532053SQ20081020743
公開日2009年9月16日 申請(qǐng)日期2008年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月19日
發(fā)明者達(dá) 丁, 軍 樂, 一 王 申請(qǐng)人:上海天昊生物科技有限公司