專利名稱：一種酵母培養(yǎng)物在促進纖維素分解菌增殖中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種酵母培養(yǎng)物在促進纖維素分解菌增殖中的應用。
背景技術：
目前，我國北方地區(qū)仍以玉米秸稈等粗飼料作為反芻動物的部分能量來源。由于這類飼料質地粗硬、適口性差，導致反芻動物采食量降低，從而影響營養(yǎng)物質的吸收，造成生產效率低下，因此很多研究人員對如何提高這類粗飼料的消化率進行了大量的研究。研究反芻動物對粗飼料的利用，實際上就是研究瘤胃內微生物如何利用粗纖維的過程。瘤胃內主要的纖維分解菌包括產琥珀酸絲狀桿菌、牛黃瘤胃球菌及白色瘤胃球菌，另外還有一部分次級纖維分解菌，它對纖維降解也起到一定的作用。目前存在許多方法用以調控瘤胃微生物菌群結構，如應用離子載體和抗生素。但對于飼料工業(yè)中應用抗生素所引起的問題和尋求安全飼料的廣泛關注，促使研究者致力于發(fā)展一種新型非抗生素或“天然”的飼料添加劑。微生物飼料添加劑，即直接飼喂微生物(DFM)，完全滿足發(fā)展需求，因此被推到了歷史前臺。DFM包括細菌、酵母等，許多研究證明DFM使用效果良好，尤其是酵母培養(yǎng)物。酵母培養(yǎng)物(Yeast culture, YC)是指由酵母菌在特定工藝條件下經充分發(fā)酵后所形成的微生態(tài)制品，主要包括酵母細胞代謝產物、經發(fā)酵后變異的培養(yǎng)基以及少量已無活性的酵母細胞。酵母培養(yǎng)物的復雜成分主要包括酵母細胞內的營養(yǎng)物質和酵母細胞的發(fā)酵代謝產物。作為集營養(yǎng)、保健于一體的新型飼料添加劑，酵母培養(yǎng)物通過調控瘤胃微生物區(qū)系有效提高反芻動物對飼料的利用率，這也是近年來反芻動物學和營養(yǎng)學研究的熱點。酵母培養(yǎng)物的質量受菌種、發(fā)酵生產工藝以及檢測手段等因素的影響。酵母菌在不同的培養(yǎng)環(huán)境下，如不同的溫度、濕度或酸堿環(huán)境尤其是底物成分，會產生不同的發(fā)酵產物，而這其中又包含大量的未知生長因子。生產酵母培養(yǎng)物時所使用的培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝控制參數(shù)對其終端產品中代謝產物的組成、濃度及其生物利用率的穩(wěn)定性有著至關重要的影響。即便在使用相同酵母菌種的情況下，不同培養(yǎng)基組成或不同的發(fā)酵生產控制工藝會導致酵母培養(yǎng)物產品中代謝產物組成和濃度出現(xiàn)明顯的差異。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種酵母培養(yǎng)物在制備促纖維素分解菌增殖制劑中的用途。所述酵母培養(yǎng)物是按照包括如下步驟的方法制備得到的將釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae CGMCC No. 2. 1882)進行液體發(fā)酵后，收集發(fā)酵液，除去所述發(fā)酵液中的所述釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No. 2. 1882)細胞得到的無菌液體即為所述酵母培養(yǎng)物。所述液體發(fā)酵在如下條件下進行20-40°C、100-200轉/分鐘振蕩培養(yǎng)10_30小時后再靜置培養(yǎng)10-60小時；該振蕩培養(yǎng)是在有氧條件下進行的，該靜置培養(yǎng)是在厭氧條件下進行的。所述液體發(fā)酵所使用的發(fā)酵培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質由如下1)-3)的物質組成
1)碳源，所述碳源為如下A) -C)中的任一種A)葡萄糖、蔗糖和糖蜜；B)葡萄糖、蔗糖和糖蜜中的任兩種；C)葡萄糖、蔗糖和糖蜜中的任一種；2)氮源，所述氮源為如下D)_F)中的任一種D)酵母膏、蛋白胨和硫酸銨；E)酵母膏、蛋白胨和硫酸銨中的任兩種；F)酵母膏、蛋白胨和硫酸銨中的任一種；3)無機鹽，所述無機鹽為 KH2P04、MgSO4, MnSO4, CaCl2, GuSO4, ZnSO4 和!^eSO4 ；所述碳源在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的總濃度為30_300g/L ；所述碳源具體可由IOg/ L-100g/L 葡萄糖、10g/L-100g/L 蔗糖和 10g/L_100g/L 糖蜜組成；所述氮源在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的總濃度為25_640g/L ；所述氮源具體可由IOg/ L-300g/L酵母膏、10g/L-300g/L蛋白胨和5g/L_40g/L硫酸銨組成；所述無機鹽中的各組分在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度分別為KH2PO4 0. Ig/ L-10. 0g/L、MgSO4 0.0488g/L-4. 88g/L, MnSO4 0.089g/L-3. 56g/L, FeSO4 0.068g/ L-2.714g/L、CaCl2 0. lg/L-4. Og/L, CuSO4 0.0639g/L_2. 556g/L、ZnSO4 0.0561g/ L-2. 244g/L ；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為4. 0-6. 5。所述液體發(fā)酵按照包括如下步驟的方法進行將所述釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No. 2. 1882)接種于種子培養(yǎng)基中，20_40°C、100-200轉/分鐘振蕩培養(yǎng)18-40小時，獲得種子液；再將所述種子液按照(1-30) 100的體積比接種于所述發(fā)酵培養(yǎng)基中進行所述液體發(fā)酵；所述種子液中所述釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No. 2. 1882)的濃度為 106_108cfu/L。所述種子培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質為葡萄糖、酵母粉、蛋白胨和MnSO4，在所述種子培養(yǎng)基中各溶質的濃度分別為葡萄糖10g/L-40g/L、酵母粉5. 0g/L-40g/L、蛋白胨5. Og/ L-40g/L、MnSO4 0. 089g/L_3. 56g/L。本發(fā)明還提供一種纖維素分解菌增殖的培養(yǎng)方法，該方法包括將所述纖維素分解菌接種于含有所述酵母培養(yǎng)物的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的步驟。在上述應用或方法中，所述纖維素分解菌為產琥珀酸擬桿菌(FibrcAacter succinogenes subsp. succinogenes (Hungate))禾口 / 或牛黃瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens Sijpesteijn)禾口 / 或白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus Hungate)。在上述應用或方法中，所述產琥珀酸擬桿菌(Fibrobacter succinogenes subsp. succinogenes(Hungate))為產玻 白酸擬桿菌(Fibrobacter succinogenes subsp. succinogenes(Hungate)ATCC N0. 19169)；所述牛黃瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens Sijpesteijn)為牛黃瘤胃球菌 (Ruminococcus flavefaciens Sijpesteijn ATCC NO. 19208)；所述白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus Hungate)為白色瘤胃球菌 (Ruminococcus albus Hungate ATCC NO. 27210)。實驗證明，使用上述工藝制備得到的酵母培養(yǎng)物分別培養(yǎng)纖維素分解菌產琥珀酸擬桿菌(Fibrobacter succinogenes subsp. succinogenes (Hungate) ATCC NO. 19169)、牛黃瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens Sijpesteijn ATCC NO. 19208)和白色瘤胃球菌 (Ruminococcus albus Hungate ATCC NO. 27210)可使其生物量分別提高 75. 6%-80. 9%、 69. 89% -82. 75%和64. 78% -76. 76%。本發(fā)明為提高反芻動物生產力水平、優(yōu)化飼料組成
提供了一個重要途徑。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實施例所用的培養(yǎng)基、菌株的詳細信息如下⑶C培養(yǎng)基青島海博生物技術有限公司。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) :CGMCC 編號為 2. 1882。產玻拍酸擬桿菌(Fibrobacter succinogenes subsp. succinogenes (Hungate) ATCC 編號為 19169。牛黃瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens Sijpesteijn) :ATCC編號為 19208。白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus Hungate) :ATCC 編號為 27210。實施例1、酵母培養(yǎng)物及其制備方法與應用一、酵母培養(yǎng)物的制備1、培養(yǎng)基的配制液體種子培養(yǎng)基稱取IOg葡萄糖、5g酵母粉、5g蛋白胨和0. Ig MnSO4 ·Η20，用IL 蒸餾水加熱溶解后，121°C、0. IMpa高溫滅菌15min，備用。液體發(fā)酵培養(yǎng)基稱取IOg葡萄糖，IOg蔗糖，IOg糖蜜，IOg蛋白胨，IOg酵母膏， 5g 硫酸銨，0. Ig KH2PO4,0. Ig MgSO4 · 7H20，0. Ig MnSO4 · Η20，0. Ig CaCl2,0. IgCuSO4 · 5Η20, 0. Ig ZnSO4 · 7Η20 和 0. Ig FeSO4 · 4Η20，蒸餾水溶解后，用 0. lmol/L HCl 溶液調節(jié) pH 值至 4.0，定容至1L，121°C、0. IMpa高溫滅菌15min，備用。2、種子液的獲得將凍干保藏的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae CGMCC No. 2. 1882)活化三代后接入上述液體種子培養(yǎng)基中，200C、100轉/分鐘振搖培養(yǎng)18h，獲得種子液，經檢測，該種子液經15倍稀釋后的0D_值為0. 491，釀酒酵母的活細胞數(shù)為1. 1 X 109cfu/L。3、發(fā)酵液的獲得將步驟2獲得的種子液按1 100的體積比接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，20°C、100 轉/分鐘條件下發(fā)酵培養(yǎng)IOh后轉入20°C恒溫箱中靜置培養(yǎng)10h，獲得發(fā)酵液。4、酵母培養(yǎng)物的獲得將步驟3獲得的發(fā)酵液于4000轉/分鐘條件下離心5min除去菌體，將獲得的上清液用細菌過濾器(0. 22 μ m)過濾，經平板檢驗無菌長出，得到的無細胞濾液即為無菌酵母培養(yǎng)物。二、利用酵母培養(yǎng)物對纖維素分解菌進行增殖培養(yǎng)將凍干保藏的三種纖維素分解菌產琥珀酸擬桿菌、牛黃瘤胃球菌和白色瘤胃球菌分別進行如下步驟1-4的實驗
1、活化后分別接入⑶C培養(yǎng)基，30°C嚴格厭氧培養(yǎng)30h，獲得菌懸液；2、制備如下培養(yǎng)基羧甲基纖維素鈉25ml、硫酸銨10g、NaCl 10g、KH2P045. 0g、 MgSO4 · 7H20 5. Og/L、MnSO4 · H2O 2. Og/L、CaCl2 2. Og/L、CuSO4 · 5H20 2. Og/L、 ZnSO4 · 7H202. Og/L 和 FeSO4 · 4H20 2. Og/L,蒸餾水溶解后，用 0. lmol/L HCl 調節(jié) pH 值至 5.0，，定容至1L，121°C、0. IMpa高溫滅菌15min，備用。3、設置如下兩組處理，每種處理3次重復處理1 (實驗組)取5. Oml步驟2制備的培養(yǎng)基、0. 5ml步驟一制備的酵母培養(yǎng)物和0. 5ml的纖維素分解菌菌懸液(約1 X 107cfu/ml)在IOml無菌離心管中混合后密封， 37°C恒溫培養(yǎng)Mh，得到纖維素分解菌培養(yǎng)液。處理2 (對照組)取5. Oml步驟2制備的培養(yǎng)基、0. 5ml無菌水和0. 5ml的纖維素分解菌菌懸液(約lX107cfu/ml)在IOml無菌離心管中混合后密封，37°C恒溫培養(yǎng)Mh，得到纖維素分解菌培養(yǎng)液。4、培養(yǎng)液中纖維素分解菌的生物量測定以纖維分解菌培養(yǎng)基(即步驟2制備的培養(yǎng)基)為調零空白對照，將步驟3培養(yǎng)的纖維素分解菌培養(yǎng)液直接用TU-1901紫外可見分光光度計測定其在600nm波長條件下的吸光值即OD6tltl值，結果如表1所示。表1.培養(yǎng)液中纖維素分解菌生物量的測定結果
實驗組的OD6m結果對照組的OD6m結果產琥珀酸擬桿菌0. 975±0. 020. 539±0. 01牛黃瘤胃球菌0. 943±0. 030. 516±0. 02白色瘤胃球菌0. 903±0. 030. 548 ±0. 02 與對照組相比，實驗組獲得的培養(yǎng)液中產琥珀酸擬桿菌生物量提高80. 9%，牛黃瘤胃球菌生物量提高82. 75%,白色瘤胃球菌生物量提高64. 78%。實施例2、酵母培養(yǎng)物及其制備方法與應用一、酵母培養(yǎng)物的制備1、培養(yǎng)基的配制液體種子培養(yǎng)基稱取40g葡萄糖、40g酵母粉、40g蛋白胨和4. Og MnSO4 ·H2O，用 IL蒸餾水加熱溶解后，121°C、0. IMpa高溫滅菌15min，備用。液體發(fā)酵培養(yǎng)基100g葡萄糖，IOOg蔗糖，IOOg糖蜜，300g蛋白胨，300g酵母膏， 40g 硫酸銨，IOg KH2PO4, IOg MgSO4 · 7H20，4. Og MnSO4 · H20,4. Og CaCl2,4. OgCuSO4 · 5Η20, 4. Og ZnSO4 · 7Η20 和 4. Og FeSO4 · 4Η20,蒸餾水溶解后，用 0. lmol/L NaOH 溶液調節(jié) pH 值至 6. 5，定容至1L，121°C、0. IMpa高溫滅菌15min，備用。2、種子液的獲得將凍干保藏的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae CGMCC No. 2. 1882)活化三代后接入上述液體種子培養(yǎng)基中，40200轉/分鐘振搖培養(yǎng)40h，獲得種子液，經檢測，該
7種子液經10倍稀釋后的0D_值為0. 591，釀酒酵母的活細胞數(shù)為8. 9X 108cfu/L3、發(fā)酵液的獲得將步驟2獲得的種子液按體積分數(shù)30%接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，40°C、200轉/ 分鐘條件下發(fā)酵培養(yǎng)30h后轉入40°C恒溫箱中靜置培養(yǎng)60h，獲得發(fā)酵液。4、酵母培養(yǎng)物的獲得將步驟3獲得的發(fā)酵液于4000轉/分鐘條件下離心5min除去菌體，將獲得的上清液用細菌過濾器(0. 22 μ m)過濾，經平板檢驗無菌長出，得到的無細胞濾液即為無菌酵母培養(yǎng)物。二、利用酵母培養(yǎng)物對纖維素分解菌進行增殖培養(yǎng)方法同實施例1中的步驟二，結果如表2所示。表2.培養(yǎng)液中纖維素分解菌生物量的測定結果
權利要求
1.一種酵母培養(yǎng)物在制備促纖維素分解菌增殖制劑中的應用所述酵母培養(yǎng)物是按照包括如下步驟的方法制備得到的將釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No. 2. 1882)進行液體發(fā)酵后，收集發(fā)酵液，除去所述發(fā)酵液中的所述釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No. 2. 1882)細胞得到的無菌液體即為所述酵母培養(yǎng)物。
2.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于所述液體發(fā)酵在如下條件下進行 20-400C >100-200轉/分鐘振蕩培養(yǎng)10-30小時后再靜置培養(yǎng)10-60小時。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的應用，其特征在于所述液體發(fā)酵所使用的發(fā)酵培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質由如下1)-3)的物質組成1)碳源，所述碳源為如下A)-C)中的任一種A)葡萄糖、蔗糖和糖蜜；B)葡萄糖、蔗糖和糖蜜中的任兩種；C)葡萄糖、蔗糖和糖蜜中的任一種；2)氮源，所述氮源為如下D)-F)中的任一種D)酵母膏、蛋白胨和硫酸銨；E)酵母膏、蛋白胨和硫酸銨中的任兩種；F)酵母膏、蛋白胨和硫酸銨中的任一種；3)無機鹽，所述無機鹽為KH2P04、MgSO4, MnSO4, CaCl2, CuSO4, ZnSO4 和!^eSO4 ；所述碳源在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的總濃度為30-300g/L;所述碳源具體可由IOg/L-100g/L 葡萄糖、10g/L-100g/L 蔗糖和 10g/L_100g/L 糖蜜組成；所述氮源在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的總濃度為25-640g/L;所述氮源具體可由IOg/ L-300g/L酵母膏、10g/L-300g/L蛋白胨和5g/L_40g/L硫酸銨組成；所述無機鹽中的各組分在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度分別為=KH2PO4 0. lg/L-10. 0g/L、 MgSO4 0. 0488g/L-4. 88g/L、MnSO4 0. 089g/L_3. 56g/L、FeSO4 0. 068g/L_2. 714g/L、CaCl2 0. lg/L-4. 0g/L、CuSO4 0. 0639g/L_2. 556g/L、ZnSO4 0. 0561g/L_2. 244g/L ；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的PH值為4. 0-6. 5。
4.根據(jù)權利要求1-3中任一所述的應用，其特征在于所述液體發(fā)酵按照包括如下步驟的方法進行將所述釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No. 2. 1882)接種于種子培養(yǎng)基中，20-40°C、100-200轉/分鐘振蕩培養(yǎng)18-40小時，獲得種子液；再將所述種子液按照(1-30) 100的體積比接種于所述發(fā)酵培養(yǎng)基中進行所述液體發(fā)酵。
5.根據(jù)權利要求4所述的應用，其特征在于所述種子培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質為葡萄糖、酵母粉、蛋白胨和MnSO4,在所述種子培養(yǎng)基中各溶質的濃度分別為葡萄糖10g/L-40g/ L、酵母粉 5. 0g/L-40g/L、蛋白胨 5. 0g/L_40g/L、MnSO4O. 089g/L_3. 56g/L。
6.一種纖維素分解菌的培養(yǎng)方法，包括將所述纖維素分解菌接種于含有所述酵母培養(yǎng)物的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的步驟。
7.根據(jù)權利要求1-6中任一所述的應用或方法，其特征在于所述纖維素分解菌為產玻 白酸擬桿菌(Fibrobacter succinogenes subsp. succinogenes (Hungate))禾口 /或牛黃瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens Sijpesteijn)和/或白色瘤胃球菌 (Ruminococcus albus Hungate)。
8.根據(jù)權利要求7所述的應用，其特征在于所述產琥珀酸擬桿菌(FibrcAacter succinogenes subsp. succinogenes(Hungate))為產玻 白酸擬桿菌(Fibrobacter succinogenes subsp. succinogenes(Hungate)ATCC NO. 19169)；所述牛黃瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens Si jpestei jn)為牛黃瘤胃球菌 (Ruminococcus flavefaciens Sijpesteijn ATCC NO. 19208)；所述白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus Hungate)為白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus Hungate ATCC NO. 27210)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種酵母培養(yǎng)物在促進纖維素分解菌增殖中的應用。所述酵母培養(yǎng)物是按照包括如下步驟的方法制備得到的將釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No.2.1882)進行液體發(fā)酵后，收集發(fā)酵液，除去所述發(fā)酵液中的所述釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No.2.1882)細胞得到的無菌液體即為所述酵母培養(yǎng)物。實驗證明，使用上述工藝制備得到的酵母培養(yǎng)物分別培養(yǎng)纖維素分解菌產琥珀酸擬桿菌、牛黃瘤胃球菌和白色瘤胃球菌可使其生物量分別提高75.6％-80.9％、69.89％-82.75％和64.78％-76.76％。本發(fā)明為提高反芻動物生產力水平、優(yōu)化飼料組成提供了一個重要途徑。
文檔編號C12R1/01GK102533621SQ201210052029
公開日2012年7月4日 申請日期2012年3月1日 優(yōu)先權日2012年3月1日
發(fā)明者劉萍, 徐樂, 解洛香 申請人:中國農業(yè)大學