專利名稱：一株纖維素分解復(fù)合菌系及其與硫酸鹽還原菌共培養(yǎng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域。特別是涉及具有分解纖維素能力的厭氧細(xì)菌復(fù)合菌系及其培養(yǎng)方法以及該菌系與硫酸鹽還原菌(SRB即Sulfate-reducing Bcteria)共培養(yǎng)，以提供SRB生長所需的碳源的方法。
背景技術(shù)：
利用硫酸鹽還原菌處理酸性礦山廢水是將酸性礦山廢水中的硫酸鹽還原為H2S，
在不同的PH條件下，可以利用H2S選擇沉淀不同重金屬形成金屬硫化物，以去除廢水中的
重金屬離子并回收有價(jià)金屬，生物還原反應(yīng)中生成的堿度可以中和酸性礦山廢水。該方法具有成本低、適用性強(qiáng)、無二次污染、可以回收酸性礦山廢水中的重金屬等特點(diǎn)。然而硫酸
鹽還原菌的生長需要外加額外的碳源才能完成，目前現(xiàn)有工藝中使用的碳氮源通常為化學(xué)藥品，價(jià)格較貴，藥劑消耗成本高，不利于在工業(yè)生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用。因此選擇適于細(xì)菌生長的、廉價(jià)的、甚至于作為廢棄物的有機(jī)質(zhì)，作為硫酸鹽還原菌的碳源用以培養(yǎng)菌種是實(shí)現(xiàn)工業(yè)應(yīng)用的重要環(huán)節(jié)。 木質(zhì)纖維素是我國最豐富的生物質(zhì)資源，包括大量的農(nóng)作物秸稈，工業(yè)與林業(yè)廢棄物以及城市固體廢棄物等。尤其是農(nóng)作物秸稈，是我國最豐富的資源之一，它具有產(chǎn)量大，分布廣，品種多的特點(diǎn)，應(yīng)用潛力巨大。木質(zhì)纖維素主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素三種成分組成，它們相互結(jié)合形成復(fù)雜的超分子復(fù)合物。由于其結(jié)構(gòu)復(fù)雜難于分解，目前這類資源大部分未能被充分利用。有許多種類的微生物可以將木質(zhì)纖維素分解為小分子有機(jī)物，進(jìn)而可用作肥料以改善和保持土壤肥力；可用作畜禽飼料以促進(jìn)畜牧業(yè)發(fā)展等。本發(fā)明通過富集分離能夠分解纖維素的厭氧細(xì)菌復(fù)合菌系，并將此分離到的厭氧細(xì)菌與SRB共培養(yǎng)于含有纖維素材料的培養(yǎng)基中，利用厭氧細(xì)菌分解纖維素的小分子產(chǎn)物作為碳源培養(yǎng)硫酸鹽還原菌(SRB)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一株纖維素分解復(fù)合菌系，該菌種對(duì)濾紙具有很強(qiáng)的分解能力，對(duì)稻草亦表現(xiàn)了較強(qiáng)的分解能力。 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種可以富集、分離、培養(yǎng)纖維素分解菌的培養(yǎng)基。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種纖維素分解菌系與SRB共培養(yǎng)的培養(yǎng)基，將分離到的纖維素分解厭氧細(xì)菌復(fù)合菌系與SRB共培養(yǎng)，利用纖維素的分解產(chǎn)物作碳源培養(yǎng)SRB。
本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
本發(fā)明所用的富集分離纖維素分解菌的樣品為活性污泥。 所述的菌種(Clostridium sp. Lwy-2，保藏登記號(hào)為CCTCC NO :M208161，保藏日2008年10月17日，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址武漢大學(xué)內(nèi))，其特征在于該菌種對(duì)濾紙具有很強(qiáng)的分解能力，對(duì)稻草亦表現(xiàn)了較強(qiáng)的分解能力。
3
本發(fā)明使用的菌種富集分離培養(yǎng)基為Tyrptone，l-10g ;CaCl2 H20，0. 5-2. 5g ;NaHC03，0. 2-1. 5g ;NH4C1，0. l_3g ; 12 X 120mm的濾紙條，蒸餾水，1L ;pH為6. 8-8. 0。 本發(fā)明使用的與纖維素分解菌共培養(yǎng)的SRB (名稱為DesulfovibriohalophilusRETECH-SRB-I，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址武漢大學(xué)內(nèi)，保藏日2007年5月11日，保藏登記號(hào):CCTCC NO :M207060)。 本發(fā)明使用的共培養(yǎng)培養(yǎng)基為:CaCl2 H20，0. 5-2. 5g ;NaHC03，0. 2-1. 5g ;K2HP04，0. l_3g ;MgS04 7H20，0. l_3g ;NaCl，O. l_5g ;NH4C1，0. l_3g ;KH2P04 ;trace element,10-15ml ;trace vitamin, 10_15ml ; (NH4)2Fe (S04)2 6H20，0. l_2g ;濾紙，3-10g ;蒸餾水，1L ;pH為6. 8-8. 0。 培養(yǎng)基制作稱取相應(yīng)藥品倒入事先裝有部分蒸餾水的燒杯中，藥品充分溶解后用蒸餾水定容至990ml，調(diào)pH到7. 2，最后定容到lOOOml。將20ml培養(yǎng)基分裝到18 X 150mm的螺口厭氧管(預(yù)先放置12X 120mm的濾紙條)中，并用真空抽換氣裝置除氧，12rC高壓蒸汽滅菌。 纖維素分解菌的富集培養(yǎng)將O. 2-0. 6g活性污泥接種到裝有培養(yǎng)基的試管中。接種后在30-4(TC條件下靜置培養(yǎng)。濾紙分解后，用相同的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接馴化，接種量為5% (v/v)。轉(zhuǎn)接4-5次后-4t:保存。 菌種形態(tài)觀察濾紙分解后用相差顯微鏡觀察菌體形態(tài)。 分解稻草和甘蔗渣在分離培養(yǎng)基中，分別用3% (w/v)稻草和甘蔗渣代替濾紙條配置培養(yǎng)基。接入10% (v/v)培養(yǎng)好的菌種，30-4(TC條件下靜置培養(yǎng)。觀察分解情況。
復(fù)合菌系微生物種群組成分析本發(fā)明采用16S rDNA克隆文庫技術(shù)對(duì)纖維素分解復(fù)合菌系中微生物種群組成進(jìn)行分析，該菌系由Clostridium屬的4種不同的種類組成。
纖維素分解復(fù)合菌系(Clostridium sp. Lwy-2，保藏登記號(hào)為CCTCC NO :M208161，保藏日2008年10月17日，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址武漢大學(xué)內(nèi))與SRB(名稱為Desulfovibrio halophilus RETECH-SRB-I，保藏單位中國國家典型培養(yǎng)物保藏中心，地址武漢大學(xué)內(nèi)，保藏日2007年5月11日，保藏登記號(hào)CCTCCNO :M207060)共培養(yǎng)配制共培養(yǎng)用培養(yǎng)基，將纖維素分解復(fù)合菌系與SRB以1 : 1比例混合，按10-20%接種量接種，30-4(TC條件下靜置培養(yǎng)，檢測(cè)SRB生長情況以及黑色沉淀FeS的形成情況。
本發(fā)明的纖維素分解復(fù)合菌系可用于其它的硫酸鹽還原菌。


圖1為本發(fā)明菌種的相差顯微鏡照片 圖2為共培養(yǎng)生長情況(大量FeS黑色沉淀形成) 圖3共培養(yǎng)SRB的掃描電鏡照片 以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 首先配制富集培養(yǎng)纖維素分解菌的培養(yǎng)基(Tyrptone， 3g ;CaCl2 H20， 2g ;NaHC03，lg ;NH4C1， lg ;蒸餾水，1L ;pH為7. 2)。將培養(yǎng)基分裝到裝有濾紙條(12X 120mm)的厭氧螺
4口試管中。經(jīng)過真空抽氣除氧后，高壓蒸汽滅菌(121°C)。將0.5g厭氧活性污泥接入到滅
好菌的培養(yǎng)基中，放入35t:培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。濾紙分解后用相同培養(yǎng)條件逐次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)。
在轉(zhuǎn)接過程中，菌系對(duì)濾紙的分解能力不斷加強(qiáng)，最終在48小時(shí)之內(nèi)即可將濾紙條完全降解。將富集分離到的纖維素分解菌系保藏(該菌名稱為Clostridium sp. Lwy-2，保藏單位中國國家典型培養(yǎng)物保藏中心，地址武漢大學(xué)內(nèi)，保藏日2008年10月21日，保藏登記號(hào)CCTCC NO :M208161)。
用相差顯微鏡觀察菌體形態(tài)。 用16S rDNA克隆文庫技術(shù)分析纖維素分解菌系中微生物種群組成。將lml菌液離心得到菌泥，提取總DNA，利用PCR技術(shù)以原核生物通用引物530f和1490r擴(kuò)增16S rDNA片段。PCR產(chǎn)物純化后與Promega的T-easy載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a 。挑取的白色菌落通過菌落PCR確定陽性菌落，經(jīng)酶切分型，對(duì)4個(gè)克隆測(cè)序。所得序列經(jīng)Blast比較表明，該菌系由4種不同的Clostridium種組成。 將新鮮稻草切成lcm的小段，按lX (w/v)裝入?yún)捬豕苤刑娲鸀V紙條。用Tyrptone，3g ;CaCl2 H20，2g ;NaHC03， lg ;NH4Cl，lg ;蒸餾水，1L ;pH為7. 2配制成培養(yǎng)基并分裝、除氧、滅菌。以2% (v/v)的量接種菌種，35t:培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。兩周后大部分稻草被分解。 配制纖維素分解菌與SRB共培養(yǎng)的培養(yǎng)基(CaC12 H20， 2g ;NaHC03， lg ;K2HP04，1. 2g ;MgS04 7H20，0. 9g ;NaCl，2g ;鵬Cl，O. 8g ;KH2P04， lg ;t潔e element, 10_15ml ;trace vitamin, 10_15ml ; (NH4) 2Fe (S04) 2 6H20，0. 5g ;濾紙，3g ;蒸餾水，1L ;pH為7. 2)，
該培養(yǎng)基是利用纖維素分解菌系對(duì)濾紙的降解產(chǎn)物作為SRB生長的碳源。將纖維素分解復(fù)合菌系(Clostridium sp. Lwy_2，保藏登記號(hào)為CCTCC NO :M208161，保藏日2008年10月17日，保藏單位中國國家典型培養(yǎng)物保藏中心，地址武漢大學(xué)內(nèi))與SRB(名稱為Desulfovibrio halophilus RETECH-SRB-I，保藏單位中國國家典型培養(yǎng)物保藏中心，地址武漢大學(xué)內(nèi)，保藏日2007年5月11日，保藏登記號(hào)CCTCC NO :M207060)以1 : 1比例混合，按10% (v/v)接種量接種，30-4(TC條件下靜置培養(yǎng)3天，濾紙全部崩解并有大量FeS黑色沉淀產(chǎn)生(SRB生長產(chǎn)生大量H2S， H2S與Fe2+反應(yīng)形成FeS黑色沉淀)。
權(quán)利要求
一種厭氧的纖維素分解細(xì)菌菌種，其名稱為Clostridium sp.Lwy-2，保藏登記號(hào)為CCTCC NOM208161，保藏日2008年10月17日，保藏單位中國國家典型培養(yǎng)物保藏中心，地址武漢大學(xué)內(nèi)。
2. —種富集、分離培養(yǎng)權(quán)利要求1所述的纖維素分解菌的培養(yǎng)基，其特征在于它包括Tyrptone， l_10g ;CaCl2 *H20，0. 5-2. 5g ;NaHC03，0. 2-1. 5g ;NH4C1，0. l_3g ; 12 X 120mm的濾紙條，蒸餾水，1L ;pH為6. 8-8. 0。
3. —種權(quán)利要求1所述的纖維素分解菌與SRB共培養(yǎng)的方法。其特征在于共培養(yǎng)使用的硫酸鹽還原菌其名稱為Desulfovibrio halophilus RETECH_SRB_I，保藏單位中國國家典型培養(yǎng)物保藏中心，地址武漢大學(xué)內(nèi)，保藏日2007年5月11日，保藏登記號(hào)CCTCCNO :M207060。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其特征在于將配制好的培養(yǎng)基分裝到螺口厭氧管中，并 真空抽氣除氧，溫度為30-4(TC，靜置培養(yǎng)。
5 根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其特征在于將纖維素分解復(fù)合菌系與SRB以1 : l(v/v)比例混合，接種量為10-20% (v/v)接種量接種。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述方法，其特征在于共培養(yǎng)用的培養(yǎng)基成分為CaCl2 *H20，0. 5-2. 5g ;NaHC03，0. 2-1. 5g ;K2HP04，0. l_3g ;MgS04 7H20，0. l_3g ;NaCl，O. l_5g ;NH4C1，0. l_3g ;KH2P04 ;trace element, 10_15ml ;trace vitamin, 10_15ml ; (NH4) 2Fe (S04) 2 6H20，0. l-2g ;濾紙，3-10g ;蒸餾水，1L ;pH為6. 8-8. 0。
全文摘要
本發(fā)明提供一種厭氧的纖維素分解細(xì)菌菌種(Clostridium sp.Lwy-2，保藏登記號(hào)為CCTCC NOM208161，保藏日2008年10月17日，保藏單位中國國家典型培養(yǎng)物保藏中心，地址武漢大學(xué)內(nèi))，該菌種對(duì)濾紙具有很強(qiáng)的分解能力，對(duì)稻草亦表現(xiàn)了較強(qiáng)的分解能力；同時(shí)提供一種厭氧的纖維素分解細(xì)菌菌種的富集、分離培養(yǎng)的培養(yǎng)基和一種纖維素分解菌與硫酸鹽還原菌(Desulfovibrio halophilus RETECH-SRB-I，保藏單位中國國家典型培養(yǎng)物保藏中心，地址武漢大學(xué)內(nèi)，保藏日2007年5月11日，保藏登記號(hào)CCTCC NOM207060)共培養(yǎng)的方法。該方法可以將纖維素分解菌與硫酸鹽還原菌共培養(yǎng)，利用纖維素分解菌系對(duì)濾紙的降解產(chǎn)物作為硫酸鹽還原菌生長的碳源。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101748079SQ200810227388
公開日2010年6月23日 申請(qǐng)日期2008年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月27日
發(fā)明者劉興宇, 劉文彥, 楊麗梅, 陳勃偉 申請(qǐng)人:北京有色金屬研究總院