專(zhuān)利名稱(chēng)：凝固酶陰性葡萄球菌的多肽及多核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明涉及微生物學(xué)及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地涉及預(yù)防，治療或診斷人或動(dòng)物的凝固酶陰性葡萄球菌感染的生物學(xué)制品。
本發(fā)明的背景葡萄球菌是革蘭氏陽(yáng)性球狀細(xì)胞，通常以葡萄狀不規(guī)則簇排列。一些葡萄球菌是人類(lèi)粘膜和皮膚的正常菌群成員，而其他的會(huì)引起化膿，膿腫，及多種化膿感染，甚至?xí)鹬旅臄⊙Y。致病的葡萄球菌常常使紅細(xì)胞溶解，血漿凝固并產(chǎn)生大量細(xì)胞外酶和毒素。最常見(jiàn)的食物中毒是由熱穩(wěn)定的葡萄球菌腸毒素引起的。葡萄球菌至少有30種。臨床上很重要的三個(gè)主要品種是金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，表皮葡萄球菌(atephylococcus epidermidis)，腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)。金黃色葡萄球菌是凝固酶陽(yáng)性的，這一點(diǎn)使它與其他品種區(qū)分開(kāi)來(lái)。金黃色葡萄球菌是人類(lèi)主要的致病菌。一生中幾乎每個(gè)人都會(huì)經(jīng)歷一些種類(lèi)的金黃色葡萄球菌感染，其嚴(yán)重程度包括食物中毒或輕度皮膚感染到嚴(yán)重危及生命的感染。
凝固酶陰性葡萄球菌是常見(jiàn)的有時(shí)引起感染的人類(lèi)菌群，并常常與植入裝置有關(guān)，特別在很年輕，年老及免疫系統(tǒng)損害的患者中。由凝固酶陰性葡萄球菌引起的感染中約75％是由表皮葡萄球菌引起的。由Staphylococcus warneri,Staphylococcushominis及其他品種引起的感染較少見(jiàn)。在年輕的婦女中腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)是相對(duì)常見(jiàn)的尿道感染病因。葡萄球菌產(chǎn)生過(guò)氧化酶，這一點(diǎn)使其與鏈球菌區(qū)別開(kāi)來(lái)。
金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌都有在修復(fù)醫(yī)療裝置部位，包括血管內(nèi)導(dǎo)管，腦脊髓液體分流管，血液透析分流器，血管移植，及長(zhǎng)期配戴的隱形眼鏡處入侵皮膚和相鄰組織的特征性?xún)A向。在48到72小時(shí)內(nèi)，在這些外源物插入部位可鑒定到相當(dāng)大量的葡萄球菌[Archer,G.L.,Remington,J.S.，等人，“在傳染疾病中最新臨床課題”，McGraw-Hill,NY,25-46,1986)。
表皮葡萄球菌是人類(lèi)皮膚上無(wú)致病力的共生生物體，是外周及中心靜脈導(dǎo)管，修復(fù)心臟瓣膜，人造關(guān)節(jié)和其他修復(fù)裝置感染的主要病因介質(zhì)。已經(jīng)得到論證是，表皮葡萄球菌細(xì)胞附著并在導(dǎo)管內(nèi)或外表面增殖-與導(dǎo)管的組成無(wú)關(guān)-無(wú)論是它們是聚乙烯，聚氯乙烯，聚氟乙烯還是聚酯基的。
留置醫(yī)療裝置的初始定位感染會(huì)引發(fā)更嚴(yán)重的入侵性感染如敗血癥，骨髓炎和心內(nèi)膜炎。當(dāng)微生物進(jìn)入到這些裝置，然后其就進(jìn)入血流，通過(guò)由皮膚表面向下移動(dòng)到導(dǎo)管的經(jīng)皮部分時(shí)，導(dǎo)管就可認(rèn)為被感染了。在涉及醫(yī)療裝置的感染中，在移植后很短時(shí)間中塑料和金屬表面被宿主血漿和基質(zhì)蛋白質(zhì)覆蓋，如血纖蛋白原，玻連蛋白，纖連蛋白。表皮葡萄球菌菌血癥會(huì)導(dǎo)致額外8天的住院，這是相當(dāng)昂貴的。
盡管凝固酶陰性葡萄球菌的致病力在存在外源物時(shí)被增強(qiáng)了，但使得這些正常皮膚共生物變成疾病病原體的微生物因素還沒(méi)有很好地被進(jìn)行說(shuō)明。凝固酶陰性表皮葡萄球菌附著這些蛋白質(zhì)的能力是初始感染的重要因素。因?yàn)檎J(rèn)為附著是凝固酶陰性葡萄球菌外源物感染的發(fā)病機(jī)理中重要的第一步，注意力已集中在可能調(diào)節(jié)對(duì)聚合物修復(fù)物質(zhì)的附著并集落化的這些生物體的表面特性上。
有很多因素影響生物體附著修復(fù)物質(zhì)的能力。這些因素包括微生物和生物物質(zhì)的特性和周?chē)h(huán)境的性質(zhì)。生物體和宿主之間的初始吸引作用受到非特異力的影響，如表面電荷，極性，范德華力和疏水作用。附著作用的重要階段包括細(xì)胞表面附著因子和固定宿主蛋白質(zhì)之間的特異作用。目前，有關(guān)表皮葡萄球菌對(duì)生物物質(zhì)的附著作用的研究已首先涉及了細(xì)胞外多糖或胞外被多糖，也稱(chēng)為粘液的作用。然而，盡管進(jìn)行了集中研究，被提議的疾病的發(fā)病機(jī)理中粘液的作用或其組成仍然有爭(zhēng)論(Drewry等人，臨床微生物學(xué)28:1292-1296,1990)。目前所認(rèn)為的是，在感染的持續(xù)及附著的晚期階段中細(xì)胞外粘液起著作用。其可能作為離子交換樹(shù)脂而優(yōu)化局部營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，阻止抗生素滲入到大型集落中或保護(hù)細(xì)菌不受噬菌宿主防衛(wèi)細(xì)胞的影響。Peters等人通過(guò)電子顯微鏡研究已發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外多糖出現(xiàn)在附著作用的晚期階段，在附著作用的初始階段并不存在(J.Infect.Dis.,65146:479-482,1982)。Hogt等人認(rèn)為通過(guò)反復(fù)沖洗除去細(xì)胞外粘液層沒(méi)有消除表皮葡萄球菌對(duì)生物物質(zhì)的附著能力(J.Gen.Microbiol.129:2959-2968,1983)。
迄今，對(duì)細(xì)胞外多糖的研究對(duì)預(yù)防細(xì)菌的初始附著作用沒(méi)有什么幫助。幾種其他研究已確定了表皮葡萄球菌其他可能的附著因子，包括有Tojo等人(J.Infect.Dis.,157:317-722,1988)觀察到的多糖附著因子(PS/A)和Christensen等人(Infect.Immun.,58:2906-2911,1990)發(fā)現(xiàn)的粘液伴隨抗原(SAA)。
已論證的是PS/A是阻斷PS/A附著產(chǎn)生表皮葡萄球菌菌株的單糖附著因子的復(fù)合混合物。在對(duì)抗PS/A的心內(nèi)膜炎抗體的動(dòng)物模式中是保護(hù)性的。然而，這種保護(hù)性作用是否是特異性的，是否涉及抗體的抗附作用，或是否由于血液生細(xì)菌的調(diào)理噬菌作用的效率的更廣泛的增加還不清楚。已假設(shè)認(rèn)為，每種附著因子在有著一種或多種決定初始吸引作用的這些附著因子的附著過(guò)程的不同階段中起著作用，而其他的是大型集落中聚集作用必需的。
盡管進(jìn)行了許多研究，對(duì)涉及表皮葡萄球菌對(duì)生物物質(zhì)的初始附著作用的因素仍然沒(méi)有很多了解。進(jìn)一步不為人所知的是對(duì)預(yù)防感染的第一步，即附著或粘著有實(shí)際應(yīng)用意義的方法。因此，需要對(duì)細(xì)菌附著因子蛋白質(zhì)和編碼蛋白質(zhì)的基因進(jìn)行發(fā)現(xiàn)和描述。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供凝固酶陰性葡萄球菌的細(xì)胞壁伴隨胞外基質(zhì)結(jié)合蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供凝固酶陰性葡萄球菌表面蛋白，其能夠抑制葡萄球菌與固定化的胞外基質(zhì)的粘著或抑制植入生物物質(zhì)表面存在的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供凝固酶陰性葡萄球菌疫苗，產(chǎn)生對(duì)凝固酶陰性葡萄球菌蛋白質(zhì)的抗血清和抗體，分離凝固酶陰性葡萄球菌的抗體。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供在臨床和實(shí)驗(yàn)室設(shè)置中檢測(cè)及區(qū)別凝固酶陰性葡萄球菌生物體的改進(jìn)物質(zhì)和方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供針對(duì)凝固酶陰性葡萄球菌的核酸探針和特異性引物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供對(duì)凝固酶陰性葡萄球菌敏感及特異的細(xì)菌感染的檢測(cè)，診斷，治療或監(jiān)測(cè)治療進(jìn)展的方法。
看過(guò)下列對(duì)公開(kāi)實(shí)施方案的詳細(xì)描述及所附權(quán)利要求書(shū)后，本發(fā)明的這些及其他目的，特性及優(yōu)點(diǎn)會(huì)變得明顯可見(jiàn)。
本發(fā)明的概述本發(fā)明提供了從凝固酶陰性葡萄球菌分離的蛋白質(zhì)和它們相應(yīng)的氨基酸和核酸序列。蛋白質(zhì)稱(chēng)為SdrF,SdrG和SdrH。SdrF的DNA序列和蛋白質(zhì)SdrF的氨基酸序列(粗體)以及它們的側(cè)翼序列在圖2中給出。SdrG的DNA序列和蛋白質(zhì)SdrG的氨基酸序列(粗體)以及它們的側(cè)翼序列在圖3中給出。最后，SdrH編碼區(qū)域包括DNA和氨基酸序列在圖4中給出。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的是，在SdrF和SdrG的A區(qū)域中有高度保留的氨基酸序列，能用來(lái)衍生共有序列TYTFTDYVD基元。該基元能用在多組分疫苗中以產(chǎn)生對(duì)細(xì)菌感染的廣譜免疫，并且也可用來(lái)產(chǎn)生具有廣譜被動(dòng)免疫的單克隆或多克隆抗體。在一個(gè)可替換的實(shí)施方案中，從Sdr蛋白質(zhì)家族中衍生出的可變序列的任何組合，(T)(Y)(T)(F)(T)(D/N)(Y)(V)(D)，可用來(lái)產(chǎn)生免疫性或用來(lái)誘導(dǎo)保護(hù)性抗體。蛋白質(zhì)或其抗原部分被用來(lái)制備診斷凝固酶陰性葡萄球菌細(xì)菌感染的抗體，或用來(lái)為主動(dòng)或被動(dòng)免疫作用制備發(fā)展抗-凝固酶陰性葡萄球菌疫苗。當(dāng)給傷口服用或在體內(nèi)及體外用來(lái)覆蓋聚合生物物質(zhì)時(shí)，蛋白質(zhì)和其抗體都可用作阻斷劑，以預(yù)防或抑制凝固酶陰性葡萄球菌與傷口部位或與任何生物物質(zhì)的結(jié)合。SdrF,SdrG和SdrH蛋白質(zhì)可進(jìn)一步用作科學(xué)研究工具，以了解細(xì)菌病理學(xué)的機(jī)理和抗細(xì)菌治療的發(fā)展。
SdrF,SdrG和SdrH基因序列可用作核酸探針，以檢測(cè)及鑒別凝固酶陰性葡萄球菌細(xì)胞表面蛋白質(zhì)。核酸序列還可插入到載體中并置于微生物中以制備重組SdrF,SdrG和SdrH蛋白質(zhì)。這些Sdr蛋白質(zhì)的氨基酸序列在制備合成的SdrF,SdrG和SdrH蛋白質(zhì)或其部分，如共有序列或可變序列氨基酸基元中也是有用的。
本發(fā)明也提供了培養(yǎng)的抗SdrF,SdrG和SdrH蛋白質(zhì)或其部分，如共有序列或可變序列氨基酸基元的抗血清和抗體，和含蛋白質(zhì)的疫苗或其他藥物組合物。
此外，本發(fā)明也提供了含核酸分子，蛋白質(zhì)，培養(yǎng)的抗SdrF,SdrG和SdrH或其部分，如共有序列或可變序列氨基酸基元的抗體或抗血清的工具，以及與樣品反應(yīng)的適當(dāng)?shù)脑噭┑脑\斷試劑盒。
在本發(fā)明第一個(gè)實(shí)施方案中，多核苷酸包括編碼含圖2中所示序列的SdrF多肽的區(qū)域或其變體。
根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面，提供了編碼表達(dá)表皮葡萄球菌菌株9491的成熟多肽的分離核酸分子。
在本發(fā)明第二個(gè)實(shí)施方案中，多核苷酸包括編碼含圖3中所示序列的SdrG多肽的區(qū)域或其變體。
根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面，提供了編碼表達(dá)表皮葡萄球菌菌株K28的成熟多肽的分離核酸分子。
在本發(fā)明第三個(gè)實(shí)施方案中，多核苷酸包括編碼含圖4中所示序列的SdrH多肽的區(qū)域或其變體。
根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面，提供了編碼表達(dá)表皮葡萄球菌菌株9491的成熟多肽的分離核酸分子。
在本發(fā)明第四個(gè)實(shí)施方案中，有從含如圖2中所示的SdrF氨基酸序列的表皮葡萄球菌獲得的新型蛋白質(zhì)或其變體。
在本發(fā)明第五個(gè)實(shí)施方案中，有從含如圖3中所示的SdrG氨基酸序列的表皮葡萄球菌獲得的新型蛋白質(zhì)或其變體。
在本發(fā)明第六個(gè)實(shí)施方案中，有一種從含如圖4中所示的SdrH氨基酸序列的表皮葡萄球菌獲得的新型蛋白質(zhì)或其變體。
根據(jù)本發(fā)明的第四，第五和第六個(gè)實(shí)施方案，提供了編碼SdrF,SdrG或SdrH蛋白質(zhì)，特別是表皮葡萄球菌蛋白質(zhì)的分離核酸分子，包括mRNA,cDNA，基因組DNA。本發(fā)明這個(gè)方面的其他實(shí)施方案包括其在生物學(xué)，診斷學(xué)，預(yù)防學(xué)，臨床學(xué)，或治療學(xué)上有用的變體，以及包括這些變體的組合物。
在本發(fā)明第七個(gè)實(shí)施方案中，提供了本發(fā)明的多核苷酸在以治療或預(yù)防為目的方面的應(yīng)用，特別是基因免疫接種應(yīng)用。
在本發(fā)明第八個(gè)實(shí)施方案中是SdrF,SdrG和SdrH多肽或其部分，如共有序列或可變序列氨基酸基元的變體，由SdrF,SdrG或SdrH基因的自然產(chǎn)生的等位基因編碼。
根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方案，提供了表皮葡萄球菌的新型多肽，本文稱(chēng)為SdrF,SdrG或SdrH或其部分，如共有序列或可變序列氨基酸基元，以及其生物學(xué)，診斷學(xué)，預(yù)防學(xué)，臨床學(xué)或治療學(xué)上有用的變體，和含有這些變體的組合物。
在本發(fā)明第九個(gè)實(shí)施方案中，提供了制備前面提及的SdrF,SdrG或SdrH多肽或其部分，如共有序列或可變序列氨基酸基元的方法。
在本發(fā)明第十個(gè)實(shí)施方案中，提供了抗SdrF,SdrG或SdrH多肽或多核苷酸或其部分，如共有序列或可變序列氨基酸基元或編碼這些基元核酸的抗體。
在本發(fā)明第十一個(gè)實(shí)施方案中，提供了與SdrF,SdrG或SdrH多核苷酸序列或其部分，如共有序列或可變序列氨基酸基元雜交的多核苷酸，特別是在嚴(yán)謹(jǐn)嚴(yán)格條件下。
在本發(fā)明第十二個(gè)實(shí)施方案中，提供了給細(xì)胞或給多細(xì)胞生物體服用的含有SdrF,SdrG或SdrH多核苷酸或SdrF,SdrG或SdrH多肽或其部分，如共有序列或可變序列氨基酸基元的組合物。
在本發(fā)明公開(kāi)的精神和范圍內(nèi)的各種變化和修正對(duì)閱讀下列描述及閱讀本公開(kāi)的其他部分的此領(lǐng)域中的技術(shù)人員將是明顯可見(jiàn)的。
本發(fā)明附圖的簡(jiǎn)述

圖1表示表皮葡萄球菌菌株K28的SdrG蛋白質(zhì)。區(qū)域沿著構(gòu)建的頂部標(biāo)記，所公開(kāi)的蛋白質(zhì)的每個(gè)區(qū)域中發(fā)現(xiàn)的氨基酸數(shù)目在示圖中相應(yīng)區(qū)域下標(biāo)記。
圖2是SdrF的DNA序列和SdrF蛋白質(zhì)的氨基酸序列(粗體)以及它們的側(cè)翼序列。
圖3是SdrG的DNA序列和SdrG蛋白質(zhì)的氨基酸序列(粗體)以及它們的側(cè)翼序列。
圖4是SdrH編碼區(qū)域的DNA序列和SdrH蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
圖5表示金黃色葡萄球菌的Sdr蛋白質(zhì)和表皮葡萄球菌的Sdr蛋白質(zhì)之間的關(guān)系。圖5A是前面描述的金黃色葡萄球菌Sdr蛋白質(zhì)的示意圖；圖5B是SdrF,SdrG和SdrH的示意圖，表示它們的信號(hào)序列(S)，區(qū)域As(A)，區(qū)域B重復(fù)(Bn),SD-重復(fù)區(qū)域(SD)，區(qū)域C(C)(只對(duì)SdrH)，和壁/膜跨越區(qū)域(WM)的相對(duì)位置和/或大?。粓D5C表示SdrF,SdrG和SdrH的C-端氨基酸序列，表示SD重復(fù)序列，LPXTG基元(下劃線)，疏水膜-跨越區(qū)域(粗體)，和帶電終端殘基的位置。
圖6給出了表皮葡萄球菌菌株的Sdr基因，并演示了含有與編碼(A)SD-重復(fù)區(qū)域；(B)SdrH區(qū)域A；(C)SdrG區(qū)域A；(D)SdrG和SdrF區(qū)域As的DNA探針雜交的表皮葡萄球菌基因組DAN的Southern印跡。菌株如下1道，ATCC14990；2道，KH11；3道，K28；4道，RP62a；5道，TU3298；6道，9142；7道，1457；8道，8400；9道，N910308；10道，N910160；11道，N910102；12道，N910173；13道，N910191；14道，N910231；15道，N950249；菌株9491沒(méi)有演示。千堿基(kb)大小標(biāo)記在A-D圖面左邊顯示。
圖7顯示了重組Sdr區(qū)域A蛋白質(zhì)和它們分別的抗血清的特異性，如下(A)用來(lái)培養(yǎng)兔多克隆抗血清的純蛋白質(zhì)的考馬斯染色SDS-PAGE。1道和2道，分別為組氨酸標(biāo)記的SdrFA和SdrGA；3道，GST標(biāo)記的SdrHA；(B)左圖面混合抗-SdrFA,-SdrGA和-SdrHA抗血清對(duì)表達(dá)GST-標(biāo)記的SdrFA(1道)，SdrGA(2道)，SdrHA(3道)的E.coli溶胞物的反應(yīng)性。中間和右圖面抗-SdrFA，和-SdrGA抗血清分別對(duì)相同蛋白質(zhì)的反應(yīng)性；(C)左圖面抗-組氨酸單克隆抗體對(duì)表達(dá)組氨酸-標(biāo)記的SdrFA(1道)，SdrGA(2道)和全長(zhǎng)SdrH(3道)的E.coli溶胞物的反應(yīng)性。右圖面抗-SdrHA抗血清對(duì)相同蛋白質(zhì)的反應(yīng)性。千道爾頓(kDa)大小標(biāo)記在A,B和C圖面左邊顯示。
圖8顯示了表皮葡萄球菌Sdr蛋白質(zhì)表達(dá)的免疫印跡分析，包括(A)抗SdrFA抗血清對(duì)表皮葡萄球菌9491溶胞物的反應(yīng)性。1道，免疫抗血清；2道，免疫前抗血清；3道，SdrFA吸收的免疫抗血清；(B)抗SdrGA免疫(1道)，免疫前(2道)，和SdrGA吸收的免疫(3道)抗血清對(duì)表皮葡萄球菌菌珠K28溶胞物的反應(yīng)性；(C)抗SdrHA免疫(1道)和SdrHA吸收的免疫(2道)抗血清對(duì)表皮葡萄球菌9491溶胞物的反應(yīng)性。kDa大小標(biāo)記在A,B和C圖面左邊顯示。
圖9顯示了表皮葡萄球菌中SdrH蛋白質(zhì)大小變異的基因分析。包括(A)抗SdrHA抗血清對(duì)不同表皮葡萄球菌菌株的在SdrH分子團(tuán)中顯示菌珠變異的溶胞物的反應(yīng)性。1-3道分別為菌株9491,9400，和KH11；(B)PCR產(chǎn)物，表示編碼SdrH SD-重復(fù)區(qū)域(1-3道)或相同菌珠區(qū)域Cs(4-6道)的DNA。kDa和kb大小標(biāo)記分別在A和B圖面顯示。
圖10顯示了在細(xì)胞壁提取物和原生質(zhì)體中對(duì)Sdr蛋白質(zhì)的分析，包括(A)抗-SdrFA抗血清對(duì)表皮葡萄球菌菌株9491溶胞物(1道)，細(xì)胞壁提取物(2道)，和純?cè)|(zhì)體(3道)的反應(yīng)性；(B)和(C)分別是抗-SdrGA和-SdrHA抗血清對(duì)相同樣品的反應(yīng)性。kDa大小標(biāo)記分別在A,B和C的左圖面顯示。
圖11顯示了從表皮葡萄球菌感染中逐漸康復(fù)的患者獲取的IgG對(duì)涂覆在ELISA微量滴定板中的重組SdrFA(空白柱),SdrGA(灰色柱)和SdrHA(黑色柱)的反應(yīng)性。從兩歲大兒童獲取的混合IgG用作對(duì)照物。誤差柱表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。
本發(fā)明的詳細(xì)描述本文描述了分離的Sdr蛋白質(zhì)和它們相應(yīng)的氨基酸和核酸序列。蛋白質(zhì)稱(chēng)為SdrF,SdrG和SdrH。SdrF的DNA序列和蛋白質(zhì)SdrF的氨基酸序列(粗體)以及它們的側(cè)翼序列在圖2中演示。SdrG的DNA序列和蛋白質(zhì)SdrG的氨基酸序列(粗體)以及它們的側(cè)翼序列在圖3中演示。最后，SdrH編碼區(qū)域包括DNA和氨基酸序列在圖4中演示。
SdrF,SdrG和SdrH蛋白質(zhì)在初級(jí)序列和結(jié)構(gòu)組織方面與從金黃色葡萄球菌獲取的胞外基質(zhì)-結(jié)合Sdr蛋白質(zhì)家族有關(guān)，并位于細(xì)胞表面。SdrF,SdrG和SdrH蛋白質(zhì)是與細(xì)胞壁相關(guān)的蛋白質(zhì)，帶有在N端的信號(hào)序列和LPXTG基元，疏水域和C端的正電荷殘基。每種還有SD重復(fù)區(qū)，其包括使配體結(jié)合域區(qū)域A在細(xì)胞表面有效表達(dá)的足夠長(zhǎng)的R區(qū)域。由于SdrF,SdrG和SdrH蛋白質(zhì)的A區(qū)域位于細(xì)胞表面，蛋白質(zhì)可與血漿，細(xì)胞外基質(zhì)或與宿主細(xì)胞的表面分子相互作用。如，SdrG結(jié)合血纖蛋白原N端的一半β鏈。
公開(kāi)的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合蛋白質(zhì)共有獨(dú)特的二肽重復(fù)區(qū)域(區(qū)域R)，主要包括天冬氨酸和絲氨酸殘基。這種DS重復(fù)區(qū)域由18個(gè)帶有共有序列GAY TCN GAY TCN GAY AGY的核苷酸重復(fù)單元編碼，TCN作為第一個(gè)和第二個(gè)絲氨酸密碼子，AGY作為第三個(gè)絲氨酸密碼子。R區(qū)域鄰近蛋白質(zhì)的C端，通常含有40到300個(gè)DS殘基，或更具體地，含多于60,80,100,120,150,200或250個(gè)重復(fù)單元，其中大于90,95或98％的重復(fù)單元是氨基酸D或S。R區(qū)域DS重復(fù)單元的長(zhǎng)度隨著蛋白質(zhì)的不同而變化，而且雖然區(qū)域R本身不結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)，但R區(qū)域能使蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū)域在金黃色葡萄球菌的細(xì)胞表面存在。這樣，編碼DS重復(fù)單元的共有序列DNA的探針(參閱上述)能用來(lái)鑒別其他編碼不同結(jié)合蛋白質(zhì)的基因，特別是使金黃色葡萄球菌附著宿主組織的結(jié)合蛋白質(zhì)。R區(qū)域的抗體也可用來(lái)鑒別其他這樣的結(jié)合蛋白質(zhì)。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的是，在SdrF和SdrG的A區(qū)域中有高度保留的氨基酸序列，能用來(lái)衍生共有序列TYTFTDYVD基元。該基元能用在多組分疫苗中獲得對(duì)細(xì)菌感染的廣譜免疫性，并且也可用來(lái)產(chǎn)生廣譜被動(dòng)免疫的單克隆或多克隆的抗體。在一個(gè)可替換的實(shí)施方案中，從Sdr蛋白質(zhì)家族中衍生出的可變序列的任何組合，(T)(Y)(T)(F)(T)(D/N)(Y)(V)(D)，可用來(lái)產(chǎn)生免疫性或用來(lái)誘導(dǎo)保護(hù)性抗體。
還發(fā)現(xiàn)，SdrG有一個(gè)編碼有913個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)的2736個(gè)核苷酸的開(kāi)放讀框。蛋白質(zhì)有一個(gè)30個(gè)氨基酸的信號(hào)序列，542個(gè)氨基酸的配體結(jié)合A區(qū)域，和兩個(gè)重復(fù)基元稱(chēng)為B區(qū)域。B1有113個(gè)氨基酸，B2有110個(gè)氨基酸，R區(qū)域有77個(gè)氨基酸。B區(qū)域含有表示Ca++結(jié)合的EF手基元，與在其他Ca++結(jié)合蛋白質(zhì)如調(diào)鈣蛋白和中肌鈣蛋白中發(fā)現(xiàn)的相似。另一個(gè)更退化形式的EF手基元在SdrG的A區(qū)域中殘基459-471之間發(fā)現(xiàn)。在EDTA存在的情況下，可注意到SdrG A與血纖蛋白原的結(jié)合顯著減少，這說(shuō)明結(jié)合對(duì)金屬離子有依賴(lài)。Ⅰ．定義本文定義的“SdrF蛋白質(zhì)”，“SdrG蛋白質(zhì)”和“SdrH蛋白質(zhì)”包括SdrF,SdrG和SdrH亞域和SdrF,SdrG和SdrH的活性或抗原片段，如共有序列或可變序列氨基酸基元。
本文所使用的“pg”是微微克，“ng”是毫微克，“ug”或“μg”是微克，“mg”是毫克，“ul”或“μl”是微升，“ml”是毫升，“l(fā)”是升。
本文所定義的SdrF,SdrG和SdrH蛋白質(zhì)的“活性片段”，是能阻斷凝固酶陰性葡萄球菌與固定或可溶宿主蛋白質(zhì)結(jié)合的肽或多肽。
本文所使用的“附著因子”包括自然產(chǎn)生及合成的或重組蛋白質(zhì)及肽，它們能與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)結(jié)合和/或調(diào)節(jié)與宿主細(xì)胞的附著。
本文所使用的“氨基酸”包括自然產(chǎn)生及合成的氨基酸，包括但不限于丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯基丙氨酸，色氨酸，蛋氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺酸，谷氨酸，天冬氨酸，賴(lài)氨酸，精氨酸和組氨酸。
“抗體”是任何與特異抗原表位結(jié)合的免疫球蛋白，包括其抗體和片段。本文所使用的該術(shù)語(yǔ)包括單克隆抗體，多克隆的，嵌合的，單鏈的，雙特異性的，猴類(lèi)的和人類(lèi)的抗體以及Fab片段，包括Fab免疫球蛋白表達(dá)文庫(kù)的產(chǎn)品。
本文所使用的各種表達(dá)方式的“抗體分子”包括完整的免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分。
本文所定義的SdrF,SdrG和SdrH蛋白質(zhì)的“抗原片段”是能產(chǎn)生免疫反應(yīng)的肽或多肽。
本文所使用的“抗體功能等同物”蛋白質(zhì)或肽是摻合一個(gè)與一個(gè)或多個(gè)公開(kāi)的具體蛋白質(zhì)的抗原表位免疫交叉反應(yīng)的抗原表位的蛋白質(zhì)或肽?？乖δ艿韧?，或抗原表位序列可被首先設(shè)計(jì)或預(yù)定然后檢測(cè)，或可簡(jiǎn)單地直接進(jìn)行交叉反應(yīng)性檢測(cè)。
“細(xì)胞種系”是能在體外穩(wěn)定生長(zhǎng)許多代的無(wú)性繁殖系原代細(xì)胞。
“無(wú)性繁殖系”是通過(guò)有絲分裂從單細(xì)胞或普通祖細(xì)胞衍生的細(xì)胞群。
DNA“編碼序列”是雙鏈DNA序列，當(dāng)置于適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列的控制下時(shí)，其在體內(nèi)可轉(zhuǎn)錄及翻譯多肽。序列的邊界由5’(氨基)端的起始密碼子和3’(羧基)端的的翻譯終止密碼子確定。編碼序列包括但不限于原核序列，從真核MRNA獲取的cDNA，從真核(如哺乳動(dòng)物)DNA獲取的遺傳DNA序列，和合成DNA序列。聚腺苷酸化信號(hào)和轉(zhuǎn)錄終止序列通常位于編碼序列的3’端。
“DNA分子”是指單鏈形式或雙鏈螺旋狀的脫氧核糖核苷酸(腺嘌呤，鳥(niǎo)嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶)的聚合物形式。這個(gè)術(shù)語(yǔ)僅指分子的一級(jí)基二級(jí)結(jié)構(gòu)，不限于任何具體的三級(jí)結(jié)構(gòu)。這樣，此術(shù)語(yǔ)包括發(fā)現(xiàn)的雙鏈DNA分子，特別是線性DNA分子(如限制性片段)，病毒，質(zhì)粒，和染色體中發(fā)現(xiàn)的雙鏈DNA分子。討論具體雙鏈DNA分子結(jié)構(gòu)時(shí)，本文按照常用慣例描述序列，僅以5’到3’方向沿著DNA的非轉(zhuǎn)錄鏈(即含有與mRNA同源的序列的鏈)給出序列。
轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列是“DNA調(diào)節(jié)序列”，如啟動(dòng)子，增強(qiáng)子，聚腺苷酸化信號(hào)，終止子等等，提供在宿主細(xì)胞中編碼序列的表達(dá)。
“表達(dá)控制序列”是控制及調(diào)節(jié)另一個(gè)DNA序列轉(zhuǎn)錄和翻譯的DNA序列。當(dāng)RNA聚合酶將編碼序列轉(zhuǎn)錄到mRNA中時(shí)，編碼序列是在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄及翻譯控制序列的控制下的，然后編碼序列被翻譯成有編碼序列編碼的蛋白質(zhì)。
本文所使用的“細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)”，或ECM，是指大型分子的四個(gè)常見(jiàn)家族，膠原質(zhì)，糖蛋白，蛋白多糖，彈性蛋白，包括纖連蛋白，血纖蛋白原，提供支持及調(diào)節(jié)分子行為。
本文所使用的“宿主細(xì)胞”是已被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，或能被外源多核苷酸序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
“一致性”，如在此領(lǐng)域中已知的，是兩個(gè)或多個(gè)多肽序列或兩個(gè)或多個(gè)多核苷酸序列之間的關(guān)系，如通過(guò)對(duì)比序列確定的關(guān)系。在此領(lǐng)域中，“一致性”也指多肽或多核苷酸之間的序列相關(guān)程度，如情況可能，是通過(guò)這些序列之間的匹配確定。
“一致性”和“相似性”可通過(guò)已知的方法(計(jì)算分子生物學(xué)，Lesk,A.M.，編輯，牛津大學(xué)出版社，紐約，1988；生物學(xué)計(jì)算信息學(xué)及基因組測(cè)序計(jì)劃，Smith,D.W，編輯，學(xué)術(shù)出版社，紐約，1993)方便地計(jì)算。雖然有很多計(jì)算兩個(gè)序列間的一致性和相似性的方法，這兩個(gè)術(shù)語(yǔ)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是眾所周知的。通常用來(lái)確定序列間一致性或相似性的方法包括但不限于在Carillo,H.，和Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)中所公開(kāi)的。確定一致性的較好的方法設(shè)計(jì)給出測(cè)試序列間的最大匹配。確定一致性和相似性的方法可編成公眾可購(gòu)到的計(jì)算機(jī)程序。確定兩個(gè)序列間一致性和相似性的較好的計(jì)算機(jī)程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux等人，核酸研究12(1):387,1984),BLASTP,BLASTN，和FASTA(Atschul等人，J.分子生物學(xué)，215:403-410,1990)。BLASTX程序是公眾可從NCBI和其他途徑(BLAST手冊(cè)，Altschul等人，NCBI NLM NIH Bethesda,Md,20894；Altschul等人，J.分子生物學(xué)，215:430-410,1990)購(gòu)到的程序。
“免疫有效量”意指肽組合物的量能在受體動(dòng)物中產(chǎn)生免疫反應(yīng)。這包括產(chǎn)生抗體反應(yīng)(B細(xì)胞反應(yīng))，和/或刺激細(xì)胞毒素免疫反應(yīng)(T細(xì)胞反應(yīng))。產(chǎn)生這樣的免疫反應(yīng)即能用來(lái)制備有用的生物試劑如CTL，更具體地是使用在診斷實(shí)施方案中的活性抗體，也能用在多種預(yù)防或治療實(shí)施方案中。
本文所使用的“體內(nèi)疫苗”是指用蛋白質(zhì)給動(dòng)物免疫以產(chǎn)生保護(hù)以后不受病原體的影響的體液和細(xì)胞反應(yīng)。
本文所定義的“分離的”是指從至少一些和其一起自然產(chǎn)生的組分中分離出來(lái)。本文所使用的“分離的”還指“通過(guò)人的手”從其自然狀態(tài)中改變，即，如果它產(chǎn)生在自然界中，它已被從其原生環(huán)境中改變或移出，或改變和移出。如，自然存在于有生命的生物體中的多核苷酸或多肽不是“分離的”，但從其自然狀態(tài)共存物質(zhì)中分離出的相同的多核苷酸或多肽是“分離的”，如本文所使用的這個(gè)術(shù)語(yǔ)。
本文所使用的“配體”包括分子，包括在宿主組織內(nèi)的致病細(xì)菌附著的分子。
本文所使用的各種表達(dá)形式的“單克隆抗體”是指僅含一種能與具體抗原免疫反應(yīng)的抗體結(jié)合位點(diǎn)的抗體。
本文所使用的“寡核苷酸”是指包括有兩個(gè)或多個(gè)核苷酸，較好的是多于三個(gè)核苷酸的分子。其精確大小取決于很多因素，這些因素進(jìn)而又取決于寡核苷酸的最終作用和應(yīng)用。
如本文所使用的“藥物可接受的”是指當(dāng)給人類(lèi)服用時(shí)，分子實(shí)體和組合物是生理學(xué)上可忍受的，并且通常不產(chǎn)生不可接受的過(guò)敏或類(lèi)似不好的反應(yīng)。
“多核苷酸”通常是指任何多核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸，其可能是未經(jīng)修飾的RNA或DNA，或修飾的RNA或DNA?！岸嗪塑账帷睕](méi)有限制地包括單鏈或雙鏈DNA，單鏈和雙鏈區(qū)域混合物，或單鏈、雙鏈及三鏈區(qū)域混合物DNA，單鏈和雙鏈RNA，和單鏈和雙鏈區(qū)域混合物RNA，含有可能是單鏈或，更常見(jiàn)的，雙鏈，或三鏈，或單鏈和雙鏈區(qū)域混合物的DNA和RNA的雜交分子。此外，本文所使用的“多核苷酸”是指含有RNA或DNA、或RNA和DNA的三鏈區(qū)域。這種區(qū)域中的鏈可以來(lái)自相同分子或來(lái)自不同分子。區(qū)域可包括所有一個(gè)或多個(gè)分子，但更常見(jiàn)的是包括一些分子的僅一個(gè)區(qū)域。三鏈-螺旋區(qū)域分子中的一個(gè)常常是寡核苷酸。如本文所使用的，“多核苷酸”包括上面描述的含有一個(gè)或多個(gè)修飾堿基的DNA或RNA。這樣，帶有為穩(wěn)定性或?yàn)槠渌蛐揎椀闹麈湹腄NA或RNA是本文所描述的“多核苷酸”。并且，包含不常見(jiàn)堿基如次黃嘌呤核苷，或修飾的堿基如三苯甲基化堿基(僅是指出的兩個(gè)實(shí)施例)的DNA或RNA也是本文所定義的多核苷酸。應(yīng)該理解的是，許多為多種有用目的對(duì)DNA和RNA作出的修飾對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。本文所使用的“多核苷酸”也包括多核苷酸這種化學(xué)上的，酶催化的或代謝的修飾形式，以及有病毒和細(xì)胞特點(diǎn)的DNA和RNA的化學(xué)形式，包括如簡(jiǎn)單細(xì)胞及復(fù)合細(xì)胞?！岸嗪塑账帷边€包括常常稱(chēng)為寡核苷酸的短的多核苷酸。
“多肽”是指含有兩個(gè)或多個(gè)通過(guò)肽鍵或修飾的肽鍵彼此連接的氨基酸。“多肽”即指短鏈，常常稱(chēng)為肽、寡肽和寡聚體，而長(zhǎng)鏈常常稱(chēng)為蛋白質(zhì)。多肽可以包括除了20個(gè)遺傳編碼氨基酸以外的氨基酸。“多肽”還包括通過(guò)自然過(guò)程修飾的多肽，如加工及其他翻譯后修飾，也包括通過(guò)本領(lǐng)域已知的化學(xué)修飾技術(shù)修飾的多肽。這樣的修飾過(guò)程在基礎(chǔ)課本中，在更詳細(xì)的專(zhuān)論中以及在多數(shù)研究著作中作了詳細(xì)的描述。應(yīng)該理解的是，同樣類(lèi)型的修飾能以相同或不同程度存在于給定的多肽中的不同位點(diǎn)。同樣，給定的多肽可含有多種修飾。修飾可發(fā)生在多肽的任何部位，包括肽的主鏈，氨基酸側(cè)鏈及氨基酸或羧基端。修飾包括乙?；饔?，?；饔?，ADP-核糖基化作用，酰胺化作用，四羥酮醇的共價(jià)附著作用，亞鐵血紅素組成的共價(jià)附著作用，核苷酸或核苷酸衍生物的共價(jià)附著作用，脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物的共價(jià)附著作用，磷脂酰肌醇的共價(jià)附著作用，交聯(lián)作用，環(huán)化作用，二硫化物鍵形成，脫甲基作用，共價(jià)交聯(lián)形成，半胱氨酸形成，焦谷氨酸形成，公式化，γ-羧酸化作用，糖基化作用，GPI-錨形成，羥基化作用，碘化作用，甲基化作用，豆蔻?；饔?，氧化作用，蛋白水解過(guò)程，磷酸化作用，異戊二烯化作用，外消旋化作用，糖基化作用，脂質(zhì)附著作用，用硫酸處理，谷氨酸殘基的γ-羧酸化作用，羥基化作用和ADP-核糖基化作用，硒化作用，用硫酸處理，氨基酸與蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)RNA調(diào)節(jié)加成作用如精氨酰化作用，遍在蛋白化作用。參閱，如Seifter等人的Meth.Emzymol.182:624-646,1990和Rattan等人的Ann.N.Y Acad.Sci.663:48-62,1992。多肽可以是支鏈的或環(huán)狀的，有或沒(méi)有支鏈。環(huán)狀，支鏈及支鏈環(huán)狀多肽可從翻譯后自然過(guò)程得到，也可完全通過(guò)合成方法制備。
本文使用的“引物”是指寡核苷酸，不論是以純的限制性酶切消化形式自然產(chǎn)生的或合成制備的，當(dāng)其置于引物延伸產(chǎn)物的合成被誘導(dǎo)的條件下時(shí)，即在存在核苷酸和誘導(dǎo)試劑如DNA聚合酶，及適當(dāng)?shù)臏囟群蚉H條件下，其能作為合成啟動(dòng)的點(diǎn)，其中引物延伸產(chǎn)物是核酸鏈的互補(bǔ)。引物可以是單鏈或雙鏈的，并且必須足夠長(zhǎng)以在存在誘導(dǎo)試劑的條件下引導(dǎo)所需延伸產(chǎn)物的合成。引物的確切長(zhǎng)度取決于許多因素，包括溫度，引物來(lái)源和使用的方法。如對(duì)于診斷應(yīng)用，根據(jù)靶序列的復(fù)雜性，寡核苷酸引物通常含有15-25個(gè)或更多個(gè)核苷酸，盡管其可能含有較少的核苷酸。
本文的引物的選取要充分地與不同鏈的具體靶DNA序列互補(bǔ)。這意味著引物必須是充分地互補(bǔ)以與其各自的鏈雜交。因此，引物序列不需要反映模板確切的序列。如非互補(bǔ)核苷酸片段可能附著在引物的5’端，引物序列的剩余部分與鏈互補(bǔ)?；蛘?，非互補(bǔ)堿基或較長(zhǎng)序列可以散布到引物中，只要引物序列同與其雜交的鏈的序列有充分的互補(bǔ)性，并從而形成延伸產(chǎn)物的合成用模板。
“啟動(dòng)子序列”是DNA調(diào)節(jié)區(qū)域，能在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合RNA聚合酶并啟動(dòng)下游(3’方向)編碼序列的轉(zhuǎn)錄。為了定義本發(fā)明，啟動(dòng)子序列以其3’端轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為界，向上游(5’方向)延伸，包括在背景以上可檢測(cè)到的水平上啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄所需的最小量的堿基或元素。在啟動(dòng)子序列內(nèi)可發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)位點(diǎn)(可用核酸酶S1制圖來(lái)方便地定義)，以及具有結(jié)合RNA聚合酶功能的蛋白質(zhì)結(jié)合域(共有序列)。真核啟動(dòng)子常常，但不總是，含有“TATA”框和“CAT”框。原核啟動(dòng)子除了含有-10和-35共有序列外還有Shine-Dalgarno序列。
“復(fù)制子”是遺傳元素(如質(zhì)粒，染色體，病毒)，用作體內(nèi)DNA復(fù)制的自主單元，即能在其自身控制下復(fù)制。
本文所使用的“限制性?xún)?nèi)切核酸酶”和“限制性酶”是指細(xì)菌酶，每種酶在或鄰近特異回文核苷酸序列上切斷雙鏈DNA。
“信號(hào)序列”可包括在編碼序列前。這個(gè)序列編碼信號(hào)肽，多肽的N-端，其給宿主細(xì)胞傳達(dá)信息以指導(dǎo)多肽到細(xì)胞表面或?qū)⑵浞置诘浇橘|(zhì)中。在蛋白質(zhì)離開(kāi)細(xì)胞前，這種信號(hào)肽被宿主細(xì)胞剪去。這種信號(hào)序列被發(fā)現(xiàn)常與真核細(xì)胞和原核細(xì)胞自身的多種蛋白質(zhì)有關(guān)。
當(dāng)外源或同源DNA被引入到細(xì)胞中時(shí)，細(xì)胞已被外源或同源DNA“轉(zhuǎn)化”。轉(zhuǎn)化DNA可以被或不被整合(共價(jià)結(jié)合)到組成細(xì)胞基因組的染色體DNA中。例如，在原核細(xì)胞、酵母、和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化DNA可以保持在附加型元素上如質(zhì)粒上。對(duì)于真核細(xì)胞，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞是其中轉(zhuǎn)化DNA已經(jīng)整合到染色體中的細(xì)胞，這樣其通過(guò)染色體復(fù)制而被其子代細(xì)胞繼承。這種穩(wěn)定性由真核細(xì)胞建立由含轉(zhuǎn)化DNA的子代細(xì)胞群組成的細(xì)胞種系或集落的能力來(lái)說(shuō)明。
本文所使用的“變體”是多核苷酸或多肽，與參比多核苷酸或多肽不同，但保持有重要的特性。多核苷酸的典型變體在核苷酸序列上與別的多核苷酸，參比多核苷酸不同。變體核苷酸序列上的變化可能有或沒(méi)有改變由參比多核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列。核苷酸變化可能導(dǎo)致在由參比序列編碼的多肽中氨基酸的取代、加成、缺失、融合或截?cái)?，如下所述。多肽的典型變體在氨基酸序列上與別的，參比多肽不同。通常，區(qū)別是有限的，這樣參比多肽和變體的序列總體是很接近的，在很多區(qū)域是一致的。變體和參比多肽可能在氨基酸序列的任何組合形式的一個(gè)或多個(gè)取代、加成或缺失上不同。取代的或插入的氨基酸殘基可能是或不是由遺傳密碼編碼的氨基酸。多核苷酸或多肽的變體可以是自然發(fā)生的如等位基因變體，或它可能是自然發(fā)生的變體內(nèi)所不了解的變體。多核苷酸和多肽的非自然發(fā)生變體可由誘變技術(shù)，通過(guò)直接合成，及通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的重組方法制成。
“載體”是另一個(gè)DNA片段可附著的以促使附著片段復(fù)制的復(fù)制子，如質(zhì)粒，噬菌體或粘粒。Ⅱ．核酸和氨基酸序列編碼SdrF,SdrG和SdrH(分別在圖2-4中給出)或其部分，如共有序列或可變序列氨基酸基元的核酸序列，可用來(lái)制備重組蛋白質(zhì)或用在有高度敏感性和特異性的樣品或試驗(yàn)物中作為檢測(cè)凝固酶陰性葡萄球菌蛋白質(zhì)的核酸探針。探針可用來(lái)檢測(cè)樣品中凝固酶陰性葡萄球菌的存在，診斷疾病的感染，確定樣品中凝固酶陰性葡萄球菌的量，或監(jiān)測(cè)用來(lái)治療感染的治療過(guò)程的進(jìn)展。核酸和氨基酸序列也可用作實(shí)驗(yàn)室研究工具以研究生物體和監(jiān)測(cè)疾病或發(fā)展對(duì)疾病的治療。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，SdrF,SdrG或SdrH蛋白質(zhì)也可由與序列清單中提供的核酸序列基本上相同的序列編碼。當(dāng)約70％或更多的(較好的至少約為80％，最好至少約為90或95％)核苷酸在DNA序列限定長(zhǎng)度上匹配時(shí)，兩個(gè)DNA序列基本上相同?；旧舷嗤男蛄锌赏ㄟ^(guò)比對(duì)序列確定，使用序列數(shù)據(jù)庫(kù)的標(biāo)準(zhǔn)軟件，或在如具體系統(tǒng)所限定的嚴(yán)緊條件下Southern雜交試驗(yàn)中確定。限定適當(dāng)?shù)碾s條件在此領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)，參看如Maniatis等人的分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，1982；DNA克隆，Ⅰ&Ⅱ卷，supra；核酸雜交，[B.D.Hames&S.J.Higgins編輯，(1985)]?！盎旧舷嗨频摹边€指由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并，DNA序列與在圖2-4中所示的任何序列不同，但其仍然編碼相同的氨基酸序列；或者，由于一個(gè)氨基酸被相似的氨基酸替代，或由于改變(不論其是取代，加成，缺失還是插入)沒(méi)有影響蛋白質(zhì)的活性位點(diǎn)，DNA序列編碼不同的但保持蛋白質(zhì)活性的氨基酸序列。當(dāng)約70％或更多的(較好的至少約為80％，最好至少約為90或95％)氨基酸在序列限定長(zhǎng)度上匹配時(shí)，兩個(gè)氨基酸序列或兩個(gè)核酸序列是“基本上相似的”。
在本發(fā)明的肽和編碼肽的DNA片段的結(jié)構(gòu)中可進(jìn)行修飾或改變并可獲得編碼具有所需特性的蛋白質(zhì)或肽的功能分子。下面是根據(jù)改變蛋白質(zhì)的氨基酸而產(chǎn)生等同物，或甚至產(chǎn)生改進(jìn)的第二代分子的討論。依據(jù)表1，氨基酸的改變可通過(guò)改變DNA序列的密碼子獲得。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解的是，表1中的說(shuō)明的密碼子是RNA序列的。相應(yīng)的DNA密碼子將以T替換U。為與標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語(yǔ)統(tǒng)一(J.Biol.Chem.,243:3552-3559,1996)。氨基酸殘基的縮寫(xiě)也在表1中列出。
表1氨基酸 密碼子丙氨酸 Ala A GCA GC GCG GCU半胱氨酸Cys C UGC UGU天冬氨酸Asp D GAC GAU GAC GAU谷氨酸 Glu E GAA GAG苯基丙氨酸 Phe F UUC UUU甘氨酸 Gly G GGA GCG GGG GGU組氨酸 His H CAC CAU異亮氨酸Ile I AUA AUC AUU賴(lài)氨酸 Lye K AAA AAG亮氨酸 Leu L UUA UUG CUA CUC GUG GUU蛋氨酸 Met M AUG天冬酰胺Asn N AAC AAU脯氨酸 Pro P CCA CCC CCG CCU谷氨酰胺Gln Q CAA CAG精氨酸 Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU絲氨酸 Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU蘇氨酸 Thr T ACA ACC ACG ACU纈氨酸 Val V GUA GUC GUG GUU色氨酸 Trp W UGG酪氨酸 Tyr Y UAC UAU
例如，在與結(jié)構(gòu)如抗體的抗原結(jié)合區(qū)域或底物分子上的結(jié)合位點(diǎn)的相互作用的結(jié)合能力沒(méi)有可感知的損失的情況下，在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中某些氨基酸可以被其他氨基酸取代。因?yàn)檎堑鞍踪|(zhì)性質(zhì)和相互作用能力定義著蛋白質(zhì)生物功能活性，所以某些氨基酸序列取代可在蛋白質(zhì)序列中進(jìn)行，當(dāng)然也可在其根本的DNA編碼序列中進(jìn)行，并且仍然獲得具有相同性質(zhì)的蛋白質(zhì)。這樣，發(fā)明者考慮認(rèn)為，在公開(kāi)組合物的肽序列中，或在編碼所說(shuō)的肽的相應(yīng)的DNA序列中，可進(jìn)行多種改變，并且不發(fā)生其生物活性或用途的可感知的損失。
在進(jìn)行這些改變時(shí)，可考慮氨基酸的親水指數(shù)。在探察蛋白質(zhì)的相互作用生物功能中氨基酸親水指數(shù)的重要性方面，本領(lǐng)域已經(jīng)有了廣泛的理解(Kyte和Doolittle,J.Mol.Biol.,157(1):105-132,1982，通過(guò)在此引證而合并于本文)。已經(jīng)接受的是，氨基酸相對(duì)的親水特征與結(jié)果蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)，其進(jìn)一步限定蛋白質(zhì)與其他分子的相互作用，如酶，底物，受體，DNA，抗體，抗原，等等。根據(jù)其疏水性和電荷特性，每種氨基酸都賦值了親水指數(shù)(Kyte和Doolittle,supra,1982)，具體有異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯基丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；賴(lài)氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
本領(lǐng)域中已知的是，某些氨基酸可被其他具有相似親水指數(shù)或評(píng)定值的氨基酸取代，并仍產(chǎn)生具有相似生物活性的蛋白質(zhì)，即仍獲得生物功能等同物蛋白質(zhì)。在進(jìn)行這樣的改變時(shí)，其親水指數(shù)在±2內(nèi)的氨基酸的取代是較好的，其親水指數(shù)在±1內(nèi)的氨基酸的取代是更好的，其親水指數(shù)在±0.5內(nèi)的氨基酸的取代是最好的。在本領(lǐng)域中還應(yīng)該理解的是，相似氨基酸的取代可依據(jù)親水性而有效地進(jìn)行。美國(guó)專(zhuān)利4,554,101中說(shuō)明了蛋白質(zhì)的最大局部平均親水性指數(shù)，取決于其鄰近的氨基酸的親水性指數(shù)，與蛋白質(zhì)的生物特性有關(guān)，該專(zhuān)利通過(guò)在此引述而合并于本文。
如在美國(guó)專(zhuān)利4,554,101中所描述的，下列氨基酸殘基賦值了親水性指數(shù)精氨酸(+3.0)；賴(lài)氨酸(+1.0)；天冬氨酸(+3.0+1)；谷氨酸(+3.0+1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5+1)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯基丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。還應(yīng)該理解的是，氨基酸可被另一個(gè)具有相似親水性指數(shù)的氨基酸取代，并仍獲得生物等同物，具體地是免疫等同物蛋白質(zhì)。在進(jìn)行這樣的改變時(shí)，其親水性指數(shù)在±2內(nèi)的氨基酸的取代是較好的，其親水性指數(shù)在±1內(nèi)的氨基酸的取代是特別推薦的，其親水性指數(shù)在±0.5內(nèi)的氨基酸的取代是更好的。
如上面所列出的，因此，氨基酸取代通常是根據(jù)氨基酸側(cè)鏈取代基的相對(duì)相似性，如，它們的疏水性，親水性，電荷，大小，等等?？紤]了多種前述特性的示范取代對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是眾所周知的，包括精氨酸和賴(lài)氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸。
本發(fā)明的多肽可通過(guò)化學(xué)合成。合成的多肽可使用已熟知的固相，液相技術(shù)，或肽縮合技術(shù)，或它們的任何組合來(lái)制備，合成多肽可包括自然的或非自然的氨基酸。用來(lái)合成肽的氨基酸可以是標(biāo)準(zhǔn)Boc(Na-氨基保護(hù)的Na-叔-丁氧基羰基)氨基酸樹(shù)脂，使用Merrifield(J.Am.Chem.Soc.,85:2149-2154,1963)的固相技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)脫保護(hù)，中和，偶聯(lián)和沖洗方案，或由Carpino和Han(J.Org.Chem.,37:3403-3409,1972)首先描述的堿基-易發(fā)生變化的Na-氨基保護(hù)的9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)氨基酸。Fmoc和Boc Na-氨基保護(hù)的氨基酸都可從Fluka,Bachem,Advanced Chemtech,Sigma,Cambridge ResearchBiochemical,Bachem，或Peninsula Labs或其他從事本領(lǐng)域的人所熟悉的化學(xué)公司獲得。此外，本發(fā)明的方法可與其他本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的Na-氨基保護(hù)基團(tuán)一起使用。固相肽合成可使用本領(lǐng)域中技術(shù)人員熟悉的技術(shù)實(shí)施，如在Stewart和Young的《固相合成》中提供的，第二版，Pierce化學(xué)公司，Rochford,IL,1984；和Field和Noble 1990年Int.J.Pept.Protein Res.35:161-214中提供的，或使用自動(dòng)合成器，如ABS所售的。這樣，本發(fā)明的多肽可含有D-氨基酸，D-和L-氨基酸的組合，和多種“設(shè)計(jì)者”氨基酸(如β-甲基氨基酸，Cα-甲基氨基酸，和Nα-甲基氨基酸)以轉(zhuǎn)達(dá)具體屬性。合成氨基酸包括鳥(niǎo)氨酸合成賴(lài)氨酸，氟代苯基丙氨酸合成苯基丙氨酸，正亮氨酸合成亮氨酸或異亮氨酸。此外，在特殊偶聯(lián)步驟排布特殊氨基酸，可制備α-螺旋，β-轉(zhuǎn)角，β-折疊，γ-轉(zhuǎn)角，及環(huán)狀肽。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，選取了提供有用的化學(xué)和結(jié)構(gòu)屬性的肽的亞基。如含D-氨基酸的肽在體內(nèi)會(huì)對(duì)L-氨基酸-特異蛋白酶有抗性。此外，本發(fā)明預(yù)想制備具有更好的限定結(jié)構(gòu)屬性的肽，使用肽模擬學(xué)和肽模擬鍵，如酯鍵，制備具有新型屬性的肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可制備摻入了還原的肽鍵即R1-CH2-NH-R2的肽，其中R1和R2是氨基酸殘基或序列。還原的肽鍵可作為二肽亞基引入。這樣的分子會(huì)對(duì)肽鍵水解如蛋白酶活性有抗性。這樣的肽會(huì)提供具有獨(dú)特功能和活性的配體，如由于對(duì)代謝衰弱或蛋白酶活性的抗性而在體內(nèi)延長(zhǎng)半衰期。并且，眾所周知的是，在某些系統(tǒng)中約束肽表現(xiàn)出增強(qiáng)的功能活性(Hruby,生命科學(xué)，31:189-199,1982；Hruby等人，Biochem.J.,268:249-262,1990)。
下列非典型氨基酸可摻入到肽中以引入特殊的構(gòu)象基元1,2,3,4-四氫異喹啉-3-羧酸酯(Kazmierski等人，J.Am.Chem.Soc.,113:2275-2283,1991)；(2S,3S)-甲基-苯基丙氨酸，(2S,3R)-甲基-苯基-丙氨酸，(2R,3S)-甲基-苯基丙氨酸和(2R,3R)-甲基-苯基丙氨酸(Kazmierski和Hruby,Tetrahedron Lett.,1991)；2-氨基四氫萘-2-羧酸(Landis,Ph.D.Thesis，亞利桑那大學(xué)，1989)；羥基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-羧酸酯(Miyake等人，J.Takeda Res.Labs.,43:53-76,1989)；β-咔啉(D和L)(Kazmierski,Ph.D.Thesis，亞利桑那大學(xué)，1988)；HIC(組氨酸異喹啉羧酸)(Zechel等人，Int.J.Pep.Protein Res.,43,1991)；和HIC(組氨酸環(huán)脲)(Dharanipragada)。
下列氨基酸類(lèi)似物和肽模擬物可摻入到肽中以誘導(dǎo)或促成特異二級(jí)結(jié)構(gòu)LL-Acp(LL-3-氨基-2-propenidone-6-羧酸),β-轉(zhuǎn)角誘導(dǎo)二肽類(lèi)似物(Kemp等人，J.Org.Chem.,50:5834-5838,1985),β-折疊誘導(dǎo)類(lèi)似物(Kemp等人，Tetrahedron Lett.,29:5081-5082,1988)；β-轉(zhuǎn)角誘導(dǎo)類(lèi)似物(Kemp等人，Tetrahedron Lett.,29:5057-5060,1988)；α-螺旋誘導(dǎo)類(lèi)似物(Kemp等人，Tetrahedron Lett.,29:4935-4938,1988)；γ-轉(zhuǎn)角誘導(dǎo)類(lèi)似物(Kemp等人，J.Org.Chem.,54:109-115,1989)；由下列參考文獻(xiàn)提供的類(lèi)似物Nagai和Sato,Tetrahedron Lett.,26:647-650(1985)；DiMaio等人，J.Chem.Soc.Perkin.Trans.,p.1687(1989)；以及Gly-Ala轉(zhuǎn)角類(lèi)似物(Kahn等人，Tetrahedron Lett.,30:2317,1989)；酰胺鍵等排體(Jones等人，Tetrahedron Lett.,29:3853-3856,1989)；四氮雜茂(Zabrocki等人，J.Am.Chem.Soc.,110:5875-5880,1988)；DTC(Samanen等人，Int.J.Protein Pep.Res.,35:501:509,1990)；和在Olson等人(J.Am.Chem.Sci.,112:323-333,1990)和Garvey等人(J.Org.Chem.,56:436,1990)中公開(kāi)的類(lèi)似物。β-轉(zhuǎn)角和β-凸起，和含它們的肽的構(gòu)象限制模擬物在1995年8月8日授予Kahn的美國(guó)專(zhuān)利No.5,440,013中公開(kāi)。
本文還提供了凝固酶陰性葡萄球菌細(xì)菌如本文所描述的表皮葡萄球菌的與編碼血纖蛋白原-結(jié)合蛋白質(zhì)或其部分，如共有序列或可變序列氨基酸基元的核酸分子選擇性雜交的核酸分子序列，或它們的互補(bǔ)序列?！斑x擇性”或“選擇地”是指不與其他核酸雜交的序列。這樣促進(jìn)了SdrF,SdrG或SdrH的特異檢測(cè)。因此，在設(shè)計(jì)雜交核酸時(shí)，選擇性將取決于存在于樣品中的其他組成。雜交核酸應(yīng)與和其雜交的核酸片段有至少70％的互補(bǔ)性。如本文用來(lái)描述核酸的術(shù)語(yǔ)“選擇地雜交”不包括偶然隨機(jī)地雜交核酸，因此，與“特異雜交”含有相同的意義。本發(fā)明的選擇性雜交核酸與和其雜交的序列片段可有至少70％,80％,85％,90％,95％,97％,98％和99％的互補(bǔ)性。
本發(fā)明考慮到了選擇性地與本文具體提供的編碼DNA或DNA的互補(bǔ)鏈，或相對(duì)應(yīng)鏈雜交的序列，探針和引物。只要功能種類(lèi)-特異雜交能力保持，與核酸的特異雜交可與核酸內(nèi)小的修飾或取代一起發(fā)生?！疤结槨笔窃跒榱藱z測(cè)或擴(kuò)增互補(bǔ)序列進(jìn)行的與互補(bǔ)活性序列選擇性雜交中能用作探針或引物的核酸序列，其探針長(zhǎng)度可從約5個(gè)核苷酸到100個(gè)核苷酸變化，或較好地從約10個(gè)到50個(gè)核苷酸變化，或更好地從約18到24個(gè)核苷酸變化。因此，本文所使用的“探針”或“探針們”包括“引物”。本文提供了分離的核酸，其與種類(lèi)-特異核酸在嚴(yán)緊條件下選擇性雜交，并且應(yīng)含有至少5個(gè)核苷酸與有興趣的序列互補(bǔ)，如Sambrook等人在分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中所描述的，1989第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約。
如果用作引物，組合物較好地包括至少兩個(gè)與靶分子的不同區(qū)域雜交的核酸分子以擴(kuò)增所需區(qū)域。根據(jù)探針或引物的長(zhǎng)度，靶區(qū)域范圍可以在70％互補(bǔ)堿基到全部堿基互補(bǔ)之間并仍在嚴(yán)格條件下雜交。如為了診斷存在表皮葡萄球菌，雜交核酸(探針或引物)和與雜交核酸雜交的序列(如從樣品獲取的凝固酶陰性葡萄球菌DNA)之間的互補(bǔ)性程度至少應(yīng)足以將核酸的雜交從其他細(xì)菌中區(qū)別開(kāi)來(lái)。
編碼SdrF,SdrG或SdrH蛋白質(zhì)或其部分，如共同序列或可變序列氨基酸基元的核酸序列可插入到載體中，如質(zhì)粒，或重組表達(dá)在有生命的生物體中以制備重組SdrF,SdrG或SdrH蛋白質(zhì)或其片段。例如，制備重組SdrF,SdrG和SdrH的DNA分子已依據(jù)本發(fā)明在質(zhì)粒中制備。
重組蛋白質(zhì)可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備?？寺≥d體，如質(zhì)?；蚴删wDNA用限制性酶切開(kāi)，將編碼SdrF,SdrG或SdrH蛋白質(zhì)或其片段，如共同序列或可變序列氨基酸基元插入到切口部位并連接。然后將克隆載體插入到宿主中以制備由SdrF,SdrG或SdrH編碼DNA編碼的蛋白質(zhì)或其片段。適當(dāng)?shù)乃拗靼?xì)菌宿主如大腸桿菌，枯草芽胞桿菌，酵母及其他細(xì)胞培養(yǎng)物?？墒褂靡阎姆肿由飳W(xué)技術(shù)實(shí)施及增強(qiáng)基因產(chǎn)品的制備和提純。Ⅲ．Sdr核酸的應(yīng)用本文提供了使用本文所描述的核酸檢測(cè)及鑒別存在凝固酶陰性葡萄球菌的方法。這些方法可用于診斷凝固酶陰性葡萄球菌感染和其他相關(guān)疾病如與導(dǎo)管相關(guān)的感染，與生物物質(zhì)相關(guān)的感染，上呼吸道感染(如耳炎，氣管炎，會(huì)厭炎，甲狀腺炎，)，下呼吸道感染(如肺氣腫，肺膿腫)心臟感染(如感染性心內(nèi)膜炎)，胃腸感染(如分泌器官痢疾，脾膿腫，腹膜后膿腫)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染(如腦膿腫)，眼睛感染(如眼瞼炎，結(jié)膜炎，角膜炎，內(nèi)眼炎，preseptal及眼窩蜂窩織炎，darcryocystitis)，腎及尿道感染(如附睪炎，腎內(nèi)和腎周膿腫，毒性休克癥)，皮膚感染(如膿包病，毛囊炎，皮膚膿腫，蜂窩織炎，傷口感染，細(xì)菌肌炎)，骨及關(guān)節(jié)感染(如膿毒性關(guān)節(jié)炎，骨髓炎)，牛乳腺炎，犬齒膿皮病。
該方法包括獲取可能含有凝固酶陰性葡萄球菌樣品步驟。樣品可從個(gè)體中獲取，如從個(gè)體的血液，唾液，組織，骨，肌肉，軟骨，或皮膚中獲取。然后可將細(xì)胞裂解，提取，沉淀并擴(kuò)增DNA。從凝固酶陰性葡萄球菌中檢測(cè)DNA可通過(guò)將擴(kuò)增的DNA與探針雜交來(lái)實(shí)施，凝固酶陰性葡萄球菌探針選擇性地與DNA雜交，如在本發(fā)明的詳細(xì)描述部分中所描述的。雜交檢測(cè)指示存在凝固酶陰性葡萄球菌。
較好地，使用可檢測(cè)的組成促進(jìn)核酸(如探針或引物)雜交檢測(cè)。如探針可用生物素標(biāo)記并使用在鏈霉抗生物素蛋白涂覆的微量滴定板測(cè)試中。其他可檢測(cè)的組成包括放射性標(biāo)記，酶標(biāo)記，和熒光標(biāo)記。
DNA可直接進(jìn)行檢測(cè)，或可在分析前使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或其他擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行酶促擴(kuò)增。RNA或cDNA可進(jìn)行相似的檢測(cè)。SdrF,SdrG或SdrH表達(dá)的增加或減少可使用任何本領(lǐng)域中眾所周知的定量核酸分子的技術(shù)測(cè)定，如擴(kuò)增，PCR,RT-PCR,RN酶保護(hù)，Northern印跡，及其他雜交技術(shù)。
對(duì)SdrF,SdrG或SdrH蛋白質(zhì)或其部分，如共有序列或可變序列氨基酸基元，或抗-SdrF,SdrG或SdrH抗體的診斷檢測(cè)也可用來(lái)測(cè)定表皮葡萄球菌感染的存在。在樣品中鑒別蛋白質(zhì)或抗體含量的檢測(cè)技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，包括方法如放射免疫測(cè)定，Western印跡分析及ELISA測(cè)定。Ⅳ．Sdr蛋白質(zhì)或抗體的應(yīng)用分離的，重組的或合成的蛋白質(zhì)，或其抗原部分(包括帶有抗原表位片段)，或其融合蛋白質(zhì)可給動(dòng)物服用作為免疫原或抗原，單獨(dú)服用或與輔劑組合服用，以制備與SdrF,SdrG或SdrH蛋白質(zhì)或其部分，如共有序列或可變序列氨基酸基元反應(yīng)的抗體。此外，蛋白質(zhì)可用來(lái)篩查從中可獲取對(duì)蛋白質(zhì)有很高親和力的特異抗體的超免疫患者的抗體或抗血清。
可用來(lái)傳遞被動(dòng)免疫的SdrF,SdrG或SdrH或其片段，如共有序列或可變序列氨基酸基元的抗體可用來(lái)預(yù)防凝固酶陰性葡萄球菌感染，用來(lái)治療正在進(jìn)行的感染或用來(lái)作為研究工具。本文所使用的“抗體”包括包括單克隆，多克隆，嵌合的，單鏈的，雙特異性的，猴類(lèi)的和人類(lèi)的抗體以及Fab片段，包括Fab免疫球蛋白表達(dá)文庫(kù)的產(chǎn)品。制備任何這些類(lèi)型抗體或抗體片段對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。
單克隆抗體可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法制備。較好的方法是Kearney等人J.Immunol.123:1548-1558(1979)的方法的修訂版，該文獻(xiàn)通過(guò)在此引述而合并于本文。簡(jiǎn)單地講，將動(dòng)物如鼠或兔子用在輔劑中的免疫原接種，收獲脾細(xì)胞并與骨髓瘤細(xì)胞種系混合，如P3X63Ag8,653。通過(guò)加入聚乙烯乙二醇誘導(dǎo)細(xì)胞融合。通過(guò)將細(xì)胞鋪排在含次黃嘌呤，氨基蝶呤和胸苷的選擇性培養(yǎng)基中以化學(xué)方法選擇雜種細(xì)胞。隨后對(duì)雜種細(xì)胞進(jìn)行制備抗-SdrF,SdrG或SdrH單克隆抗體能力的篩查。將制備抗體的雜種細(xì)胞克隆，擴(kuò)展及冷凍保存作將來(lái)制備使用。
制備單鏈抗體的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，在美國(guó)專(zhuān)利No.4,946,778中作了描述，可用來(lái)制備本文所描述的蛋白質(zhì)的單鏈抗體。噬菌體展示技術(shù)可用來(lái)從進(jìn)行SdrF,SdrG或SdrH或原初文庫(kù)抗體篩查的人的淋巴細(xì)胞的PCR擴(kuò)增基因中，選擇對(duì)SdrF,SdrG或SdrH，或其抗原部分如共有序列或可變序列氨基酸基元具有結(jié)合活性的抗體基因。雙特異抗體含有兩個(gè)抗原結(jié)合域，其中每個(gè)域?qū)χ煌目乖砦弧?br> 任何上述抗體都可用在鑒別及定量凝固酶陰性葡萄球菌中可檢測(cè)的標(biāo)記直接標(biāo)記。在免疫測(cè)定中使用的標(biāo)記對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，通常包括酶，放射性同位素，熒光物質(zhì)，發(fā)光酶和顯色物質(zhì)，包括著色顆粒如膠體金或乳膠珠。適當(dāng)?shù)拿庖邷y(cè)定法包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)。
或者，抗體可通過(guò)與對(duì)免疫球蛋白有親和力的標(biāo)記物質(zhì)反應(yīng)間接標(biāo)記?？贵w可與第二物質(zhì)綴合，用標(biāo)記的對(duì)與抗體綴合的第二物質(zhì)有親和力的第三物質(zhì)檢測(cè)。如，抗體可與生物素綴合，然后使用標(biāo)記的抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白檢測(cè)抗體-生物素綴合物。同樣地，抗體可以與半抗原綴合，然后使用標(biāo)記的抗-半抗原抗體檢測(cè)抗體-半抗原綴合物。標(biāo)記抗體和測(cè)定綴合物的這些和其他方法對(duì)本領(lǐng)域中的技術(shù)人員是眾所周知的。
細(xì)胞外基質(zhì)-結(jié)合蛋白質(zhì)SdrF,SdrG或SdrH或其部分，如共有序列或可變序列氨基酸基元的抗體，也可用在生產(chǎn)設(shè)施或?qū)嶒?yàn)室中以分離附加量的蛋白質(zhì)，如通過(guò)親和層析。如，血纖蛋白原-結(jié)合蛋白質(zhì)SdrG的抗體可用來(lái)分離附加量的血纖蛋白原。
蛋白質(zhì)，或其活性片段，及蛋白質(zhì)的抗體可用在凝固酶陰性葡萄球菌細(xì)菌感染的治療和診斷中，如上面描述的有關(guān)診斷方法，或用來(lái)發(fā)展主動(dòng)或被動(dòng)免疫的抗-凝固酶陰性葡萄球菌疫苗。并且，當(dāng)在體內(nèi)或體外作為藥物組合物給傷口服用戶(hù)用來(lái)覆蓋醫(yī)療設(shè)備或聚合生物物質(zhì)時(shí)，蛋白質(zhì)和抗體都用作阻斷劑，與預(yù)防或抑制凝固酶陰性葡萄球菌與傷口或生物物質(zhì)的結(jié)合。較好地，抗體是修飾的，這樣在服用抗體的患者體內(nèi)其具有較小的免疫原性。如果患者是人，抗體可通過(guò)將雜種細(xì)胞衍生的抗體的互補(bǔ)體決定區(qū)域移植到人的單克隆抗體中“人化”，如在Jones等人，自然321:522-525(1986)中或Tempest等人生物技術(shù)9:266-273(1991)中所描述的及在本文上面所提及的。
用本文所描述的抗體，蛋白質(zhì)及活性片段覆蓋的醫(yī)療設(shè)備或聚合生物物質(zhì)包括但不限于U形釘，縫合線，替換心臟瓣膜，助心設(shè)備，硬質(zhì)及軟質(zhì)隱形眼鏡，眼內(nèi)晶體移植(室前或室后)，其他移植如角膜鑲嵌，角膜-假體，脈管擴(kuò)張器，epikeratophalia設(shè)備，青光眼分流器，視網(wǎng)膜U形釘，虹膜扣，假牙，甲狀腺整形設(shè)備，喉部整形設(shè)備，脈管移植體，軟質(zhì)和硬質(zhì)組織假體，包括但不限于泵，電動(dòng)設(shè)備如刺激器，記錄器，耳假體，起博器，人造喉，牙齒移植，乳房移植，陰莖移植，頭部/面部腱，人造關(guān)節(jié)，腱，韌帶，半月板和盤(pán)，人造骨，人造器官包括人造胰腺，人造心臟，人造肢，和人造瓣膜；擴(kuò)張器，金屬線，導(dǎo)引金屬線，靜脈內(nèi)和靜脈中心導(dǎo)管，激光和球形血管成形術(shù)設(shè)備，脈管及心臟設(shè)備(管，導(dǎo)管，球)，心室助器，血液透析組成，血液充氧器，尿道/輸尿管/泌尿器設(shè)備(Foley導(dǎo)管，擴(kuò)張器，管和球)，通風(fēng)導(dǎo)管(氣管內(nèi)和氣管造口術(shù)管和套箍)，腸飼食管(包括鼻飼，胃內(nèi)和空腸管)，傷口倒流管，用于體腔排放的管如胸腔，腹腔，顱腔，心包腔排放管，血液袋，測(cè)試管，血液收集管，vacutainers，耳咽管，針頭，吸液管，吸液管頭和血液管。
本領(lǐng)域中的技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，本文所使用的“覆蓋的”或“覆蓋”是指將蛋白質(zhì)，抗體或活性片段涂在設(shè)備的表面，較好地涂在會(huì)經(jīng)歷凝固酶陰性葡萄球菌感染的外表面。設(shè)備表面沒(méi)有必要全部由蛋白質(zhì)，抗體或活性片段覆蓋。Ⅴ．藥物組合物免疫組合物，包括疫苗，和其他含SdrF,SdrG或SdrH蛋白質(zhì)或其片段，如共有序列或可變序列氨基酸基元的藥物組合物包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。使用疫苗領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的物料和方法，一種或多種SdrF,SdrG或SdrH蛋白質(zhì)，或活性或抗原片段，單獨(dú)地或與其他抗原一起制成配方或包裝。免疫反應(yīng)可作治療或預(yù)防應(yīng)用，并能提供抗體免疫或分子免疫，如由T淋巴細(xì)胞提供。
免疫組合物如疫苗，和其他藥物組合物可單獨(dú)使用或與其他阻斷劑一起使用，以保護(hù)人或動(dòng)物不得由凝固酶陰性葡萄球菌引起的或加劇的感染。具體地，組合物可用來(lái)保護(hù)人不得心內(nèi)膜炎，毒性休克癥，骨髓炎，附睪炎，蜂窩織炎或許多其他感染。組合物也可保護(hù)人或反芻動(dòng)物不得由凝固酶陰性葡萄球菌感染引起的乳腺炎。疫苗可進(jìn)一步用來(lái)保護(hù)其他種類(lèi)動(dòng)物如犬科和馬科動(dòng)物不得類(lèi)似的凝固酶陰性葡萄球菌感染。
為了增強(qiáng)免疫原性，蛋白質(zhì)抗原可與載體分子綴合。適當(dāng)?shù)拿庖咴暂d體包括蛋白質(zhì)，多肽或肽如清蛋白，血藍(lán)蛋白，甲狀腺球蛋白和它們的衍生物，具體地有牛血清清蛋白(BSA)和匙孔嘁血藍(lán)蛋白(KLH)，多糖，碳水化合物，聚合物，和固相。其他蛋白質(zhì)衍生或非蛋白質(zhì)衍生的物質(zhì)對(duì)本領(lǐng)域中的技術(shù)人員是已知的。免疫原性載體通常分子量至少1,000道爾頓，較好地大于10,000道爾頓。載體分子常常含有活性基團(tuán)以便于與半抗原綴合。羧酸基團(tuán)或氨基酸的氨基基團(tuán)或糖蛋白的糖基團(tuán)常常以這種方式應(yīng)用。缺少這些基團(tuán)的載體可與適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)物質(zhì)反應(yīng)制備。較好地，當(dāng)將免疫原注入動(dòng)物如鼠，兔子，山羊，田鼠，綿羊，豚鼠，雞或其他動(dòng)物中時(shí)，最好是鼠和兔子，免疫反應(yīng)產(chǎn)生?；蛘撸跊](méi)有使用載體時(shí)，含多種蛋白質(zhì)或多肽，或抗原性或免疫性等同物多肽的多抗原肽，可具有充分抗原性以改善免疫原性。
SdrF,SdrG或SdrH蛋白質(zhì)或其部分，如共有序列或可變序列氨基酸基元，或蛋白質(zhì)組合物可以有效量與輔劑一起服用，以增強(qiáng)對(duì)綴合物的免疫原反應(yīng)。這個(gè)時(shí)候，被廣泛使用在人類(lèi)中的唯一的輔劑是明磯(磷酸鋁或氫氧化鋁)。皂苷和其提純組分Quil A,Freund的完全輔劑和其他使用在研究中和醫(yī)獸用輔劑含有限制其在人類(lèi)疫苗中應(yīng)用的毒性。然而，化學(xué)定義的制備品如胞壁酰二肽，單磷酰基脂質(zhì)A，磷脂綴合物如在Goodman-Snitkoff等人的J.Immunol.147:410-415(1991)中所描述的，和蛋白磷脂體內(nèi)封包的綴合物如在Miller等人的J.Exp.Med.,176:1739-1744(1992)中所描述的，和在脂質(zhì)囊中封包的蛋白質(zhì)如Novasome脂質(zhì)囊(微脈管系統(tǒng)有限公司，Nashua,NH)也可使用，這些文獻(xiàn)通過(guò)在此引述而合并于本文。
本文所使用的“疫苗”包括給患者服用的藥物組合物中的DNA疫苗，其中核酸分子編碼SdrF,SdrG或SdrH，或其抗原片段，如任何共有序列或可變序列氨基酸基元。為了基因免疫接種，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適當(dāng)?shù)慕o藥方法包括直接將質(zhì)粒DNA注射到肌肉中(Wolff等人，Hum.Mol.Genet.1:363,1992)，將DNA與特異蛋白質(zhì)載體混合給藥(Wu等人，J.Bio.Chem.264:16985,1989)，用磷酸鈣共沉淀DNA(Benvenisty和Reshef,Proc.Natl.Acad.Sci.83:9551,1986)，將DNA封包在脂質(zhì)體中(Kaneda等人，科學(xué)243:375,1989)，粒子轟擊(Tang等人，自然，356:152,1992和Eisenbraun等人，DNA分子生物學(xué)，12:791,1993)，及使用克隆的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體體內(nèi)感染(Seeger等人Proc.Natl.Acad.Sci.81:5849,1984)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是多核苷酸，其包括在體內(nèi)將所說(shuō)的多核苷酸引入到真核組織中時(shí)能表達(dá)制備基因產(chǎn)品的鄰接核酸序列。編碼的基因產(chǎn)品較好地用作免疫刺激劑或作用能產(chǎn)生免疫反應(yīng)的抗原。這樣，在這個(gè)實(shí)施方案中的核酸序列編碼免疫原抗原表位，是細(xì)胞因子或T-細(xì)胞共同刺激因子，如蛋白質(zhì)B7家族中的成員。
用基因而不是用其基因產(chǎn)品免疫接種有幾種優(yōu)勢(shì)，首先是相對(duì)簡(jiǎn)單，天然或接近天然的抗原可被引入到免疫系統(tǒng)中。哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)重組表達(dá)在細(xì)菌，酵母中，甚至哺乳動(dòng)物細(xì)胞常常需要廣泛的治療與確保適當(dāng)?shù)目乖?。用DNA免疫接種的第二個(gè)優(yōu)勢(shì)是免疫原可能進(jìn)入到MHC-Ⅰ類(lèi)途徑中，并刺激細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)。使用編碼流感A核蛋白質(zhì)(NP)的DNA免疫接種鼠產(chǎn)生對(duì)NP的CD8+反應(yīng)，保護(hù)鼠不受異類(lèi)流感菌株的影響(Montgomery,D.L.等人，細(xì)胞分子生物學(xué)，43(3):285-92,1997和Ulmer等人，疫苗，15(8):792-794,1997)。
細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫對(duì)控制感染是很重要的。因?yàn)镈NA免疫接種可刺激體液和細(xì)胞-調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，所以其大的優(yōu)點(diǎn)是，它提供了相對(duì)簡(jiǎn)單的方法測(cè)定了大量表皮葡萄球菌基因的疫苗潛能。Ⅵ．服用方法及藥物組合物劑量含SdrF,SdrG或SdrH蛋白質(zhì)或其部分，如共有序列或可變序列氨基酸基元，或核酸分子，抗體，或它們的片段的藥物組合物可調(diào)配在藥物載體中，如鹽水，葡萄糖，甘油，乙醇，其他治療用化合物，和它們的組合。配方應(yīng)適于服用方式。組合物可用來(lái)干擾，調(diào)節(jié)，或抑制凝固酶陰性葡萄球菌和宿主細(xì)胞上的血纖蛋白原之間的結(jié)合。
可表達(dá)DNA或引入到疫苗受體中的可轉(zhuǎn)錄RNA的量有很大的劑量范圍，并取決于使用的轉(zhuǎn)錄和翻譯啟動(dòng)子的強(qiáng)度。此外，免疫反應(yīng)的大小取決于蛋白質(zhì)表達(dá)的量及表達(dá)的基因產(chǎn)品的免疫原性。通常，可直接給肌肉組織服用的DNA的有效劑量范圍在約1ng到5mg,100ng到2.5mg,1μg到750μg，較好地約為10μg到300μg。皮下注射，真皮內(nèi)引入，皮膚壓入，及其他服用方式如腹腔內(nèi)，靜脈內(nèi)，或吸入給藥也是適用的。本發(fā)明還考慮提供了推進(jìn)器接種疫苗。下列用多核苷酸免疫原接種疫苗，用蛋白質(zhì)免疫原如SdrH基因產(chǎn)品推進(jìn)也考慮在本發(fā)明中。
多核苷酸可能是“裸的”，即不與影響受體免疫系統(tǒng)的任何蛋白質(zhì)，輔劑或其他試劑結(jié)合。在這種情況下，需要多核苷酸在生理上可接受的溶液中，如但不限于，無(wú)菌鹽水或無(wú)菌緩沖鹽水?；蛘撸珼NA可與脂質(zhì)體結(jié)合，如卵磷脂脂質(zhì)體或此領(lǐng)域中已知的其他脂質(zhì)體，成為DNA-脂質(zhì)體混合物，或DNA可與本領(lǐng)域中已知的輔劑結(jié)合以促進(jìn)免疫反應(yīng)，如蛋白質(zhì)或其他載體。對(duì)細(xì)胞吸收DNA有幫助的試劑，如但不限于鈣離子也可使用。這些試劑本文通常稱(chēng)為轉(zhuǎn)染促進(jìn)試劑或藥物可接受的載體。用多核苷酸涂覆微粒的技術(shù)在本領(lǐng)域中是眾所周知的，也可用在本發(fā)明中。對(duì)于應(yīng)用于人類(lèi)的DNA，可將最終DNA產(chǎn)物置于藥物可接受的載體或緩沖液中。藥物可接受的載體或緩沖液在本領(lǐng)域中眾所周知，包括在多種課本中所描述的，如Remington藥物科學(xué)。
本領(lǐng)域中的技術(shù)人員應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，對(duì)于DNA疫苗接種用藥法最理想的劑量方案包括5到6個(gè)之多，但較好的有3到5個(gè)，更好的1個(gè)到3個(gè)免疫實(shí)體用藥法，間隔少的兩到四周，長(zhǎng)的五到十年，或甚至更長(zhǎng)的間隔。
本申請(qǐng)中公開(kāi)的任何藥物組合物的適當(dāng)?shù)挠盟幏椒ò?，但不限于局部用藥，口服用藥，肛門(mén)用藥，陰道用藥，靜脈內(nèi)用藥，腹腔內(nèi)用藥，肌肉內(nèi)用藥，皮下用藥，鼻內(nèi)用藥，真皮內(nèi)用藥。
對(duì)于局部用藥，組合物配制成藥膏，霜?jiǎng)?，凝膠，洗劑，滴劑(如眼睛滴劑和耳滴劑)，或溶液(如漱口液)。傷口或外科敷裹物，縫合線，和汽霧劑也可充滿(mǎn)組合物。組合物可含有傳統(tǒng)的添加劑，如防腐劑，促進(jìn)滲透的溶劑，和柔和劑。局部用藥配方還可含有傳統(tǒng)的載體如乳脂或軟膏基質(zhì)，乙醇，或油烯基醇。
在一個(gè)較好的實(shí)施方案中，疫苗以對(duì)注射用藥(即肌肉內(nèi)注射，真皮內(nèi)注射，皮下注射)或鼻因用藥(即鼻內(nèi)用藥)免疫接種為一次劑量的形式包裝。疫苗最好通過(guò)肌肉注射到三角肌肌肉中。疫苗較好地與藥物可接受的載體混合以便于服用。載體通常是水或緩沖鹽水，含或不合防腐劑。疫苗也可是凍干的，在服用時(shí)重新懸浮或溶解。
蛋白質(zhì)的微囊化作用會(huì)產(chǎn)生控釋。很多因素影響微囊化作用的具體聚合物的選擇。必須考慮到的所有因素有聚合物合成的再現(xiàn)性，微囊化作用方法，微囊化作用的物料和方法的成本，毒物學(xué)分布，可變釋放動(dòng)力學(xué)的要求，聚合物和抗原的生理學(xué)相容性?？墒褂玫木酆衔飳?shí)例有聚碳酸酯，聚酯，聚亞胺酯，聚原酸酯，聚酰胺，聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)和其他生物可分解的聚合物。在抗原的控釋中使用PLGA由Eldridge等人在微生物學(xué)和免疫學(xué)的當(dāng)前課題，146:59-66(1989)中作了評(píng)述。
對(duì)于人類(lèi)用藥，較好的劑量為從0.01毫克/公斤到10毫克/公斤，推薦劑量為約1毫克/公斤。根據(jù)這個(gè)范圍，對(duì)于較重體重的等同劑量可以確定。劑量應(yīng)調(diào)節(jié)以適應(yīng)給服組合物的個(gè)體，并且隨著個(gè)體的年齡，體重和新陳代謝的不同而變化。疫苗可另外含有穩(wěn)定劑或藥物可接受的防腐劑，如thimerosal[乙基(巰基安息香酸鹽-S)汞鈉鹽](Sigma化學(xué)公司，St.Louis,MO)。Ⅶ．蛋白質(zhì)標(biāo)記綴合物當(dāng)用可檢測(cè)的生物分子或化化學(xué)物質(zhì)標(biāo)記時(shí)，本文所描述的血纖蛋白原結(jié)合蛋白質(zhì)可用來(lái)如在體內(nèi)和體外診斷葡萄球菌感染，或檢測(cè)凝固酶陰性葡萄球菌。通過(guò)使用這樣的Sdr蛋白質(zhì)標(biāo)記綴合物也可促進(jìn)實(shí)驗(yàn)室研究。多種標(biāo)記和將標(biāo)記與蛋白質(zhì)綴合的方法對(duì)本領(lǐng)域中的技術(shù)人員是已知的。下面列出幾種特異標(biāo)記。當(dāng)與蛋白質(zhì)如抗體或受體綴合時(shí)這些標(biāo)記特別有用。
例如，蛋白質(zhì)可與放射性標(biāo)記如，但不限于32P,3H,14C,35S,125I,或131I綴合。對(duì)標(biāo)記的檢測(cè)可使用如閃爍計(jì)數(shù)法，γ射線光譜測(cè)定法，放射自顯影法。
生物熒光標(biāo)記，如螢火蟲(chóng)蟲(chóng)熒光素的衍生物也可使用。通過(guò)傳統(tǒng)方法將生物熒光物質(zhì)與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合，當(dāng)酶如熒光素酶催化與ATP的反應(yīng)時(shí)，產(chǎn)生生物熒光分子發(fā)出光子，標(biāo)記的蛋白質(zhì)被檢測(cè)出來(lái)。
熒光團(tuán)也可用來(lái)標(biāo)記蛋白質(zhì)熒光團(tuán)的實(shí)例包括熒光素及衍生物，藻紅蛋白，藻青蛋白，同分異構(gòu)藻青蛋白，玫瑰精，和Texas紅。熒光團(tuán)通常有熒光檢測(cè)器檢測(cè)。
另外，蛋白質(zhì)也可用顯色物質(zhì)標(biāo)記以提供酶或親和標(biāo)記。如蛋白質(zhì)可被生物素化，這樣蛋白質(zhì)可用在生物素-抗生物素蛋白反應(yīng)中，其也可與標(biāo)記如酶或熒光團(tuán)偶聯(lián)。如蛋白質(zhì)可用過(guò)氧化物酶，堿性磷酸酶或其他酶標(biāo)記，在加入的底物上產(chǎn)生顯色或熒光團(tuán)反應(yīng)。添加劑如5-氨基-2,3-二氫-1,4-phthalazinedione(也稱(chēng)為發(fā)光氨)(Sigma化學(xué)公司，St.Louis,MO)和速度增強(qiáng)劑如p-羥基二苯基(也稱(chēng)p-苯基苯酚)(Sigma化學(xué)公司，St.Louis,MO)也可用來(lái)通過(guò)發(fā)光反應(yīng)擴(kuò)增酶如山葵過(guò)氧化物酶；酶底物的發(fā)光或熒光團(tuán)的dioxetane衍生物也可使用。這樣的標(biāo)記可用酶聯(lián)免疫測(cè)定法(ELISA)或通過(guò)分光光度計(jì)檢測(cè)顏色改變來(lái)測(cè)定。此外，依據(jù)本領(lǐng)域中技術(shù)人員熟知的方法，蛋白質(zhì)可用膠體金標(biāo)記以使用在免疫電鏡術(shù)中。
細(xì)胞中配體的定位可通過(guò)標(biāo)記抗體(如上所述)及檢測(cè)標(biāo)記來(lái)鑒別，依據(jù)本領(lǐng)域中的技術(shù)人員熟知的檢測(cè)標(biāo)記的方法，如使用由Warren和Nelson所描述的方案(分子細(xì)胞生物學(xué)，7:1326-1337,1987)的免疫熒光顯微鏡法。Ⅷ．治療應(yīng)用除了上面描述的治療組合物和方法外，SdrF,SdrG或SdrH蛋白質(zhì)或其部分，如共有序列或可變序列氨基酸基元，核酸分子或抗體可用來(lái)干擾病原體和哺乳動(dòng)物宿主之間的引發(fā)感染的初始物理相互作用，如細(xì)菌，特別是革蘭氏陰性細(xì)菌對(duì)在留置設(shè)備上的哺乳動(dòng)物細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)或傷口中細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)的附著；用來(lái)阻斷SdrF,SdrG或SdrH蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞入侵；用來(lái)阻斷用來(lái)阻斷哺乳動(dòng)物細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)和調(diào)節(jié)組織損失的細(xì)菌SdrF,SdrG或SdrH蛋白質(zhì)或其片段，如共有序列或可變序列氨基酸基元之間的細(xì)菌附著；用來(lái)阻斷不是由留置設(shè)備的植入或外科技術(shù)引發(fā)的感染病理的正常進(jìn)展。Ⅸ．篩查方法SdrF,SdrG或SdrH蛋白質(zhì)，或其片段，如共有序列或可變序列氨基酸基元可用在篩查化合物以確定抑制凝固酶陰性葡萄球菌與宿主分子結(jié)合的化合物的方法中。根據(jù)這種方法，將有興趣的化合物與一種或多種SdrF,SdrG或SdrH蛋白質(zhì)或其片段結(jié)合，測(cè)定或觀察蛋白質(zhì)與血纖蛋白原或其他細(xì)胞外基質(zhì)蛋白結(jié)合程度。如果存在的蛋白質(zhì)產(chǎn)生對(duì)蛋白質(zhì)-血纖蛋白原結(jié)合的抑制作用，那么該化合物可用來(lái)在體內(nèi)或體外抑制凝固酶陰性葡萄球菌。該方法可同樣用來(lái)鑒別促進(jìn)凝固酶陰性葡萄球菌與宿主分子相互作用的化合物。
該方法特別可用來(lái)鑒別具有抑制細(xì)菌或殺菌屬性的化合物。
如，為了篩查凝固酶陰性葡萄球菌激動(dòng)劑，或拮抗劑，將合成反應(yīng)混合物，細(xì)胞區(qū)室(如膜，細(xì)胞外膜或細(xì)胞壁)含有一種或多種SdrF,SdrG或SdrH蛋白質(zhì)，或其片段，如共有序列或可變序列氨基酸基元，和蛋白質(zhì)的標(biāo)記的底物或配體，在存在或不存在所研究的化合物的情況下溫育?；衔锛?dòng)或拮抗蛋白質(zhì)的能力由標(biāo)記配體結(jié)合現(xiàn)象的減少或底物產(chǎn)物的產(chǎn)量減少顯示。結(jié)合好的并且增加底物產(chǎn)物形成速度的化合物是激動(dòng)劑。對(duì)底物產(chǎn)物生產(chǎn)量或速度的檢測(cè)可通過(guò)使用報(bào)道基因系統(tǒng)來(lái)增強(qiáng)，如轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物的比色標(biāo)記底物，對(duì)SdrF,SdrG或SdrH核酸或蛋白質(zhì)活性的改變敏感的報(bào)道基因，和本領(lǐng)域中技術(shù)人員熟知的結(jié)合測(cè)定法。也可使用競(jìng)爭(zhēng)性抑制測(cè)定法。
可能的拮抗劑包括小型有機(jī)分子，肽，多肽，和與SdrF,SdrG或SdrH核酸分子或蛋白質(zhì)或其部分，如共有序列或可變序列氨基酸基元結(jié)合，從而抑制它們的活性的抗體，或與結(jié)合分子(如血纖蛋白原)結(jié)合抑制SdrF,SdrG或SdrH核酸分子或蛋白質(zhì)與其配體結(jié)合的抗體。如，抑制SdrF,SdrG或SdrH活性的化合物可以是與SdrF,SdrG或SdrH蛋白質(zhì)結(jié)合并占據(jù)結(jié)合位點(diǎn)從而阻止與細(xì)胞結(jié)合分子的結(jié)合抑制正常生物活性的小型分子。小型分子的實(shí)例包括但不限于，小型有機(jī)分子，肽或類(lèi)肽分子。其他可能的拮抗劑包括反義分子。較好的拮抗劑包括與SdrF,SdrG或SdrH蛋白質(zhì)，或其部分，如共有序列或可變序列氨基酸基元有關(guān)的化合物，以及SdrF,SdrG或SdrH蛋白質(zhì)，或其部分，如共有序列或可變序列氨基酸基元的變體或衍生物。
本文所描述的核酸分子也可用來(lái)篩查抗細(xì)菌活性的化合物。Ⅹ．凝固酶陰性葡萄球菌的檢測(cè)試劑盒本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有一種或多種SdrF,SdrG或SdrH-特異核酸探針的試劑盒，它能用來(lái)在樣品中檢測(cè)凝固酶陰性葡萄球菌或凝固酶陰性葡萄球菌Sdr蛋白質(zhì)或其部分，如共有序列或可變序列氨基酸基元，或用來(lái)診斷凝固酶陰性葡萄球菌的感染。這種試劑盒也可含有適當(dāng)試劑用來(lái)將探針與樣品雜交并檢測(cè)結(jié)合探針。
在一個(gè)可替換的實(shí)施方案中，試劑盒含有對(duì)一種或多種SdrF,SdrG或SdrH蛋白質(zhì)，或其片段，如共有序列或可變序列氨基酸基元特異的抗體，它可用來(lái)檢測(cè)凝固酶陰性葡萄球菌。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒含有一種或多種SdrF,SdrG或SdrH蛋白質(zhì)，或其活性片段，它可用來(lái)檢測(cè)樣品中凝固酶陰性葡萄球菌生物體或凝固酶陰性葡萄球菌Sdr蛋白質(zhì)的抗體。
本文所描述的試劑盒可另外含有用來(lái)安全地獲取樣品的設(shè)備，存放試劑的容器，計(jì)時(shí)裝置，稀釋樣品的緩沖液，比色計(jì)，放射計(jì)，或測(cè)定顏色變化的對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)。
在一個(gè)較好的實(shí)施方案中，試劑，包括蛋白質(zhì)或抗體是凍干的，最好放在單一容器中。向容器中加入水溶樣品產(chǎn)生凍干試劑的溶液，使它們起作用。最好的是，依據(jù)本領(lǐng)域中的技術(shù)人員熟知的方法，將試劑順序地在單一容器中凍干，以使加入樣品前試劑的反應(yīng)最小化。
實(shí)施例下列實(shí)施例用來(lái)演示本發(fā)明較好的實(shí)施方案。本領(lǐng)域中的技術(shù)人員應(yīng)理解的是，遵循發(fā)明者發(fā)現(xiàn)的技術(shù)的在實(shí)施例中公開(kāi)的技術(shù)，在實(shí)施發(fā)明中起到很好的作用，因此，實(shí)施例中公開(kāi)的技術(shù)可以認(rèn)為組成了實(shí)施發(fā)明的較好模式。然而，本領(lǐng)域中的技術(shù)人員應(yīng)理解的是，根據(jù)本篇公開(kāi)內(nèi)容，在公開(kāi)的具體實(shí)施方案中可以作出許多改變，在沒(méi)有背離本發(fā)明精神和范圍的情況下，仍然可以獲得相同或相似的結(jié)果。實(shí)施例Ⅰ在凝固酶陰性葡萄球菌中識(shí)別Sdr編碼基因在含有二肽天冬氨酸和絲氨酸(DS)的金黃色葡萄球菌中已識(shí)別出五種基因(clfA,clfB,sdrC,sdrD,sdrF)，由18kb重復(fù)基元GAY TCN GAY TCN GAY AGY編碼，其中Y=嘧啶，N=任何堿基。這個(gè)家族的蛋白質(zhì)因絲氨酸-天冬氨酸重復(fù)單元已經(jīng)被命名為Sdr蛋白質(zhì)。所有5種金黃色葡萄球菌sdr基因編碼蛋白質(zhì)都含有使它們?cè)诟锾m氏陽(yáng)性細(xì)菌中成為表面相關(guān)蛋白質(zhì)的屬性；即在N-端有分泌信號(hào)，在C-端有(ⅰ)作為蛋白質(zhì)分泌終止信號(hào)的幾個(gè)正電荷殘基，(ⅱ)疏水跨膜區(qū)域，(ⅲ)細(xì)胞壁中精確分類(lèi)及修正蛋白質(zhì)取向所需的帶有LPXTG基元的壁-跨越區(qū)域。為了在凝固酶陰性葡萄球菌中鑒別編碼細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的新型基因，我們使用clfA的DS編碼區(qū)域作為基因探針來(lái)鑒別是否在不同種類(lèi)的凝固酶陰性葡萄球菌中存在同系物。我們描述的凝固酶陰性葡萄球菌菌種有(1)S.Lugdunensis,(2)S.Haemolyticus,(3)S.Schleiferi，(4)表皮葡萄球菌。每種菌在下面列出。
從Jerome Etienne(里昂，法國(guó))獲取S.Lugdunensis,S.Haemolyticus,S.Schleifri和表皮葡萄球菌每種十個(gè)菌株。此外，Timothy Foster博士的菌株收集中含其他研究者捐助的表皮葡萄球菌。使用從所有凝固酶陰性葡萄球菌菌株中分離出的基因組DNA實(shí)施Southern雜交分析。將染色體DNA用HindⅢ酶切，clfA的DS編碼區(qū)域進(jìn)行DIG標(biāo)記(Boehringer)并用作探針。對(duì)全部十個(gè)S.Lugdunensis菌株的Southern雜交分析顯示9kb的單一HindⅢ片段與clfA的DS編碼區(qū)域雜交。用clfA的DS編碼序列對(duì)S.Haemolyticus菌株的分析顯示了不同大小的片段。在測(cè)試的十個(gè)菌株之中，有6個(gè)菌株在18kb到10kb之間表現(xiàn)出強(qiáng)烈雜交帶。在HindⅢ片段上存在不止一個(gè)DS編碼區(qū)域的可能性是存在的。放射自顯影圖長(zhǎng)時(shí)間曝光后，四個(gè)保留菌株顯示與clfA的DS編碼區(qū)域較弱雜交。clfA探針沒(méi)有在從S.Schleiferi獲取的基因組DNA中檢測(cè)到DS編碼區(qū)域。所有測(cè)試的表皮葡萄球菌菌株顯示出在至少兩個(gè)HindⅢ片段上與clfA的DS編碼區(qū)域雜交。
測(cè)試菌株S.Lugdunensis菌株1．S.Lugdunensis N9401132．S.Lugdunensis N9401643．S.Lugdunensis N9401354．S.Lugdunensis N9502325．S.Lugdunensis N9201436．S.Lugdunensis N9304327．S.Lugdunensis N9400848．S.Lugdunensis N9400259．S.Lugdunensis N91031910．S.Lugdunensis N910320表皮葡萄球菌菌株1．表皮葡萄球菌ATCC1499O(Kloos)2．表皮葡萄球菌KH113．表皮葡萄球菌K284．表皮葡萄球菌TU3298
5．表皮葡萄球菌91426．表皮葡萄球菌14577．表皮葡萄球菌84008．表皮葡萄球菌RP62a9．表皮葡萄球菌N91010210．表皮葡萄球菌N91017311．表皮葡萄球菌N91019112．表皮葡萄球菌N91023113．表皮葡萄球菌N91024914．表皮葡萄球菌N91027515．表皮葡萄球菌N95019016．表皮葡萄球菌N95032917．表皮葡萄球菌N91030818．表皮葡萄球菌N910160S.haemolyticus菌株1．S.Haemolyticus N970612．S.Haemolyticus N9605123．S.Haemolytieus N9101064．S.Haemolyticus N910245．S.Haemolyticus N9201606．S.Haemolyticus N9102877．S.Haemolyticus N92018
8．S.Haemolyticus N9301009．S.Haemolyticus N95025210．S.Haemolyticus N93016S.Schleiferi菌株1．S.Schleiferi JCM74302．S.Schleiferi N9202473．S.Schleiferi N9102454．S.Schleiferi N9100175．S.Schleiferi N9605186．S.Schleiferi N9502427．S.Schleiferi N9201628．S.Schleiferi N920179．S.Schleiferi N93004710．S.Schleiferi N920260在其他表皮葡萄球菌菌株中的sdrF同系物通過(guò)Southern雜交測(cè)定17個(gè)表皮葡萄球菌菌株是否存在sdrF基因。個(gè)體菌株的染色體DNA用HindⅢ酶切，并用sdrF的區(qū)域A編碼序列作為探針探測(cè)。這種DNA探針通過(guò)PCR使用pC5(在實(shí)施例2中作進(jìn)一步描述)作為模板進(jìn)行DIG-標(biāo)記。sdrF基因存在于HindⅢ片段上，從4到10kb變化，并且在測(cè)試的16個(gè)菌株中的12個(gè)中存在。使用clfA的區(qū)域R編碼序列作為探針也鑒別出相同大小的帶，說(shuō)明在其他表皮葡萄球菌菌株中的sdrF同系物也含有區(qū)域R編碼序列。在其他表皮葡萄球菌菌株中的sdrG同系物測(cè)試16個(gè)表皮葡萄球菌菌株是否存在sdrG基因，使用設(shè)計(jì)探測(cè)sdrG的區(qū)域A編碼序列的探針。Southern雜交分析顯示sdrG存在于16kb的HindⅢ片段上，并且在全部測(cè)試的表皮葡萄球菌中存在。用作sdrG的區(qū)域A編碼序列擴(kuò)增的引物序列如下F1-sdrG:5’GATGATGAATTATCAGAC3’R.-sdrG:5’CAGGAGGCAAGTCACCTTG3’(包含sdrG的配位點(diǎn)195到1795)在表皮葡萄球菌菌株中的DS-編碼區(qū)域同系物用HindⅢ酶切染色體DNA，將clfA的DS-編碼區(qū)域進(jìn)行DIG標(biāo)記(Boehringer)并用作探針。Southem雜交分析顯示至少兩個(gè)HindⅢ片段與clfA的DS-編碼區(qū)域雜交。十個(gè)菌株與三個(gè)HindⅢ片段雜交。實(shí)施例2研究凝固酶陰性葡萄球菌中的Sdr基因，并鑒別，分離，測(cè)序及表達(dá)SdrF,SdrG和SdrH總述表皮葡萄球菌菌株可表達(dá)三種不同的含絲氨酸-天冬氨酸二肽重復(fù)單元的與細(xì)胞表面相關(guān)蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)SdrF和SdrG在序列上和結(jié)構(gòu)組織上與金黃色葡萄球菌的Sdr蛋白質(zhì)相似。它們?cè)谒鼈兊腘-端分別包括625和548個(gè)殘基獨(dú)特區(qū)域A，接著可變數(shù)量的110-119個(gè)殘基區(qū)域B，一個(gè)SD重復(fù)區(qū)域，以及與肽聚糖共價(jià)錨定的C-端的LPXTG基元和表面蛋白質(zhì)特有的疏水域。相對(duì)照，SdrH包括在N-端的較短的60個(gè)殘基區(qū)域A，接著一個(gè)SD重復(fù)區(qū)域，一個(gè)獨(dú)特的277個(gè)殘基區(qū)域C，和C-端疏水域。SdrH缺少LPXTG基元。編碼SdrF,SdrG和SdrH的每個(gè)區(qū)域A的DNA克隆到E.Coli的表達(dá)載體中，表達(dá)并提純重組蛋白質(zhì)。在兔子中培養(yǎng)特異抗血清并用來(lái)鑒別用表皮葡萄球菌表達(dá)的Sdr蛋白質(zhì)。從生長(zhǎng)到指數(shù)期的細(xì)胞的溶-葡萄球菌酶產(chǎn)生的原生質(zhì)體中只釋放出SdrF。SdrG和SdrH保持與原生質(zhì)體部分結(jié)合，因此沒(méi)有分類(lèi)并與肽聚糖結(jié)合。在Southern雜交分析中，SdrG和SdrH在測(cè)試的全部十六個(gè)菌株中都存在，而SdrF只在十二個(gè)菌株中存在。從已經(jīng)從表皮葡萄球菌感染恢復(fù)的十五個(gè)患者中獲取的抗血清含有與SdrF,SdrG和SdrH的重組區(qū)域A反應(yīng)的抗體，這說(shuō)明這些蛋白質(zhì)在感染期間被表達(dá)了。背景表皮葡萄球菌是人類(lèi)皮膚常見(jiàn)的居住者并是外源物感染的常見(jiàn)病因。由于生物體能與留置設(shè)備先附著，接著形成生物膜而促使致病，留置設(shè)備有如人造瓣膜，整形外科設(shè)備和靜脈內(nèi)和腹膜內(nèi)導(dǎo)管。設(shè)備相關(guān)感染危及治療的成功并大大增加了患者的發(fā)病率(11)。
表皮葡萄球菌對(duì)合成表面的附著作用與表面的疏水性和細(xì)胞表面蛋白質(zhì)有關(guān)(2,13)。表皮葡萄球菌的蛋白酶治療已顯示降低了疏水性和附著作用(24)，與表皮葡萄球菌的220kDa細(xì)胞表面蛋白質(zhì)反應(yīng)的單克隆抗體能部分阻斷細(xì)菌對(duì)聚苯乙烯的附著作用(30)。由ica操縱子表達(dá)的多糖對(duì)形成生物膜是至關(guān)重要的。一種觀點(diǎn)認(rèn)為，多糖附著因子(PS/A)同時(shí)影響附著作用和與生物膜形成的累積時(shí)期有關(guān)的細(xì)胞與細(xì)胞間的相互作用。另一種觀點(diǎn)認(rèn)為，附著作用是由表面相關(guān)蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)，而多糖只影響積累時(shí)期(5,12,19)。
如同表皮葡萄球菌一樣，金黃色葡萄球菌也可與醫(yī)療植入設(shè)備附著，但這種附著作用主要由對(duì)植入后短時(shí)間覆蓋生物物質(zhì)表面的宿主血纖蛋白原和纖連蛋白原特異的細(xì)菌受體調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)這些相互作用的金黃色葡萄球菌附著因子包括血纖蛋白原結(jié)合蛋白質(zhì)，ClfA和ClfB，纖連蛋白原結(jié)合蛋白質(zhì)，F(xiàn)nbpA和FnbpB[在(3)中作了評(píng)述]。盡管表皮葡萄球菌有可能與血纖蛋白原，纖連蛋白原，玻連蛋白，層粘連蛋白(6,25,29)，但對(duì)有關(guān)調(diào)節(jié)這些相互作用的特異附著因子及這些相互作用如何影響細(xì)菌對(duì)由宿主蛋白質(zhì)覆蓋的生物物質(zhì)附著作用了解很少。
金黃色葡萄球菌的血纖蛋白原結(jié)合從生因子蛋白質(zhì)(或ClfA)(如圖1A)特點(diǎn)在于存在絲氨酸-天冬氨酸(SD)二肽重復(fù)區(qū)域(在以前的研究中稱(chēng)為區(qū)域R)，位于配體結(jié)合區(qū)域A和C-端序列之間，并與對(duì)細(xì)胞壁的附著作用有關(guān)(16,17)。SD-重復(fù)區(qū)域預(yù)計(jì)跨越細(xì)胞壁并從細(xì)菌表面延伸到配體結(jié)合區(qū)域(4)。ClfA是在金黃色葡萄球菌中發(fā)現(xiàn)的SD-重復(fù)(Sdr)蛋白質(zhì)家族的前體。其他成員包括ClfB(第二血纖蛋白原結(jié)合從生因子),SdrC,SdrD和SdrE(圖5A)(8,21)。SdrC,SdrD和SdrE蛋白質(zhì)含有其他重復(fù)單元，稱(chēng)為區(qū)域B重復(fù)單元，位于區(qū)域A和SD重復(fù)單元之間。每個(gè)B重復(fù)單元長(zhǎng)度為110-113個(gè)氨基酸并含有推定的Ca2+結(jié)合，EF-手基元。Ca2+結(jié)合已經(jīng)顯示是區(qū)域B重復(fù)單元結(jié)構(gòu)完整所需的(9)。SdrC,SdrD和SdrE的功能還不了解，但蛋白質(zhì)假定通過(guò)它們的區(qū)域A與宿主基元分子相互作用。
這個(gè)實(shí)施例描述了由表皮葡萄球菌表達(dá)的三種Sdr蛋白質(zhì)。兩種含有與金黃色葡萄球菌的Sdr蛋白質(zhì)相同的結(jié)構(gòu)組織及相似的序列，而SdrH是不同的。編碼這些蛋白質(zhì)的基因在表皮葡萄球菌菌株中是普遍的。在康復(fù)期患者中存在對(duì)每種Sdr區(qū)域A反應(yīng)的抗體說(shuō)明在感染期間蛋白質(zhì)被表達(dá)。材料和方法細(xì)菌菌株和生長(zhǎng)條件E.coli XL-1藍(lán)或JM109用作為重組宿主菌株。菌株XL-1藍(lán)或TOPP3(Stratagene,La Jolla,CA)細(xì)胞用作蛋白質(zhì)表達(dá)。細(xì)菌在補(bǔ)充有100μg/ml的氨卡青霉素(USB,Cleveland,OH)的Luria肉湯或瓊脂(Gibco BRL,Gaithersburg,MD)中常規(guī)生長(zhǎng)。表皮葡萄球菌菌株(表2)在胰蛋白酶大豆肉湯(TSB)或瓊脂(TSA)(Difco,Detroit,MI)中生長(zhǎng)。Sdr基因的克隆和測(cè)序從表皮葡萄球菌菌株9491中克隆SdrF基因。長(zhǎng)度范圍為6.5到7.5kb的HindⅢ-DNA片段從瓊脂糖凝膠中分離并連接到用HindⅢ消化的pBluescript SK+克隆載體(Stratagene)中，用小牛小腸堿性磷酸酶(CIAP)(Promega,Madison,WI)處理。使用朝向ClfA的編碼SD-重復(fù)區(qū)域的DNA的引物(P3和P4引物，表3)，通過(guò)PCR篩查(27)確定一個(gè)重組質(zhì)粒，pC5。
從用已用Sau3A部分消化并連接到入Gem-11(Promega)的半位點(diǎn)XhoI臂中的DNA制備的表皮葡萄球菌菌株K28的入Gem-11文庫(kù)克隆SdrG基因。包裝后，通過(guò)表示ClfA SD-重復(fù)單元區(qū)域的DNA探針的雜交作用鑒別陽(yáng)性噬菌體，稱(chēng)為E6-2。然后將從E6-2中獲取的SacI-KpnⅠ DNA片段亞克隆到E.Coli質(zhì)粒載體，pZero(Invitrogen,Carlsbad,CA)中。然后將克隆用限制性?xún)?nèi)切核酸酶定位，將含與編碼SD-重復(fù)單元氨基酸序列的DNA相同的DNA的3.5kb的EcoRⅠ-KpnⅠ片段亞克隆pUC18(Amersham Pharmacia Biotech,piscataway,NJ)中以制備pE6-2。
下面克隆SdrH基因。從表皮葡萄球菌菌株9491基因組DNA中獲取的HindⅢ片段按大小分級(jí)在5-20％蔗糖梯度上。將從含1.5-2.5kb片段的組分中獲取的DNA連接到用HindⅢ消化及用CIAP(Promega)脫磷酸化的pBluescript中。通過(guò)集落印跡雜交，使用制作用來(lái)探測(cè)編碼ClfA SD-重復(fù)單元區(qū)域DNA的DIG標(biāo)記(Boehringer,Mannheim,Indianapolis,IN)探針篩查含連接產(chǎn)物的E.Coli轉(zhuǎn)化體。
在兩條克隆的DNA鏈上實(shí)施自動(dòng)雙脫氧-DNA測(cè)序。在大多數(shù)情況中，使用引物行走實(shí)施DNA序列在給定克隆體上的延伸。然而，這種方法不能覆蓋編碼SdrF的SD-重復(fù)單元的重復(fù)DNA的長(zhǎng)度。因此，DNA的這個(gè)區(qū)域用Sau3A從pC5中切除，并連接到pBluescript中，用作構(gòu)建核酸外切酶缺失衍生物(Erase-a-base,Promega)。兩條鏈上的適當(dāng)缺失(未顯示)通過(guò)PCR篩查和選擇性制圖確定。
表2使用在這項(xiàng)研究中的表皮葡萄球菌菌株 注釋和屬性 來(lái)源或參比□□9491□SdrF和SdrH原型菌株□ATCC菌株□□ATCC14990□參比菌株KH11 P.VaudauxK28SdrG原型菌株 P.VaudauxRP62a可轉(zhuǎn)化菌株TU3298生物膜模型 F.Gotz9142D.Mack1457D.Mack8400N910308參比菌株，法國(guó)，里昂J.EtienneN910160參比菌株，法國(guó)，里昂J.EtienneN910102參比菌株，法國(guó)，里昂J.EtienneN910173參比菌株，法國(guó)，里昂J.EtienneN910191參比菌株，法國(guó)，里昂J.EtienneN910231參比菌株，法國(guó)，里昂J.EtienneN910249參比菌株，法國(guó)，里昂J.Etienne
表3使用在DNA探針和蛋白質(zhì)表達(dá)構(gòu)建的PCR擴(kuò)增中的引物擴(kuò)增區(qū) 序列 指定 模板域 載體 DNAClfA SD F:GCCGGATCCCCAATTCCAGAGGATTCANa PCF重復(fù) R:GCCAAGCTTATTGTTAGAACCTGACTC 48SD重復(fù) P3:GATTCAGATAGCCATTC Na SdrP4:CTGAGTCACTGTCTGAG克隆SdrF區(qū) F:CCCGGATCCGCTGAAGACAATCAATTAG PQE菌株域AR:CCCAAGCTTAATTATCCCCCTGTGCTG30 9491SdrG區(qū) F:CCCGGATCCGAGGAGAATACAGTACAAGA PQE菌株域ACG 30 K28R:CCCGGTACCTAGTTTTTCAGGAGGCAAGTCACCSdrH全 F:CCCGGATCCGAAGGTAATCATCCTATTGAC PQE菌株長(zhǎng) R:CCCAAGCTTACTTTTTTCTAAAGATATATA 30 9491GTCCSdrF區(qū) F如上 PGE菌株域A R:CCCGAATTCAATTATCCCCCTGTGCTGTTG X- 94912TSdrG區(qū) F如上 PGE菌株域AR:CCCGAATTCTAGTTTTTCAGGCAAGTCACC X- K282TSdrH區(qū) F:GGCGGATCCGAAGGTAATCATCCTATTG PGE菌株域A X- 9491R:GGCAAGCTTCTAAATATGTGTCATTTTC KGNa不可適用下劃線用來(lái)克隆的限制性?xún)?nèi)切核酸酶位點(diǎn)Southern雜交其他地方已經(jīng)對(duì)Southern印跡轉(zhuǎn)移和雜交進(jìn)行了描述(8)。DNA探針從編碼ClfAd SD重復(fù)區(qū)域或編碼SdrF,SdrG和SdrH的每個(gè)區(qū)域A(表3)的PCR產(chǎn)物制備。使用Taq DNA聚合酶(Gibco BRL)制備PCR產(chǎn)物，探針是異羥基洋地黃毒苷配基(Boehringer Mannheim)或熒光素(Amersham)標(biāo)記的。蛋白質(zhì)表達(dá)和提純以制備抗血清使用適當(dāng)?shù)囊?表3)，通過(guò)從表皮葡萄球菌菌株9491或K28中獲取的基因組模板DNA的PCR擴(kuò)增，獲得編碼重組SdrF,SdrG或SdrH區(qū)域A的DNA。SdrF區(qū)域A構(gòu)建缺少末端殘基，脯氨酸。PCR使用Pfu DNA聚合酶(Stratagene)；說(shuō)明書(shū)中已作了描述(7)。PCR產(chǎn)物用適當(dāng)?shù)南拗菩詢(xún)?nèi)切核酸酶消化，并連接到表達(dá)載體PQE30(Qiagen,Valencia,CA)中以制備組氨酸-標(biāo)記蛋白質(zhì)，或連接到PGEX-2T(Pharmacia)或PGEX-KG中以制備GST-標(biāo)記蛋白質(zhì)。通過(guò)培養(yǎng)4升重組生物體到光學(xué)密度(OD600)到0.5并用0.3mM異丙基-1-硫βD-半乳糖苷(IPTG)(Gibco BRL)誘導(dǎo)兩個(gè)小時(shí)，將蛋白質(zhì)表達(dá)到E.Coli中。將細(xì)胞收獲在PBS(150mM氯化鈉，4.3mMNa2HPO4,1mM NaH2PO4)中并在-80℃冷凍。E.coli流經(jīng)French濾紙，這些裂解物的上清液通過(guò)0.45μm的膜過(guò)濾。存在于上清液中的溶解的組氨酸-標(biāo)記蛋白質(zhì)通過(guò)金屬螯合色譜法進(jìn)行初始提純。將上清液加在5毫升帶Ni2+-電荷的HiTrap螯合柱(Pharmacia Biotech有限公司)中，用200毫升線性梯度的0-200mM咪唑的4mM Tris-鹽酸，100mM氯化鈉溶液，pH7.9，以流速5毫升每分鐘洗脫結(jié)合蛋白質(zhì)。含重組蛋白質(zhì)的組分通過(guò)SDS-PAGE(如下)確定，混合，并用25mM Tris-鹽酸，pH8.0透析。將透析蛋白質(zhì)濃縮，并用離子交換色譜法通過(guò)將樣品加到5毫升HiTrap Q柱(Pharmaeia Biotech有限公司)中，用200毫升線性梯度的0-0.5M氯化鈉的25mM Tris-鹽酸，pH9.0，以流速5毫升每分鐘洗脫結(jié)合蛋白質(zhì)進(jìn)一步提純。含重組蛋白質(zhì)的組分通過(guò)SDS-PAGE確定。從如上獲得的E.Coli溶胞物中提純GST標(biāo)記的蛋白質(zhì)。在重力作用流動(dòng)下，溶胞物流經(jīng)10毫升的谷胱甘肽-瓊脂糖柱，并用五倍柱體積的PBS沖洗。用新鮮制備的5mM還原的谷胱甘肽(Sigma)的50mM Tris-鹽酸溶液，pH8.0從柱上將蛋白質(zhì)洗脫。提純的蛋白質(zhì)用來(lái)在新西蘭白兔中培養(yǎng)抗血清，使用由HTI Bioproducts(Romano,CA)或由愛(ài)爾蘭國(guó)立大學(xué)生物學(xué)核心實(shí)驗(yàn)室(愛(ài)爾蘭，都柏林)公開(kāi)的標(biāo)準(zhǔn)方案。SDS-PAGE和Western印跡轉(zhuǎn)移SDS-PAGE使用含10％丙烯酰胺的trycine凝膠(28)。使用半干轉(zhuǎn)移細(xì)胞(Bio-Rad，實(shí)驗(yàn)室，Hercules,CA)，將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Immobilon-P.Millipore,Bedford,MA)上。在還原條件下將所有蛋白質(zhì)加熱變性。提純的蛋白質(zhì)(每種1ug)用SDS-PAGE處理并用Coomassie亮藍(lán)染色。獲取E.Coli溶胞物或溶胞物組分，如下IPTG誘導(dǎo)，重組E.Coli培養(yǎng)到OD600為2.0，沖洗并重新懸浮到初始體積量的PBS中，制備SDS-PAGE。將10μl的每種制備物裝入各自的含丙烯酰胺的培養(yǎng)皿中。表皮葡萄球菌菌株在含有1.25U每10毫升內(nèi)切蛋白酶抑制劑α2-巨球蛋白(Boehringer Mannheim)的TSB中培養(yǎng)到早期穩(wěn)定期。將細(xì)胞調(diào)節(jié)到OD600為2.0，沖洗并重新懸浮到一半初始體積量中。在溶葡萄球菌酶(100μg/ml)和溶解酵素(100μg/ml)前加入蛋白酶抑制劑(4mM苯基甲基磺酰氟，1mM N-乙基-順丁烯二酰亞胺，和25mM氨基己酸)和DNA(10μg/ml)。在37℃搖晃下實(shí)施酶促消化30分鐘。使用相同的條件，在存在30％蜜三糖的情況下從原生質(zhì)體中分離細(xì)胞壁蛋白質(zhì)。用如處理E.Coli的方式處理表皮葡萄球菌溶胞物或溶胞物組分。將30μl等分樣品置于含丙烯酰胺的培養(yǎng)皿中。免疫測(cè)定法如下實(shí)施Western免疫測(cè)定法將Western印跡在含有1％無(wú)脂肪干奶的PBS中溫育1小時(shí)。然后用抗血清(稀釋在PBS-奶中)將印跡溫育1小時(shí)。單克隆，抗組氨酸抗體(Clonetech,Palo,Alto,CA)稀釋到1∶3000?？筍drFA抗血清(免疫，預(yù)免疫，和抗原吸收的)稀釋到1∶30,000；抗-SdrGA抗血清稀釋到1∶2000，抗-SdrHA抗血清稀釋到1∶1000?？寡逦找炎髁嗣枋?14)。簡(jiǎn)單地講，抗-SdrFA和抗-SdrGA抗血清分別被存在于已被超聲波降解然后離心的誘導(dǎo)E.coli不溶組分中的GST標(biāo)記的SdrGA和SdrFA蛋白質(zhì)廣泛地吸收。這種方法用來(lái)除去存在于每種抗血清中可能的交叉反應(yīng)抗體。通過(guò)使用分別含有GST標(biāo)記的SdrFA,SdrGA和SdrHA的E.coli溶胞物吸收每種抗血清來(lái)除去免疫反應(yīng)的抗-SdrFA,-SdrGA和-SdrHA抗體。接著溫育抗血清，用PBS沖洗Western印機(jī)三次，并用與堿性磷酸酶(Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室)綴合的山羊，抗-兔或抗-鼠IgG的1∶2000稀釋液溫育30分鐘。沖洗印跡，然后在顯色底物(150μg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯p-甲苯胺鹽和300μg/ml的p-硝基藍(lán)四唑氯的重碳酸鹽緩沖液)中顯影10到15分鐘。
康復(fù)期患者IgG對(duì)重組蛋白質(zhì)的反應(yīng)性已有描述(1)。收集從表皮葡萄球菌感染恢復(fù)的15名個(gè)體的抗血清，使用蛋白質(zhì)-A瓊脂糖凝膠層析法提純IgG。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)用來(lái)演示IgG(每個(gè)培養(yǎng)皿2μg)對(duì)涂覆在微量滴定板上的重組蛋白質(zhì)(每個(gè)培養(yǎng)皿1μg)的反應(yīng)性。結(jié)果SdrF,SdrG和SdrH基因的鑒另對(duì)表皮葡萄球菌的初步Southern雜交分析顯示存在幾個(gè)與編碼金黃色葡萄球菌Sdr蛋白質(zhì)家族(未公開(kāi)觀察結(jié)果)的SD重復(fù)單元的DNA雜交的位點(diǎn)。為了進(jìn)一步描述這些位點(diǎn)，我們克隆了從表皮葡萄球菌菌株9491和K28獲取的三個(gè)DNA片段。通過(guò)直接將HindⅢ-DNA片段連接到E.Coli質(zhì)粒載體中從菌株9491獲得兩個(gè)克隆體，pC5和pC28。第三個(gè)克隆體，E6-2從由菌株K28制備的入Gem-11基因組文庫(kù)中獲得。E6-2插入DNA的片段亞克隆到E.coli質(zhì)粒載體中形成pE6-2。pC5,pE6-2和pC28發(fā)現(xiàn)分別有6.8,6.0，和2.0kb的DNA插入(未顯示)。
DNA序列分析顯示在每個(gè)質(zhì)粒中存在單一開(kāi)放讀框(ORF)。ORP，稱(chēng)為SdrF,SdrG和SdrH，分別有5199,2793和1461個(gè)堿基對(duì)。亮氨酸，而不是蛋氨酸，密碼子預(yù)計(jì)作為SdrG的翻譯起始密碼子?？赡艿暮颂求w結(jié)合位點(diǎn)(GGAG)確定為每個(gè)ORF5’的7到12個(gè)堿基對(duì)。drF,SdrG和SdrH ORF的側(cè)翼500到1000個(gè)堿基對(duì)的DNA序列不同，說(shuō)明它們不象金黃色葡萄球菌的SdrC,SdrD和SdrE基因那樣銜接結(jié)合(數(shù)據(jù)未顯示)。SdrF,SdrG和SdrH的推導(dǎo)氨基酸序列表皮葡萄球菌SdrF和SdrG蛋白質(zhì)的氨基酸結(jié)構(gòu)組織與金黃色葡萄球菌的Sdr蛋白質(zhì)的相似，因此具有典型的共價(jià)錨定革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的肽聚糖的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的特性。這些細(xì)胞表面特性包括在疏水膜跨越區(qū)域后C端盡頭的正電荷殘基，LPXTG基元。SD重復(fù)區(qū)域位于LPXTG基元的N-端并認(rèn)為貫穿細(xì)胞壁(4,10)。SdrF和SdrG在它們的N-端含有預(yù)定的信號(hào)序列(分別為52和50個(gè)殘基)，在它們的C-端含有與細(xì)胞壁連接有關(guān)的殘基(圖5B和5C)。SdrF和SdrG的SD重復(fù)區(qū)域(如下)分別終止7個(gè)和13個(gè)殘基，最接近LPXTG基元。SdrF和SdrG的SD重復(fù)區(qū)域分別含有558和56個(gè)殘基(圖5B)。SdrG的二肽組合物沒(méi)有從絲氨酸和天冬氨酸偏離，而在SdrF中，在SD重復(fù)區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)26個(gè)丙氨酸。成熟蛋白質(zhì)(損失信號(hào)序列)的預(yù)計(jì)分子量對(duì)于SdrF為179kDa，對(duì)于SdrG為97.6kDa。
金黃色葡萄球菌的Sdr蛋白質(zhì)每種具有結(jié)構(gòu)性特點(diǎn)，在它們的N-端有已知的或推定的配體結(jié)合域，稱(chēng)為區(qū)域A(8,16,21)。成熟SdrF和SdrG的N-端分別有625和548個(gè)氨基酸區(qū)域A。成對(duì)地比較顯示SdrF和SdrG區(qū)域A的氨基酸序列彼此有22％相同，與金黃色葡萄球菌的Sdr蛋白質(zhì)的區(qū)域A有20-35％(平均23％)相同。
在金黃色葡萄球菌Sdr蛋白質(zhì)的區(qū)域A內(nèi)已報(bào)道有氨基酸序列基元，這些基元包括在ClfB內(nèi)的推定的Ca2+結(jié)合EF-手基元，在ClfB內(nèi)的陽(yáng)離子調(diào)整MIDAS基元，和常見(jiàn)的Sdr蛋白質(zhì)基元，TYTFDYVD，不了解功能(8,23)。SdrF和SdrG區(qū)域A都含有TYTFDYVD基元，在SdrG的區(qū)域A中發(fā)現(xiàn)EF-手基元(DYSEYEDVTNDDY)。
金黃色葡萄球菌的三種Sdr蛋白質(zhì)(SdrC,SdrD和SdrE)含有可變數(shù)量的110-113個(gè)氨基酸的片段，稱(chēng)為區(qū)域B(圖5A)，每個(gè)重復(fù)單元含有推定的Ca2+結(jié)合EF-手基元(8,9)。同樣地，SdrF含有四個(gè)區(qū)域B重復(fù)單元(119,110,111和111個(gè)殘基)，SdrG含有兩個(gè)區(qū)域B重復(fù)單元(113和111個(gè)殘基)(圖5B)。每個(gè)重復(fù)單元含有推定EF-手基元，帶有共有序列DX(N/D)X(D/N)GXX(D/N/G)XX(E/D)。SdrF和SdrG區(qū)域B重復(fù)單元彼此有43-58％相同，與在金黃色葡萄球菌Sdr蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的區(qū)域B有39-73％(平均54％)相同。
SdrH的結(jié)構(gòu)組織與SdrF和SdrG的結(jié)構(gòu)組織在氨基酸序列量上相當(dāng)不同。在其N(xiāo)-端的可能的30殘基信號(hào)序列后，SdrH有獨(dú)特的60殘基鏈(區(qū)域A)，接著120-殘基SD重復(fù)區(qū)域和277-殘基片段，區(qū)域C，在其C-端含有疏水序列，但缺少適當(dāng)定位的LPXTG基元。然而，在疏水區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)LGVTG序列(圖1B,1C)。SdrH不含區(qū)域B重復(fù)單元。SdrH的區(qū)域A和區(qū)域C不含與其他已知的Sdr蛋白質(zhì)或各種數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白質(zhì)相同的氨基酸序列。與其他Sdr蛋白質(zhì)相同的基元也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。SdrH的成熟分子量預(yù)計(jì)為50.5kDa。
總之，這些結(jié)果說(shuō)明表皮葡萄球菌能表達(dá)兩種與金黃色葡萄球菌Sdr蛋白質(zhì)家族有關(guān)的蛋白質(zhì)，并且能表達(dá)具有新型結(jié)構(gòu)的第三中Sdr蛋白質(zhì)。表皮葡萄球菌菌株中SdrF,SdrG和SdrH的分布在Southern雜交分析中，表現(xiàn)ClfA的SD重復(fù)單元編碼區(qū)域的DNA探針與幾種基因組HindⅢ片段在十六個(gè)表皮葡萄球菌菌株中雜交(如圖6A)。在大多數(shù)菌株中觀察到三個(gè)雜交片段，推測(cè)為SdrF,SdrG和SdrH基因。為了證實(shí)推測(cè)并確定在這些菌株中基因的頻率，用對(duì)編碼每個(gè)區(qū)域A的DNA特異的探針實(shí)施其他分析測(cè)定法。SdrH探針在全部菌株內(nèi)與1.8-6.5kb片段雜交(圖6B)。SdrG探針在全部菌株內(nèi)與16kb片段雜交(圖6C)。此外，在16個(gè)菌株的4個(gè)(KH11,K28,RP62a,和N910102)中探針與3.4kb的HindⅢ片段雜交。然而，同樣的3.4kb片段不與對(duì)編碼SD重復(fù)單元的DNA特異的探針雜交(圖6A)，說(shuō)明存在的與SdrG區(qū)域A相同的基因沒(méi)有SD重復(fù)區(qū)域。圖6D顯示了用SdrG和SdrF區(qū)域A DNA探測(cè)的Southern印跡。SdrF探針在16個(gè)菌株中的12個(gè)中與4.5kb-10kb間的HindⅢ-DNA片段雜交(菌株K28,RP62a,N910173，和N910191缺少雜交帶)。這些結(jié)果說(shuō)明SdrF,SdrG和SdrH基因在表皮葡萄球菌中是普遍的。表皮葡萄球菌中SdrF,SdrG和SdrH的表達(dá)使用免疫法測(cè)定是否表皮葡萄球菌表達(dá)SdrF,SdrG和SdrH。培養(yǎng)特異兔抗血清重組表現(xiàn)不同區(qū)域A的融合蛋白質(zhì)(稱(chēng)為SdrFA,SdrGA和SdrHA)。將SdrFA和SdrGA與聚組氨酸(Hisn)融合，SdrHA與GST融合(圖7A)。通過(guò)一組含不同蛋白質(zhì)融合物的重組蛋白質(zhì)證實(shí)抗血清的單特異性。具體地，培養(yǎng)的Hisn-SdrFA和-SdrGA的抗血清分別不與GST-SdrGA和-SdrFA交叉反應(yīng)(圖7B)。此外，這些相同的抗血清不與GST-SdrHA交叉反應(yīng)(圖7B)。培養(yǎng)的Hisn-SdrHA抗血清與全長(zhǎng)Hisn-SdrH蛋白質(zhì)反應(yīng)，但不與Hisn-SdrFA或-SdrGA蛋白質(zhì)反應(yīng)(圖7C)。
通過(guò)Western免疫印跡法，區(qū)域A特異抗血清可用來(lái)在其同類(lèi)表皮葡萄球菌的裂解物中確定原生SdrF,SdrG和SdrH?？?SdrFA抗血清與菌株9491的230kDa帶反應(yīng)(圖8A)。在用Western印跡與預(yù)免疫抗血清或與已經(jīng)用表達(dá)GST-SdrFA融合蛋白質(zhì)的E.coli溶胞物吸附的抗-SdrFA抗血清反應(yīng)時(shí)，這條帶沒(méi)有出現(xiàn)(圖8A)。抗-SdrGA抗血清與表皮葡萄球菌菌株K28的裂解物中的170kDA帶反應(yīng)。在與預(yù)免疫抗血清或與已經(jīng)用表達(dá)GST-SdrGA融合蛋白質(zhì)的E.coli溶胞物吸附的抗-SdrGA抗血清反應(yīng)時(shí)，這條帶沒(méi)有出現(xiàn)(圖8B)。SdrHA的抗血清在菌株9491中識(shí)別出75kDa的帶，這種反應(yīng)性可通過(guò)用存在于E.coli溶胞物中的重組SdrH吸附抗血清來(lái)除去(圖8C)?？?SdrFA,-SdrGA和-SdrHA免疫反應(yīng)帶的表觀分子量比從推導(dǎo)氨基酸序列推定的分子量(分別為179,97，和50kDa)要大。在SDS-PAGE上減少的移動(dòng)已被解釋為兩種金黃色葡萄球菌Sdr蛋白質(zhì)，ClfA和ClfB，其中觀察到多達(dá)50％-100％的預(yù)計(jì)分子量增加。Sdr蛋白質(zhì)的酸性屬性建議用來(lái)解釋這些觀察結(jié)果。在表皮葡萄球菌中SdrH分子量的不同Western免疫印跡分析，不同菌株的表皮葡萄球菌含有具有不同表觀分子量的SdrH，表觀分子量在60到75kDa之間變化(圖9A)。ClfA分子量的不同認(rèn)為與SD重復(fù)區(qū)域的長(zhǎng)度有關(guān)(15)。對(duì)從上面使用的表皮葡萄球菌菌株獲取的SdrH基因的PCR分析顯示，編碼SD重復(fù)區(qū)域的DNA大小的不同與在Western印跡上SdrH蛋白質(zhì)的分子量的不同有關(guān)。相反，編碼每個(gè)SdrF區(qū)域C的DNA的PCR產(chǎn)物大小是相似的(圖9B)。在細(xì)胞壁提取物和原生質(zhì)體中分析SdrF,SdrG和SdrH在SdrF和SdrG中都存在LPXTG基元說(shuō)明，這些蛋白質(zhì)是錨定在細(xì)胞壁上的，因此這些蛋白質(zhì)也存在于溶葡萄球菌酶處理的表皮葡萄球菌的細(xì)胞壁提取物中。在使用抗-SdrFA抗血清，進(jìn)行穩(wěn)定期早期的Western印跡分析中，溶葡萄球菌酶消化的表皮葡萄球菌菌株9491表現(xiàn)出，在完整細(xì)胞溶胞物和細(xì)胞壁提取物中都存在230kDa的SdrF帶，但在原生質(zhì)體部分中不存在(圖10A)。相對(duì)照的是，在使用抗-SdrGA抗血清對(duì)同樣樣品進(jìn)行的分析中表現(xiàn)出，在溶胞物和原生質(zhì)體部分中存在著SdrG(170kDa)，但在細(xì)胞壁提取物中不存在(圖10B)。在使用含有溶葡萄球菌酶處理的菌株K28的印跡時(shí)可以觀察到相似的結(jié)果(未顯示)。使用抗-SdrHA抗血清對(duì)9491溶葡萄球菌酶部分進(jìn)行進(jìn)一步分析，在細(xì)胞壁裂解物和原生質(zhì)體部分中都顯示出免疫活性帶(圖10C)。這些結(jié)果說(shuō)明，在體外條件下，SdrF位于并錨定在細(xì)胞壁上，這些結(jié)果也說(shuō)明SdrG(除了其LPXTG基元)和SdrH或者與細(xì)胞質(zhì)膜相連或者位于細(xì)胞內(nèi)部?？祻?fù)期患者SdrF,SdrG和SdrH的抗血清的反應(yīng)性目前，從金黃色葡萄球菌感染恢復(fù)的患者的IgG顯示與纖連蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)(FnbpA)反應(yīng)，這說(shuō)明在感染期間金黃色葡萄球菌表達(dá)FnbpA(1)。這里，通過(guò)ELISA法，使用重組SdrF,SdrG和SdrH區(qū)域A蛋白質(zhì)，測(cè)試從不同的表皮葡萄球菌感染中恢復(fù)的15名患者的抗血清中提純的IgG的反應(yīng)性。圖11表示與從混合的兒童抗血清中提純的IgG相比，患者抗血清的IgG具有對(duì)SdrFA,SdrGA和SdrHA較高的滴定度?；颊叩腎gG常常對(duì)SdrGA和SdrHA比對(duì)SdrFA有更大的反應(yīng)活性。這說(shuō)明在表皮葡萄球菌感染期間Sdr蛋白質(zhì)在人類(lèi)中表達(dá)。討論人類(lèi)表皮葡萄球菌的感染與當(dāng)引入患者體內(nèi)時(shí)很快被基質(zhì)蛋白質(zhì)覆蓋的外源體設(shè)備有關(guān)(26)。盡管已提出一些機(jī)理調(diào)節(jié)未被覆蓋的聚合物表面的附著作用和生物膜形成，但調(diào)節(jié)被宿主蛋白質(zhì)覆蓋的表面的附著作用的具體因素還沒(méi)有確定。在表皮葡萄球菌中存在Sdr蛋白質(zhì)說(shuō)明，表皮葡萄球菌可以與金黃色葡萄球菌相似的方式結(jié)合蛋白質(zhì)-覆蓋基質(zhì)設(shè)備，即使用ClfA和ClfB調(diào)節(jié)與被血纖蛋白原覆蓋的整形設(shè)備的附著作用(21,31)。在這方面，克隆的表皮葡萄球菌DNA表達(dá)的并與SdrG相似的重組蛋白質(zhì)，已顯示與血纖蛋白原結(jié)合(22)。
在不考慮初始附著的情況下，表皮葡萄球菌在致病過(guò)程中起到重要的作用。試驗(yàn)顯示纖連蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)，F(xiàn)nbp從金黃色葡萄球菌的表面的蛋白酶解產(chǎn)生可溶的活性蛋白質(zhì)，并切這種酶解作用已建議認(rèn)為啟動(dòng)了金黃色葡萄球菌從固-相纖連蛋白的釋放和分發(fā)(18)。類(lèi)似地，在體外培養(yǎng)不存在蛋白酶抑制劑的條件下，天然的SdrF和SdrG經(jīng)歷快速降解(未公開(kāi)觀察結(jié)果)，這種蛋白酶解過(guò)程可提供細(xì)菌能從底物分離的機(jī)理。
通過(guò)溶葡萄球菌酶消化作用釋放的細(xì)胞壁錨定蛋白質(zhì)SdrF部分化，說(shuō)明其存在于細(xì)胞表面。相反，SdrG，其含有LPXTG-與SdrF相似的細(xì)胞壁分類(lèi)基元，發(fā)現(xiàn)只存在于原生質(zhì)體部分中。在細(xì)胞壁部分中明顯缺少SdrG可能受到細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)期的影響，或受到蛋白酶在不同生長(zhǎng)期期間表達(dá)的影響。如，在早期指數(shù)期中，在菌株K28的溶胞物中發(fā)現(xiàn)沒(méi)有或減少的SdrG。此外，在大量生長(zhǎng)到晚期穩(wěn)定期的表皮葡萄球菌中確實(shí)在細(xì)胞壁提取物中含有SdrG，而其他菌株(包括K28和9491)只含有SdrG可能的降解產(chǎn)物(未公開(kāi)結(jié)果)。有必要進(jìn)一步研究以細(xì)化有關(guān)SdrG對(duì)細(xì)胞壁的錨定和在細(xì)胞表面定位的規(guī)則。同樣地，也需要對(duì)有細(xì)胞壁蛋白質(zhì)屬性但缺少明顯的LPXTG基元的SdrH的進(jìn)行研究。
如上面所提及，與SdrG相似的蛋白質(zhì)(稱(chēng)為Fbe)已確定為能結(jié)合血纖蛋白原的表皮葡萄球菌蛋白質(zhì)(22)。據(jù)報(bào)道，F(xiàn)be有直接與SD重復(fù)區(qū)域相鄰的區(qū)域A，但與其他B相似的結(jié)構(gòu)沒(méi)有描述。我們發(fā)現(xiàn)Fbe含有兩個(gè)區(qū)域B重復(fù)單元，有99％的氨基酸與SdrG的區(qū)域B重復(fù)單元相同(未公開(kāi)結(jié)果)。在報(bào)道的Fbe序列中，這些重復(fù)單元在氨基酸601開(kāi)始在SD-重復(fù)單元開(kāi)始處終止。Fbe的原始區(qū)域A報(bào)道在殘基269到599間含有最小的血纖蛋白原結(jié)合區(qū)域。有關(guān)新確定的區(qū)域B重復(fù)單元，最小的血纖蛋白原結(jié)合區(qū)域會(huì)位于區(qū)域A的C-端盡頭。這一點(diǎn)與在C-端含有最小血纖結(jié)合區(qū)域的ClfA相似(McDeitt,1995)。Fbe和SdrG的區(qū)域A在氨基酸序列上有93％相同，預(yù)計(jì)的最小結(jié)合區(qū)域有98％相同。
在八種所描述的Sdr蛋白質(zhì)家族(金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌)成員中SdrH是最獨(dú)特的，因?yàn)樗哂汹叜愅贫ㄓ蚪M織。在N-端SD-重復(fù)區(qū)域的位置，新型區(qū)域C，和缺少確定的細(xì)胞壁相關(guān)序列說(shuō)明這種蛋白質(zhì)在功能上不同于已知的SdrMSCRAMM。對(duì)SdrH的細(xì)菌定位和配體結(jié)合可能的進(jìn)一步研究在進(jìn)行中。
SdrF和SdrG的SD-重復(fù)區(qū)域代表了八種已知Sdr蛋白質(zhì)中最長(zhǎng)和最短的SD重復(fù)區(qū)域(分別為558和56個(gè)殘基)。盡管SD-重復(fù)單元沒(méi)有參與血纖蛋白原的結(jié)合，但功能ClfA表達(dá)的野生型標(biāo)準(zhǔn)發(fā)現(xiàn)需要含多于40個(gè)殘基的SD重復(fù)區(qū)域(區(qū)域A末端的72個(gè)殘基到LPXTG基元)。氨基酸的區(qū)域假定跨越細(xì)胞壁并產(chǎn)生功能區(qū)域A。盡管SdrG含有從區(qū)域B重復(fù)單元的末端到LPXTG基元的73個(gè)殘基，但兩個(gè)區(qū)域B重復(fù)單元也可能影響配體結(jié)合區(qū)域A的結(jié)構(gòu)和功能。在SdrF中存在極大SD重復(fù)區(qū)域的用途還不了解。給定SD重復(fù)區(qū)域與細(xì)胞壁間的相互作用，SdrF和SdrG之間SD重復(fù)區(qū)域長(zhǎng)度的不同可能與在這些蛋白質(zhì)的細(xì)胞壁部分中觀察到的定位的不同有關(guān)。在SdrH中SD重復(fù)單元長(zhǎng)度的變化已作了描述。從KH11中獲取的SdrH蛋白質(zhì)(觀察到最小的SdrH)通過(guò)DNA序列分析發(fā)現(xiàn)含有64個(gè)殘基(未公開(kāi)結(jié)果)。在SdrH中SD重復(fù)單元的作用還不了解，但我們推測(cè)這個(gè)區(qū)域，象其他Sdr蛋白質(zhì)一樣，可能部分地與細(xì)胞壁有關(guān)。
編碼表皮葡萄球菌的Sdr蛋白質(zhì)的基因存在于大多數(shù)目前測(cè)試的臨床分離物中。這些菌株是從不同地理位置的患者中寬范圍的疾病中分離獲得。此外，從各種表皮葡萄球菌感染中恢復(fù)的患者在他們的抗血清中含有SdrF-,SdrG-和SdrH-反應(yīng)性IgG。相似的特性也在報(bào)道的金黃色葡萄球菌的五種Sdr蛋白質(zhì)中觀察到[(8,17)未公開(kāi)結(jié)果]。這些研究說(shuō)明Sdr蛋白質(zhì)在表皮葡萄球菌感染性及生長(zhǎng)方面是重要的要素。有趣的是，與編碼SD重復(fù)區(qū)域的DNA同源的位點(diǎn)在S.Haemolyticus,S.Lugdunensis,S.Intermedius和能在人類(lèi)和其他動(dòng)物中產(chǎn)生疾病的其他葡萄球菌菌株中也普遍存在(未公開(kāi)結(jié)果)。
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1995。使用金黃色葡萄球菌的附著作用缺損突變體確定特異血漿蛋白質(zhì)在促進(jìn)細(xì)菌與犬科動(dòng)靜脈連接分流器附著中的作用，感染免疫，63:585-590。
權(quán)利要求
1．一種編碼血纖蛋白原結(jié)合蛋白質(zhì)的分離的核酸分子，其中血纖蛋白原結(jié)合蛋白質(zhì)是從凝固酶陰性表皮葡萄球菌中分離出來(lái)的。
2．依據(jù)權(quán)利要求1的分離的核酸，其中蛋白質(zhì)由圖2中所示的氨基酸序列編碼。
3．依據(jù)權(quán)利要求1的分離的核酸，包括如圖2中所示的序列。
4．依據(jù)權(quán)利要求1的分離的核酸，包括與圖2中所示的序列選擇性雜交的序列。
5．權(quán)利要求1的分離的核酸在載體中。
6．依據(jù)權(quán)利要求5的載體，在有生命的生物體中表達(dá)分離的核酸。
7．一種編碼與細(xì)胞壁相關(guān)的，表現(xiàn)依賴(lài)-陽(yáng)離子配體結(jié)合的，并含有其中共有序列是TYTFTDYVD的高度保留基元的血纖蛋白原結(jié)合蛋白質(zhì)的分離的核酸分子，其中蛋白質(zhì)是從凝固酶陰性表皮葡萄球菌中分離出來(lái)的。
8．依據(jù)權(quán)利要求7的分離的核酸，其中蛋白質(zhì)是由從圖2-4中所示氨基酸序列組中選取的氨基酸序列編碼的。
9．依據(jù)權(quán)利要求7的分離的核酸，包括從圖2-4中所示核酸序列組中選取的序列。
10．依據(jù)權(quán)利要求7的分離的核酸，包括與從圖2-4中所示核酸序列組中選取的序列選擇性雜交的序列。
11．權(quán)利要求7的分離的核酸在載體中。
12．依據(jù)權(quán)利要求11的載體，在有生命的生物體中表達(dá)分離的核酸。
13．一種分離的，重組的或合成的Sdr蛋白質(zhì)，其是與細(xì)胞壁相關(guān)的，與可溶及固定血纖蛋白原結(jié)合的，及與血纖蛋白原的α和β鏈都結(jié)合的蛋白質(zhì)。
14．依據(jù)權(quán)利要求13的蛋白質(zhì)，其中蛋白質(zhì)含有包括圖2中所示序列的氨基酸序列。
15．依據(jù)權(quán)利要求13的蛋白質(zhì)，其由包括圖2中所示序列的核酸序列編碼。
16．依據(jù)權(quán)利要求13的蛋白質(zhì)，其由包括與圖2中所示序列選擇性雜交的序列的核酸序列編碼。
17．依據(jù)權(quán)利要求13的蛋白質(zhì)，其在有生命的生物體中從載體表達(dá)，其中載體含有包括如圖2中所示序列的核酸序列。
18．一種分離的，重組的或合成的蛋白質(zhì)，其是與細(xì)胞壁相關(guān)的，表現(xiàn)依賴(lài)-陽(yáng)離子配體結(jié)合的，并含有其中共有序列是TYTFTDYVD的高度保留基元的蛋白質(zhì)，其中蛋白質(zhì)是從凝固酶陰性表皮葡萄球菌中分離出來(lái)的。
19．依據(jù)權(quán)利要求18的蛋白質(zhì)，其中蛋白質(zhì)含有包括從圖2-4中所示氨基酸序列組中選取的序列的氨基酸序列。
20．依據(jù)權(quán)利要求1 8的蛋白質(zhì)，其由包括從圖2-4中所示核酸序列組中選取的序列的核酸序列編碼。
21．依據(jù)權(quán)利要求18的蛋白質(zhì)，其由包括與從圖2-4中所示氨基酸序列組中選取的序列選擇性雜交的序列的核酸序列編碼。
22．依據(jù)權(quán)利要求18的蛋白質(zhì)，其在有生命的生物體中從載體表達(dá)，其中載體含有包括從圖2-4中所示核酸序列組中選取的序列的核酸序列。
23．在藥物可接受的載體中的權(quán)利要求13的蛋白質(zhì)。
24．在藥物可接受的載體中的權(quán)利要求18的蛋白質(zhì)。
25．固定在固相上的權(quán)利要求13的蛋白質(zhì)。
26．固定在固相上的權(quán)利要求18的蛋白質(zhì)。
27．培養(yǎng)的抗Sdr蛋白質(zhì)的抗體和抗血清，其中蛋白質(zhì)是與細(xì)胞壁相關(guān)的，與可溶的和固定的血纖蛋白原都可結(jié)合的蛋白質(zhì)。
28．培養(yǎng)的抗與細(xì)胞壁相關(guān)的，表現(xiàn)依賴(lài)-陽(yáng)離子配體結(jié)合的，并含有其中共有序列是TYTFTDYVD的高度保留基元的蛋白質(zhì)的抗體和抗血清，其中蛋白質(zhì)是從凝固酶陰性表皮葡萄球菌中分離出來(lái)的。
29．一種包括Sdr蛋白質(zhì)的診斷試劑盒，其中蛋白質(zhì)是與細(xì)胞壁相關(guān)的，與可溶的和固定的血纖蛋白原都可結(jié)合的蛋白質(zhì)。
30．一種包括與細(xì)胞壁相關(guān)的，表現(xiàn)依賴(lài)-陽(yáng)離子配體結(jié)合的，并含有其中共有序列是TYTFTDYVD的高度保留基元的蛋白質(zhì)的診斷試劑盒，其中蛋白質(zhì)是從凝固酶陰性表皮葡萄球菌中分離出來(lái)的。
31．一種包括和與細(xì)胞壁相關(guān)的，與可溶的和固定的血纖蛋白原都可結(jié)合的蛋白質(zhì)反應(yīng)的抗體的診斷試劑盒。
32．一種包括和與細(xì)胞壁相關(guān)的，表現(xiàn)依賴(lài)-陽(yáng)離子配體結(jié)合的，并含有其中共有序列是TYTFTDYVD的高度保留基元的蛋白質(zhì)反應(yīng)的抗體的診斷試劑盒，其中蛋白質(zhì)是從凝固酶陰性表皮葡萄球菌中分離出來(lái)的。
33．一種包括編碼與細(xì)胞壁相關(guān)的，與可溶的和固定的血纖蛋白原都可結(jié)合的蛋白質(zhì)的核酸的診斷試劑盒。
34．一種包括編碼與細(xì)胞壁相關(guān)的，表現(xiàn)依賴(lài)-陽(yáng)離子配體結(jié)合的，并含有其中共有序列是TYTFTDYVD的高度保留基元的蛋白質(zhì)的核酸的診斷試劑盒，其中蛋白質(zhì)是從凝固酶陰性表皮葡萄球菌中分離出來(lái)的。
35．一種在患者中治療凝固酶陰性葡萄球菌感染的方法，包括給患者服用充分量的含有從SdrF,SdrG，和SdrH，以及它們的抑制血纖蛋白原結(jié)合的片段中選取的蛋白質(zhì)的藥物組合物。
36．依據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中的感染是敗血癥，骨髓炎或心內(nèi)膜炎。
37．一種在患者中抑制凝固酶陰性葡萄球菌感染的方法，包括給患者服用充分量的含有從SdrF,SdrG，和SdrH，以及它們的抑制凝固酶陰性葡萄球菌與血纖蛋白原結(jié)合的片段中選取的蛋白質(zhì)的藥物組合物。
38．一種在患者中抑制凝固酶陰性葡萄球菌素感染的方法，包括給患者服用充分量的含有從SdrF,SdrG，和SdrH，以及它們的抑制凝固酶陰性葡萄球菌與血纖蛋白原結(jié)合的片段中選取的蛋白質(zhì)的藥物組合物。
39．一種減少留置醫(yī)療設(shè)備的凝固酶陰性葡萄球菌感染的方法，包括用含有從SdrF,SdrG，和SdrH，以及它們的片段中選取的蛋白質(zhì)的藥物組合物涂覆醫(yī)療設(shè)備。
40．依據(jù)權(quán)利要求39的方法，其中醫(yī)療設(shè)備從脈管移植體，脈管擴(kuò)張器，靜脈內(nèi)導(dǎo)管，人造心臟瓣膜和助心設(shè)備中選取。
41．一種誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法，包括給患者服用含有從SdrF,SdrG，和SdrH，以及它們的片段，亞域和核酸分子中選取的蛋白質(zhì)的藥物組合物。
42．一種鑒別抑制凝固酶陰性葡萄球菌化合物的方法，包括將化合物與含有從SdrF,SdrG，和SdrH蛋白質(zhì)組中選取的蛋白質(zhì)混合，測(cè)定蛋白質(zhì)與結(jié)合分子的結(jié)合，其中如果與結(jié)合分子的結(jié)合被抑制那么化合物就抑制凝固酶陰性葡萄球菌。
全文摘要
提供了用來(lái)預(yù)防及治療由凝固酶陰性葡萄球菌如表皮葡萄球菌(S.epidermidis)引起的感染的分離的蛋白質(zhì)，稱(chēng)為SdrF,SdrG，和SdrH，以及它們相應(yīng)的氨基酸和核酸序列。SdrF,SdrG，和SdrH蛋白質(zhì)是與細(xì)胞壁相關(guān)的特異結(jié)合宿主蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)，每種含有其共有序列為T(mén)YTFTDYVD的高度保留基元。蛋白質(zhì)，其抗原部分，和抗－SdrF，－SdrG，和－SdrH抗體也可用來(lái)鑒別和診斷凝固酶陰性葡萄球菌感染。具體地，由于蛋白質(zhì)可用作疫苗組分或其抗體，所有它們是有價(jià)值的，它們可以給傷口服用或用來(lái)涂覆生物物質(zhì)以作為阻斷試劑，預(yù)防或抑制凝固酶陰性葡萄球菌與傷口或生物物質(zhì)的結(jié)合。
文檔編號(hào)A61P31/04GK1317043SQ99810487
公開(kāi)日2001年10月10日 申請(qǐng)日期1999年8月31日 優(yōu)先權(quán)日1998年8月31日
發(fā)明者蒂莫西·J·福斯特, 瑪紐斯·胡克, 斯塔西·戴維斯, 奧拉·哈特福德, 柯克·麥克伊, 迪艾爾·尼艾德欣 申請(qǐng)人:都柏林伊麗莎白女皇神學(xué)院, 得克薩斯藝術(shù)與音樂(lè)大學(xué)