專利名稱：一種微流控芯片及研究細(xì)胞在三維介質(zhì)中定向移動的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及將微流控芯片技術(shù)應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，提供了一種微流控芯片
及研究細(xì)胞在三維介質(zhì)中定向移動的方法，利用微流控芯片為細(xì)胞生長及遷移提供三維空間支持，并在此三維空間生成穩(wěn)定的濃度梯度，在趨化物的誘導(dǎo)下，細(xì)胞在三維介質(zhì)內(nèi)發(fā)生定向移動，并可同時考察兩種不同的細(xì)胞在相同條件下的移動。
背景技術(shù)：
細(xì)胞的定向移動在胚胎發(fā)育、傷口愈合、腫瘤浸潤及轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮重要作用。傳統(tǒng)研究體外細(xì)胞遷移所采用的模型往往只能觀察到細(xì)胞在二維表面的爬行，與體內(nèi)細(xì)胞所處的三維空間有很大差異。微流控芯片技術(shù)是20世紀(jì)90年代初在毛細(xì)管電泳基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新技術(shù)，2006年被《自然》雜志列為21世紀(jì)最重要的前沿技術(shù)之一，近幾年微流控芯片技術(shù)迅速向生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域滲透，顯示了廣闊的應(yīng)用前景，越來越多的跡象表明微流控芯片技術(shù)將成為生物醫(yī)學(xué)研究的一個極重要的平臺。本發(fā)明可以在芯片上為細(xì)胞的生長和遷移提供三維介質(zhì)支持，并利用層流原理生成穩(wěn)定的濃度梯度，誘導(dǎo)細(xì)胞在三維介質(zhì)內(nèi)定向移動。與傳統(tǒng)二維研究模型比較，該微流控芯片為細(xì)胞生長及遷移所提供的三維微環(huán)境更接近體內(nèi)環(huán)境。并且本發(fā)明操作簡單、快速，易于生物醫(yī)學(xué)研究者接受。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供了一種微流控芯片及研究細(xì)胞在三維介質(zhì)中定向移動的方法。 本發(fā)明提供了一種微流控芯片，該微流控芯片由注射泵、兩條平行的灌流通道、細(xì)胞進(jìn)樣口、細(xì)胞培養(yǎng)池、廢液池組成；灌流通道的上端連接注射泵，下端連接廢液池；細(xì)胞培養(yǎng)池與兩條平行的灌流通道相連，細(xì)胞培養(yǎng)池的上端與細(xì)胞進(jìn)樣口相連。
本發(fā)明提供的微流控芯片的材料為P匿S聚合物，與玻璃材料不可逆封。
本發(fā)明提供的微流控芯片，所述細(xì)胞培養(yǎng)池為橢圓形。 本發(fā)明還提供了用微流控芯片研究細(xì)胞在三維介質(zhì)中定向移動的方法，方法過
程如下將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞經(jīng)過胰酶消化、離心，然后將獲得的細(xì)胞以濃度107ml與
Cultrex Basement Membrane Extract (BME， R&D Systems, MN)在冰上混勻，通過細(xì)胞進(jìn)樣口
將細(xì)胞與BME的混合物加入細(xì)胞培養(yǎng)池內(nèi)，放置于室溫約30min到BME凝固成膠狀；待BME
形成凝膠后，兩側(cè)灌流通道的上端連接注射泵，其中一側(cè)灌流通道內(nèi)灌注含有趨化因子的
細(xì)胞培養(yǎng)液，另一側(cè)作為空白對照灌注不含趨化因子的細(xì)胞培養(yǎng)液，流速均為0. 5iU/min，
連續(xù)灌流培養(yǎng)24小時，細(xì)胞培養(yǎng)池內(nèi)形成穩(wěn)定的濃度梯度；用羅丹明123(Rodamin 123)和
碘化丙啶(PI)表征培養(yǎng)24小時后的細(xì)胞在BME三維空間內(nèi)的生長狀態(tài)及活性。 本發(fā)明提供的微流控芯片研究細(xì)胞在三維介質(zhì)中定向移動的方法，所述BME為基
底膜樣物質(zhì)，在細(xì)胞培養(yǎng)池內(nèi)為細(xì)胞生長及遷移提供三維支撐，低溫時為液態(tài)，室溫時凝固
成膠態(tài)。
本發(fā)明提供的微流控芯片研究細(xì)胞在三維介質(zhì)中定向移動的方法，所述細(xì)胞培養(yǎng)池內(nèi)的濃度梯度用熒光染料(FAM)標(biāo)記的DNA分子(分子量約為6000D)表征。
本發(fā)明提供的微流控芯片研究細(xì)胞在三維介質(zhì)中定向移動的方法，整個方法過程中維持注射泵的流速為0. 5iU/min。 本發(fā)明提供的微流控芯片研究細(xì)胞在三維介質(zhì)中定向移動的方法，在芯片上同時進(jìn)行兩種細(xì)胞的檢測；該微流控芯片具有兩個細(xì)胞培養(yǎng)池，可以分別加入不同種類的細(xì)胞，檢測在相同條件下不同細(xì)胞的遷移率。 總之，本發(fā)明可在一塊幾平方厘米的芯片上，為細(xì)胞的生長和遷移提供三維介質(zhì)支持，并在介質(zhì)內(nèi)生成穩(wěn)定的濃度梯度，在趨化因子的作用下誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生定向移動。相對于傳統(tǒng)的研究方法，為細(xì)胞的生長和移動提供一個更接近體內(nèi)的微環(huán)境。并且本發(fā)明具有操作簡單、快速和樣品用量少等特點(diǎn)。具有重要的生物醫(yī)學(xué)研究價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。


圖l本發(fā)明微流控芯片示意圖，其中(1)細(xì)胞進(jìn)樣口、(2)細(xì)胞培養(yǎng)池、(3)灌流通道、(4)廢液池; 圖2顯示不同時間細(xì)胞培養(yǎng)池內(nèi)的熒光信號灌流通道內(nèi)液體流動速度為0. 5 ii 1/min ; 圖3在細(xì)胞培養(yǎng)池內(nèi)生成穩(wěn)定的線性熒光濃度梯度；
圖4乳腺癌細(xì)胞MCF7在三維介質(zhì)中生長狀態(tài)及活性檢測；
圖5乳腺癌細(xì)胞MCF7在EGF誘導(dǎo)下發(fā)生定向遷移；
圖6乳腺癌細(xì)胞MCF7在EGF誘導(dǎo)下發(fā)生遷移率。
具體實(shí)施例方式
下面的實(shí)施例將對本發(fā)明予以進(jìn)一步的說明，但并不因此而限制本發(fā)明。
實(shí)施例 所用微流控芯片為本實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)及制備。芯片材料為PDMS聚合物，通過不可逆封接技術(shù)封接于玻璃表面。如圖l所示，兩條平行的灌流通道尺寸為長5mm，寬400iim，橢圓形細(xì)胞培養(yǎng)池的尺寸為長徑lmm，短徑200iim。通過細(xì)胞進(jìn)樣口在低溫下向細(xì)胞培養(yǎng)池內(nèi)加入乳腺癌細(xì)胞MCF7與Basement Membrane Extract (BME)的混合物，待混合物形成凝膠后，兩側(cè)灌流通道的上端接注射泵，在灌流通道內(nèi)灌注細(xì)胞培養(yǎng)液，置于37t:的C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞24小時。采用Rodamin-123 (Rh-123)禾P PI聯(lián)合檢測BME包埋的MCF7細(xì)胞活性，結(jié)果顯示MCF7細(xì)胞在BME中24小時的成活率大于90% (圖4)。
在一側(cè)通道內(nèi)灌注含有0 200ng/ml不同濃度的表皮生長因子(EGF)的培養(yǎng)液作為實(shí)驗(yàn)側(cè)，另一側(cè)作為對照灌注不含趨化物的培養(yǎng)液作為對照側(cè)，連續(xù)灌流培養(yǎng)細(xì)胞24小時。在EGF的誘導(dǎo)下，24小時內(nèi)大部分MCF7細(xì)胞向EGF濃度較高的方向遷移，而在靠近對照側(cè)灌流通道的MCF7細(xì)胞則不發(fā)生移動(圖5)，在200ng/ml濃度的EGF誘導(dǎo)下實(shí)驗(yàn)側(cè)的細(xì)胞遷移率顯著大于對照側(cè)(圖6)。
權(quán)利要求
一種微流控芯片，其特征在于該微流控芯片由細(xì)胞進(jìn)樣口(1)、細(xì)胞培養(yǎng)池(2)、兩條平行的灌流通道(3)、廢液池(4)組成；灌流通道的下端連接廢液池，細(xì)胞培養(yǎng)池與兩條平行的灌流通道相連，細(xì)胞培養(yǎng)池的上端與細(xì)胞進(jìn)樣口相連。
2. 按照權(quán)利要求l所述微流控芯片，其特征在于所述微流控芯片的材料為PDMS聚合物，與玻璃材料不可逆封。
3. 按照權(quán)利要求1所述微流控芯片，其特征在于所述細(xì)胞培養(yǎng)池為橢圓形。
4. 權(quán)利要求1所述微流控芯片研究細(xì)胞在三維介質(zhì)中定向移動的方法，其特征在于 方法過程如下通過細(xì)胞進(jìn)樣口將細(xì)胞與BME的混合物加入細(xì)胞培養(yǎng)池內(nèi)，放置于室溫到BME凝固成 膠狀；待BME形成凝膠后，兩側(cè)灌流通道的上端連接注射泵，其中一側(cè)灌流通道內(nèi)灌注含有 趨化因子的細(xì)胞培養(yǎng)液，另一側(cè)作為空白對照灌注不含趨化因子的細(xì)胞培養(yǎng)液，流速均為 0. 5iU/min，連續(xù)灌流培養(yǎng)24小時，趨化因子在細(xì)胞培養(yǎng)池內(nèi)形成穩(wěn)定的濃度梯度；用羅丹明123和碘化丙啶表征培養(yǎng)24小時后的細(xì)胞在BME三維空間內(nèi)的生長狀態(tài)及 活性。
5. 按照權(quán)利要求4所述微流控芯片研究細(xì)胞在三維介質(zhì)中定向移動的方法，其特征在 于所述BME為基底膜樣物質(zhì)，低溫時為液態(tài)，室溫時凝固成膠態(tài)。
6. 按照權(quán)利要求4所述微流控芯片研究細(xì)胞在三維介質(zhì)中定向移動的方法，其特征在 于所述細(xì)胞培養(yǎng)池內(nèi)的濃度梯度用熒光染料標(biāo)記的DNA分子表征。
7. 按照權(quán)利要求6所述微流控芯片研究細(xì)胞在三維介質(zhì)中定向移動的方法，其特征在 于所述DNA分子的分子量為6000D。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種微流控芯片及其研究細(xì)胞在三維介質(zhì)中定向移動的方法，該微流控芯片由細(xì)胞進(jìn)樣口、細(xì)胞培養(yǎng)池、兩條平行的灌流通道、廢液池組成；灌流通道的下端連接廢液池，細(xì)胞培養(yǎng)池與兩條平行的灌流通道相連，細(xì)胞培養(yǎng)池的上端與細(xì)胞進(jìn)樣口相連；利用微流控芯片為細(xì)胞生長及遷移提供三維空間支持，并在此三維空間生成穩(wěn)定的濃度梯度，在趨化物的誘導(dǎo)下，細(xì)胞在三維介質(zhì)內(nèi)發(fā)生定向移動，本發(fā)明具有操作簡單、快速和樣品用量少等特點(diǎn)。
文檔編號C12N5/00GK101748059SQ20081022939
公開日2010年6月23日 申請日期2008年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月8日
發(fā)明者劉婷姣, 林炳承, 秦建華 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所