專利名稱：：用于沙門氏菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌復(fù)合增菌的培養(yǎng)基及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于致病菌的前增菌培養(yǎng)基，特別是涉及一種同時(shí)對(duì)沙門氏菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌復(fù)合增菌的培養(yǎng)基及其制備方法。
背景技術(shù)：
：我國(guó)是世界上畜牧業(yè)生產(chǎn)大國(guó)，肉產(chǎn)量居世界第一，國(guó)內(nèi)人均肉類占有量達(dá)到58千克，高于世界40千克的平均水平。隨著經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)，食物消費(fèi)發(fā)生了變化，畜產(chǎn)品消費(fèi)量的快速增加，這種變化對(duì)肉類食品的質(zhì)量安全要求有了更高、更迫切的要求。在已知的致病菌中，沙門氏菌(5W/wo恥Wa)、金黃色葡萄球菌(Sto;A少/ococcusciwew)、單核細(xì)胞增生李斯特菌(丄加er^wo"oo^取脫"經(jīng)常出現(xiàn)在各類肉制品中，有較高的致病率和致死率，是國(guó)家常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目。根據(jù)國(guó)家食源性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)的統(tǒng)計(jì)資料顯示，近10年來(lái)，在我國(guó)由微生物引起的食源性疾病事件中，沙門氏菌、金黃色葡萄球菌分別占117.9%和8.9%，是最常見(jiàn)和最主要的病因物質(zhì)。據(jù)美國(guó)疾病控制中心報(bào)告，由金黃色葡萄球菌引起的感染占世界第二位，僅次于大腸桿菌。在美國(guó)國(guó)內(nèi)由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒占整個(gè)細(xì)菌性食物中毒的33%。就單增李斯特菌而言，外國(guó)的調(diào)查表明各類產(chǎn)品中，新鮮肉類、肉類日制品和熟食肉類制品含有單增李斯特菌的比例最高，而國(guó)內(nèi)發(fā)現(xiàn)肉類制品污染單增李斯特菌的比例最高。因此，通過(guò)控制和阻止沙門氏菌、金黃色葡萄球菌及單增李斯特菌來(lái)改善食品供應(yīng)的安全受到高度重視。在食品分配銷售之前，快速準(zhǔn)確的檢測(cè)這三種菌是必要的、有時(shí)甚至是強(qiáng)制的。盡管諸如基于抗體，核酸，生物傳感器的現(xiàn)代檢測(cè)方法已經(jīng)大大提高了致病菌的檢測(cè)速度，但能夠滿足的檢測(cè)靈敏度仍然要求一個(gè)前增菌步驟。現(xiàn)今的研究側(cè)重于強(qiáng)調(diào)在一個(gè)檢測(cè)平臺(tái)上檢測(cè)多個(gè)致病菌，例如多重PCR技術(shù)、蛋白或抗體微陣列感受器、免疫吸收及DNA微陣列等技術(shù)。多重致病菌的檢測(cè)方法經(jīng)濟(jì)實(shí)效，因?yàn)樗梢詼p少處理大量樣品儀器所占用的空間、供應(yīng)物、試劑、員工，從而減少總的成本。為了加快多種致病菌在同一檢測(cè)平臺(tái)上的共檢，一種合適的復(fù)合增菌培養(yǎng)基是急需的。營(yíng)養(yǎng)肉湯等前增菌肉湯是經(jīng)濟(jì)的，但是缺乏抑制劑去選擇目標(biāo)菌，不合適于高背景微生物的原材料及未經(jīng)處理的樣品。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明旨在提供可以同時(shí)支持沙門氏菌，金黃色葡萄球菌及單核細(xì)胞增生李斯特菌三種食源性疾病的同時(shí)生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，將常規(guī)檢測(cè)方法中的前增菌步驟和選擇性增菌步驟合二為一，用于在一個(gè)檢測(cè)平臺(tái)上檢測(cè)多個(gè)致病菌。本發(fā)明通過(guò)選擇合適的組分，并進(jìn)行合理混配，經(jīng)加熱、溶解、混合、高溫滅菌等步驟而獲得一種使沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌及金黃色葡萄球菌復(fù)合增菌的培養(yǎng)基。本發(fā)明選擇的配方如下胰蛋白胨17份、蛋白胨3份、磷酸二氫鈉2.5份、葡萄糖2.5份、七葉苷1.0份、蒸餾水1000份、丙酮酸鈉2.5份、甘露醇5.0份、氯化鈉20.0份、氯化鋰2.0份、亞碲酸鉀0.00015份、萘啶酮酸0.01份，pH值7.2-7.3。本培養(yǎng)基含有抑制劑氯化鋰、亞碲酸鉀及萘啶酮酸。其中萘啶酮酸抑制革蘭氏陰性菌的生長(zhǎng)，但是對(duì)沙門氏菌的抑制作用不明顯，氯化鋰對(duì)三種目標(biāo)菌沒(méi)有明顯的沒(méi)有抑制作用，但對(duì)綠膿桿菌、志賀氏菌、小腸耶爾森氏菌等有抑制作用。亞碲酸鉀對(duì)大腸桿菌及蠟樣芽孢桿菌有抑制作用。三種抑制劑的添加可以起到抑制背景微生物的生長(zhǎng)，使目標(biāo)菌有較好的生長(zhǎng)。三種菌對(duì)氯化鈉的耐受性能好，提高其用量，抑制其他微生物的生長(zhǎng)。磷酸二氫鉀用于調(diào)節(jié)pH。胰蛋白胨、蛋白胨、葡萄糖、丙酮酸鈉是培養(yǎng)基中基本的營(yíng)養(yǎng)和支持成分。七葉苷、甘露醇分別用于促進(jìn)單增李斯特菌及金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)。標(biāo)本接種后，在37C培養(yǎng)，增菌24小時(shí)后，劃線到三種目標(biāo)菌各自的選擇性培養(yǎng)基上，分離鑒別。本發(fā)明的制備方法是l)將胰蛋白胨、蛋白胨、葡萄糖、磷酸二氫鉀、甘露醇、丙酮酸鈉、氯化鈉、七葉苷、氯化鋰、按配比加入到990份蒸鎦水中，加熱溶解，冷卻至室溫后，矯正pH值為7.2-7.3。(2)混勻，121。C滅菌15min;(3)稱取0.01份萘啶酮酸加入到5份濃度為0.05mol/L的氫氧化鈉溶液中，得到萘啶酮酸溶液。稱取0.00015份亞碲酸鉀加入到5份以滅菌的蒸餾水中，得到亞碲酸鉀溶液。(4)在無(wú)菌條件下，加入步驟3中配制的萘啶酮酸溶液5份及亞碲酸鉀溶液5份；分裝存于4'C下備用。相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)本培養(yǎng)基可融合致病菌的前增菌及選擇性增菌兩個(gè)步驟，縮短增菌時(shí)間至24小時(shí)；使得三種常見(jiàn)的致病菌同時(shí)增菌而其他的致病微生物生長(zhǎng)受到一定的抑制；本發(fā)明的培養(yǎng)物可以直接做目標(biāo)菌的分離培養(yǎng)及生物鑒定實(shí)驗(yàn)，也可以直接用于多重PCR檢測(cè)，作出診斷報(bào)告。圖1是沙門氏菌熒光PCR檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果圖。圖2是沙門氏菌熒光PCR檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果圖。圖3是沙門氏菌熒光PCR檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果圖。具體實(shí)施例方式為更好理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步地詳細(xì)說(shuō)明，但是本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不局限于實(shí)施例表示的范圍。實(shí)施例1:稱取胰蛋白胨17g、蛋白胨3g、磷酸二氫鈉2.5g、葡萄糖2.5g、七葉苷l(shuí)g、丙酮酸鈉2.5g、甘露醇5g、氯化鈉20g、氯化鋰2g、蒸餾水加至990ml，加熱溶解，冷卻到室溫后矯正pH值至7.2-7.3;混勻，121'C滅菌15min;稱取lOmg萘啶酮酸加入到5ml濃度為0.05mol/L的氫氧化鈉溶液中，得到萘啶酮酸溶液。稱取0.15mg亞碲酸鉀加入到5ml以滅菌的蒸餾水中，配成亞碲酸鉀溶液。在無(wú)菌條件下，加入萘啶酮酸溶液5ml及亞碲酸鉀溶液5mh分裝存于4°C下備用，制得用于沙門氏菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌復(fù)合增菌的培養(yǎng)基。將制備的用于沙門氏菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌復(fù)合增菌的培養(yǎng)基分別接入稀釋到104的沙門氏菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌三種目標(biāo)菌及雜菌(表1中)的菌液0.2ml,37'C培養(yǎng)24h。用可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定540nm下的OD值。以營(yíng)養(yǎng)肉湯為空白對(duì)照。結(jié)果見(jiàn)表l。表l目標(biāo)菌及雜菌單獨(dú)在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表中，x表示菌體不生長(zhǎng)，O號(hào)為空白對(duì)照，l-3號(hào)為三個(gè)重復(fù)。由表1可知，將沙門氏菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌三種目標(biāo)菌及雜菌單獨(dú)接入到復(fù)合增菌液中，經(jīng)24小時(shí)增菌復(fù)合增菌液對(duì)目標(biāo)菌的增菌效果與無(wú)選擇性的營(yíng)養(yǎng)肉湯相當(dāng)，而雜菌在復(fù)合增菌液中的不生長(zhǎng)或生長(zhǎng)受抑制。實(shí)施例2:稱取胰蛋白胨17g、蛋白胨3g、磷酸二氫鈉2.5g、葡萄糖2.5g、七葉苷l(shuí)g、丙酮酸鈉2.0g、甘露醇10g、氯化鈉25g、氯化鋰2.5g、蒸餾水加至990ml，加熱溶解，冷卻到室溫后矯正pH值至7.2-7.3;混勻，121。C滅菌15min;稱取15mg萘啶酮酸加入到5ml濃度為0.05md/L的氫氧化鈉溶液中，得到萘啶酮酸溶液。稱取0.2mg亞碲酸鉀加入到5ml以滅菌的蒸餾水中，配成亞碲酸鉀溶液。在無(wú)菌條件下，加入萘啶酮酸溶液5ml及亞碲酸鉀溶液5ml;分裝存于4'C下備用，制得用于沙門氏菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌復(fù)合增菌的培養(yǎng)基。將制備的用于沙門氏菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌復(fù)合增菌的培養(yǎng)基分別接入稀釋到104的三種目標(biāo)菌及雜菌(見(jiàn)表2)的菌液0.2ml，37'C培養(yǎng)24h。用可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定540nm下的OD值。同時(shí)將菌體接入營(yíng)養(yǎng)肉湯中做空白對(duì)照。表2目標(biāo)菌及雜菌單獨(dú)在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況0123沙門氏菌1.218U341.0891.021金黃色葡萄球菌1.2130，0.9871.012單增李斯特菌1.0390.978l屈0扁大腸桿菌1.4230.5340.4560.601蠟樣芽孢桿菌1.342XXX小腸耶爾森氏菌1.123XXX變形桿菌1.4820.6230.4300.402產(chǎn)氣腸桿菌1.221XXX凈雖氏志賀菌1.342XXX鮑氏志賀菌1.345XxX綠膿桿菌1.231XX表中，x表示菌體不生長(zhǎng)，O號(hào)為空白對(duì)照，l-3號(hào)管為三個(gè)重復(fù)。由表2可知，將沙門氏菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌三種菌單獨(dú)接入到增菌液中，經(jīng)24小時(shí)增菌與無(wú)選擇性的營(yíng)養(yǎng)肉湯有相當(dāng)?shù)脑鼍Ч?。雜菌生長(zhǎng)受抑制或受部分抑制，可減少背景微生物對(duì)目標(biāo)菌生長(zhǎng)的影響。實(shí)施例3:稱取胰蛋白胨17g、蛋白胨3g、磷酸二氫鈉2.5g、葡萄糖2.5g、七葉苷l(shuí)g、丙酮酸鈉lg、甘露醇3g、氯化鈉10g、氯化鋰2.5g、蒸餾水加至990ml，加熱溶解，冷卻到室溫后矯正pH值至7.2-7.3;混勻，12rC滅菌15min;稱取5mg萘啶酮酸加入到5ml濃度為0.05mol/L的氫氧化鈉溶液中，得到萘啶酮酸溶液。稱取0.05mg亞碲酸鉀加入到5ml以滅菌的蒸餾水中，配成亞碲酸鉀溶液。在無(wú)菌條件下，加入萘啶酮酸溶液5ml及亞碲酸鉀溶液5ml;分裝存于4'C下備用，制得用于沙門氏菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌復(fù)合增菌的培養(yǎng)基。將制備的用于沙門氏菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌復(fù)合增菌的培養(yǎng)基分別接入稀釋到10—4的沙門氏菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌三種目標(biāo)菌及雜菌(見(jiàn)表3)的菌液0.2ml，37'C培養(yǎng)24h。用可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定540nm下的OD值。同時(shí)將菌體接入營(yíng)養(yǎng)肉湯中做空白對(duì)照。表3目標(biāo)菌及雜菌單獨(dú)在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表中，x表示菌體不生長(zhǎng)，O號(hào)為空白對(duì)照，1-3號(hào)管為沙門氏菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌三個(gè)重復(fù)。由本表可知，將三種菌單獨(dú)接入到增菌液中，經(jīng)24小時(shí)增菌與無(wú)選擇性的營(yíng)養(yǎng)肉湯有相當(dāng)?shù)脑鼍Ч６s菌在復(fù)合增菌液中的不生長(zhǎng)或生長(zhǎng)受抑制。實(shí)施例4:按實(shí)施例l配制培養(yǎng)基，按沙門氏菌單增李斯特菌金黃色葡萄球菌的比例為1:1:I接入培養(yǎng)基中，37'C培養(yǎng)24小時(shí)候，將菌液稀釋到10—6，分別涂布到BS瓊脂平板，MMA瓊脂平板及B-P平板上，進(jìn)行分離培養(yǎng)。沙門氏菌在BS瓊脂上為墨綠色圓形菌落，金葡菌和單增李斯特菌不生長(zhǎng)。在B-P平板上金葡菌為黑色菌落，沙門菌劑李斯特菌不生長(zhǎng)。用白熾燈45度照射MMA平板，李斯特菌為灰藍(lán)或藍(lán)色小的圓形菌落，沙門菌和金葡菌不生長(zhǎng)。生長(zhǎng)結(jié)果見(jiàn)表4。表4復(fù)合增菌培養(yǎng)基增菌效果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由本表可知，經(jīng)過(guò)24小時(shí)增菌，菌體可增多至105至106，可以滿足后期檢測(cè)的菌濃度要求。實(shí)施例5:按實(shí)施例l配制培養(yǎng)基。在無(wú)菌條件下，將雞脯肉、牛肉、豬肉(經(jīng)熒光PCR鑒定不含三種目標(biāo)菌)分別制備成25g粉碎。將大約3Xl(^CFU/g的培養(yǎng)物被接種于樣品中，室溫下處理15min，使細(xì)菌被吸收，然后將其放入含有225ml的自制培養(yǎng)基的無(wú)菌袋中，混合2min。均勻好的樣品接種后37'C培養(yǎng)24小時(shí)。用酚/氯仿法提取細(xì)菌的DNA，用沙門氏菌、金黃色葡萄球菌及單增李斯特菌熒光PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖1至圖3，可見(jiàn)三種目標(biāo)菌均出現(xiàn)明顯的DNA擴(kuò)增曲線，說(shuō)明復(fù)合增菌培養(yǎng)基使得樣品中的沙門氏菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌三種目標(biāo)菌同時(shí)增長(zhǎng)，并達(dá)到PCR檢測(cè)的菌濃度要求，證明經(jīng)復(fù)合增菌培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)后，可用于PCR檢驗(yàn)，滿足其檢測(cè)限的要求。權(quán)利要求1、用于沙門氏菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌復(fù)合增菌的培養(yǎng)基，其特征在于，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)，其配方組成為胰蛋白胨15-19份、蛋白胨2-4份、磷酸二氫鈉2-3份、葡萄糖2-3份、七葉苷0.5-1.5份、蒸餾水1000份、丙酮酸鈉1-2.5份、甘露醇3-10.0份、氯化鈉1.0-25.0份、氯化鋰1-2.5份、亞碲酸鉀0.0001-0.0002份、萘啶酮酸0.005-0.015份，pH值為7.1-7.5。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基的的配方為胰蛋白胨17份、蛋白胨3份、磷酸二氫鈉2.5份、葡萄糖2.5份、七葉苷1.0份、蒸餾水1000份、丙酮酸鈉2.5份、甘露醇5.0份、氯化鈉20.0份、氯化鋰2.0份、亞碲酸鉀0.00015份、萘啶酮酸0.010份，pH值7.2-7.3。3、權(quán)利要求1所述用于沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌及金黃色葡萄球菌復(fù)合增菌的培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)按照權(quán)利要求1所述的配方，將胰蛋白胨、蛋白胨、葡萄糖、磷酸二氫鉀、甘露醇、丙酮酸鈉、氯化鈉、七葉苷、氯化鋰加入到990份蒸餾水中，加熱至溶解，冷卻至室溫后，矯正pH值至7.2-7.3;(2)混勻，121-125'C滅菌15-18min;(3)按權(quán)利要求1稱取萘啶酮酸加入到5份濃度為0.05mol/L的氫氧化鈉溶液中，得到萘淀酮酸溶液；按權(quán)利要求1稱取亞碲酸鉀加入到5份以滅菌的蒸餾水中，得到亞碲酸鉀溶液；(4)在無(wú)菌條件下，加入步驟(3)中配制的萘啶酮酸溶液及亞碲酸鉀溶液；分裝存于4-6。C下備用。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了用于沙門氏菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌復(fù)合增菌的培養(yǎng)基及制備方法，該培養(yǎng)基包括胰蛋白胨15-19份、蛋白胨2-4份、磷酸二氫鈉2-3份、葡萄糖2-3份、七葉苷0.5-1.5份、蒸餾水1000份、丙酮酸鈉1-2.5份、甘露醇3-10.0份、氯化鈉1.0-25.0份、氯化鋰1-2.5份、亞碲酸鉀0.0001-0.0002份、萘啶酮酸0.005-0.015份，pH值為7.1-7.5。本培養(yǎng)基在使得三種目標(biāo)致病菌同時(shí)增菌的同時(shí)，抑制其它的致病微生物生長(zhǎng)，可直接做目標(biāo)菌的分離培養(yǎng)及生物鑒定實(shí)驗(yàn)，也可以直接用于多重PCR等基于一個(gè)檢測(cè)平臺(tái)的多個(gè)致病菌的檢測(cè)技術(shù)中，作出診斷報(bào)告。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101412978SQ20081021941公開(kāi)日2009年4月22日申請(qǐng)日期2008年11月25日優(yōu)先權(quán)日2008年11月25日發(fā)明者余以剛,劉園園,暉吳,李蘇龍,肖性龍申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)